CN111172273A - 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SMN1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法，利用LAMP技术将待测碱基位于引物3’端，辅助突变碱基在辅助突变引物3’端第二个碱基上，通过对待测位点相邻碱基在设计引物的过程中对扩增引物进行人为突变，得到的引物在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基。显著提高了Bst DNA Polymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放DNA即可作为模板进行扩增，极大的简化了操作步骤。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种SMN1基因检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓型肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一类相对常见的常染色体隐性遗传病，以脊髓前角运动神经元退化变性和丢失导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。SMA发病率为1/10 000～1/6000，携带率为1/50～1/40。SMA的发病原因主要是由于位于5q13.2上的运动神经元存活基因1(survival motor neuron gene 1，SMN1)上的7号外显子第6个碱基由C突变为T，导致SMN蛋白功能缺陷所致的遗传性神经肌肉病。SMN是一个广泛表达的管家蛋白，可作为亚单位与Sm蛋白结合，以SMN复合体形式募集Sm核蛋白和小核核糖核酸(snRNAs)组装成核糖核蛋白复合物(snRNPs)。目前已经研制出了针对SMA的有效药物，但仍需要早发现早治疗，尤其是针对婴儿期的SMA患者治疗效果更佳。因此，实施新生儿SMA筛查对于进行症状前诊断至关重要。
目前，针对SMA的基因检测技术主要是基于聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(RT-PCR)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、荧光原位杂交技术(FISH)等，然后结合核酸测序技术进行序列分析。但是，上述技术均是基于PCR技术的体外扩增，但是由于受PCR技术的灵敏度限制，检测结果有一定失败的可能性。另一方面由于PCR技术由于DNA Polymerase扩增过程中有一定几率出现扩增变异，因此，也存在一定的假阳性率。且上述技术的检测时间长、费用高，在基层医疗单位推广普及的难度较高。
环介导等温扩增技术(LAMP)由于其对检测设备的要求较低，操作简便，以及高灵敏度，目前已经广泛应用于病原微生物的检测中。近年来也研究报道利用LAMP法检测基因突变，但仍存在较为明显的不足。如专利文献CN 105861690A利用肽核酸(PNA)制备的探针与DNA或RNA能够形成稳定的复合体，而单碱基突变能够引起该复合体较大Tm值变化的原理，与LAMP技术结合。但目前肽核酸合成技术仍不成熟，合成的PNA纯度一般仅能达到90％-95％，同时，肽核酸合成成本较高，合成50nmol的费用高达5000～6000元左右，检测费用高，推广难度大。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种SMN1基因检测引物组、试剂盒及检测方法，解决现有的基因突变检测技术检测耗时长、费用高、设备依赖度高等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种SMN1基因检测的引物组，该引物组为以下A、B、C、D四组中的任一种；
所述的A组包括引物A-F3-W、A-F3-M、A-B3、A-FIP、A-BIP、A-LF和A-LB：
A-F3-W：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
A-F3-M：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
A-B3：5’-CTAGTAGGGATGTAGATTAACC-3’；
A-FIP:5’-AAAGTAAGATTCACTTTCATAATGCTGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGT-3’；
A-BIP:5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAGGCATCAAAATTCTTTAATATT-3’；
A-LF：5’-GACTTACTCCTTAATTTAAGGAAT-3’；
A-LB：5’-GTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAA-3’；
所述的B组包括引物B-F3、B-B3-W、B-B3-M、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB：
B-F3：5’-CCTTAACTGCAGCCTAATAAT-3’；
B-B3-W：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
B-B3-M：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
B-FIP:5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTTTACGGATAACTTTTAAAGTACATTAA-3’；
B-BIP:5’-CATCCATATAAAGCTATCTATATACCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGTT-3’；
B-LF：5’-CAACAAAATATGATCAGAAATTAA-3’；
B-LB：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
所述的C组包括引物C-F3、C-B3、C-FIP-W、C-FIP-M、C-BIP、C-LF和C-LB：
C-F3：5’-CTATGTCTATATAGCTATTTTTTTT-3’；
C-B3：5’-TGATTGTTTTACATTAACCTTTCA-3’；
C-FIP-W:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
C-FIP-M:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
C-BIP:5’-ATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAATTAACATCTGAACTTTTTAAATGTT-3’；
C-LF：5’-GCACCTTCCTTCTTTTTGATTT-3’；
C-LB：5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTT-3’；
所述的D组包括引物D-F3、D-B3、D-FIP、D-BIP-W、D-BIP-M、D-LF和D-LB：
D-F3：5’-AGTACATTAAAAGACTATCAACTT-3’；
D-B3：5’-ACTCCTTAATTTAAGGAATGTGA-3’；
D-FIP:5’-ATATAGATAGCTTTATATGGATGTTATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAA-3’；
D-BIP-W:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
D-BIP-M:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
D-LF：5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTT-3’；
D-LB：5’-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGG-3’。
其中，V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基；A-F3-W、B-B3-W、C-FIP-W、D-BIP-W均为检测SMN1野生型引物，A-F3-M、B-B3-M、C-FIP-M、D-BIP-M均为检测SMN1突变型引物。
本发明还公开了一种SMN1基因检测的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。
具体的，该试剂盒还包括Bst DNA Polymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
具体的，所述的A组中，引物A-F3-W、A-F3-M、A-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，A-LF、A-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，A-FIP、A-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的B组中，B-F3、B-B3-W、B-B3-M浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，B-LF、B-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，B-FIP、B-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的C组中，C-F3、C-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，C-LF、C-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，C-FIP-W、C-FIP-M、C-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的D组中，D-F3、D-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，D-LF、D-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，D-FIP、D-BIP-W、D-BIP-M浓度相同，为1.6～3.2μmol/L。
具体的，所述的Bst DNA Polymerase为0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；
所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％；
具体的，所述的SYBR Green I浓度为1×SYBR Green I～5×SYBR Green I；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10-30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L。
具体的，所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml。
本发明公开了一种SMN1基因的检测方法，包括以下步骤：
将口腔拭子放入200μl TE缓冲液中涡旋震荡1min，100℃加热5min，得到待测试模板；分别将SMN1-W和SMN1-M基因连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，得到阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照；
利用LAMP技术，分别取待测试模板、阳性对照和阴性对照加入到权利要求2～7任一项所述的试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec条件下反应60个循环；然后85℃反应5min，分析曲线判断基因是否发生突变。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用LAMP技术将待测碱基位于引物3’端，同时人为的突变待测碱基相邻位置的碱基，从而使DNA聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了Bst DNA Polymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；
(2)本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，因此，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放DNA即可作为模板进行扩增，不需采集血液标本；
(3)本发明无需进行DNA提取操作，口腔拭子经过煮沸即可作为模板，结合冷冻干燥技术，整个检测过程只需加入少量的口腔拭子粗提液和反应缓冲液即可，极大的简化了操作步骤；
(4)本发明的检测方法能够快速筛选出SMN1纯合缺失的病人，并且对检测设备没有特殊要求，仅需一台水浴锅或其他能够提供恒温条件的设备和一台蓝光灯即可。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测点突变示意图，A：野生型引物可以扩增野生型模板；B：突变型引物不能扩增野生型模板；C：野生型引物不能扩增突变型模板；D：突变型引物可以扩增突变型模板。
图2是实施例1的检测结果图，曲线A：A-F3-W扩增SMN1-W；曲线B：A-F3-M扩增SMN1-M；曲线C：A-F3-M扩增待测样品。
图3是实施例2的检测结果图，曲线A：B-B3-W扩增SMN1-W；曲线B：B-B3-M扩增SMN1-M；曲线C：B-B3-M扩增待测样品。
图4是实施例3的检测结果图，曲线A：C-FIP-W扩增SMN1-W；曲线B：C-FIP-M扩增SMN1-M；曲线C：C-FIP-M扩增待测样品。
图5是实施例4的检测结果图，曲线A：D-BIP-W扩增SMN1-W；曲线B：D-BIP-M扩增SMN1-M；曲线C：D-BIP-M扩增待测样品。
图6是对比例1的检测结果图，曲线A：A-F3-W扩增SMN1-W；曲线B：A-F3-M扩增SMN1-M；曲线C：A-F3-M扩增待测样品。
图7是实施例6的检测结果图，曲线A：A-F3-W扩增SMN1-W；曲线B：A-F3-M扩增SMN1-M；曲线C：A-F3-M扩增待测样品。
图8是实施例7的检测结果图，曲线A：A-F3-W扩增SMN1-W；曲线B：A-F3-W扩增SMN1-M；曲线C：A-F3-M扩增SMN1-W；曲线D：A-F3-M扩增SMN1-M；曲线E：A-F3-W扩增待测样品；曲线F：A-F3-M扩增待测样品。
图9是实施例8的检测结果图，曲线A：A-F3-W扩增SMN1-W；曲线B：A-F3-M扩增SMN1-M；曲线C：A-F3-M扩增待测样品；曲线D：A-F3-W扩增SMN1-M；曲线E：A-F3-M扩增SMN1-W；曲线F：A-F3-W扩增待测样品。
具体实施方式
本发明中用于检测未反生突变的扩增引物称为野生型引物，用W表示，用于检测发生突变的扩增引物称为突变型引物，用M表示，如F3-W表示检测SMA基因野生型引物，F3-M表示检测SMA突变型引物。辅助突变碱基在野生型引物和突变型引物中均存在，且为同一碱基，可以是除本身碱基以外的其他三种碱基，如本身为A，则可以是T、C或G。
图1所示为本发明的检测方法的检测点突变示意图。本发明通过对待测位点相邻碱基在设计引物的过程中对扩增引物进行人为突变，并确保待测碱基在辅助突变引物的3’末端，辅助突变碱基在辅助突变引物3’端第二个碱基上，得到的引物在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例公开的试剂盒包括：Bst DNA Polymerase、dNTP、引物组、缓冲液、指示剂和添加剂；其中，Bst DNA Polymerase为0.32U/μl，dNTP为1.4mmol/L，缓冲液由20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、50mmol/L KCl、质量份数为0.1％的Tween-20、8mmol/LMgSO4组成，指示剂为2×SYBR Green I，添加剂由0.1mol/L海藻糖和0.5mg/ml BSA组成。
本实施例的引物组为A组，包括引物A-F3-W、A-F3-M、A-B3、A-FIP、A-BIP、A-LF和A-LB：
A-F3-W：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
A-F3-M：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
A-B3：5’-CTAGTAGGGATGTAGATTAACC-3’；
A-FIP:5’-AAAGTAAGATTCACTTTCATAATGCTGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGT-3’；
A-BIP:5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAGGCATCAAAATTCTTTAATATT-3’；
A-LF：5’-GACTTACTCCTTAATTTAAGGAAT-3’；
A-LB：5’-GTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAA-3’；
该引物组中，F3-W、F3-M、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
使用本实施例的试剂盒检测SMN1基因，具体包括：
制备DNA模板：将口腔拭子放入TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)中涡旋震荡1min，100℃加热5min，取5μl作为待测试模板。
分别将SMN1-W和SMN1-M连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，即为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照。
利用LAMP技术，分别取5μl待测试模板、5μl阳性对照和5μl阴性对照加入到试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec(采集荧光)，共反应60个循环；然后85℃反应5min，荧光通道选择SYBR Green I，通过曲线判断样品基因是否发生突变。
本实施例的检测结果如图2所示，从图2可以看出，A-F3-W(曲线A)能够特异性扩增SMN1-W，而A-F3-M(曲线B)则特异性扩增SMN1-M，待测样品(曲线C)结果显示其基因型为纯合突变。
实施例2
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为B组，包括引物B-F3、B-B3-W、B-B3-M、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB：
B-F3：5’-CCTTAACTGCAGCCTAATAAT-3’；
B-B3-W：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
B-B3-M：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
B-FIP:5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTTTACGGATAACTTTTAAAGTACATTAA-3’；
B-BIP:5’-CATCCATATAAAGCTATCTATATACCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGTT-3’；
B-LF：5’-CAACAAAATATGATCAGAAATTAA-3’；
B-LB：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
该引物组中，F3、B3-W、B3-M的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测方法与实施例1相同，其结果如图3所示，从图3可以看出，B-B3-W(曲线A)能够特异性扩增SMN1-W，而B-B3-M(曲线B)则特异性扩增SMN1-M，待测样品(曲线C)结果显示其基因型为纯合突变。
实施例3
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为C组，包括引物C-F3、C-B3、C-FIP-W、C-FIP-M、C-BIP、C-LF和C-LB：
C-F3：5’-CTATGTCTATATAGCTATTTTTTTT-3’；
C-B3：5’-TGATTGTTTTACATTAACCTTTCA-3’；
C-FIP-W:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
C-FIP-M:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
C-BIP:5’-ATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAATTAACATCTGAACTTTTTAAATGTT-3’；
C-LF：5’-GCACCTTCCTTCTTTTTGATTT-3’；
C-LB：5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTT-3’；
该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测方法与实施例1相同，其结果如图4所示，从图4可以看出，C-FIP-W(曲线A)能够特异性扩增SMN1-W，而C-FIP-M(曲线B)则特异性扩增SMN1-M，待测样品(曲线C)结果显示其基因型为纯合突变。
实施例4
本实施例的试剂盒与实施例1的区别在于：引物组为D组，包括引物D-F3、D-B3、D-FIP、D-BIP-W、D-BIP-M、D-LF和D-LB：
D-F3：5’-AGTACATTAAAAGACTATCAACTT-3’；
D-B3：5’-ACTCCTTAATTTAAGGAATGTGA-3’；
D-FIP:5’-ATATAGATAGCTTTATATGGATGTTATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAA-3’；
D-BIP-W:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
D-BIP-M:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
D-LF：5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTT-3’；
D-LB：5’-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGG-3’；
该引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP、BIP-W、BIP-M的浓度相同，为1.6μmol/L。
本实施例的检测方法与实施例1相同，其结果如图5所示，从图5可以看出，D-BIP-W(曲线A)能够特异性扩增SMN1-W，而D-BIP-M(曲线B)则特异性扩增SMN1-M，待测样品(曲线C)结果显示其基因型为纯合突变。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.1mol/L海藻糖。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图6所示。单独使用0.1mol/L海藻糖作为添加剂的时候，虽然也能够完成特异性的检测工作，但是扩增效率较实施例1有明显下降。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.5mg/ml BSA。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图7所示。单独使用0.5mg/ml BSA作为添加剂的时候，虽然也能够完成特异性的检测工作，但是扩增效率较实施例1有明显下降。
综合实施例1、对比例1与对比例2的检测结果可以看出，在单独使用海藻糖和BSA的时候对反应均轻微的抑制作用。但是，当海藻糖和BSA联合使用的时候未表现出抑制作用。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，A组中引物F3无辅助突变碱基，其余引物与实施例1相同，即：
A-F3-W:5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3’；
A-F3-M:5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTT-3’；
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图8所示。可以看出，没有辅助突变碱基的引物完全不能区分野生型和突变型，根据该组引物的检测结果判断待测样品的基因型则为携带者；当辅助突变碱基与待测位点相邻时，野生型引物仅扩增野生型模板，突变型引物仅扩增突变型模板，可以显著区分野生型和突变型。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，A组中引物F3中辅助突变碱基的位置为：
A-F3-W:5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTVTC-3’；
A-F3-M:5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTVTT-3’；
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图9所示。可以看出，当辅助突变碱基与待测位点相隔1～2个碱基的时候，野生型引物对突变型模板的扩增效率有明显降低，但体现在时间间隔上仅有5～10min，不利于区分两种基因型。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>一种 SMN1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
<160>
<210> 1
<211> 24
<212> A-F3-W
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3'
<210> 2
<211> 24
<212> A-F3-M
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3'
<210> 3
<211> 22
<212> A-B3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CTAGTAGGGATGTAGATTAACC-3'
<210> 4
<211> 50
<212> A-FIP
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AAAGTAAGATTCACTTTCATAATGCTGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGT-3'
<210> 5
<211> 48
<212> A-BIP
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAGGCATCAAAATTCTTTAATATT-3'
<210> 6
<211> 24
<212> A-LF
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GACTTACTCCTTAATTTAAGGAAT-3'
<210> 7
<211> 23
<212> A-LB
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAA-3'
<210> 8
<211> 21
<212> B-F3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CCTTAACTGCAGCCTAATAAT-3'
<210> 9
<211> 22
<212> B-B3-W
<213> DNA
<220>
<400>
5'-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3'
<210> 10
<211> 22
<212> B-B3-M
<213> DNA
<220>
<400>
5'-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3'
<210> 11
<211> 49
<212> B-FIP
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCATTTTGTTTCACAAGACATTTTACGGATAACTTTTAAAGTACATTAA-3'
<210> 12
<211> 48
<212> B-BIP
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CATCCATATAAAGCTATCTATATACCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGTT-3'
<210> 13
<211> 24
<212> B-LF
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CAACAAAATATGATCAGAAATTAA-3'
<210> 14
<211> 23
<212> B-LB
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3'
<210> 15
<211> 25
<212> C-F3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CTATGTCTATATAGCTATTTTTTTT-3'
<210> 16
<211> 24
<212> C-B3
<213> DNA
<220>
<400>
5'-TGATTGTTTTACATTAACCTTTCA-3'
<210> 17
<211> 44
<212> C-FIP-W
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3'
<210> 18
<211> 44
<212> C-FIP-M
<220>
<400>
5'-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3'
<210> 19
<211> 51
<212> C-BIP
<220>
<400>
5'-ATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAATTAACATCTGAACTTTTTAAATGTT-3'
<210> 20
<211> 22
<212> C-LF
<220>
<400>
5'-GCACCTTCCTTCTTTTTGATTT-3'
<210> 21
<211> 23
<212> C-LB
<220>
<400>
5'-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTT-3'
<210> 22
<211> 24
<212> D-F3
<220>
<400>
5'-AGTACATTAAAAGACTATCAACTT-3'
<210> 23
<211> 23
<212> D-B3
<220>
<400>
5'-ACTCCTTAATTTAAGGAATGTGA-3'
<210> 24
<211> 51
<212> D-FIP
<220>
<400>
5'-ATATAGATAGCTTTATATGGATGTTATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAA-3'
<210> 25
<211> 48
<212> D-BIP-W
<220>
<400>
5'-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3'
<210> 26
<211> 48
<212> D-BIP-M
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3'
<210> 27
<211> 23
<212> D-LF
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCATTTTGTTTCACAAGACATTT-3'
<210> 28
<211> 22
<212> D-LB
<213> DNA
<220>
<400>
5'-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGG-3'
<210> 29
<211> 589
<212> SMN1-W
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTCATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAGCTTTAGGATAT-3'
<210> 30
<211> 589
<212> SMN1-M
<213> DNA
<220>
<400>
5'-AAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTCATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAGCTTTAGGATAT-3'
Claims (8)
1.一种SMN1基因检测的引物组，其特征在于，该引物组为以下A、B、C、D四组中的任一种；
所述的A组包括引物A-F3-W、A-F3-M、A-B3、A-FIP、A-BIP、A-LF和A-LB：
A-F3-W：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
A-F3-M：5’-CCTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
A-B3：5’-CTAGTAGGGATGTAGATTAACC-3’；
A-FIP:5’-AAAGTAAGATTCACTTTCATAATGCTGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGT-3’；
A-BIP:5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAGGCATCAAAATTCTTTAATATT-3’；
A-LF：5’-GACTTACTCCTTAATTTAAGGAAT-3’；
A-LB：5’-GTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAA-3’；
所述的B组包括引物B-F3、B-B3-W、B-B3-M、B-FIP、B-BIP、B-LF和B-LB：
B-F3：5’-CCTTAACTGCAGCCTAATAAT-3’；
B-B3-W：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
B-B3-M：5’-TCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
B-FIP:5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTTTACGGATAACTTTTAAAGTACATTAA-3’；
B-BIP:5’-CATCCATATAAAGCTATCTATATACCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGTT-3’；
B-LF：5’-CAACAAAATATGATCAGAAATTAA-3’；
B-LB：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
所述的C组包括引物C-F3、C-B3、C-FIP-W、C-FIP-M、C-BIP、C-LF和C-LB：
C-F3：5’-CTATGTCTATATAGCTATTTTTTTT-3’；
C-B3：5’-TGATTGTTTTACATTAACCTTTCA-3’；
C-FIP-W:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVC-3’；
C-FIP-M:5’-GCTGGCAGACTTACTCCTTAATTTTATTTTCCTTACAGGGTTVT-3’；
C-BIP:5’-ATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAATTAACATCTGAACTTTTTAAATGTT-3’；
C-LF：5’-GCACCTTCCTTCTTTTTGATTT-3’；
C-LB：5’-GGTTTGTGGAAAACAAATGTTTT-3’；
所述的D组包括引物D-F3、D-B3、D-FIP、D-BIP-W、D-BIP-M、D-LF和D-LB：
D-F3：5’-AGTACATTAAAAGACTATCAACTT-3’；
D-B3：5’-ACTCCTTAATTTAAGGAATGTGA-3’；
D-FIP:5’-ATATAGATAGCTTTATATGGATGTTATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAA-3’；
D-BIP-W:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVG-3’；
D-BIP-M:5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCVA-3’；
D-LF：5’-GCATTTTGTTTCACAAGACATTT-3’；
D-LB：5’-CTTCCTTTATTTTCCTTACAGG-3’。
2.一种SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括Bst DNAPolymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；
所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；
所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
4.如权利要求3所述的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的A组中，引物A-F3-W、A-F3-M、A-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，A-LF、A-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，A-FIP、A-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的B组中，B-F3、B-B3-W、B-B3-M浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，B-LF、B-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，B-FIP、B-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的C组中，C-F3、C-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，C-LF、C-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，C-FIP-W、C-FIP-M、C-BIP浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；
所述的D组中，D-F3、D-B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，D-LF、D-LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，D-FIP、D-BIP-W、D-BIP-M浓度相同，为1.6～3.2μmol/L。
5.如权利要求3所述的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的Bst DNAPolymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；
所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％。
6.如权利要求3所述的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的SYBR Green I浓度为1×SYBR Green I～5×SYBR Green I；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10-30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L。
7.如权利要求3所述的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml。
8.一种SMN1基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将口腔拭子放入200μl TE缓冲液中涡旋震荡1min，100℃加热5min，得到待测试模板；分别将SMN1-W和SMN1-M基因连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，作为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照；
利用LAMP技术，分别取待测试模板、阳性对照和阴性对照加入到权利要求2～7任一项所述的试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec条件下反应60个循环；然后85℃反应5min，分析曲线判断基因是否发生突变。
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