CN102994640A - 一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测VEGFR2 mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定VEGFR2基因表达量。本发明所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择血管生成抑制剂靶向药物(舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗等)进行治疗。

Description

一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。

背景技术

血管生成是实体瘤细胞生长和转移的必要条件，抑制肿瘤细胞诱导的血管生成已成为近年来寻找新型抗肿瘤药物的重要研究方向。血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）是抗血管生成靶向治疗的主要靶标。抗血管生成药物作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞诱导的血管生成来达到阻止肿瘤的生长、转移和复发的目的。目前经FDA批准的此类药物包括舒尼替尼、索拉非尼和贝伐单抗等。贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin)是一种重组的人类单克隆IgG1抗体，通过抑制人类血管内皮生长因子VEGF的生物学活性，而阻断肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤细胞的生长。2004年经美国FDA批准后，用于结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤的治疗。

VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor，血管内皮生长因子受体)，迄今已发现的VEGF信号转导的主要受体包括fms样酪氨酸激酶VEGFR-1，即Flt-1(Fms-like tyrosine)，胎儿肝激酶插入区受体VEGFR-2，即KDR/Flk-1(Kinase insert domain-containing receptor)和VEGFR-3(Flt-4)，三者均具有酪氨酸活性，此外还有一些相关受体，如神经纤维网蛋白 (Neuropilin-1,2,NRP-1,2) 等非激酶受体。大量研究证明，VEGFR在正常人体组织中呈低水平表达，而在绝大多数肿瘤中呈现高表达，且VEGF受体不仅表达于血管内皮细胞,还表达于肿瘤细胞，故认为除旁分泌外,还存在自分泌途径。它不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖，且诱导肿瘤血管增生，并促使其肿瘤细胞生长转移 (Harada Y, etal. Int J Clin Oncol. 2001 Oct;6(5):221-8) 。

临床研究表明，VEGFR2 (或称KDR) mRNA表达水平检测对结直肠癌患者接受靶向治疗具有明显的指导意义，VEGFR2 低表达的患者中位无进展生存期较短 (AB El-Khoueiry AP et al. J Clin Oncol.2009;27:15s. ) 。因此，对 VEGFR2 表达量实时、准确、定量地检测，有利于临床医生及时、准确、合理的制定个体化治疗方案。

荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中VEGFR2 mRNA的表达量，用于临床医生对血管生成抑制剂靶向药物 (舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗等)的合理化使用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测 VEGFR2 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，能简单快速、准确可靠的检测VEGFR2基因。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成部分：

（1）VEGFR2基因标准品：含有VEGFR2基因编码序列的重组载体，所述VEGFR2基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照B2M基因标准品：含有B2M基因编码序列的重组载体，所述B2M基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3’（SEQ ID NO.3）；

VEGFR2-下游引物：5’- ATCTGGGGTGGGACATACAC -3’（SEQ ID NO.4）；

（4）检测B2M基因的上、下游引物：

B2M-上游引物：5’- CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’（SEQ ID NO.5）；

B2M-下游引物：5’- TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3’（SEQ ID NO.6）。

进一步，所述含有VEGFR2基因编码序列的重组载体和含有B2M基因编码序列的重组载体的空载体均采用pUC57载体；

进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶中。

所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5×逆转录缓冲液 (有浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4 mmol/L的MgCl2和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成) 等；所述逆转录引物 Oligo-(dT) 为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述 dNTPs 溶液为 dATP (脱氧腺苷三磷酸) 的混合水溶液；所述定量 PCR 缓冲液为常规定量 PCR 缓冲液，如5×定量 PCR 缓冲液 (由浓度为10mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L 的 KCl 和浓度为2 mmol/L的 MgCl2 组成) 等。

本发明还提供了基于上述试剂盒检测VEGFR2 mRNA基因表达量的方法，包括以下步骤：

（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的VEGFR2和内对照B2M基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的VEGFR2基因标准品为模板，加入内对照B2M基因标准品，检测VEGFR2基因的上、下游引物，检测内对照B2M基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

（4）由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的VEGFR2和内对照B2M基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制VEGFR2和内对照B2M基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的VEGFR2基因和内对照B2M基因的初始拷贝数进行定量，从标准曲线上读取其含有的VEGFR2基因和内对照B2M基因的初始拷贝数。

进一步，所述步骤（3）的PCR扩增条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共38个循环。

本发明的定量PCR检测试剂盒由于选择了合适的引物，制备了合适的VEGFR2基因标准品和内对照B2M基因标准品，能够灵敏、特异、准确地同时检测VEGFR2基因，适用于临床上对血管生成抑制剂靶向药物 (舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗等)疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。

附图说明

图1 为本发明中VEGFR2基因的标准曲线；

图2为本发明中B2M基因的标准曲线；

图3为本发明中VEGFR2基因和B2M基因的溶解曲线；

图4为本发明中VEGFR2基因的扩增曲线；

图5为本发明中B2M基因的扩增曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、VEGFR2基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置

本实施例的VEGFR2基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分：

1) VEGFR2基因标准品：含有VEGFR2基因编码序列( GeneBank编号为NM_002253.2) 的重组pUC57载体；

2) 内对照B2M基因标准品：含有B2M基因编码序列 (GeneBank 编号为NM_004048.2) 的重组pUC57载体；

3) 检测VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA-3’（SEQ ID NO.3）

VEGFR2-下游引物：5’- ATCTGGGGTGGGACATACAC-3’（SEQ ID NO.4）；

4) 检测内对照B2M 基因的上、下游引物：

B2M -上游引物：5’- CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA-3’（SEQ ID NO.5）

B2M -下游引物：5’- TTCATCCAATCCAAATGCGGC-3’（SEQ ID NO.6）；

5) 5×逆转录缓冲液，浓度为10pmol/μl的逆转录引物Oligo-(dT)16，浓度为20pmol/μl的dNTPs溶液，浓度为10U/μl的M-MLV逆转录酶，5×定量PCR缓冲液，浓度为2U/μl的TaqDNA聚合酶。

其中，VEGFR2和内对照B2M基因标准品由以下方法制得：

a) 直接合成获得含有VEGFR2和B2M基因编码序列的片段DNA；

b) 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至pGET载体进行连接；

c) 连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆；

d) 提取重组质粒，即得分别含有VEGFR2和B2M基因编码序列的重组pGET载体。

除了pGET载体外，其它载体如pBU18等也可用于构建含有VEGFR2和B2M基因编码序列的重组载体，都可以达到本发明目的。

此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。

二、VEGFR2基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测

本实施例的VEGFR2基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1) 从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度；

(2) 将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表1所示：

表1

(3) 逆转录条件为：37^oC孵育1小时，再95^oC变性3分钟；

(4) 分别将已知拷贝数的VEGFR2和内对照B2M基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

(5) 分别以步骤 (1) 所得待测cDNA及步骤 (4) 所得倍比稀释的VEGFR2基因标准品为模板，进行荧光定量PCR；

(6) PCR体系如表2所示：

表2

(7) PCR条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共38个循环 (PCR条件可根据使用的荧光定量PCR仪略做调整) ；在每个循环结束时进行荧光检测；

(8) 模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释的VEGFR2和内对照B2M基因标准品的循环阈值与初始拷贝数，用荧光定量PCR仪工作软件分别绘制VEGFR2和内对照B2M基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的VEGFR2和内对照B2M基因的初始拷贝数。

采用本发明试剂盒及其检测方法，能够灵敏、特异、准确地检测VEGFR2基因表达量，指导临床对血管生成抑制剂靶向药物 (舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗等)的合理使用。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  周宏灏

<120>  一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  81

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  1

actgtcatcc ttaccaatcc catggcttgg gcctagatgt atcagtccat tgcctcaaat     60

ggtgcatgtc ccaccccaga t                                               81

 

<210>  2

<211>  81

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  2

ccaagatagt taagtgggat cgagaaggtg ttcgatcctg acgtacctca acgagctagc     60

gccgcatttg gattggatga a                                               81

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  3

actgtcatcc ttaccaatcc ca                                              22

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  智人

 

<400>  4

atctggggtg ggacatacac                                                 20

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  5

ccaagatagt taagtgggat cgaga                                           25

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  6

ttcatccaat ccaaatgcgg c                                               21

 

 

Claims (5)

1.一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成部分：

（1） VEGFR2基因标准品：含有VEGFR2基因编码序列的重组载体，所述VEGFR2基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照B2M基因标准品：含有B2M基因编码序列的重组载体，所述B2M基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3’；

VEGFR2-下游引物：5’- ATCTGGGGTGGGACATACAC -3’；

（4）检测B2M基因的上、下游引物：

B2M-上游引物：5’- CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’；

B2M-下游引物：5’- TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述含有VEGFR2基因编码序列的重组载体和含有B2M基因编码序列的重组载体中的空载体均为pUC57载体。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。

4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测VEGFR2 mRNA基因表达量的方法，包括如下步骤：

（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的VEGFR2和内对照B2M基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的VEGFR2基因标准品为模板，加入内对照B2M基因标准品，检测VEGFR2基因的上、下游引物，检测内对照B2M基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

（4）根据倍比稀释的VEGFR2和内对照B2M基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制VEGFR2和内对照B2M基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的VEGFR2基因和内对照B2M基因的初始拷贝数。

5.根据权利要求 4 所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的PCR扩增条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共38个循环。

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