CN108949981A - 利用实时荧光定量pcr检测vegfr2基因相对表达量的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用实时荧光定量PCR检测VEGFR2基因相对表达量的试剂盒，包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括检测目的基因用上下游引物VEGFR2‑F、VEGFR2‑R以及探针VEGFR2‑Probe，检测内参基因β‑actin引物β‑actin‑F，β‑actin‑R及探针β‑actin‑Probe。本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β‑actin和目的基因VEGFR2的定量标准曲线，可检测受测者体内VEGFR2的相对于内参基因的表达水平。

Description

利用实时荧光定量PCR检测VEGFR2基因相对表达量的试剂盒

技术领域

本专利涉及一种临床检验用途的基因相对表达量的检测试剂盒，采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术，用于检测肿瘤患者体内VEGFR2基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

肿瘤新生血管生成是人体肿瘤生长和转移的必要条件。血管内皮细胞生长因子及其受体与血管生成、肿瘤侵袭、复发与转移有密切关系。VEGFR通过与胞外特异抗体结合，介导细胞内酪氨酸激酶磷酸化而发生的一系列生理功能，激活下游AKT，ERK等通路，促进肿瘤发生发展。迄今为止，已发现两种信号转导途径的VEGF受体：酪氨酸激酶受体和非酪氨酸激酶受体。前者包括血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1，Flt-1)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2，KDR)及血管内皮生长因子受体-3(VEGFR3)，后者包括肝素样分子、神经纤毛蛋白-1受体和神经纤毛蛋白2受体。研究证实，VEGFR2在VEGF的信号转导及血管内皮生成中起主导作用。因此，VEGFR2成为当前抗肿瘤血管生成研究中的热点。

VEGFR2作为一种酪氨酸激酶受体，由一个胞外结构域，一个跨膜结构域和一个胞质内酪氨酸激酶结构域组成，其胞外结构域含7个免疫球蛋白样袢。研究证实，VEGFR2胞外段是VEGFR2与其配体VEGF相结合的部位，VEGFR2与VEGF结合，形成二聚体及酪氨酸发生自身磷酸化，激活并将反应信号传递到细胞核，可引发内皮细胞的一系列变化，包括钙离子内流、IP3的增加、VonWillebrand因子的释放以及胎儿血管内皮金属蛋白酶、凝血酶的产生、诱导整合素的表达、调节与纤维蛋白溶解和凝固相关的因子在内皮上的表达，如Vwf、组织因子。这些级联反应通过抗凋亡等机制调节内皮细胞的存活，促进新生血管形成并维持其完整性。另外，VEGF刺激VEGFR2，介导肿瘤血管内皮细胞DNA合成和增殖。VEGF诱导内皮细胞的增殖、迁移。此外，VEGFR2还参与由VEGF介导的血管通透性改变。

临床研究表明，VEGFR2mRNA表达水平检测对患者接受靶向治疗有明显的指导意义。VEGFR2和VEGFR3基因表达水平高的患者的中位无进展期较长，而VEGFR2基因表达水平低的患者中位无进展期较短。如图1所示，针对VEGF/VEGFR2信号转导通路的抗肿瘤策略，肿瘤特有的微环境刺激VEGF和VEGFR2在肿瘤细胞和肿瘤周围内皮细胞特异性表达，使之较正常组织中VEGF和VEGFR2的表达明显增加。而很多抗肿瘤药物特别是抗VEGFR2抗体，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)、奥曲肽、干扰素、中草药及其衍生物等也具有抑制VEGF、抗血管生成的作用。这提示，通过阻止VEGF/VEGFR2信号转导通路抑制肿瘤新生血管生成是一种有效的抗癌治疗方案。

贝伐单抗，即阿瓦斯汀(Bevacizumab，Avastin)是重组的人源化单克隆抗体。2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。通过体内、体外检测系统证实IgG1抗体能与人血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断其生物活性。而阿瓦斯汀包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区。可结合VEGF并防止其与内皮细胞表面的受体(Flt-1和KDR)结合。在体外血管生成模型上，VEGF与其相应的受体结合可导致内皮细胞增殖和新生血管形成。在接种了结肠癌的裸(无胸腺)鼠模型上，使用阿瓦斯汀可减少微血管生成并抑制转移病灶进展。因此，可以根据对VEGFR2表达量的检测选择有效的治疗方式和合适的针对性药物，对疾病发生早期的治疗来说十分重要，但是由于对这类疾病缺乏足够认识，许多患者丧失最佳治疗时机。故VEGFR2基因检测项目的开展有利于疾病的早期诊断和治疗，对肿瘤治疗有着重要的意义。

目前临床上已经将VEGFR2基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对VEGFR2基因mRNA含量进行检测。

RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足VEGFR2基因mRNA含量的检测，进而选择有效的治疗方式和合适的针对性药物，有利于研究用药前和用药后VEGFR表达水平对抗肿瘤药物效用的影响，便于抗肿瘤药物的开发。被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于VEGFR2的基因检测。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因的引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因VEGFR2两种类型的定量标准曲线，检测VEGFR2相对于内参基因的表达水平。试剂盒通过调整两个基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

利用实时荧光定量PCR检测VEGFR2基因相对表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：

(1)检测目的基因用上下游引物VEGFR2-F、VEGFR2-R以及探针VEGFR2-Probe，其序列如下：

VEGFR2-F：CTGAGCAGGAGAGCGTGTCTT

VEGFR2-R：ATGGATTGGCAGAGGCTGTG

VEGFR2-Probe：FAM-TGGTGCACTGCAGACAGATCTACGTTTGA–TAMRA；

(2)检测内参基因β-actin的上下游引物β-actin-F、β-actin-R以及探针β-actin-Probe，其序列如下：

β-actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

β-actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

β-actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。

进一步地，所述RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇；所述逆转录试剂包括TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit。

检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物VEGFR2-F、VEGFR2-R以及探针VEGFR2-Probe，检测内参基因β-actin引物β-actin-F，β-actin-R及探针β-actin-Probe。

进一步地，所述阳性对照品分别为含有对应VEGFR2基因的溶液；所述阴性对照品为无对应VEGFR2基因的溶液。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因VEGFR2的定量标准曲线，检测受测者体内VEGFR2的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于检测人类肿瘤患者体内VEGFR2基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

附图说明

图1是VEGFR2及抗VEGFR2抗体作用机理。

图2是以正常人血液cDNA为模板检测VEGFR2制成的标准图。

图3是以正常人血液cDNA为模板检测VEGFR2制成的的扩增曲线图。

图4是以正常人血液cDNA为模板检测β-actin制成的标准图。

图5是以正常人血液cDNA为模板检测β-actin制成的的扩增曲线图。

图6是以正常人血液cDNA为模板检测VEGFR2与对应β-actin的表达曲线。

图7是以正常人组织cDNA为模板检测VEGFR2与对应β-actin的表达曲线1。

图8是以正常人组织cDNA为模板检测VEGFR2与对应β-actin的表达曲线2。

具体实施方式

实施例1

本试剂盒用于辅助临床上人类肿瘤的早期预防、早期诊断以及预后的辅助性指标；还可对对高危人群进行较为准确的筛查。试剂盒包括：

1.组织RNA抽提试剂；

2.血液RNA抽提试剂；

3.RNA反转录试剂

4.检测体系PCR反应液；

5.阳性对照品和阴性对照品。

其中，组织和血液RNA抽提试剂以及RNA反转录试剂可购自TOYOBO公司相关试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR反应液：ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)；TH NDERBIRDProbe qPCR Mix(2×)、VEGFR2上、下游引物、VEGFR2探针；β-actin上、下游引物、β-actin-probe探针；其中引物与探针序列为：

VEGFR2-F：CTGAGCAGGAGAGCGTGTCTT

VEGFR2-R：ATGGATTGGCAGAGGCTGTG

VEGFR2-Probe：FAM-TGGTGCACTGCAGACAGATCTACGTTTGA

-TAMRA

β-actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

β-actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

β-actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA

进一步地，所述阳性对照品分别为含有对应VEGFR2基因的溶液；所述阴性对照品为无对应VEGFR2基因的溶液。

实施例2

本方法的操作流程：

1.RNA的制备(石蜡)。提取步骤如下：

1.1切去组织或者石蜡片样本于1.5ml离心管中(刮拭)

1.2加入1ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心1min

1.3去除上清加入500ml组织透明液振荡混匀后13000rpm离心1min

1.4去除上清，加入1ml无水乙醇振荡混匀后13000rpm离心1min

1.5去除上清后至于37度金属浴10min(开盖)，直至液体干燥

1.6加入150ulbuffer PKD(来自RNeasy FFPE KIT)振荡混匀1000rpm 1min

1.7加入10ulPK(来自RNeasy FFPE KIT)上下颠倒混匀

1.8在56℃金属浴15min，后80℃金属浴15min

1.9冰上放置3min后，13200rpm15min

1.10吸取上清至新的1.5毫升离心管，加入DNase Booster buffer(来自RNeasyFFPE KIT)16ul和DNase1(来自RNeasy FFPE KIT)10ul振荡混匀后低速离心，室温静置15min。

1.12加入320ulbuffer RBC(来自RNeasy FFPE KIT)混匀后加入720ul无水乙醇混匀

1.13向层析柱(来自RNeasy FFPE KIT)内加入700ul前一步液体，10000rpm15S，弃去管中液体

1.14向层析柱内加入剩下液体，10000rpm 15S，弃去管中液体

1.15向层析柱内加入500ul buffer RPE(来自RNeasy FFPE KIT)，10000rpm 15S，弃去废液

1.16向层析柱内加入500ul buffer RPE，10000rpm 2min，弃去废液

1.17打开盖子，全速离心5min弃去废液

1.18向层析柱中加入30ul DEPC水，静置2min后，全速离心1min.

2.RNA的制备(血液)。提取步骤如下：

2.1去体检中心采集30个正常人的抗凝新鲜血液1ml，登记好年龄、性别。

2.2在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min。

2.3 5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞。

2.4再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞。

2.5向细胞中加入0.2ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，将5管TRIzol消化液混在1管中，

室温静止5min。

2.6加入0.2ml氯仿，震荡均匀。

2.7 14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)，

2.8加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min。

2.9 14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁。

2.10 14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇。

2.11室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水。

2.12在NanoDrop仪器上测定RNA浓度和纯度。对RNA进行定量，-70℃保存。

实施例3

1.参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

2.试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装：

X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

3.加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。

4.检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

5.结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)样本结果有效性判断标准：，Ct<38，有效结果；Ct＞38，无效结果。

实施例4

采用本发明核酸检测试剂盒检测正常人群血液标本。

取送检的血液标本30例，按实施例2和实施例3所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。

每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测15份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。

实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。如表1所示，在阴性和阳性对照无误的情况下，检测结果显示VEGFR2基因相对表达水平如下：

表1 VEGFR2基因正常外周血检测结果

通过对30例正常人(VEGFR2表达量/β-actin内参表达量)比值的统计，排除异常值，得到正常人相对表达的参考范围为4.39E-04～4.20E-02。由此得评判标准：当VEGFR2/β-actin<4.39E-04时，为低表达；当4.39E-04<VEGFR2/β-actin<4.20E-02时，为中表达；当VEGFR2/β-actin>4.20E-02时，为高表达。

实施例5

临床样品检测

取待检的胃组织样本30份，按实施例2和实施例3所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。

实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。如表1所示，在阴性和阳性对照无误的情况下，检测结果显示VEGFR2基因相对表达水平如下：

表2 VEGFR2基因胃组织检测结果

通过对30例正常人组织(VEGFR2表达量/β-actin内参表达量)比值的统计，得到正常人石蜡组织相对表达的参考范围越为2.86E-04～2.04E-03。由此得评判标准：当VEGFR2/β-actin<2.86E-04时，为低表达；当2.86E-04<VEGFR2/β-actin<2.04E-03时，为中表达；当VEGFR2/β-actin>2.04E-03时，为高表达。

序列表

<110> 济南艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 利用实时荧光定量PCR检测VEGFR2基因相对表达量的试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgagcagga gagcgtgtct t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggattggc agaggctgtg 20

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtgcactg cagacagatc tacgtttga 29

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagcgaggc tacagctt 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttgatgt cgcgcacgat tt 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (4)

1.利用实时荧光定量PCR检测VEGFR2基因相对表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂、逆转录试剂、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中检测体系PCR反应液包括：

(1)检测目的基因用上下游引物VEGFR2-F、VEGFR2-R以及探针VEGFR2-Probe，其序列如下：

VEGFR2-F：CTGAGCAGGAGAGCGTGTCTT

VEGFR2-R：ATGGATTGGCAGAGGCTGTG

VEGFR2-Probe：FAM-TGGTGCACTGCAGACAGATCTACGTTTGA–TAMRA；

(2)检测内参基因β-actin的上下游引物β-actin-F、β-actin-R以及探针β-actin-Probe，其序列如下：

β-actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

β-actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

β-actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇；所述逆转录试剂包括TOYOBO公司的ReverTraAce qPCR RT Kit。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品分别为含有对应VEGFR2基因的溶液；所述阴性对照品为无对应VEGFR2基因的溶液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR反应程序：95℃1min预变性；95℃15sec，58℃35sec，40个循环。