BR112017022779B1

BR112017022779B1 - Método para detectar uma mutação de deleção in-frame no éxon 9 do gene da calreticulina

Info

Publication number: BR112017022779B1
Application number: BR112017022779-7A
Authority: BR
Inventors: Yongbao Wang; Daniel Jones
Original assignee: Quest Diagnostics Investments Incorporated
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2024-04-30
Also published as: US10519509B2; MX2017013623A; US20200165688A1; US20160312303A1; WO2016172505A3; BR112017022779A2; EP3286336A2; WO2016172505A2; EP3286336A4; CA2983820A1; MX2022000176A; CN107949643A; HK1254254A1; US20220364180A1

Abstract

MÉTODOS PARA DETECTAR UMA MUTAÇÃO DE DELEÇÃO NO QUADRO (INDEL) NO ÉXON 9 DO GENE DA CALRETICULINA, PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA. HEMATOPOIÉTICA EM UM PACIENTE, PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE UM PACIENTE DESENVOLVER UMA MUTAÇÃO EM UM GENE DE VIA JAK-STAT, PARA DETERMINAR O PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE COM UMADOENÇA MIELOPROLIFERATIVA, KIT, E, SONDA OU INICIADOR DE OLIGONUCLEOTÍDEO. São providos aqui métodos e composições para a detecção de mutações da linha germinal de deleção no marco no gene CALR. Também são fornecidos métodos para determinar o prognóstico de doenças mieloproliferativas e a probabilidade de desenvolver mutações somáticas em genes envolvidos na via JAK-STAT.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório dos U.S. n° 62/151742, depositado em 23 de abril de 2015, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMPs) são malignidades de células-tronco hematopoiéticas clonais caracterizadas por produção excessiva de células sanguíneas. A policitemia vera (PV), a trombocitemia essencial (TE) e a mielofibrose idiopática (MF) são as três NMPs mais comuns BCR/ABL1-negativas e estão associadas a trombose e hemorragia, esplenomegalia e risco de transformação para leucemia mieloide aguda.

[003] A classificação das neoplasias mieloproliferativas (NMP) se concentrou em translocações e mutações específicas definidoras de doenças, mutuamente exclusivas, nos principais genes reguladores de crescimento. Algumas dessas alterações genéticas estão fortemente associadas a entidades previamente definidas clinicamente, como o rearranjo de BCR-ABL1 em leucemia mieloide crônica (LMC) e mutações do éxon 12 de JAK2 em policitemia vera (PV). Outras mutações, como JAK2 V617F, mutações do gene da leucemia mieloproliferativa (LMP) e mutações do receptor do fator 3 estimulante de colônia (CSF3R), também foram encontradas associadas a NMP (Cazzola et al. Blood 2014 Jun 12;123(24):3714-9).

[004] As mutações somáticas no gene da chaperona calreticulina (CALR) foram identificadas em trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) e são essencialmente mutuamente exclusivas com mutações JAK2 e MPL (Klampfl et al. N Engl J Med 2013 Dec 19;369(25):2379-90; Lundberg et al. Blood 2014 Apr 3;123(14):2220-8; Nangalia et al. N Engl J Med 2013 Dec 19;369(25):2391-405; Tefferi et al. Leukemia 2014 Jul;28(7):1568-70; Vannucchi et al. Leukemia 2014 Sep;28(9):1811-8). Essas mutações CALR estão localizadas no éxon 9 do gene da CALR e são em grande parte específicas para TE e MFP, sendo encontradas raramente em casos de mielodisplasia. As proteínas CALR normais e mutantes podem afetar diferencialmente o tráfego subcelular de componentes de sinalização JAK- STAT (Rampal et al. Blood 2014 May 29;123(22):e123-e133). As duas mutações CALR associadas a doenças mais comuns em TE e MFP são uma deleção de 52 pares de bases (pb) no códon 367 (tipo 1) e uma inserção TTGTC de 5 pb no códon 385 (tipo 2). Ambos produzem um deslocamento do quadro de leitura de +1 pb que gera novas sequências de proteína C- terminal com um deslocamento de resíduos de aminoácidos ácidos para básicos, o que se acredita que afeta a atividade de chaperonas (Rizvi et al. Mol Cell 2004 Sep 24;15(6):913-23). Outras mutações de deslocamento do quadro de leitura de +1 pb (tipos 3-30) e 3 deleções in-frame no éxon 9 (Ensembl TMP_ESP_19_13054649 E393_E395del3 e TMP_ESP_19_13054685 e COSM3355757 (p.E405_D408) também foram descritas (Klampfl et al. N Engl J Med 2013 Dec 19;369(25):2379-90).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para detectar mutações de deleção in-frame (indel) no éxon 9 do gene da CALR. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada dentre deleção p.E381_A382>A, uma deleção p.D397_D400>D e uma deleção p.E405_V409>V. Os métodos de detecção podem ser utilizados, por exemplo, para o diagnóstico de uma doença mieloproliferativa, determinar a probabilidade de desenvolver uma doença mieloproliferativa, determinar o prognóstico de uma doença mieloproliferativa, monitorar uma doença mieloproliferativa, selecionar um indivíduo para tratamento de uma doença mieloproliferativa e/ou determinar a probabilidade de ter ou desenvolver uma mutação em um gene adicional associado a uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a detecção de uma ou mais mutações adicionais associadas a uma doença mieloproliferativa.

[006] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para detectar uma mutação de deleção in-frame (Indel) no éxon 9 do gene da calreticulina (CALR), que compreendem: realizar um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra de paciente para detectar uma mutação de éxon 9 Indel de CALR, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V. Em algumas modalidades, a mutação de deleção in-frame corresponde a uma deleção genômica selecionada dentre chr19:g.13054615_13054617, chr19:g.13054664_13054672, e chr19:g.13054687_13054698.

[007] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para detectar uma mutação de deleção in-frame (Indel) no éxon 9 do gene da calreticulina (CALR) em um indivíduo, onde o indivíduo é suspeito de ter uma doença relacionada à CALR ou uma doença ou condição relacionada ao JAK2. Em algumas modalidades, a doença ou condição relacionada à CALR ou relacionada ao JAK2 é uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a doença mieloproliferativa é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V. Em algumas modalidades, a mutação de deleção in-frame corresponde a uma deleção genômica selecionada dentre chr19:g.13054615_13054617, chr19:g.13054664_13054672, e chr19:g.13054687_13054698.

[008] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para detectar uma mutação de deleção in-frame (Indel) no éxon 9 do gene da calreticulina (CALR) em um indivíduo, onde o indivíduo recebeu um ou mais tratamentos para uma doença ou condição relacionada à CALR ou uma doença ou condição relacionada ao JAK2. Em algumas modalidades, a doença ou condição relacionada à CALR ou relacionada ao JAK2 é uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a doença ou condição é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada. Em algumas modalidades, um ou mais tratamentos incluem flebotomia, doação de plaquetas por aférese, terapia transfusional, quimioterapia, radioterapia, cirurgia, terapia biológica, terapia alvejada, alta dose ou transplante de células-tronco. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V. Em algumas modalidades, a mutação de deleção in-frame corresponde a uma deleção genômica selecionada dentre chr19:g.13054615_13054617, chr19:g.13054664_13054672, e chr19:g.13054687_13054698.

[009] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para diagnosticar uma doença hematopoiética em um paciente compreendendo: realizar um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra compreendendo ácido nucleico de CALR de um paciente para determinar se o ácido nucleico compreende uma mutação Indel do éxon 9 de CALR, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V; e diagnosticar o paciente como tendo uma doença hematopoiética quando a mutação Indel do éxon 9 de CALR é detectada. Em algumas modalidades, a mutação de deleção in-frame corresponde a uma deleção genômica selecionada dentre chr19:g.13054615_13054617, chr19:g.13054664_13054672, e chr19:g.13054687_13054698. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente o tratamento do paciente se a mutação Indel do éxon 9 de CALR estiver presente. Em algumas modalidades, a doença hematopoiética é uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a doença mieloproliferativa é policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada.

[0010] Em algumas modalidades, os métodos de detecção de uma mutação Indel do éxon 9 de CALR compreendem amplificação de ácido nucleico, por exemplo, usando um par de iniciadores, compreendendo um iniciador direto e um iniciador reverso que flanqueiam a mutação de deleção. Em algumas modalidades, o método de amplificação de ácido nucleico compreende a reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR), a PCR em tempo real (qPCR) ou a nested PCR. Em algumas modalidades, o método compreende transcrição reversa de RNA em DNAc. Em algumas modalidades, o método compreende o uso de uma sonda de oligonucleotídeos marcada. Em algumas modalidades, a sonda marcada hibridiza com um ácido nucleico que tem a deleção e não hibridiza com uma sequência de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a sonda marcada compreende de cerca de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos da sequência SEQ ID NO: 1 e compreende o local de deleção do éxon 9 de CALR. Em algumas modalidades, o método compreende o sequenciamento de um amplicon que compreende a totalidade ou uma porção do éxon 9 de CALR que compreende a deleção. Em algumas modalidades, o método compreende a detecção de um amplicon que compreende a totalidade ou uma porção do éxon 9 de CALR compreendendo a deleção por electroforese. Em algumas modalidades, o amplicon é detectado usando uma sonda de oligonucleotídeo marcada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é isolado da amostra antes da detecção. Sondas ou iniciadores exemplificativos para detecção incluem moléculas de ácido nucleico com a sequência de qualquer das SEQ ID NO: 10, 11, 12, e 13. Em algumas modalidades, o método compreende a amplificação de uma porção do éxon 9 de CALR compreendendo a deleção usando um ou mais pares de iniciadores. Em algumas modalidades, o par de iniciadores compreende um iniciador direto selecionado dentre SEQ ID NO:10 ou 12. Em algumas modalidades, o par de iniciadores compreende um iniciador reverso selecionado dentre SEQ ID NO:11 ou 13. Em algumas modalidades, o par de iniciadores compreende um iniciador direto selecionado dentre SEQ ID NO:10 ou 12 e um iniciador reverso selecionado dentre SEQ ID NO:11 ou 13.

[0011] Em algumas modalidades, a mutação CALR do éxon 9 é detectada em uma amostra de ácido nucleico contendo DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é o DNA genômico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é DNAc. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é de uma amostra biológica obtida de um paciente. Em algumas modalidades, a amostra do paciente é uma amostra de fluido ou uma amostra de tecido. Em algumas modalidades, a amostra do paciente é uma amostra de sangue, soro ou plasma. Em algumas modalidades, a amostra do paciente é uma amostra de biópsia. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a obtenção da amostra do paciente. Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a doença mieloproliferativa é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada.

[0012] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a detecção de uma ou mais mutações adicionais em um ou mais genes adicionais associados a uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, um ou mais genes adicionais são um gene da via JAK- STAT. Em algumas modalidades, o um ou mais genes adicionais são JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações adicionais é um único polimorfismo, inserção, deleção, duplicação ou translocação de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações adicionais é selecionada dentre uma mutação no éxon 12 de JAK2, no éxon 14 de JAK2, no éxon 10 de MPL ou no éxon 14 ou no éxon 17 CSFR3R. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações adicionais é selecionada dentre JAK2 V617F, MPL W515L, CSFR3R A470T, ASXL1 D954fs*26 ou ZRSR2 S449_R450du. Em algumas modalidades, JAK2 V617F é detectado. Em algumas modalidades, a mutação adicional é uma mutação em JAK2 conforme descrito na Tabela 2 da Patente U.S. n° 8.512.948.

[0013] Em algumas modalidades, a detecção de uma mutação provida aqui compreende adicionalmente a análise usando um dispositivo analítico. Em algumas modalidades, o dispositivo analítico compreende um computador. Em algumas modalidades, o dispositivo analítico compreende um analisador de sequência.

[0014] Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a administração de uma terapia ao paciente se o paciente tiver uma mutação de éxon 9 de CALR provida aqui. Em algumas modalidades, a terapia compreende flebotomia, obtenção de plaquetas por aférese, terapia transfusional, quimioterapia, radioterapia, cirurgia, terapia biológica, terapia alvejada, alta dose ou transplante de células-tronco. Em algumas modalidades, a terapia compreende a administração de trióxido de arsênico, azacitidina, ciclofosfamida, citarabina, dasatinibe, cloridrato de daunorrubicina, decitabina, cloridrato de doxorrubicina, mesilato de imatinibe, nilotinibe, fosfato de ruxolitinibe e sulfato de vincristina.

[0015] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para determinar a probabilidade de um paciente desenvolver uma mutação em um gene da via JAK-STAT, compreendendo: realizar um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra compreendendo ácido nucleico de CALR de um paciente para determinar se o ácido nucleico compreende uma mutação Indel do éxon 9 de CALR, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V; e diagnosticar o dito indivíduo como tendo uma maior probabilidade de desenvolver uma mutação em um gene da via JAK-STAT se a mutação Indel do éxon 9 de CALR for detectada. Em algumas modalidades, o gene da via JAK-STAT é JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2. Em algumas modalidades, a mutação é selecionada dentre uma mutação no éxon 12 de JAK2, éxon 14 de JAK2, éxon 10 de MPL ou éxon 14 ou éxon 17 de CSFR3R. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações adicionais é selecionada dentre JAK2 V617F, MPL W515L, CSFR3R A470T, ASXL1 D954fs*26 ou ZRSR2 S449_R450du. Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a doença mieloproliferativa é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a realização de um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra para detectar uma mutação em um gene da via JAK-STAT. Em algumas modalidades, o gene da via JAK-STAT é JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2.

[0016] São providos aqui, em certas modalidades, métodos para determinar o prognóstico de um paciente com doença mieloproliferativa, compreendendo: realizar um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra compreendendo ácido nucleico de CALR de um paciente para determinar se o ácido nucleico compreende uma mutação Indel do éxon 9 de CALR, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V; e diagnosticar o paciente como tendo um prognóstico ruim quando a mutação Indel do éxon 9 de CALR é detectada. Em algumas modalidades, a doença mieloproliferativa é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada.

[0017] São providos aqui, em certas modalidades, kits compreendendo um iniciador ou sonda que é complementar e hibridiza especificamente com um ácido nucleico alvo que compreende uma mutação Indel do éxon 9 de CALR em uma amostra de ácido nucleico, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V. Em algumas modalidades, o kit compreende adicionalmente enzimas adequadas para amplificar um ácido nucleico de CALR. Em algumas modalidades, o iniciador ou a sonda compreende de cerca de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos da sequência SEQ ID NO: 1 e compreende o local de deleção do éxon 9 de CALR (por exemplo, abrange o local do ponto de ruptura da deleção). Em algumas modalidades, o iniciador ou sonda contém cerca de pelo menos um nucleotídeo em ambos os lados do ponto de ruptura da deleção). Em algumas modalidades, o iniciador ou sonda é marcado com um ou mais de um radioisótopo, um fluoróforo, um cromóforo, um corante, uma enzima ou um carreador de tempo de voo (TOF). Em algumas modalidades, o iniciador ou a sonda são configurados para indicar hibridização ou ligação por reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), quimioluminiscência, amplificação de sinal enzimático, partículas densas de elétrons, partículas magnéticas, acoplamento de capacitância ou espectrometria de massa. Em algumas modalidades, a sonda é fixada a um substrato sob a forma de uma micromatriz. Em algumas modalidades, o kit compreende adicionalmente um iniciador ou sonda de controle indicativo de uma sequência CALR de referência.

[0018] São providas aqui, em certas modalidades, proteínas CALR isoladas, compreendendo uma mutação de deleção de aminoácidos in-frame do éxon 9 selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V.

[0019] São providas aqui, em certas modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína CALR, compreendendo uma mutação de deleção de aminoácidos inframe do éxon 9 selecionada do grupo que consiste em p.E381_A382>A, p.D397_D400>D, p.E405_V409>V. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico isolada está operacionalmente ligada a um promotor. São providos aqui, em certas modalidades, vetores de clonagem ou de expressão que compreendem qualquer das moléculas de ácido nucleico isoladas providas aqui. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral ou um vetor plasmídico.

[0020] São providas aqui, em certas modalidades, células de mamífero compreendendo qualquer uma das moléculas ou vetores de ácido nucleico isolados providos aqui.

[0021] São providos aqui, em certas modalidades, animais transgênicos não humanos que compreendem qualquer uma das moléculas ou vetores de ácido nucleico isolados providos aqui.

[0022] São providos aqui, em certas modalidades, sondas ou iniciadores de oligonucleotídeos compreendendo de cerca de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos da sequência SEQ ID NO: 1 e compreendendo o local de deleção do éxon 9 de CALR. Sondas ou iniciadores exemplificativos incluem moléculas de ácido nucleico com a sequência de qualquer das SEQ ID NOS: 10, 11, 12, e 13.

[0023] Em algumas modalidades, uma variante adicional para a detecção, em adição às mutações indel do éxon 9 de CALR providas aqui, é selecionada de uma variante em um gene selecionado dentre ASXL1, CALR, CBL, CEBPA, CSF3R, DDX41, DNMT3A, EZH2, FLT3, GATA1, IDH1, IDH2, JAK2, KDM6A, KIT, KRAS, MLL, MPL, NPM1, NRAS, PTPN11, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, TET2, TP53, U2AF1, WT1 e ZRSR2.

[0024] Em algumas modalidades, a variante adicional para a detecção, em adição às mutações indel do éxon 9 de CALR providas aqui, é selecionada de uma variante em um gene selecionado dentre ABL1, ASXL1, ATRX, BCOR, BCORL1, BRAF, CALR, CBL, CBLB, CBLC, CDKN2A, CEBPA, CSF3R, CUX1, DDX41, DNMT3A, ETV6/TEL, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, IKZF1, JAK2, JAK3, KDM6A, KIT, KRAS, MLL, MPL, MYD88, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PHF6, PTPN11, RAF21, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, WT1 e ZRSR2.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A FIG. 1 ilustra uma visão geral de um método de sequenciamento MiSeq para a detecção de variantes.

[0026] A FIG. 2 ilustra (A) uma sequência representativa de uma deleção in-frame (indel) exemplificativa do éxon 9 de CALR produzindo uma proteína modificada C-terminal (p.D397_D400>D) e (B) um alinhamento representativo de C-terminal de proteínas CALR de tipo selvagem de várias espécies. As sequências de referência são derivadas de NP_004334 (H. sapiens) (SEQ ID No: 2), XP_003316194 (P. troglodytes) (SEQ ID No: 4), NP_001248060 (M. mulatta) (SEQ ID No: 5), XP_867310.2 (C. lupus) (SEQ ID No: 6), NP_031617.1(M. musculus) (SEQ ID No: 8), e NP_071794.1 (R. norvegicus) (SEQ ID No: 9). A deleção in-frame mais comum é conservada (sublinhada).

[0027] A FIG. 3 ilustra (A) uma sequência representativa de uma deleção in-frame (indel) exemplificativa do éxon 9 de CALR produzindo uma proteína modificada C-terminal (p.E405_V409>V).

[0028] A FIG. 4 ilustra (A) uma sequência representativa de uma deleção in-frame (indel) exemplificativa do éxon 9 de CALR produzindo uma proteína modificada C-terminal (p.E381_A382>A).

[0029] A FIG. 5 ilustra os domínios estruturais da proteína CALR, com áreas afetadas por mutações de mudança de quadro e o polimorfismo de tamanho C-terminal in-frame mais comum destacado. O domínio N e o domínio C são os principais locais de ligação de proteínas interativas durante o tráfego de retículo endoplasmático. A mutação p.L367fs*46 +1 pb em ET/PMF resulta na mudança das sequências C-terminais de uma predominância de aminoácidos ácidos para básicos e perda do motivo KDEL de retenção RE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0030] A presente invenção baseia-se na identificação de várias mutações de deleção in-frame (indel) no éxon 9 do gene de CALR em pacientes com diagnóstico de neoplasia mieloproliferativa. As mutações incluem uma deleção p.E381_A382>A, uma deleção p.D397_D400>D e uma deleção p.E405_V409>V. Consequentemente, a invenção provê ácidos nucleicos variantes com essas mutações genéticas e as proteínas, métodos e reagentes mutados resultantes para a detecção das variantes aqui descritas, os usos dessas variantes para o desenvolvimento de reagentes de detecção e ensaios ou kits que utilizam tais reagentes. A invenção provê adicionalmente composições e métodos úteis no diagnóstico, prognóstico e monitoração de doenças hematopoiéticas incluindo, por exemplo, doenças mieloproliferativas.

Determinada terminologia

[0031] Certos termos empregados nessa descrição têm os seguintes significados definidos. Os termos que não são definidos têm seus significados reconhecidos pela técnica. Isto é, a menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado na técnica a que pertence esta invenção.

[0032] Tal como aqui usado, salvo indicação em contrário, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” também incluem o plural. Assim, por exemplo, uma referência a “um oligonucleotídeo” inclui uma pluralidade de moléculas oligonucleotídicas, uma referência ao marcador é uma referência a um ou mais marcadores, uma referência a “uma sonda” é uma referência a uma ou mais sondas e uma referência a “um ácido nucleico” é uma referência a um ou mais polinucleotídeos.

[0033] Tal como aqui usado, o termo “cerca de” quando usado antes de um valor numérico, por exemplo, temperatura, tempo, quantidade e concentração, incluindo intervalo, indica aproximações que podem variar em aproximadamente ± 10%, 5% ou 1%.

[0034] Tal como aqui usado, os termos “isolado”, “purificado” ou “substancialmente purificado” referem-se a moléculas, tais como moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, que são removidas do seu ambiente natural, isoladas ou separadas e são pelo menos 60% livres, preferivelmente 75% livres, e mais preferivelmente 90% livre de outros componentes aos quais estão naturalmente associadas. Uma molécula isolada é, portanto, uma molécula substancialmente purificada.

[0035] Um “fragmento” no contexto de um fragmento de gene ou um fragmento de cromossomo refere-se a uma sequência de resíduos de nucleotídeos que são pelo menos ou cerca de 10 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 20 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 25 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 40 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 250 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 500 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 1.000 nucleotídeos, pelo menos ou cerca de 2.000 nucleotídeos.

[0036] Os termos “identidade” e “idêntico” referem-se a um grau de identidade entre sequências. Pode haver identidade parcial ou identidade completa. Uma sequência parcialmente idêntica é aquela que é menos de 100% idêntica a outra sequência. As sequências parcialmente idênticas podem ter uma identidade global de pelo menos 70% ou pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

[0037] O termo “marcador detectável”, tal como aqui usado refere-se a uma molécula ou um composto ou um grupo de moléculas ou um grupo de compostos associados a uma sonda e é usado para identificar a sonda hibridizada com uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de ácido nucleico genômico, uma molécula de ácido nucleico de RNA, uma molécula de DNAc ou um ácido nucleico de referência.

[0038] Tal como aqui usado, o termo “detecção” refere-se a observar um sinal de um marcador detectável para indicar a presença de um alvo. Mais especificamente, a detecção é usada no contexto da detecção de uma sequência específica de uma molécula de ácido nucleico alvo. O termo “detecção” usado no contexto da detecção de um sinal de um marcador detectável para indicar a presença de um ácido nucleico alvo na amostra não requer o método para prover 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade. É preferida uma sensibilidade de pelo menos 50%, embora sejam mais preferidas sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 99%. É preferida uma especificidade de pelo menos 50%, embora sejam mais preferidas sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 99%. A detecção também abrange ensaios que produzem falsos positivos e falsos negativos. Taxas de falsos negativos podem ser 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou até maiores. Taxas de falsos positivos podem ser 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou até maiores.

[0039] Tal como aqui usados, os termos “amplificação” e “amplificar” englobam todos os métodos para copiar ou reproduzir uma molécula de ácido nucleico alvo com uma sequência específica, aumentando assim o número de cópias ou a quantidade da sequência de ácido nucleico em uma amostra. A amplificação pode ser exponencial ou linear. O ácido nucleico alvo pode ser DNA ou RNA. Um ácido nucleico alvo amplificado desta maneira é aqui chamado de “amplicon”. Enquanto os métodos ilustrativos aqui descritos referem-se à amplificação usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), inúmeros outros métodos são conhecidos na técnica para amplificação de ácidos nucleicos, tais como, mas não se limitando a métodos isotérmicos, métodos de círculo de rolamento, etc. O versado na técnica entende que esses outros métodos podem ser usados em vez de ou em conjunto com, métodos de PCR. Ver, por exemplo, Saiki, “Amplification of Genomic DNA” in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. 2001 Jun 1;29(11):E54-E54; Hafner, et al., Biotechniques 2001 Apr;30(4):852-6, 858, 860; Zhong, et al., Biotechniques 2001 Apr;30(4):852- 6, 858, 860.

[0040] Tal como aqui usado, o termo “oligonucleotídeo” refere-se a um polímero de ácido nucleico curto composto por desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. Os oligonucleotídeos têm geralmente entre cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 a cerca de 150 nucleotídeos (nt) de comprimento, mais preferivelmente cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 a cerca de 70 nt de comprimento. Um oligonucleotídeo pode ser usado como um iniciador ou como uma sonda de acordo com os métodos aqui descritos e conhecido geralmente na técnica.

[0041] Tal como aqui usado, um oligonucleotídeo que é “específico” para um ácido nucleico é aquele que, nas condições adequadas de hibridização ou lavagem, é capaz de hibridizar com o alvo de interesse e não hibridizar substancialmente com ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais altos de identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador comercialmente disponível com uma configuração padrão que emprega algoritmos bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são específicos para as sequências genômicas de CALR que flanqueiam a sequência de CALR que codifica a mutação de deleção alvo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são específicos para a mutação de deleção CALR (por exemplo, específicos do alelo) e não hibridizam com uma sequência de CALR de tipo selvagem. Por exemplo, em algumas modalidades, os oligonucleotídeos que são específicos para a mutação de deleção CALR abrangem a junção entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ da deleção. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são específicos para as sequências de CALR dentro do éxon 9. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos são projetados para amplificar uma região de codificação de CALR apenas se a mutação de deleção estiver presente.

[0042] Um “iniciador” para amplificação de ácido nucleico é um oligonucleotídeo que se enovela especificamente para uma sequência nucleotídica alvo e leva à adição de nucleotídeos à extremidade 3’ do iniciador na presença de uma DNA ou RNA polimerase. Conforme conhecido na técnica, o nucleotídeo 3’ do iniciador deve ser geralmente idêntico à sequência de ácido nucleico alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para expressão e amplificação ideais. O termo “iniciador” tal como aqui usado inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizados, incluindo, mas não se limitando a, iniciadores de ácido nucleico peptídico, iniciadores de ácido nucleico bloqueados, iniciadores modificados com fosforotioato, iniciadores marcados e semelhantes. Os iniciadores podem ocorrer naturalmente como em uma amostra purificada a partir de uma amostra biológica ou de uma síntese de restrição ou produzida sinteticamente. Em algumas modalidades, os iniciadores podem ter aproximadamente 15 a 100 nucleotídeos de comprimento, tipicamente 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. O comprimento exato do iniciador dependerá de muitos fatores, incluindo hibridização e temperaturas de polimerização, fonte de iniciador e método usado. Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência alvo, o iniciador de oligonucleotídeos contém tipicamente 15 a 25 ou mais nucleotídeos, embora possa conter menos ou mais nucleotídeos. Os fatores envolvidos na determinação do comprimento adequado do iniciador são facilmente conhecidos por um versado na técnica. Um versado na técnica entende que os termos “iniciador direto” e “iniciador reverso” se referem geralmente a iniciadores complementares a sequências que flanqueiam o ácido nucleico alvo e são usadas para amplificação do ácido nucleico alvo. Geralmente, um “iniciador direto” é um iniciador que é complementar à cadeia antissentido do DNA e um “iniciador reverso” é complementar à cadeia no sentido do DNA.

[0043] Tal como aqui usado, uma “sonda” refere-se a um tipo de oligonucleotídeo com ou contendo uma sequência que é complementar a outro polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo alvo ou outro oligonucleotídeo. As sondas para uso nos métodos aqui descritos são idealmente menores ou iguais a 500 nucleotídeos de comprimento, tipicamente entre cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 100, por exemplo, cerca de 15 nucleotídeos para cerca de 40 nucleotídeos. As sondas para uso nos métodos aqui descritos são tipicamente usadas para a detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo por hibridização especifica com o ácido nucleico alvo. Os ácidos nucleicos alvo incluem, por exemplo, um ácido nucleico genômico, um ácido nucleico expresso, um ácido nucleico transcrito reverso, um ácido nucleico recombinante, um ácido nucleico sintético, um produto de amplificação ou um produto de extensão como aqui descrito.

[0044] O termo “PCR multiplex”, tal como aqui usado, refere-se a um ensaio que provê amplificação simultânea de ácido nucleico e detecção de dois ou mais amplicons dentro do mesmo vaso de reação. Cada ácido nucleico alvo é iniciado usando um par de iniciadores distintos. Uma reação multiplex pode incluir adicionalmente sondas específicas para cada amplicon que são marcadas de forma detectável com porções detectáveis para distinguir os amplicons. Em algumas modalidades, as sondas para cada amplicon são marcadas de forma detectável com diferentes porções detectáveis. Em algumas modalidades, as sondas para cada amplicon são marcadas de forma detectável com a mesma porção detectável. Em algumas modalidades, a porção detectável está ligada à sonda específica de uma maneira que permite a remoção seletiva da porção detectável.

[0045] O termo “reação em cadeia da polimerase aninhada” (nested PCR) é uma modificação da reação em cadeia da polimerase que envolve dois conjuntos de iniciadores, usados em duas séries sucessivas de reação em cadeia da polimerase, o segundo conjunto destinado a amplificar o alvo do primeiro produto de série.

[0046] O termo “complemento”, “complementar” ou “complementaridade” com referência a polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos, tais como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) refere-se a regras de pareamento Watson/Crick padrão. O complemento de uma sequência de ácido nucleico tal que a extremidade 5’ de uma sequência é pareada com a extremidade 3’ do outro, está em “associação antiparalela”. Por exemplo, a sequência “5’-A-G-T-3’“ é complementar à sequência “3’-T-C-A-5’“. Certas bases que não são comumente encontradas em ácidos nucleicos naturais podem ser incluídas nos ácidos nucleicos aqui descritos; estes incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, ácidos nucleicos bloqueados (LNA) e ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Complementar não precisa ser perfeito; os duplex estáveis podem conter pares de bases incompatíveis, bases degenerativas ou não correspondentes. Os versados na técnica de tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade duplex de forma empírica, considerando uma série de variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, a composição de base e a sequência do oligonucleotídeo, a força iônica e a incidência de pares de bases incompatíveis.

[0047] Tal como aqui usada, a detecção de uma mutação em um gene ou proteína pode ser realizada por um ensaio apropriado. Para detectar uma mutação em um gene ou proteína em uma amostra biológica, a amostra biológica é ensaiada para determinar a presença ou ausência do gene mutado ou proteína mutada. O ensaio pode incluir extrair ácido nucleico (tal como, por exemplo, DNA e/ou RNA genômico total) a partir da amostra e analisar o ácido nucleico extraído por métodos conhecidos na técnica. Um ensaio pode envolver isolar a proteína da amostra biológica e analisar a proteína. No entanto, um ensaio não precisa envolver nem a extração de ácido nucleico ou o isolamento de proteínas. Ou seja, podem ser utilizados alguns ensaios que analisam diretamente uma amostra biológica sem extrair ou isolar ácido nucleico ou proteína.

[0048] Tal como aqui usado, o termo “sujeito” ou “indivíduo” refere- se a um mamífero, tal como um ser humano, mas também pode ser outro animal, tal como um animal doméstico (por exemplo, um cão, gato ou outro), um animal de fazenda (por exemplo, uma vaca, uma ovelha, um porco, um cavalo ou semelhante) ou um animal de laboratório (por exemplo, um macaco, um rato, um rato, um coelho, um porquinho-da-Índia ou semelhante).

[0049] Tal como aqui usado, o termo “amostra” ou “amostra de teste” refere-se a qualquer material líquido ou sólido (ou ambos) que pode ser usado para testar a presença de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, uma amostra de teste é uma amostra biológica tal como uma célula ou tecido ou uma porção ou fração do mesmo. Uma amostra biológica pode compreender uma amostra clínica (isto é, obtida diretamente de um paciente) ou ácidos nucleicos isolados. Em algumas modalidades, uma amostra é obtida a partir de um tecido ou fluido corporal coletado de um indivíduo. As fontes de amostra incluem, mas não estão limitadas a, fluidos corporais, tais como, mas não limitado a, sangue total ou células de sangue isoladas de qualquer tipo (por exemplo, células mieloides, linfócitos), plasma, soro, expectoração (processada ou não processada), líquido cefalorraquidiano (LCR), líquido pleural, lágrimas, fluido do ducto lactífero, linfa, urina, saliva, líquido amniótico ou sêmen, lavagem alveolar brônquica (BAL), lavagem brônquica (BW) ou tecidos (por exemplo, material de biópsia). Uma amostra pode ser uma amostra de fluido e/ou tecido (por exemplo, uma biópsia) que é celular (isto é, contém células inteiras) ou acelular (isto é, não contém células inteiras). Um “fluido corporal acelular” inclui menos de cerca de 1% (p/p) de material celular inteiro. O plasma ou o soro são exemplos de fluidos corporais acelulares. Uma amostra pode incluir um espécime de origem natural ou sintética. Exemplos de tecidos de amostra incluem, mas não estão limitados a medula óssea ou tecido (por exemplo, material de biópsia). Os métodos de obtenção de amostras de teste e amostras de referência são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a aspirações, secções de tecido, coleta de sangue ou outros fluidos, biópsias cirúrgicas ou de agulhas, coleta de tecido embebido em parafina, coleta de fluidos corporais, coleta de fezes e similares. No presente contexto, a amostra biológica preferencialmente é uma amostra de sangue, soro ou plasma. O termo “amostra do paciente”, tal como aqui usado, refere-se a uma amostra obtida a partir de um humano em busca de diagnóstico e/ou tratamento de uma doença, especialmente uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, a amostra é derivada de um indivíduo que tem ou suspeita ter uma doença ou condição relacionada a CALR. Em algumas modalidades, a amostra é derivada de um indivíduo que tem ou suspeita ter uma doença ou condição relacionada a JAK2. Em algumas modalidades, a amostra é derivada de um indivíduo que recebeu um ou mais tratamentos para uma doença ou condição relacionada a JAK2 ou uma doença ou condição relacionada a CALR. Em algumas modalidades, a doença ou condição relacionada à CALR ou relacionada ao JAK2 é uma doença mieloproliferativa.

[0050] Tal como aqui usado, os termos “gene da CALR” se referem ao gene da calreticulina, que codifica a proteína da calreticulina. Tal como aqui usado, o termo pode referir-se a qualquer ácido nucleico que codifique uma proteína CALR, tal como DNA genômico, RNAm, DNAc ou outro ácido nucleico engenheirado/recombinante ou porções do mesmo. O termo engloba a sequência de ácido nucleico estabelecida no Número de Acesso NCBI NM_004343.3 (SEQ ID NO: 3) ou a sua região de codificação (SEQ ID NO: 1), bem como isoformas e variantes naturais e engenheiradas. O termo inclui transcritos de RNA incluindo toda ou uma porção da SEQ ID NO: 1, sequências genômicas que codificam SEQ ID NO: 1, e todas as sequências genômicas de CALR não traduzidas, como, por exemplo, íntrons, regiões líderes não traduzidas e sinais de poliadenilação. As sequências ilustrativas de ácido nucleico abrangidas pelo termo estão publicamente disponíveis no National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD (www.ncbi.nlm.nih.gov) e HUGO Gene Nomenclature Committee, Cambridge, Reino Unido (www.genenames.org).

[0051] Tal como aqui usado, o termo “proteína CALR” refere-se geralmente à proteína de calreticulina, também conhecida na técnica como antígeno A da síndrome de Sicca, Autoantígeno Ro, proteína residente 60 do retículo endoplasmático (ERp60), CRP55, HACBP, grp60, HEL-S- 99n, cC1qR, calregulina ou Proteína ligadora do espermatozoide epididimal Li 99n. Tal como aqui usado, o termo pode referir-se a qualquer proteína CALR, polipeptídeo ou uma porção da mesma. O termo engloba a sequência de aminoácidos estabelecida no Número de Acesso NCBI NP_004334.1 (SEQ ID NO: 2) e codificada pela SEQ ID NO:1, bem como isoformas e variantes naturais e engenheiradas. Proteínas CALR exemplificativas incluíam, mas não estão limitadas a, NP_004334 (H. sapiens) (SEQ ID No: 2), XP_003316194 (P. troglodytes) (SEQ ID No: 4), NP_001248060 (M. mulatta) (SEQ ID No: 5), XP_867310.2 (C. lupus) (SEQ ID No: 6), NP_776425.1 (B. taurus) (SEQ ID No: 7), NP_031617.1(M. musculus) (SEQ ID No: 8), e NP_071794.1 (R. norvegicus) (SEQ ID No: 9).

[0052] Tal como aqui usado, o termo “mutante CALR” refere-se geralmente a sequências de ácido nucleico ou aminoácido de CALR que diferem da sequência do tipo selvagem tal como estabelecida, por exemplo, na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. O termo inclui todas as formas de mutações conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a inserções, deleções, substituições e inversões, abrange mutações silenciosas e aquelas que alteram a função da CALR e engloba mutações de ganho de função e perda de função. Em algumas modalidades aqui descritas, as mutações CALR compreendem uma deleção p.E381_A382>A, p.D397_D400>D ou p.E405_V409>V.

[0053] As sequências de ácido nucleico e de proteína CALR aqui descritas podem ser isoladas de qualquer fonte, incluindo, mas não limitado a um paciente humano, um animal de laboratório ou animal veterinário (por exemplo, cão, porco, vaca, cavalo, rato, camundongo, etc.), uma amostra do mesmo (por exemplo, tecido ou fluido corporal ou extrato) ou uma célula do mesmo (por exemplo, célula primária ou linhagem celular ou extrato da mesma).

[0054] O termo “deleção p.E381_A382>A” refere-se a uma mutação no gene da CALR em que os nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos AGG na posição na posição do genoma chr19:g.13054615_13054617 (referência a GRCh37/hg19) são deletados (correspondentes aos nucleotídeos 1142-1144 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Essa mutação de inserção/deleção in-frame (indel) resulta na mutação de deleção p.E381_A382>A na proteína CALR em que o ácido glutâmico- alanina (EA) de dipeptídeo nas posições de aminoácido 381-382 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por alanina (A).

[0055] O termo “deleção p.D397_D400>D” refere-se a uma mutação no gene da CALR em que os nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos TGAGGAGGA na posição na posição do genoma chr19:g.13054664_13054672 (referência a GRCh37/hg19) são deletados (correspondentes aos nucleotídeos 1182-1190 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Essa mutação de inserção/deleção in-frame (indel) resulta na mutação de deleção p.D397_D400>D na proteína CALR em que o tetrapeptídeo DEED nas posições de aminoácido 397-400 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por ácido aspártico (D).

[0056] O termo “deleção p.E405_V409>V” refere-se a uma mutação no gene da CALR em que os nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos AGGAGGAAGATG na posição na posição do genoma chr19:g.13054687_13054698 (referência a GRCh37/hg19) são deletados (correspondentes aos nucleotídeos 1214-1225 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Essa mutação de inserção/deleção in-frame (indel) resulta na mutação de deleção p.E405_V409>V na proteína CALR em que o pentapeptídeo EEEDV nas posições de aminoácido 405-409 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por valina (V).

[0057] O termo “estado de zigosidade”, tal como aqui usado, significa se um indivíduo é homozigoto para um gene ou mutação genética ou seja, ambos os alelos têm a mesma cópia de um gene ou mutação genética ou heterozigoto para um gene ou mutação genética ou seja, apenas um alelo tem uma cópia do gene ou mutação genética.

[0058] Os termos “doença mieloproliferativa (DMP)” e “neoplasia mieloproliferativa (NMP)” ou “transtorno mieloproliferativo” são usados aqui de forma intercambiável para significar condições displásicas ou neoplásicas não linfáticas decorrentes de uma célula-tronco hematopoiética ou sua progênie. Uma doença mieloproliferativa geralmente é manifestada por uma divisão celular anormal, resultando em um nível anormal de uma população particular de células hematológicas. A divisão celular anormal subjacente a um distúrbio hematológico proliferativo é tipicamente inerente às células e não uma resposta fisiológica normal à infecção ou inflamação. As doenças mieloproliferativas exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose idiopática (MFI). Também estão incluídos na definição, tal como aqui usada, leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásica (SMD), leucemia mielogênica crônica (LMC), síndrome hipereosinofílica (SHE), leucemia neutrofílica crônica (LNC), mielofibrose com metaplasia mieloide (MMM), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia basofílica crónica, leucemia eosinofílica crónica, mastocitose sistêmica (MS) e doenças mieloproliferativas não classificadas (UMPD ou MPD-NC).

[0059] O termo “diagnosticar” ou “diagnóstico” ou “diagnosticar”, tal como aqui usado, refere-se a distinguir ou identificar uma doença, síndrome ou condição ou distinguir ou identificar uma pessoa com uma determinada doença, síndrome ou condição. Geralmente, o diagnóstico de uma doença ou distúrbio é baseado na avaliação de um ou mais fatores e/ou sintomas que são indicativos da doença. Ou seja, um diagnóstico pode ser feito com base na presença, ausência ou quantidade de um fator que é indicativo de presença ou ausência da doença ou condição. Cada fator ou sintoma que é considerado indicativo para o diagnóstico de uma determinada doença não precisa ser exclusivamente relacionado à doença particular; ou seja, pode haver diagnósticos diferenciais que podem ser inferidos a partir de um fator ou sintoma diagnóstico. Da mesma forma, pode haver casos em que um fator ou sintoma que seja indicativo de uma determinada doença esteja presente em um indivíduo que não tenha a doença em particular.

[0060] O termo “prognóstico”, tal como aqui usado, refere-se a uma previsão do curso e desfecho provável de uma condição clínica ou doença. Um prognóstico de um paciente geralmente é feito avaliando fatores ou sintomas de uma doença que são indicativos de um curso ou desfecho favorável ou desfavorável da doença.

[0061] A frase “determinar o prognóstico”, tal como aqui usada, refere-se ao processo pelo qual o versado na técnica pode prever o curso ou desfecho de uma condição em um paciente. O termo “prognóstico” não se refere à capacidade de prever o curso ou desfecho de uma condição com 100% de precisão. Em vez disso, o versado na técnica entenderá que o termo “prognóstico” refere-se a uma maior probabilidade de que um determinado curso ou desfecho ocorra; ou seja, que um curso ou desfecho é mais provável de ocorrer em um paciente que apresente uma determinada condição, quando comparado aos indivíduos que não apresentam a condição. Um prognóstico pode ser expresso como a quantidade de tempo que um paciente pode esperar para sobreviver. Alternativamente, um prognóstico pode referir-se à probabilidade de que a doença entre em remissão ou a quantidade de tempo que a doença possa permanecer em remissão. O prognóstico pode ser expresso de várias maneiras; por exemplo, o prognóstico pode ser expresso como uma porcentagem de chance de um paciente sobreviver após um ano, cinco anos, dez anos ou outros. Alternativamente, o prognóstico pode ser expresso como o número de anos, em média, que um paciente pode esperar sobreviver como desfecho de uma condição ou doença. O prognóstico de um paciente pode ser considerado como uma expressão do relativismo, com muitos fatores que afetam o desfecho final. Por exemplo, para pacientes com certas condições, o prognóstico pode ser apropriadamente expresso como a probabilidade de que uma condição possa ser tratável ou curável ou a probabilidade de uma doença entrar em remissão, enquanto que para pacientes com condições mais severas, o prognóstico pode ser expresso de forma mais adequada como probabilidade de sobrevivência por um determinado período de tempo.

[0062] O termo “prognóstico ruim”, tal como aqui usado, no contexto de um paciente com uma doença mieloproliferativa e uma mutação no gene da CALR, refere-se a uma maior probabilidade de que o paciente tenha um desfecho pior em uma condição clínica em relação a um paciente diagnosticado como tendo a mesma doença, mas sem a mutação. Um prognóstico ruim pode ser expresso em termos prognósticos relevantes e pode incluir, por exemplo, a expectativa de redução da duração da remissão, redução da taxa de sobrevivência e redução da duração da sobrevivência.

[0063] Tal como aqui usado, o termo “se liga especificamente”, quando se refere a uma unidade de ligação, significa que a porção é capaz de discriminar entre várias sequências alvo. Por exemplo, um oligonucleotídeo (por exemplo, um iniciador ou sonda) que se liga especificamente a uma sequência alvo mutante é aquele que hibridiza preferivelmente com a sequência alvo (por exemplo, a sequência de tipo selvagem) em relação às outras variantes de sequência (por exemplo, mutantes e sequências polimórficas). Preferivelmente, os oligonucleotídeos se ligam especificamente às suas sequências alvo em condições de hibridização de alta estringência.

[0064] Tal como aqui usado, “hibridização” ou “hibridizar” refere-se ao processo pelo qual uma cadeia simples de oligonucleotídeo se enovela com uma cadeia complementar através de pareamento de bases em condições de hibridização definidas. É uma interação específica, isto é, não aleatória, entre dois polinucleotídeos complementares. A hibridização e a força da hibridização (isto é, a força da associação entre os ácidos nucleicos) é influenciada por fatores como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas e o Tm do híbrido formado.

[0065] Tal como aqui usado, o termo “estringência” é usado em referência às condições de temperatura, força iônica e a presença de outros compostos, nos quais as hibridizações de ácido nucleico são conduzidas. Com condições de alta estringência, o pareamento de bases de ácido nucleico ocorrerá apenas entre ácidos nucleicos que têm um segmento suficientemente longo com alta frequência de sequências de bases complementares.

[0066] Exemplos de condições de hibridização são as seguintes. Alta estringência geralmente refere-se a condições que permitem a hibridização apenas das sequências de ácido nucleico que formam híbridos estáveis em NaCl 0,018 M a 65°C. Podem ser providas condições de alta estringência, por exemplo, por hibridização em formamida a 50%, 5 x solução de Denhardt, 5 x SSC (citrato de sódio salino), 0,2% de SDS (dodecilsulfato de sódio) a 42°C, seguido de lavagem em 0,1 x SSC e 0,1% de SDS a 65°C. A estringência moderada refere-se a condições equivalentes a hibridização em 50% de formamida, 5 x solução de Denhardt, 5 x SSC, 0,2% de SDS a 42°C, seguido de lavagem em 0,2 x SSC, 0,2% de SDS, a 65°C. A baixa estringência refere-se a condições equivalentes a hibridização em 10% de formamida, 5 x solução de Denhardt, 6 x SSC, 0,2% de SDS, seguido de lavagem em 1 x SSC, 0,2% de SDS, a 50°C.

Mutações indel CALR

[0067] São providos aqui métodos para detectar mutações de deleção in-frame no éxon 9 do gene da CALR. Em algumas modalidades, o gene da CALR compreende uma deleção de ácido nucleico na posição do genoma chr19:g.13054615_13054617 (referência a GRCh37/hg19) (correspondente aos nucleotídeos 1142-1144 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Por exemplo, em uma modalidade, a mutação resulta em uma proteína CALR, em que E381 e A382 de SEQ ID NO:2 são substituídos por alanina (A) sozinha. Em algumas modalidades, o gene da CALR compreende uma deleção de ácido nucleico na posição do genoma chr19:g.13054664_13054672 (referência a GRCh37/hg19) (correspondente aos nucleotídeos 1182-1190 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Por exemplo, em uma modalidade, a mutação resulta em uma proteína CALR, em que D397, E398, E399, e D400 de SEQ ID NO:2 são substituídos por ácido aspártico (D) sozinho. Em algumas modalidades, o gene da CALR compreende uma deleção de ácido nucleico na posição do genoma chr19:g.13054687_13054698 (referência a GRCh37/hg19) (correspondente aos nucleotídeos 1214-1225 da sequência codificadora de nucleotídeos de CALR de SEQ ID NO: 1). Por exemplo, em uma modalidade, a mutação resulta em uma proteína CALR, em que E405, E406, E407, D408, e V409 de SEQ ID NO:2 são substituídos por valina (V) sozinha. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a detecção de uma ou mais mutações adicionais no gene da CALR. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a detecção de uma ou mais mutações adicionais no um ou mais genes adicionais. Em algumas modalidades, o um ou mais genes adicionais são associados a um distúrbio mieloproliferativo.

Mutação de deleção p.E381_A382>A

[0068] Em algumas modalidades providas aqui, a mutação indel p.E381_A382>A no gene da CALR é detectada em uma amostra contendo um ácido nucleico da CALR. O ácido nucleico da CALR é avaliado por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, por sequenciamento de ácido nucleico ou hibridização de oligonucleotídeos. Por exemplo, a mutação indel p.E381_A382>A pode ser avaliada pela amplificação de uma sequência alvo de um ácido nucleico da CALR (por exemplo, DNA genômico, RNA ou DNAc) contendo a totalidade ou uma porção da mutação. Além disso, a detecção da mutação indel p.E381_A382>A pode envolver o uso de sondas e/ou iniciadores capazes de se hibridizar especificamente ao local da mutação. Uma sequência de ácido nucleico alvo adequada do gene da CALR para avaliar a presença dessa mutação compreende a totalidade ou uma porção do éxon 9 da CALR. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19.13054525-13054728. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19:g.13054615_13054617. As sequências alvo (incluindo sequências de iniciador e sonda abrangendo esta mutação) podem ser de qualquer comprimento adequado (por exemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 300 ou mais nucleotídeos de comprimento). O ácido nucleico pode ser DNA e/ou RNA.

[0069] Alternativamente, a presença da mutação indel p.E381_A382>A pode ser avaliada avaliando a proteína CALR presente na amostra de um paciente, por exemplo, detectando especificamente a variante da proteína CALR p.E381_A382>A. A avaliação da proteína CALR pode ser realizada por qualquer método apropriado incluindo sequenciamento de aminoácidos ou através do uso de anticorpos específicos de CALR mutantes (por exemplo, usando um ELISA). As proteínas CALR mutantes podem ser avaliadas por sequenciamento de aminoácidos de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante. Opcionalmente, os anticorpos (policlonais ou monoclonais) podem ser criados contra um epítopo de polipeptídeo com a sequência de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante.

[0070] Métodos adicionais para a detecção de ácidos nucleicos mutantes e/ou as proteínas mutantes codificadas são providos em outro local aqui e podem ser utilizados para a detecção da mutação indel p.E381_A382>A.

Mutação de deleção p.D397_D400>D

[0071] Em algumas modalidades providas aqui, a mutação indel p.D397_D400>D no gene da CALR é detectada em uma amostra contendo um ácido nucleico da CALR. O ácido nucleico da CALR é avaliado por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, por sequenciamento de ácido nucleico ou hibridização de oligonucleotídeos. Por exemplo, a mutação indel p.D397_D400>D pode ser avaliada pela amplificação de uma sequência alvo de um ácido nucleico da CALR (por exemplo, DNA genômico, RNA ou DNAc) contendo a totalidade ou uma porção da mutação. Além disso, a detecção da mutação indel p.D397_D400>D pode envolver o uso de sondas e/ou iniciadores capazes de se hibridizar especificamente ao local da mutação. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19.13054525- 13054728. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19:g.13054664_13054672. As sequências alvo (incluindo sequências de iniciador e sonda abrangendo esta mutação) podem ser de qualquer comprimento adequado (por exemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 300 ou mais nucleotídeos de comprimento). O ácido nucleico pode ser DNA e/ou RNA.

[0072] Alternativamente, a presença da mutação indel p.D397_D400>D pode ser avaliada avaliando a proteína CALR presente na amostra de um paciente, por exemplo, detectando especificamente a variante da proteína CALR p.D397_D400>D. A avaliação da proteína CALR pode ser realizada por qualquer método apropriado incluindo sequenciamento de aminoácidos ou através do uso de anticorpos específicos de CALR mutantes (por exemplo, usando um ELISA). As proteínas CALR mutantes podem ser avaliadas por sequenciamento de aminoácidos de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante. Opcionalmente, os anticorpos (policlonais ou monoclonais) podem ser criados contra um epítopo de polipeptídeo com a sequência de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante.

[0073] Métodos adicionais para a detecção de ácidos nucleicos mutantes e/ou as proteínas mutantes codificadas são providos em outro local aqui e podem ser utilizados para a detecção da mutação indel p.D397_D400>D.

Mutação de deleção p.E405_V409>V

[0074] Em algumas modalidades providas aqui, a mutação indel p.E405_V409>V no gene da CALR é detectada em uma amostra contendo um ácido nucleico da CALR. O ácido nucleico da CALR é avaliado por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, por sequenciamento de ácido nucleico ou hibridização de oligonucleotídeos. Por exemplo, a mutação indel p.E405_V409>V pode ser avaliada pela amplificação de uma sequência alvo de um ácido nucleico da CALR (por exemplo, DNA genômico, RNA ou DNAc) contendo a totalidade ou uma porção da mutação. Além disso, a detecção da mutação indel p.E405_V409>V pode envolver o uso de sondas e/ou iniciadores capazes de se hibridizar especificamente ao local da mutação. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19.13054525- 13054728. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico alvo compreende um ácido nucleico correspondente à posição do genoma chr19:g.13054687_13054698. As sequências alvo (incluindo sequências de iniciador e sonda abrangendo esta mutação) podem ser de qualquer comprimento adequado (por exemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300, 300 ou mais nucleotídeos de comprimento). O ácido nucleico pode ser DNA e/ou RNA.

[0075] Alternativamente, a presença da mutação indel p.E405_V409>V pode ser avaliada avaliando a proteína CALR presente na amostra de um paciente, por exemplo, detectando especificamente a variante da proteína CALR p.E405_V409>V. A avaliação da proteína CALR pode ser realizada por qualquer método apropriado incluindo sequenciamento de aminoácidos ou através do uso de anticorpos específicos de CALR mutantes (por exemplo, usando um ELISA). As proteínas CALR mutantes podem ser avaliadas por sequenciamento de aminoácidos de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante. Opcionalmente, os anticorpos (policlonais ou monoclonais) podem ser criados contra um epítopo de polipeptídeo com a sequência de toda ou uma porção da proteína CALR compreendendo a variante.

[0076] Métodos adicionais para a detecção de ácidos nucleicos mutantes e/ou as proteínas mutantes codificadas são providos em outro local aqui e podem ser utilizados para a detecção da mutação indel p.E405_V409>V.

Mutações da via JAK-STAT

[0077] Conforme aqui descrito, as mutações indel no éxon 9 de CALR estão associadas a uma maior frequência de mutações somáticas em genes que codificam proteínas que participam da via JAK-STAT, particularmente em pacientes com doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades providas aqui, a detecção de uma mutação indel do éxon 9 da CALR em um indivíduo indica uma maior probabilidade de que o indivíduo desenvolva uma mutação somática em genes que codificam proteínas envolvidas na doença mieloproliferativa. Em casos particulares, a mutação somática ocorre em genes que codificam uma proteína da via JAK-STAT. Em algumas modalidades, o gene que é mutado é JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2. Em algumas modalidades, a mutação é localizada no éxon 12 de JAK2, éxon 10 de MPL ou éxon 14 ou éxon 17 de CSFR3R. Em algumas modalidades, a mutação é JAK2 V617F, MPL W515L, CSFR3R A470T, ASXL1 D954fs*26 ou ZRSR2 S449_R450du (c.1338_1343dupGGCCG).

[0078] Consequentemente, são providos aqui métodos para a detecção de uma ou mais mutações adicionais em um ou mais genes adicionais associados a um distúrbio mieloproliferativo. Em algumas modalidades, o gene codifica uma proteína da via JAK-STAT. Em algumas modalidades, é detectada uma mutação em JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2. Em algumas modalidades, é detectada uma mutação no éxon 12 de JAK2, éxon 14 de JAK2, éxon 10 de MPL ou éxon 14 ou éxon 17 de CSFR3R. Em algumas modalidades, é detectada uma translocação em BCR-ABL1. Em algumas modalidades, é detectada uma mutação que é JAK2 V617F, MPL W515L, CSFR3R A470T, ASXL1 D954fs*26 ou ZRSR2 S449_R450du. (c.1338_1343dupGGCCG). Em algumas modalidades, é detectada uma translocação que envolve FGFR1, PDGFRA ou PDGFRB. Em algumas modalidades, a mutação adicional é uma mutação em JAK2 conforme descrito na Tabela 2 da Patente U.S. n° 8.512.948.

[0079] Em algumas modalidades, a variante adicional para a detecção com um mutante de CALR descrito aqui é selecionada de uma variante em um gene selecionado dentre ASXL1, CALR, CBL, CEBPA, CSF3R, DDX41, DNMT3A, EZH2, FLT3, GATA1, IDH1, IDH2, JAK2, KDM6A, KIT, KRAS, MLL, MPL, NPM1, NRAS, PTPN11, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, TET2, TP53, U2AF1, WT1 e ZRSR2. Em algumas modalidades, a variante adicional para a detecção com um mutante de CALR descrito aqui é selecionada de uma variante em um éxon descrito na Tabela 1.

[0080] Em algumas modalidades, a variante adicional para a detecção com um mutante de CALR descrito aqui é selecionada de uma variante em um gene selecionado dentre ABL1, ASXL1, ATRX, BCOR, BCORL1, BRAF, CALR, CBL, CBLB, CBLC, CDKN2A, CEBPA, CSF3R, CUX1, DDX41, DNMT3A, ETV6/TEL, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, IKZF1, JAK2, JAK3, KDM6A, KIT, KRAS, MLL, MPL, MYD88, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PHF6, PTPN11, RAF21, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, WT1 e ZRSR2.

[0081] Em algumas modalidades, é detectada uma mutação adicional no gene da CALR. Em algumas modalidades, a mutação adicional é uma mutação adicional no éxon 9 do gene da CALR. Em algumas modalidades, a mutação adicional é uma mutação de deslocamento de quadro de leitura +1 no gene da CALR.

[0082] Em algumas modalidades, os métodos incluem acompanhamento de pacientes com mutações indel no éxon 9 de CALR para o desenvolvimento de uma mutação somática em um gene envolvido em uma doença mieloproliferativa. Em algumas modalidades, o gene codifica uma proteína da via JAK-STAT. Em algumas modalidades, o paciente tem uma doença mieloproliferativa.

[0083] Em algumas modalidades, os métodos incluem monitorar pacientes tratados devido a uma doença mieloproliferativa para o desenvolvimento de uma mutação indel no éxon 9 de CALR. Em algumas modalidades, os métodos incluem monitorar pacientes tratados devido a uma doença mieloproliferativa para o desenvolvimento de uma mutação indel no éxon 9 da CALR e uma ou mais mutações em um gene da via JAK-STAT, incluindo, mas não limitado a, JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1 ou ZRSR2. Consequentemente, os métodos podem ser utilizados como um diagnóstico complementar para a detecção de uma mutação indel de éxon 9 da CALR em um indivíduo que recebeu um ou mais tratamentos para uma doença mieloproliferativa, como a policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada.

Coleta e preparação de amostras

[0084] Os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para detectar mutações no gene da CALR e outras mutações aqui descritas usando uma amostra biológica obtida de um indivíduo. As amostras podem ser obtidas de pacientes suspeitos de ter uma sequência de ácido nucleico mutado, por exemplo, a partir de um tecido de amostra de fluido contendo células tumorais ou células cancerígenas. Os métodos providos podem ser realizados usando qualquer amostra contendo ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é ácido desoxirribonucleico (DNA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é ácido ribonucleico (RNA). A amostra pode ser processada para liberar ou de outro modo disponibilizar um ácido nucleico para detecção como aqui descrito. O ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) pode ser isolado a partir da amostra de acordo com qualquer método bem conhecido dos versados na técnica. Tal processamento pode incluir etapas de manipulação de ácido nucleico, por exemplo, preparar um DNAc por transcrição reversa de RNA a partir da amostra biológica. Assim, o ácido nucleico a ser ensaiado pelos métodos da invenção pode ser DNA genômico, DNAc, DNA de cadeia simples ou RNAm.

[0085] Exemplos de amostras biológicas incluem amostras de tecido ou quaisquer fluidos corporais contendo células ou acelulares. As amostras biológicas podem ser obtidas por procedimentos padrão e podem ser usadas imediatamente ou armazenadas, em condições apropriadas para o tipo de amostra biológica, para uso posterior.

[0086] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui podem ser aplicados a qualquer tipo de tecido de um paciente. Fontes de tais tecidos incluem, mas não estão limitadas a, sistema nervoso, tireoide, pele, trato gastrointestinal, intestino grosso, trato biliar, ovário, olho, próstata, sistema nervoso central, fígado, intestino delgado, mama, pâncreas, tecido mole, trato digestivo, glândula adrenal, gânglios autonômicos, tecido hematopoiético e linfoide, pulmão, esôfago, pituitária e estômago.

[0087] Em algumas modalidades, os métodos podem ser aplicados em uma ampla gama de tipos de tumores. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são aplicados a amostras de pacientes com neoplasia mieloproliferativa. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são aplicados a amostras de sangue de pacientes com neoplasia mieloproliferativa.

[0088] Os métodos de obtenção de amostras de teste são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a aspirações, secções de tecido, coleta de sangue ou outros fluidos, biópsias cirúrgicas ou de agulhas e semelhantes. A amostra de teste pode ser obtida de um indivíduo ou paciente diagnosticado como tendo um distúrbio mieloproliferativo ou suspeita de estar com um distúrbio mieloproliferativo. Em algumas modalidades, a amostra de teste é obtida de um indivíduo ou paciente que recebeu um ou mais tratamentos para um distúrbio mieloproliferativo. A amostra de teste pode ser um líquido contendo células ou um tecido. As amostras podem incluir, mas não estão limitadas a, líquido amniótico, biópsias, sangue, células sanguíneas, medula óssea, amostras de biópsia de agulha fina, líquido peritoneal, líquido amniótico, plasma, líquido pleural, saliva, sêmen, soro, tecido ou homogenatos de tecido, secções congeladas ou de parafina de tecido. As amostras também podem ser processadas, como seccionamento de tecidos, fracionamento, purificação ou separação de organelas celulares.

[0089] Se necessário, a amostra pode ser coletada ou concentrada por centrifugação e semelhantes. As células da amostra podem ser submetidas a lise, tais como por tratamentos com enzimas, calor, tensoativos, ultrassonografia ou uma combinação dos mesmos. O tratamento de lise é realizado de modo a obter uma quantidade suficiente de ácido nucleico derivado das células do indivíduo para detectar o uso de um ensaio de detecção de ácido nucleico, por exemplo, um teste de detecção usando PCR.

[0090] Os métodos de preparação de plasma e soro são bem conhecidos na técnica. Podem ser usados plasma ou soro de sangue “fresco” ou plasma congelado (armazenado) e subsequentemente plasma ou soro descongelados. O plasma ou soro congelado (armazenado) deve ser mantido idealmente em condições de armazenamento de -20°C a -70°C até descongelado e usado. O plasma ou soro “fresco” pode ser refrigerado ou mantido em gelo até ser usado, com a extração de ácido nucleico (por exemplo, RNA, DNA ou ácido nucleico total) sendo realizada o mais rápido possível. Métodos exemplificativos são descritos abaixo.

[0091] O sangue pode ser coletado por métodos padrão em um tubo de coleta, tipicamente vidro siliconado, sem anticoagulante para a preparação de soro ou com EDTA, citrato de sódio, heparina ou anticoagulantes semelhantes para a preparação de plasma. Se preparando plasma ou soro para armazenamento, o plasma ou o soro podem ser primeiro fracionados a partir do sangue total antes de serem congelados. Isto reduz a carga de RNA intracelular estranho liberado da lise de células congeladas e descongeladas que podem reduzir a sensibilidade do ensaio de amplificação ou interferir no ensaio de amplificação através da liberação de inibidores tais como porfirinas e hematina que inibem a amplificação de ácido nucleico (por exemplo, PCR). O plasma ou o soro “fresco” podem ser fracionados a partir de sangue total por centrifugação, usando centrifugação suave a 300 a 800 vezes a gravidade por cinco a dez minutos ou fracionados por outros métodos padrão. As altas taxas de centrifugação capazes de fragmentar os corpos apoptóticos geralmente são evitadas. Uma vez que a heparina pode interferir com transcrição reversa e amplificação de ácido nucleico, o uso de sangue heparinizado pode requerer pré-tratamento com heparanase, seguido de remoção de cálcio antes da transcrição ou amplificação reversa. Imai, H. et al. J. Virol. Methods 36:181-184, (1992). Em algumas modalidades, EDTA é um anticoagulante adequado para espécimes de sangue para os quais a amplificação de ácido nucleico (por exemplo, PCR) é subsequentemente realizada.

Extração e amplificação de ácido nucleico

[0092] O ácido nucleico a ser ensaiado pode ser ensaiado diretamente a partir de uma amostra biológica ou extraído da amostra biológica antes da detecção. Tal como aqui descrito, a amostra biológica pode ser qualquer amostra que contenha uma molécula de ácido nucleico, tal como uma amostra de fluido, uma amostra de tecido ou uma amostra de células. A amostra biológica pode ser de um indivíduo que inclui qualquer animal, preferivelmente um mamífero. Um indivíduo preferido é um ser humano, que pode ser um paciente se apresentando a um médico para diagnóstico ou tratamento de uma doença. O volume de plasma ou soro usado na extração pode variar dependendo da intenção clínica, mas os volumes de 100 μL a um mililitro de plasma ou soro são geralmente suficientes.

[0093] Vários métodos de extração são adequados para isolar o DNA ou o RNA. Em geral, o objetivo é separar o DNA presente no núcleo da célula de outros componentes celulares. O isolamento do ácido nucleico geralmente envolve lise de tecido ou células. Esse processo é essencial para a destruição das estruturas proteicas e permite a liberação de ácidos nucleicos do núcleo. A lise é tipicamente realizada em uma solução salina, contendo detergentes para desnaturar proteínas ou proteases (enzimas que digerem proteínas), como Proteinase K ou em alguns casos, ambas. Isso resulta na degradação das células e na dissolução das membranas. Os métodos de isolamento de DNA incluem, mas não estão limitados a extração de fenol: clorofórmio, precipitação de alto teor de sal, desnaturação alcalina, cromatografia em coluna de troca iônica, ligação de resina e ligação de grânulos paramagnéticos. Ver, por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 16.54 (1989). Inúmeros kits comerciais que produzem DNA e RNA adequados incluem, mas não estão limitados a mini kit de sangue QIAamp™, Agencourt Genfind™, Roche Cobas®, Roche MagNA Pure® ou extração de fenol:clorofórmio usando Eppendorf Phase Lock Gels® e kit de extração de NucliSens (Biomerieux, Marcy l’Etoile, França).

[0094] São também utilizados métodos de isolamento de RNA conhecidos pelos versados na técnica. O RNA pode ser isolado e preparado para a hibridização por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitado a, Trizol® e extração de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio. O princípio do isolamento de RNA é baseado na lise celular/de tecido, seguido de extração, precipitação e lavagem. Em outros métodos, o RNAm pode ser extraído de amostras biológicas do paciente (por exemplo, amostras de sangue) usando um kit comercial adequado para extração de RNAm, por exemplo, kit MagNA Pure LC mRNA HS e Mag NA Pure LC Instrument (Roche Diagnostics Corporation, Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.).

[0095] O ácido nucleico extraído de tecidos, células, plasma ou soro pode ser amplificado usando técnicas de amplificação de ácido nucleico bem conhecidas na técnica. Muitos desses métodos de amplificação também podem ser usados para detectar a presença de mutações simplesmente criando iniciadores ou sondas de oligonucleotídeos para interagir ou hibridizar com uma sequência alvo particular de uma maneira específica (por exemplo, iniciadores e/ou sondas específicos de alelos ou iniciadores que flanqueiam sequências alvo de ácidos nucleicos). A título de exemplo, mas não a título de limitação, essas técnicas podem incluir, mas não estão limitadas a reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR), PCR em tempo real (qPCR), nested PCR, reação em cadeia da ligase (LCA) (ver Abravaya, K., et al., Nucleic Acids Research, 23:675-682, (1995)), amplificação de sinal de DNA ramificado (Urdea, M. S., et al., AIDS, 7 (suppl 2):S11-S14, (1993)), repórteres de RNA amplificáveis, replicação de Q-beta, sistema de amplificação baseado em transcrição (TAS), amplificação de DNA de boomerang, ativação de deslocamento de cadeia (SDA), tecnologia de sonda de ciclagem, amplificação baseada em sequência de ácido nucleico isotérmico (NASBA) (ver Kievits, T. et al., J Virological Methods, 35:273-286, (1991)), Tecnologia Invader, sistema de mutação refratária de amplificação (ARMS) de amplificação dependente de helicase (HDA) e outros ensaios de replicação de sequência ou ensaios de amplificação de sinal. Métodos exemplificativos de amplificação são descritos brevemente abaixo e são bem conhecidos na técnica.

[0096] Em algumas modalidades, os métodos providos aqui empregam transcrição reversa de RNA obtido do indivíduo para DNAc. O método de transcrição reversa e amplificação é bem conhecido na técnica. As transcriptases reversas exemplificativas que podem ser usadas, incluem, mas não estão limitadas a, MMLV RT, RNase H mutantes de MMLV RT tais como Superscript e Superscript II (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.), AMV RT e transcriptase reversa termoestável de Thermus Thermophilus. Por exemplo, um método exemplificativo que pode ser usado para converter RNA extraído de plasma ou soro para DNAc é o protocolo adaptado do sistema de pré-amplificação Superscript II (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md., Catálogo n° 18089-011), conforme descrito por Rashtchian, A., PCR Methods Applic., 4:S83-S91, (1994). Em algumas modalidades, o DNAc é então usado como modelo para uma reação de amplificação de ácido nucleico para amplificar ácidos nucleicos que codificam a mutação.

[0097] Uma variedade de enzimas de amplificação é bem conhecida na técnica e inclui, por exemplo, DNA polimerase, RNA polimerase, transcriptase reversa, Q-beta replicase, DNA termoestável e RNA polimerases. Como essas e outras reações de amplificação são catalisadas por enzimas, em um ensaio de única etapa, os reagentes de liberação de ácido nucleico e os reagentes de detecção não devem ser inibidores potenciais de enzimas de amplificação se a detecção final for baseada em amplificação.

[0098] A PCR é uma técnica para fazer, exponencialmente, várias cópias de uma sequência de DNA de modelo específica. A reação consiste em múltiplos ciclos de amplificação (isto é, termociclagem) e é iniciada usando um par de sequências de iniciadores que hibridizam com as extremidades 5’ e 3’ da sequência a ser copiada. O ciclo de amplificação tipicamente inclui uma desnaturação inicial (isto é, separação da cadeia) do ácido nucleico alvo, tipicamente a cerca de 95°C, seguido de até 50 ciclos ou mais de (1) desnaturação, (2) enovelamento dos iniciadores ao ácido nucleico alvo a uma temperatura determinada pelo ponto de fusão (Tm) da região de homologia entre o iniciador e o alvo, e (3) extensão a uma temperatura dependente da polimerase, mais comumente 72°C. Um período prolongado de extensão normalmente é realizado no final do ciclo. Em cada ciclo da reação, a sequência de DNA entre os iniciadores é copiada. Os iniciadores podem se ligar ao DNA copiado, bem como à sequência do modelo original, de modo que o número total de cópias aumenta exponencialmente com o tempo. A PCR pode ser realizada de acordo com Whelan, et al., J of Clin Micro, 33(3):556-561 (1995). Uma mistura de reação de PCR exemplificativa inclui dois iniciadores específicos, dNTPs, aproximadamente 0,25 U de polimerizase termoestável, tal como uma Taq polimerase, e tampão de 1 x PCR, contendo tipicamente um tampão (por exemplo, Tris), um sal (por exemplo, KCl) e magnésio (MgCl2). O Tm de um iniciador varia de acordo com o comprimento, o conteúdo de G + C e as condições do tampão, entre outros fatores. Tal como aqui usado, Tm refere-se àquele no tampão usado para a reação de interesse.

[0099] Os parâmetros de ciclagem para amplificação podem variar, dependendo do comprimento dos ácidos nucleicos a serem estendidos. O versado na técnica é capaz de projetar e preparar iniciadores que são apropriados para amplificar uma sequência alvo em vista desta descrição. O comprimento dos iniciadores de amplificação para uso na presente invenção depende de vários fatores incluindo a identidade da sequência de nucleotídeos e a temperatura à qual estes ácidos nucleicos são hibridizados ou usados durante a amplificação de ácido nucleico in vitro. As considerações necessárias para determinar um comprimento preferido para um iniciador de amplificação de uma identidade de sequência particular são bem conhecidas para a pessoa versada. Por exemplo, o comprimento de um ácido nucleico curto ou oligonucleotídeo pode se relacionar com a sua especificidade ou seletividade de hibridização.

[00100] LCR é um método de amplificação de DNA semelhante a PCR, exceto que ele usa quatro iniciadores em vez de dois e usa a enzima ligase para ligar ou juntar dois segmentos de DNA. A LCR pode ser realizada de acordo com Moore et al., J Clin Micro, 36(4):1028-1031 (1998). Resumidamente, uma mistura de reação de LCR contém dois pares de iniciadores, dNTP, DNA ligase e DNA polimerase representando cerca de 90 μl, aos quais são adicionados 100 μl de ácido nucleico isolado do organismo alvo. A amplificação é realizada em um ciclador térmico (por exemplo, LCx de Abbott Labs, Chicago, Ill.).

[00101] TAS é um sistema de amplificação de ácido nucleico em que cada ciclo é que consiste em uma etapa de síntese de DNAc e uma etapa de transcrição de RNA. Na etapa de síntese de DNAc, uma sequência reconhecida por uma RNA polimerase dependente de DNA (isto é, uma sequência de ligação à polimerase ou PBS) é inserida na cópia de DNAc a jusante da sequência alvo ou de marcador a ser amplificada usando um iniciador de oligonucleotídeos de dois domínios. Na segunda etapa, uma polimerase de RNA é usada para sintetizar múltiplas cópias de RNA do modelo de DNAc. A amplificação usando TAS requer apenas alguns ciclos porque a transcrição de RNA dependente do DNA pode resultar em 10 a 1000 cópias para cada cópia do modelo de DNAc. O TAS pode ser realizado de acordo com Kwoh et al., PNAS, 86:1173-7 (1989). Resumidamente, o RNA extraído é combinado com tampão de amplificação de TAS e albumina de soro bovino, dNTPs, NTPs e dois iniciadores de oligonucleotídeos, um dos quais contém uma PBS. A amostra é aquecida para desnaturar o molde de RNA e resfriada até a temperatura de enovelamento do iniciador. A transcriptase reversa (RT) é adicionada a amostra incubada à temperatura apropriada para permitir o alongamento do DNAc. Posteriormente, a RNA polimerase T7 é adicionada e a amostra é incubada a 37°C durante aproximadamente 25 minutos para a síntese de RNA. As etapas acima são então repetidas. Alternativamente, após a síntese inicial de DNAc, tanto a RT como a RNA polimerase são adicionadas após uma desnaturação de 1 minuto a 100°C seguida por um alongamento de RNA de aproximadamente 30 minutos a 37°C. O TAS também pode ser realizado em fase sólida, de acordo com Wylie et al., J Clin Micro, 36(12):3488-3491 (1998). Nesse método, os alvos de ácidos nucleicos são capturados com esferas magnéticas contendo iniciadores de captura específicos. As esferas com os alvos capturados são lavadas e globulizadas antes de adicionar reagentes de amplificação que contém iniciadores de amplificação, dNTP, NTP, 2500 U de transcriptase reversa e 2500 U de RNA polimerase T7. Uma mistura de reação de 100 μA de TMA é colocada em um tubo, é adicionado 200 μA de reagente de óleo e a amplificação é realizada por incubação a 42°C em um banho de água durante uma hora.

[00102] O NASBA é um método de amplificação baseado em transcrição que amplifica RNA a partir de um alvo de RNA ou DNA. NASBA é um método usado para a amplificação contínua de ácidos nucleicos em uma única mistura a uma temperatura. Por exemplo, para a amplificação de RNA, são usadas a transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV), RNase H e RNA polimerase T7. Esse método pode ser realizado de acordo com Heim, et al., Nucleic Acids Res., 26(9):2250-2251 (1998). Resumidamente, uma mistura de reação NASBA contém dois iniciadores específicos, dNTP, NTP, 6,4 U de transcriptase reversa AMV, 0,08 U de RCHa Escherichia coli e 32 U de RNA polimerase T7. A amplificação é realizada durante 120 min a 41°C em um volume total de 20 μl.

[00103] Em um método relacionado, reação autossustentada de replicação de sequência (3SR), amplificação isotérmica de sequências de DNA ou RNA alvo in vitro usando três atividades enzimáticas: transcriptase reversa, RNA polimerase dependente do DNA e ribonuclease H deEscherichia coli. Esse método pode ser modificado de um sistema de 3 enzimas para um sistema de 2 enzimas usando a transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1 em vez da transcriptase reversa do vírus da mieloblastose aviária (AMV) para permitir a amplificação com RNA polimerase T7, mas sem ribonuclease H de E. coli. Na 3SR de 2 enzimas, o RNA amplificado é obtido em uma forma mais pura em comparação com a 3SR de 3 enzimas (Gebinoga & Oehlenschlager Eur J Biochem, 235:256-261 (1996)).

[00104] O SDA é um método de amplificação do ácido nucleico isotérmico. Um iniciador contendo um local de restrição é enovelado ao modelo. Os iniciadores de amplificação são então enovelados a sequências adjacentes a 5’ (formando um corte) e a amplificação é iniciada a uma temperatura fixa. As cadeias de DNA recém-sintetizadas são cortadas por uma enzima de restrição e a amplificação da polimerase começa novamente, deslocando as cadeias recém-sintetizadas. O SDA pode ser realizado de acordo com Walker, et al., PNAS, 89:392-6 (1992). Resumidamente, uma mistura de reação de SDA contém quatro iniciadores SDA, dGTP, dCTP, TTP, dATP, 150 U de Hinc II e 5 U de deficiente em exonuclease do grande fragmento de DNA polimerase I de E. coli (polimerase exo-Klenow). A mistura da amostra é aquecida a 95°C durante 4 minutos para desnaturar o DNA alvo antes da adição das enzimas. Após a adição das duas enzimas, a amplificação é realizada durante 120 min a 37°C em um volume total de 50 μl. Em seguida, a reação é terminada por aquecimento durante 2 min a 95°C.

[00105] O sistema de replicação Q-beta usa o RNA como um modelo. Q-beta replicase sintetiza o genoma de RNA de cadeia simples do colifago Qβ. A clivagem do RNA e a ligação em um ácido nucleico de interesse permitem a replicação dessa sequência quando o RNA é replicado pela Q-beta replicase (Kramer & Lizardi, Trends Biotechnol. 1991 9(2):53-8, 1991).

[00106] Em algumas modalidades, a PCR é usada para amplificar uma sequência alvo ou marcadora de interesse. O versado na técnica é capaz de projetar e preparar iniciadores que são apropriados para amplificar uma sequência alvo ou marcadora. O comprimento dos iniciadores de amplificação depende de vários fatores incluindo a identidade da sequência de nucleotídeos e a temperatura à qual estes ácidos nucleicos são hibridizados ou usados durante a amplificação de ácido nucleico in vitro. As considerações necessárias para determinar um comprimento preferido para um iniciador de amplificação de uma identidade de sequência particular são bem conhecidas para uma pessoa versada. Por exemplo, o comprimento de um ácido nucleico curto ou oligonucleotídeo pode se relacionar com a sua especificidade ou seletividade de hibridização.

[00107] Para analisar mutações e outros ácidos nucleicos variantes, podem ser usados oligonucleotídeos específicos para alelos alternativos. Tais oligonucleotídeos que detectam variações de nucleotídeos únicos (por exemplo, polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs)), inserções ou deleções em sequências alvo podem ser chamados de termos como “sondas alelo-específicas” ou “iniciadores alelo-específicos”. O projeto e uso de sondas alelo-específicas para análise de variações de nucleotídeos é descrito, por exemplo, Mutation Detection A Practical Approach, ed. Cotton et al. Oxford University Press, 1998; Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986); Dattagupta, EP235,726; and Saiki, WO 89/11548. Em uma modalidade, em que a variante é uma deleção, uma sonda ou iniciador pode ser projetado para hibridizar com um segmento de DNA alvo de tal forma que a sonda ou o iniciador abrange a junção 5’ a 3’ da deleção. Em uma modalidade, em que a variante é uma inserção, uma sonda ou iniciador pode ser projetado para hibridizar com um segmento de DNA alvo de tal modo que a sonda ou iniciador inclua a totalidade ou uma porção da sequência de nucleotídeos inserida. Em uma modalidade, em que a variante é um SNP, uma sonda ou iniciador pode ser projetado para hibridizar com um segmento de DNA alvo de tal modo que o SNP alinhe com a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ da sonda ou iniciador. Normalmente, as sondas e iniciadores de alelo específico são projetados para se hibridizar especificamente com a mutação, inserção ou deleção com alta estringência.

[00108] Os controles de ensaio podem ser usados no ensaio para detectar uma sequência de ácido nucleico mutado. Em algumas modalidades, um controle de amplificação positivo interno pode ser incluído na amostra, utilizando iniciadores e/ou sondas de oligonucleotídeos.

[00109] Em algumas modalidades, as sequências de duas ou mais regiões de interesse são amplificadas no mesmo vaso de reação.

[00110] Em algumas modalidades, a amplificação de ácido nucleico inclui um iniciador marcado, permitindo assim a detecção do produto de amplificação desse iniciador. Em modalidades particulares, a amplificação de ácido nucleico inclui uma multiplicidade de iniciadores marcados; tipicamente, tais iniciadores são identificados de forma distinta, permitindo a detecção simultânea de múltiplos produtos de amplificação. Em algumas modalidades, os iniciadores com sequências diferentes são marcados com diferentes porções detectáveis. Em outras modalidades, os iniciadores com sequências diferentes são marcados com a mesma porção detectável e distinguidos por diferentes ligantes cliváveis que ligam o marcador ao iniciador. Os métodos que envolvem iniciadores de marcação usados durante a etapa de amplificação podem ser utilizados de tal modo que os produtos de amplificação são marcados com um marcador detectável e hibridizando o produto de amplificação com sondas de oligonucleotídeos marcadas com um marcador detectável. Os marcadores detectáveis incluem, mas não estão limitados a marcadores luminescentes, marcadores fluorescentes e marcadores radioativos. O produto de amplificação marcado pode ser medido diretamente usando métodos correspondentes ao tipo de marcador usado de acordo com métodos que seriam conhecidos por um versado na técnica. As sondas marcadas podem ser hibridizadas com o produto de amplificação de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica.

[00111] Em um tipo de ensaio baseado em PCR, um iniciador alelo- específico hibridiza com uma região em uma molécula de ácido nucleico alvo que sobrepõe uma sequência de ácido nucleico tendo uma deleção alvo e apenas inicia amplificação de uma forma alélica a que o iniciador apresenta uma complementaridade perfeita. Esse iniciador é usado em conjunto com um segundo iniciador que hibridiza em um local distal. A amplificação procede dos dois iniciadores, produzindo um produto detectável que indica qual forma alélica está presente na amostra de teste.

[00112] Em um outro tipo de ensaio baseado em PCR, um iniciador alelo-específico hibridiza com uma região em uma molécula de ácido nucleico alvo que sobrepõe uma posição SNP ou local de ponto de ruptura de deleção e apenas inicia amplificação de uma forma alélica a que o iniciador apresenta uma complementaridade perfeita (Gibbs, 1989, Nucleic Acid Res., 17:2427-2448). Tipicamente, o nucleotídeo máximo de 3’ do iniciador está alinhado e complementar à posição SNP ou local de ponto de ruptura de deleção da molécula de ácido nucleico alvo. Esse iniciador é usado em conjunto com um segundo iniciador que hibridiza em um local distal. A amplificação procede dos dois iniciadores, produzindo um produto detectável que indica qual forma alélica está presente na amostra de teste. Normalmente, um controle é realizado com um segundo par de iniciadores, um dos quais mostra uma incompatibilidade de base única no local polimórfico e a outra apresenta uma complementaridade perfeita para um local distal. A incompatibilidade de base única impede a amplificação ou reduz substancialmente a eficiência de amplificação, de modo que qualquer produto não detectável é formado ou é formado em quantidades mais baixas ou a um ritmo mais lento. O método geralmente funciona de forma mais eficaz quando a incompatibilidade é na posição máxima de 3’ do oligonucleotídeo (ou seja, a posição máxima de 3’ do oligonucleotídeo alinha com a posição de mutação alvo) porque esta posição é mais desestabilizadora para o alongamento do iniciador (ver, por exemplo, WO 93/22456).

[00113] Em uma modalidade específica, um iniciador contém uma sequência substancialmente complementar a um segmento de uma molécula de ácido nucleico contendo mutação alvo, exceto que o iniciador tem um nucleotídeo incompatível em uma das três posições nucleotídicas na extremidade máxima de 3’ do iniciador, de modo que o nucleotídeo incompatível não forma par de bases com um alelo particular no local da mutação. Em uma modalidade, o nucleotídeo incompatível no iniciador é o segundo a partir do último nucleotídeo na posição máxima de 3’ do iniciador. Em outra modalidade, o nucleotídeo incompatível no iniciador é o último nucleotídeo na posição máxima de 3’ do iniciador.

[00114] Em uma modalidade, o iniciador ou a sonda é marcado com um corante repórter fluorogênico que emite um sinal detectável. Enquanto um corante repórter adequado é um corante fluorescente, qualquer corante repórter que pode ser ligado a um reagente de detecção tal como uma sonda ou iniciador de oligonucleotídeos é adequado para uso na invenção. Tais corantes incluem, mas não estão limitados a Acridina, AMCA, BODIPY, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, Dabcyl, Edans, Eosin, Eritrosina, Fluoresceína, 6-Fam, Tet, Joe, Hex, Oregon Green, Rhodamine, Rhodol Green, Tamra, Rox e Texas Red.

[00115] A presente invenção também contempla reagentes que não contêm (ou são complementares) uma sequência de nucleotídeos mutada aqui identificada, mas que são usados para ensaiar uma ou mais das mutações aqui descritas. Por exemplo, os iniciadores que flanqueiam, mas não hibridizam diretamente com uma posição alvo provida aqui são úteis em reações de extensão de iniciador nas quais os iniciadores hibridizam com uma região adjacente à posição alvo (isto é, dentro de um ou mais nucleotídeos do local de mutação alvo, por exemplo, SNP, inserção ou deleção). Durante a reação da extensão do iniciador, um iniciador tipicamente não é capaz de se estender além de um local de mutação alvo se um determinado nucleotídeo (alelo) estiver presente nesse local alvo e o produto de extensão do iniciador pode ser facilmente detectado para determinar qual alelo (isto é, tipo selvagem ou mutante) está presente. Por exemplo, os ddNTP específicos são tipicamente usados na reação de extensão do iniciador para terminar a extensão do iniciador uma vez que um ddNTP é incorporado no produto da extensão. Assim, reagentes que se ligam a uma molécula de ácido nucleico em uma região adjacente a um local de mutação, mesmo que as sequências ligadas não incluam necessariamente o próprio local de mutação, também são abrangidos pela presente invenção.

Detecção de sequências variantes.

[00116] Os ácidos nucleicos variantes podem ser amplificados antes da detecção ou podem ser detectados diretamente durante uma etapa de amplificação (isto é, métodos “em tempo real”). Em algumas modalidades, a sequência alvo é amplificada e o amplicon resultante é detectado por eletroforese. Em algumas modalidades, a mutação ou variante específica é detectada por sequenciamento do ácido nucleico amplificado, por exemplo, sequenciamento de Sanger ou Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). O sequenciamento de próxima geração diminui os custos e aumenta consideravelmente a velocidade dos métodos padrão de terminação de corantes. Exemplos de NGS incluem, mas não estão limitados a Sequenciamento de assinatura massivamente paralela (MPSS), sequenciamento Polony combinou uma biblioteca in vitro com marcadores pareados com PCR em emulsão, pirosequenciamento 454, sequenciamento Solexa, tecnologia SOLiD, nanoesfera de DNA, molécula única de Heliscope, sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT) e de íons semicondutores.

[00117] Em algumas modalidades, a sequência alvo é amplificada usando um iniciador marcado de tal modo que o amplicon resultante é marcado de forma detectável. Em algumas modalidades, o iniciador é marcado fluorescentemente. Em algumas modalidades, é usado pelo menos um iniciador alelo-específico (por exemplo, um iniciador que abrange o local do ponto de ruptura da deleção, isto é, abrange a junção formada pelas extremidades 5’ e 3’ da deleção).

[00118] Para os métodos aqui providos, um único iniciador pode ser usado para a detecção, por exemplo, como na extensão de iniciador de nucleotídeo único ou na detecção de alelo específico de ácido nucleico contendo a mutação ou pode ser usado um segundo iniciador que pode estar a montante ou a jusante do iniciador alelo-específico. Um ou mais dos iniciadores usados podem ser iniciadores específicos de alelos. Preferivelmente, o iniciador alelo-específico contém uma porção de sequência de tipo selvagem, mais preferivelmente pelo menos cerca de 3 a 40 nucleotídeos consecutivos de sequência de tipo selvagem.

[00119] Em uma modalidade, a detecção de um ácido nucleico variante é realizada usando um ensaio de RT-PCR, tal como o ensaio TaqMan®, o qual também é conhecido como o ensaio de nuclease 5’ (Pat. U.S. n° 5.210.015 e 5.538.848) ou sonda Molecular Beacon (Pat. U.S. n° 5.118.801 e 5.312.728) ou outra sonda sem haste ou linear (Livak et al., 1995, PCR Method Appl., 4:357-362; Tyagi et al, 1996, Nature Biotechnology, 14:303308; Nazarenko et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25:2516-2521; U.S. Pat. nos 5.866.336 e 6.117.635). O teste TaqMan® detecta a acumulação de um produto amplificado específico durante a PCR. O ensaio TaqMan® utiliza uma sonda de oligonucleotídeos marcada com um corante repórter fluorescente e um corante supressor. O corante repórter é excitado por irradiação a um comprimento de onda apropriado, ele transfere energia para o corante supressor na mesma sonda através de um processo chamado transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Quando ligado à sonda, o corante repórter excitado não emite um sinal. A proximidade do corante supressor com o corante repórter na sonda intacta mantém uma fluorescência reduzida para o repórter. O corante repórter e o corante supressor podem estar nas extremidades máxima de 5’ e máxima de 3’, respectivamente ou vice-versa. Alternativamente, o corante repórter pode estar na extremidade máxima de 5’ ou 3’ enquanto o corante supressor está ligado a um nucleotídeo interno ou vice-versa. Ainda em outra modalidade, tanto o repórter como o supressor podem ser ligados a nucleotídeos internos a uma distância um do outro, de modo que a fluorescência do repórter é reduzida.

[00120] Durante a PCR, a atividade de nuclease 5’ de DNA polimerase cliva a sonda, separando assim o corante repórter e o corante supressor e resultando em fluorescência aumentada do repórter. A acumulação de produto de PCR é detectada diretamente monitorando o aumento da fluorescência do corante repórter. A DNA polimerase cliva a sonda entre o corante repórter e o corante supressor somente se a sonda hibridizar com o modelo que contém mutação alvo que é amplificado durante a PCR e a sonda é projetada para hibridizar com o local de mutação alvo somente se um alelo de mutação particular (por exemplo, SNP, inserção ou deleção) está presente.

[00121] As sequências de iniciador e sonda TaqMan® podem ser facilmente determinadas usando a variante e a informação de sequência de ácido nucleico associada aqui provida. Uma série de programas de computador, como o Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), podem ser usados para obter rapidamente conjuntos de iniciadores/sondas ideais. Será evidente para um versado na técnica que tais iniciadores e sondas para detectar as variantes da presente invenção são úteis em ensaios de diagnóstico para distúrbios mieloproliferativos e patologias relacionadas, e podem ser facilmente incorporados em um formato de kit. A presente invenção também inclui modificações do ensaio TaqMan® bem conhecidas na técnica, tais como o uso de sondas Molecular Beacon (Pat. U.S. nos 5.118.801 e 5.312.728) e outros formatos variantes (Pat. U.S. nos 5.866.336 e 6.117.635).

[00122] Em uma modalidade ilustrativa, a PCR em tempo real é realizada usando sondas TaqMan® em combinação com um amplificador/analisador adequado, como o sistema de detecção de sequência ABI Prism® 7900HT. O sistema de detecção de sequência ABI PRISM® 7900HT é um sistema de PCR em tempo real de alto rendimento que detecta e quantifica as sequências de ácido nucleico. Resumidamente, as sondas TaqMan® específicas para a sequência alvo ou marcadora amplificada estão incluídas na reação de amplificação por PCR. Essas sondas contêm um corante repórter na extremidade 5’ e um corante supressor na extremidade 3’. As sondas que hibridizam com diferentes sequências alvo ou marcadoras são conjugadas com um corante repórter fluorescente diferente. Durante a PCR, as sondas com marcação fluorescente ligam-se especificamente às respectivas sequências alvo ou marcadora; a atividade de nuclease 5’ da polimerase Taq cliva o corante repórter da sonda e é gerado um sinal fluorescente. O aumento do sinal de fluorescência é detectado apenas se a sequência alvo ou marcador for complementar à sonda e for amplificada durante a PCR. Uma incompatibilidade entre a sonda e o alvo reduz consideravelmente a eficiência da hibridização e clivagem da sonda. O sistema de detecção de sequência ABI Prism 7700HT ou 7900HT mede o aumento da fluorescência durante o ciclo térmico de PCR, proporcionando a detecção “em tempo real” da acumulação de produtos de PCR. A detecção em tempo real no detector de sequências ABI Prism 7900HT ou 7900HT monitora a fluorescência e calcula Rn durante cada ciclo de PCR. O ciclo limiar ou o valor Ct, é o ciclo no qual a fluorescência corta o valor de limiar. O valor de limiar é determinado pelo software do sistema de detecção de sequência ou manualmente.

[00123] Outros métodos de hibridização de sonda detectados em tempo real podem ser usados para detectar a amplificação de uma sequência alvo ou marcadora flanqueando uma região de repetição em tandem. Por exemplo, as sondas MGB Eclipse™ comercialmente disponíveis (Epoch Biosciences), que não dependem de uma degradação da sonda podem ser usadas. As sondas MGB Eclipse™ funcionam através de um mecanismo de fluorescência desencadeada por hibridização. As sondas MGB Eclipse™ têm o supressor de fluorescência Eclipse™ e o MGB posicionado na extremidade 5’ da sonda. O fluoróforo está localizado na extremidade 3’ da sonda. Quando a sonda está em solução e não hibridizada, a conformação tridimensional traz o supressor próximo ao fluoróforo e a fluorescência é suprimida. No entanto, quando a sonda se enovela a uma sequência alvo ou marcadora, a sonda é desdobrada, o supressor é movido do fluoróforo e a fluorescência resultante pode ser detectada.

[00124] Os fragmentos amplificados podem ser detectados usando métodos padrão de eletroforese em gel. Por exemplo, em modalidades preferidas, as frações amplificadas são separadas em um gel de agarose e coradas com brometo de etídio por métodos conhecidos na técnica para detectar fragmentos amplificados.

[00125] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos amplificados são detectados por hibridização com uma sonda de mutação específica. Os oligonucleotídeos de sonda, complementares a uma porção da sequência alvo amplificada, podem ser usados para detectar fragmentos amplificados. Os ácidos nucleicos amplificados para cada uma das sequências alvo podem ser detectados simultaneamente (isto é, no mesmo vaso de reação) ou individualmente (isto é, em vasos de reação separados). Em algumas modalidades, o DNA amplificado é detectado simultaneamente, usando duas sondas de oligonucleotídeos de genes específicos marcadas de forma distinta, uma que hibridiza com a primeira sequência alvo e uma que hibridiza com a segunda sequência alvo. Podem ser projetadas sondas de oligonucleotídeos que estão entre cerca de 10 e cerca de 100 nucleotídeos de comprimento e hibridizam com a região amplificada. As sondas de oligonucleotídeos tem preferivelmente 12 a 70 nucleotídeos; mais preferivelmente de 15 a 60 nucleotídeos de comprimento; e mais preferivelmente 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. A sonda pode ser marcada.

[00126] Outra metodologia de detecção adequada envolve o projeto e o uso de combinações de iniciadores/sondas bipartidos, como as sondas Scorpion™. Essas sondas executam iniciação de sequência específica e a detecção de produto de PCR é conseguida usando uma única molécula. As sondas Scorpion™ compreendem um iniciador 3’ com uma cauda de sonda estendida 5’, compreendendo uma estrutura de grampo que possui um par fluoróforo/supressor. A cauda da sonda é “protegida” da replicação na direção 5’ a 3’ pela inclusão de hexetileno glicol (HEG) que bloqueia a polimerase de replicar a sonda. O fluoróforo está ligado à extremidade 5’ e é suprimido por uma porção acoplada à extremidade 3’. Após a extensão do iniciador Scorpion™, a sequência de sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento dentro do amplicon estendido, abrindo assim a alça tipo grampo. Isso evita a supressão da fluorescência e observa-se um sinal. Um alvo específico é amplificado pelo iniciador reverso e pela porção de iniciador do Scorpion™, resultando em um produto de extensão. Um sinal fluorescente é gerado devido à separação do fluoróforo do supressor resultante da ligação do elemento de sonda do Scorpion™ ao produto de extensão. Tais sondas são descritas em Whitcombe et al., Nature Biotech 17: 804-807 (1999).

[00127] Em algumas modalidades, dois ou mais ensaios são realizados para a detecção de qualquer das variantes aqui descritas. Em algumas modalidades, a identidade de qualquer das variantes aqui descritas é confirmada por sequenciamento de ácido nucleico.

Isolamento de proteínas CALR

[00128] As proteínas CALR com e sem mutações de deleções (por exemplo, uma deleção p.E381_A382>A, uma deleção p.D397_D400>D e uma deleção p.E405_V409>V) e/ou outras mutações aqui descritas podem ser recuperadas a partir de amostra biológica de um indivíduo, meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se for ligado à membrana, pode ser liberado da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton- X 100) ou por clivagem enzimática. As células empregadas na expressão da proteína CALR podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, ruptura mecânica ou agentes de lise celular.

[00129] Em algumas modalidades, a sequência de codificação para a proteína CALR mutante ou tipo selvagem é expressa em uma célula de mamífero através do uso de um sistema de expressão de mamífero, induzível ou constitutivamente, após a introdução do sistema de expressão de mamífero juntamente com as sequências de codificação de interesse na célula de mamífero. Exemplos de células de mamífero incluem, mas não estão limitados a células COS-7, células HEK-293, células U20S e HeLa.

[00130] Pode ser desejado purificar a proteína CALR a partir de proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: por fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação de sulfato de amônio; filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas de quelação de metal para ligar as formas marcadas com epítopo da CALR. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser utilizados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology (1990), 182:83-89; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção, fonte de CALR usada e CALR particular produzida.

Detecção de proteínas CALR

[00131] Vários métodos para a detecção de proteínas são bem conhecidos na técnica. A detecção das proteínas pode envolver a resolução das proteínas por eletroforese em SDS de poliacrilamida em gel (SDS PAGE), seguido pela coloração das proteínas com mancha adequada, por exemplo, o azul de Coomassie. As proteínas CALR com e sem mutação podem ser diferenciadas uma da outra e também de outras proteínas por análise de Western blot usando anticorpos de mutação específica. Os métodos para realizar um Western blot são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em W. Burnette W. N. Anal. Biochem. 1981; 112 (2): 195-203.

[00132] Alternativamente, a citometria de fluxo pode ser aplicada para detectar a proteína CALR mutante e de tipo selvagem. Anticorpos específicos para a proteína mutante ou de tipo selvagem podem ser acoplados a esferas e podem ser usados na análise de citometria de fluxo.

[00133] Em algumas modalidades, as micromatrizes de proteínas podem ser aplicadas para identificar as várias variantes da proteína CALR. Os métodos das matrizes de proteínas são bem conhecidos na técnica. Em um exemplo, os anticorpos específicos para cada proteína podem ser imobilizados na superfície sólida tal como membrana de vidro ou de nylon. As proteínas podem então ser imobilizadas na superfície sólida através da ligação dos anticorpos específicos. Podem aplicar-se anticorpos que se ligam especificamente a um segundo epítopo (por exemplo, um epítopo comum ao mutante e ao tipo selvagem) das proteínas CALR. O primeiro complexo de anticorpo/proteína/segundo anticorpo pode então ser detectado usando um anticorpo secundário marcado de forma detectável. O marcador detectável pode ser detectado como aqui provido para polinucleotídeos e como é conhecido na técnica.

[00134] Em algumas modalidades, as proteínas CALR recombinantes podem ser manipuladas para conter a mutação de deleção. Em algumas modalidades, as proteínas CALR recombinantes contêm um marcador de epítopo (por exemplo, um marcador de peptídeo, tal como um marcador myc ou HA). Em algumas modalidades, o marcador do epítopo pode ser removido da proteína após a expressão e/ou a purificação da proteína recombinante.

Produção e triagem de anticorpos

[00135] Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos contra epítopos da proteína CALR que podem ser usados para distinguir entre as variantes de proteínas. Tais anticorpos incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia simples e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab.

[00136] Os anticorpos podem ser marcados radioativamente, permitindo que se acompanhe sua localização e distribuição no organismo após a injeção. Os anticorpos marcados com radioatividade podem ser usados como uma ferramenta de diagnóstico não invasiva para formação de imagem de células novas de tumores e metástases.

[00137] Também podem ser projetadas imunotoxinas que alvejam agentes citotóxicos a locais específicos do corpo. Por exemplo, os anticorpos monoclonais específicos da CALR de alta afinidade podem ser complexados covalentemente com toxinas bacterianas ou vegetais, como a toxina da difteria, abrina ou ricina. Um método geral de preparação de moléculas de anticorpo/híbrido pode envolver o uso de reagentes de reticulação de tiol tais como SPDP, que atacam os grupos amino primários no anticorpo e por troca de dissulfeto, prendem a toxina ao anticorpo. Os anticorpos híbridos podem ser usados para eliminar especificamente as células que expressam a proteína CALR mutante.

[00138] Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com o comprimento completo ou fragmento de proteínas CALR, incluindo, mas não limitado a coelhos, camundongos, ratos, etc. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, incluindo, mas não se limitando a géis minerais de Freund (completos e incompletos) tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilos Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

[00139] Os anticorpos monoclonais para proteínas CALR podem ser preparados usando qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura. Estes incluem, mas não estão limitados à técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler and Milstein, (Nature (1975), 256:495-497), à técnica humana de hibridoma de células B (Kosbor et al., Immunology Today (1983), 4:72; Cote et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80:2026-2030) e à técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos” por emenda dos genes a partir de uma molécula de anticorpo de camundongo de especificidade de antígeno apropriado juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada podem ser usadas (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81:6851-6855; Neuberger et al., Nature (1984), 312:604-608; Takeda et al., Nature (1985), 314:452-454). Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Pat. U.S. n° 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos da proteína CALR.

[00140] Os fragmentos de anticorpos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, esses fragmentos incluem, mas não estão limitados aos: fragmentos F(ab’)2 que podem ser produzidos pela digestão com pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes dissulfeto dos fragmentos F(ab’) 2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão Fab podem ser construídas (Huse et al., Science, 1989; 246: 1275-1281) para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada.

Métodos de tratamento

[00141] Os métodos de tratamento de distúrbios mieloproliferativos também são providos aqui e podem ser usados em combinação com o método diagnóstico e prognóstico provido para a detecção e monitoramento das mutações CALR descritas (por exemplo, uma deleção p.E381_A382>A, uma deleção p.D397_D400>D e uma deleção p.E405_V409>V). Em algumas modalidades, métodos para detectar mutações CALR são providos para tratamento, diagnóstico, prognóstico e/ou gerenciamento de uma doença ou condição relacionada a um distúrbio mieloproliferativo. Em algumas modalidades, são providos métodos para detectar mutações CALR para tratar um câncer ou doença ou condição relacionada com uma mutação CALR, em conjunto com uma ou mais terapias eficazes no tratamento do câncer ou doença, incluindo mas não limitado a terapia medicamentosa (por exemplo, fármaco quimioterapêutico), tratamento de radiação (por exemplo, raio-x, raio-Y ou elétron, próton, nêutron ou feixe de partículas), aquecimento de hipertermia (por exemplo, micro-ondas, ultrassom, ablação por radiofrequência), terapia de vacina, terapia genética, terapia fotodinâmica, cirurgia e transplante de medula óssea ou células-tronco.

[00142] Os tratamentos exemplificativos para neoplasias mieloproliferativas incluem, mas não estão limitados a flebotomia, obtenção de plaquetas por aférese, terapia transfusional, quimioterapia, radioterapia (por exemplo, radioterapia externa ou interna com substâncias radioativas) outros fármacos terapêuticos (por exemplo, prednisona, danazol, anagrelida, aspirina de baixa dose, talidomida, lenalidomida e pomolidomida), cirurgia (por exemplo, esplenectomia), terapia biológica (por exemplo, agentes imunoterapêuticos, como interferon alfa, interferon alfa peguilado e fatores de crescimento eritropoiéticos), terapia alvejada (por exemplo, inibidores da tirosina quinase, como o ruxolotinibe), quimioterapia de alta dose com transplante de células-tronco.

[00143] Em algumas modalidades, são providos métodos para detectar e identificar mutações CALR para o tratamento de mutações CALR relacionadas a uma doença ou condição ou câncer, por exemplo, uma neoplasia mieloproliferativa, em um indivíduo, administrando ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição incluindo um ou mais agentes quimioterapêuticos adequados. Em algumas modalidades, um ou mais agentes quimioterapêuticos adequados são selecionados de um agente alquilante, incluindo, mas não limitado a, adozelesina, altretamina, bizelesina, bussulfano, carboplatina, carboquona, carmustina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, estramustina, fotemustina, hepsulfam, ifosfamida, improssulfano, irofulven, lomustina, mecloretamina, melfalan, oxaliplatina, pipossulfano, semustina, estreptozocina, temozolomida, tiotepa e treossulfano; um antibiótico, incluindo, mas não limitado a, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, menogaril, mitomicina, mitoxantrona, neocarzinostatina, pentostatina e plicamicina; um antimetabólito, incluindo, mas não limitado a azacitidina, capecitabina, cladribina, clofarabina, citarabina, decitabina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracila, ftorafur, gemcitabina, hidroxiureia, mercaptopurina, metotrexato, nelarabina, pemetrexed, raltitrexed, tioguanina e trimetrexato; uma imunoterapia, incluindo, mas não limitada a alemtuzumabe, bevacizumabe, cetuximabe, galiximabe, gemtuzumabe, panitumumabe, pertuzumabe, rituximabe, tositumomabe, trastuzumabe e 90 Y ibritumomabe tiuxetano; um hormônio ou antagonista hormonal, incluindo, mas não limitado a anastrozol, androgênios, buserelina, dietilstilbestrol, exemestano, flutamida, fulvestranto, goserelina, idoxifeno, letrozol, leuprolida, magestrol, raloxifeno, tamoxifeno e toremifeno; um taxano, incluindo, mas não limitado a DJ-927, docetaxel, TPI 287, paclitaxel e DHA- paclitaxel; um retinoide, incluindo, mas não limitado a alitretinoína, bexaroteno, fenretinido, isotretinoína e tretinoína; um alcaloide, incluindo, mas não limitado a etopósido, homoharringtonina, tenipósido, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina; um agente antiangiogênico, incluindo, mas não limitado a AE-941 (GW786034, Neovastat), ABT-510, 2- metoxiestradiol, lenalidomida e talidomida; um inibidor de topoisomerase, incluindo, mas não limitado a amsacrina, edotecarina, exatecano, irinotecano (também metabólito ativo SN-38 (7-etil-10-hidroxi-camptotecina)), rubitecano, topotecano e 9-aminocamptotecina; um inibidor de quinase, incluindo, mas não limitado a erlotinibe, gefitinibe, flavopiridol, mesilato de imatinibe, lapatinibe, sorafenibe, malato de sunitinibe, AEE-788, AG-013736, AMG 706, AMN107, BMS-354825, BMS-599626, UCN- 01 (7- hidroxistaurosporina) e vatalanibe; um inibidor de transdução de sinal alvo incluindo, mas não limitado a bortezomibe, geldanamicina e rapamicina; um modificador de resposta biológica, incluindo, mas não limitado a imiquimod, interferon-α e interleucina-2; e outros quimioterapêuticos, incluindo, mas não se limitando a 3-AP (3-amino-2-carboxialdeído-tiossemicarbazona), aminoglutetimida, asparaginase, briostatina-1, cilengitide, E7389, ixabepilona, procarbazina, sulindac, temsirolimus, tipifarnibe. Os agentes quimioterapêuticos comumente usados para o tratamento de neoplasias mieloproliferativas incluem, mas não estão limitados a trióxido de arsênio, azacitidina, ciclofosfamida, citarabina, dasatinibe, cloridrato de daunorrubicina, decitabina, cloridrato de doxorrubicina, mesilato de imatinibe, nilotinibe, fosfato de ruxolitinibe e sulfato de vincristina.

[00144] As vias e a frequência de administração dos agentes terapêuticos aqui descritos, bem como a dosagem, variam de indivíduo para indivíduo, bem como com o fármaco selecionado, e podem ser facilmente estabelecidas usando técnicas padrão. Em geral, as composições farmacêuticas podem ser administradas, por injeção (por exemplo, intracutânea, intratumoral, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), por via intranasal (por exemplo, por aspiração) ou por via oral. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é administrada por via oral. Em um exemplo, entre 1 e 10 doses podem ser administradas durante um período de 52 semanas. Preferivelmente, são administradas 6 doses, em intervalos de 1 mês, e os tratamentos de reforço podem ser administrados periodicamente depois disso. Protocolos alternativos podem ser apropriados para pacientes individuais. Em uma modalidade, 2 injeções intradérmicas da composição são administradas com 10 dias de intervalo.

[00145] Uma “forma de dosagem oral sólida”, “forma de dosagem oral”, “forma de dose unitária”, “forma de dosagem para administração oral” e semelhantes são usadas de forma intercambiável e referem-se a uma composição farmacêutica na forma de um comprimido, cápsula, comprimido revestido, cápsula gelatinosa, pílula e similares.

[00146] As formas de dosagem tipicamente incluem um “excipiente”, que como aqui usado, é qualquer componente de uma forma de dosagem que não é uma API. Os excipientes incluem aglutinantes, lubrificantes, diluentes, desintegrantes, revestimentos, componentes da camada de barreira, deslizantes e outros componentes. Os excipientes são conhecidos na técnica (ver HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS, FIFTH EDITION, 2005, editado por Rowe et al., McGraw Hill). Alguns excipientes atendem a múltiplas funções ou são chamados excipientes de alta funcionalidade. Por exemplo, o talco pode atuar como um lubrificante e um antiaderente e um deslizante. Ver Pifferi et al., 2005, “Quality and functionality of excipients” Farmaco. 54:1-14; e Zeleznik and Renak, Business Briefing: Pharmagenerics 2004.

[00147] Uma dose adequada é uma quantidade de um composto que, quando administrado como descrito acima, é capaz de promover uma resposta terapêutica anticancerígena e é pelo menos 10 a 50% acima do nível basal (isto é, não tratado). Essa resposta pode ser monitorada usando métodos convencionais. Em geral, para composições farmacêuticas, a quantidade de cada fármaco presente em uma dose varia de cerca de 100 μg a 5 mg por kg de hospedeiro, mas os versados na técnica apreciarão que as doses específicas dependem do fármaco a ser administrado e não são necessariamente limitadas a esta faixa geral. Do mesmo modo, volumes adequados para cada administração irão variar com o tamanho do paciente.

[00148] No contexto do tratamento, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um fármaco é uma quantidade de ou seu sal farmaceuticamente aceitável que elimina, alivia ou provê alívio dos sintomas para os quais é administrado. As composições descritas são administradas de qualquer maneira adequada, frequentemente com carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Os métodos adequados de administração de tratamento no contexto da presente invenção a um indivíduo estão disponíveis e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode frequentemente prover uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo ou para inibir a progressão da doença. Dessa forma, a composição é administrada a um indivíduo em uma quantidade suficiente para provocar uma resposta eficaz e/ou aliviar, reduzir, curar ou pelo menos parcialmente reprimir sintomas e/ou complicações da doença. Uma quantidade adequada para realizar isso é definida como uma “dose terapeuticamente eficaz”.

[00149] Em geral, uma dosagem e regime de tratamento apropriado envolve a administração do(s) composto(s) ativo(s) em uma quantidade suficiente para prover um benefício terapêutico e/ou profilático. Essa resposta pode ser monitorada estabelecendo um resultado clínico melhorado (por exemplo, remissões mais frequentes, completas ou parciais ou maior sobrevivência livre de doença) em pacientes tratados em comparação com pacientes não tratados.

Kits

[00150] As presentes invenções também contemplam sistemas de diagnóstico em forma de kit. Em algumas modalidades, um kit pode ser usado para conduzir os métodos de diagnóstico, prognóstico ou tratamento aqui descritos. Em algumas modalidades, um kit pode ser usado como um diagnóstico complementar para a detecção de uma mutação indel do éxon 9 de CALR em um indivíduo que recebeu um ou mais tratamentos para uma doença ou condição relacionada a CALR ou uma doença ou condição relacionada a JAK2. Em algumas modalidades, a doença ou condição relacionada a CALR ou uma doença ou condição relacionada a JAK2 é uma doença mieloproliferativa, como policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática e doença mieloproliferativa não classificada. Tipicamente, o kit deve conter, em um carreador ou recipiente compartimentado, reagentes úteis em qualquer uma das modalidades descritas acima dos métodos.

[00151] Um sistema diagnóstico aqui provido pode incluir um kit que contenha, em uma quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, qualquer uma das sondas de ensaio de hibridização e iniciadores de amplificação para a detecção de ácidos nucleicos de tipo selvagem de CALR e mutantes e/ou anticorpos contra proteínas de tipo selvagem de CALR e mutantes em um material de acondicionamento. Em algumas modalidades, o kit compreende adicionalmente reagentes para a detecção de mutações adicionais em um ou mais genes envolvidos na doença mieloproliferativa, como, por exemplo, um gene que codifica uma proteína de via JAK-STAT.

[00152] Em algumas modalidades, o kit inclui um ou mais iniciadores ou sondas adequadas para amplificação e/ou sequenciamento. Os iniciadores exemplificativos incluem iniciadores selecionados de SEQ ID NOs: 10-13. Os iniciadores podem ser marcados com um marcador detectável, como isótopos radioativos ou marcadores de fluorescência.

[00153] Tipicamente, os kits também incluirão instruções gravadas em uma forma tangível (por exemplo, contidas em papel ou um meio eletrônico) para usar as sondas, iniciadores e/ou anticorpos acondicionados em um ensaio de detecção para determinar a presença ou quantidade de ácido nucleico ou proteína mutante em uma amostra de teste.

[00154] Os vários componentes dos sistemas diagnóstico podem ser providos em uma variedade de formas. Por exemplo, as enzimas requeridas, os nucleotídeos trifosfatos, as sondas, iniciadores e/ou anticorpos podem ser providos como um reagente liofilizado. Esses reagentes liofilizados podem ser pré-misturados antes da liofilização de modo que quando reconstituídos formam uma mistura completa com a razão adequada de cada um dos componentes prontos para uso no ensaio. Além disso, os sistemas diagnósticos das presentes invenções podem conter um reagente de reconstituição para reconstituir os reagentes liofilizados do kit. Em kits preferidos, as enzimas, os nucleotídeos trifosfatos e os cofatores requeridos para as enzimas são providos como um único reagente liofilizado que, quando reconstituído, forma um reagente adequado para uso nos métodos de amplificação presentes.

[00155] Em algumas modalidades, o kit inclui tampões adequados, reagentes para isolar ácido nucleico e instruções de uso. Os kits também podem incluir uma micromatriz que contém sondas de ácido nucleico ou peptídeo para a detecção de genes mutantes ou proteínas codificadas, respectivamente.

[00156] Em algumas modalidades, os kits podem conter adicionalmente um suporte sólido para ancorar o ácido nucleico ou proteínas de interesse sobre o suporte sólido. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo pode ser ancorado ao suporte sólido, direta ou indiretamente, através de uma sonda de captura ancorada ao suporte sólido e capaz de hibridizar com o ácido nucleico de interesse. Exemplos de tais suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a grânulos, micropartículas (por exemplo ouro e outras nanopartículas), micromatriz, micropoços, placas de multipoços. As superfícies sólidas podem compreender um primeiro membro de um par de ligação e a sonda de captura ou o ácido nucleico alvo podem compreender um segundo membro do par de ligação. A ligação dos membros do par de ligação irá ancorar a sonda de captura ou o ácido nucleico alvo na superfície sólida. Exemplos de tais pares de ligação incluem, mas não estão limitados a biotina/estreptavidina, hormônio/receptor, ligante/receptor, antígeno/anticorpo.

[00157] O acondicionamento exemplificativo para o kit pode incluir, por exemplo, um recipiente ou suporte, na forma de, por exemplo, saco, caixa, tubo, suporte e é opcionalmente compartimentado. O acondicionamento pode definir um confinamento fechado por motivos de segurança durante o transporte e armazenamento.

[00158] Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção. Esses exemplos não pretendem, de forma alguma, limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Identificação de deleções in-frame do éxon 9 de CALR

[00159] Determinamos a frequência de alterações in-frame da proteína no éxon 9 de CALR em amostras submetidas a descarte/suspeita de uma neoplasia mieloproliferativa (RO MPN). Também avaliamos se as alterações in-frame de CALR são associadas diferencialmente a mutações de deslocamento de quadro de leitura de CALR de +1 pb ou com JAK2 V617F ou outras mutações somáticas em genes associados a MPN.

[00160] As mutações de CALR foram avaliadas em 1394 amostras de sangue negativo JAK2 V617F (n = 1253) e medula óssea (n = 141) inicialmente submetidas para RO MPN. Um conjunto adicional de 94 amostras JAK2 V671F positivas também foi testado para mutações CALR.

[00161] A análise de mutação do éxon 9 de CALR foi realizada em DNA genômico extraído das amostras de sangue, aspirado de medula óssea ou seções fixas de biópsia de medula óssea usando um teste de sequência de Sanger com uma sensibilidade analítica de pelo menos 15% (limite mínimo de detecção). Um subconjunto de casos foi adicionalmente avaliado com quantificação de mutação usando um painel de sequenciamento de Íon Torrent para avaliar o éxon 9 de CALR, o éxon 14 e o éxon 17 de CSF3R, o éxon 12 ou o éxon 14 de JAK2 e o éxon 10 MPL; um segundo painel avaliando ASXL1 (Additional Sex Combs Like 1), EZH2 (intensificador do homólogo zeste 2), IDH1 (isocitrato desidrogenase 1), IDH2 (isocitrato desidrogenase 2), KRAS (homólogo de oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten), NRAS (homólogo de oncogene viral de neuroblastoma RAS (v-ras)) e TET2 (tet metilcitosina dioxigenase 2); ou um painel extenso Illumina TruSeq avaliando esses genes e outros 18 genes associados à MPN (isto é, ASXL1, CALR, CBL, CEBPA, CSF3R, DDX41, DNMT3A, EZH2, FLT3, GATA1, IDH1, IDH2, JAK2, KDM6A, KIT, KRAS MPL, NPM1, NRAS, PTPN11, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SRSF2, TET2, TP53, U2AF1, WT1 e ZRSR2). Um ensaio de dimensionamento também foi realizado (ensaio MLL PTD). Os 29 genes e os éxons correspondentes testados por sequenciamento MiSeq (417 amplicons) estão listados na Tabela 1. Esse painel de sequenciamento inclui quase todos os marcadores de mutação prognósticos importantes atualmente conhecidos (ou genes mutados diferencialmente) em AML, MDS e MPN/MDS. Esses ensaios apresentaram sensibilidade de aproximadamente 5%. As mutações JAK2 V617F foram quantificadas usando um teste de pirosequenciamento com uma sensibilidade analítica de 1%. Tabela 1: Éxons para cada gene ou éxons parciais ou completos são cobertos no painel

[00162] O sequenciamento Illumina MiSeq emprega um método baseado em terminador de corante fluorescente reversível para sequenciar milhões de moléculas de DNA em paralelo, detectando a incorporação de bases simples durante a síntese de DNA. A preparação da biblioteca de DNA baseia-se no método Illumina TruSeq Custom Amplicon (TSCA) que envolve o uso de um conjunto de sondas de DNA para hibridizar especificamente às regiões alvo, em seguida, pela extensão e ligação da sonda para formar DNA de cadeia dupla que é amplificado sequencialmente para sequenciar os modelos de DNA. O protocolo envolve as seguintes etapas: 1) extração de DNA; 2) hibridização e limpeza de sondas de DNA; 3) PCR com adição de índice; 4) geração e sequenciamento de agrupamento no sistema Illumina MiSeq.

[00163] Resumidamente, o DNA é extraído de sangue total, aspirado de medula óssea ou glóbulos de células fixas. As sondas de oligonucleotídeos são agrupadas em um único tubo de amplicon personalizado (CAT) contendo todas as sondas necessárias para hibridizar com as regiões alvejadas. As sondas personalizadas são adicionadas a cada amostra e hibridizadas com as regiões genômicas específicas alvejadas pela diminuição lenta de temperatura de 95°C para 40°C dentro de 80 minutos, seguido de uma etapa de purificação para remover quaisquer sondas não ligadas. Em seguida, uma etapa de extensão-ligação é realizada pela adição de DNA polimerase e DNA-ligase para gerar fragmentos de DNA de cadeia dupla que são flanqueados por sequências comuns necessárias para amplificação por PCR. As sequências de índice de multiplexação específicas de amostra são então adicionadas a cada biblioteca por PCR usando sequências comuns incluídas nas sondas e iniciadores de PCR de índice. O produto de PCR é então purificado e quantificado usando PCR em tempo real. Até 24 bibliotecas individuais de indexação única são misturadas igualmente, desnaturadas e diluídas para fazer uma biblioteca agrupada a uma concentração de 20 pM. Essa biblioteca agrupada é ainda desnaturada por calor antes de ser adicionada ao cartucho de reagente MiSeq que é então carregado no MiSeq para sequenciamento. Uma visão geral dos métodos de sequenciamento é provido na Figura 1.

[00164] Os dados de sequenciamento são baseados no uso do software Illumina Basecaller, alinhados usando o software SeqNext (JSI Medical Systems) ou GATK/BWA usando GRCh37/hg19 como sequência de referência e as mutações são chamadas e anotadas pelo software SeqNext ou Alamut (ver CHA MO.061). Este relatório de teste qualitativo é “POSITIVO” ou “NEGATIVO” para mutação(ões) nos 29 genes no painel de sequenciamento, bem como o ensaio de dimensionamento de MLL PTD. Ele pode ser usado para detectar o intervalo de mutações presentes em uma neoplasia mieloide ou relatada no diagnóstico e para monitorar a resposta de recidiva ou terapia de pacientes em comparação com o nível de leitura de mutação na amostra inicial. Exemplos de iniciadores empregados para a detecção da variante CALR são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2

[00165] O estado de mutação do éxon 9 de CALR foi avaliado em 1394 amostras submetidas para RO MPN que foram negativas para a mutação JAK2 V617F. Destes, 264 (18,9%) apresentaram mutações típicas de deslocamento de quadro de leitura +1, incluindo 150 com L367fs*46 (tipo 1), 71 com K385fs*47 e 43 com outros deslocamentos de quadro de leitura +1 envolvendo códons 367-379, 373-374 e 384- 385. Dois casos (0,1%) tiveram mutações pontuais (E381A e D373N). Nove casos (0,6%) tiveram deleções in-frame, incluindo p.D397_D400>D (n = 6, Figura 2), p.E381_A382>A (n = 2) e p.E405_V409>V (n = 1). Todas as deleções in-frame E9 estavam presentes em aproximadamente 50% das leituras, sugerindo um polimorfismo da linha germinal (Tabela 3). Os diagnósticos clínicos nestes indels in-frame foram citopenia/mielofibrose, TE, trombocitose/anemia e RO MPN não especificada. Tabela 3. Alterações de sequência indel no éxon 9 da CALR in-frame

[00166] Em um conjunto paralelo de 94 amostras NMP positivas para JAK2 V617F, foram observadas mutações CALR em apenas 2 amostras: a deleção in-frame p.D397_D400>D foi detectada em um caso de TE com 28% de mutação JAK2 V617F e uma mutação CALR K385fs*47 foi detectada em níveis heterozigóticos em um caso com JAK2 V617F de baixo nível (4,2%). Entre 185 casos com diagnóstico referencial de leucemia mieloide aguda (LMA) ou síndrome mielodisplásica (SMD), a deleção in-frame p.D397_D400>D foi observada em um caso de pancitopenia.

[00167] A região C-terminal da calreticulina funciona na ligação ao cálcio, com uma mudança no ponto isoelétrico (pI) de proteínas de tipo selvagem para proteínas mutantes vistas na NMP provavelmente influenciando o grau de ligação de cálcio (Shivarov et al. Blood Cancer Journal 2014 4:e185). O gene da CALR é altamente conservado, com sua sequência C-terminal ácida não estruturada idêntica em muitas espécies. No entanto, a sequência de chimpanzé de consenso (P. troglodytes) mostra uma deleção similar de resíduos ácidos envolvendo códons 493-497 em comparação com as outras proteínas (Figura 2B). A perda de alguns resíduos ácidos nas variantes acima deslocaria o pI, possivelmente afetando a função chaperona (Villamil et al. J Biol Chem 2010 Feb 12;285(7):4544-53; Jorgensen et al. Protein Pept Lett 2005 Oct;12(7):687-93

[00168] Para avaliar as outras características das amostras contendo estas variantes, testamos mutações em 28 genes adicionais associados à NMP (Tabela 1). As mutações somáticas definitivas foram detectadas em 5 (50%) dos 10 casos indel de CALR in-frame, incluindo MPL (W515L, 40%; D163Y,12%), CSF3R (A470T 46%), ASXL1 (D954fs*26, 45%), e ZRSR2 (S449_R450dup, 27%). A frequência de mutações em CSF3R e MPL foi maior que em amostras RO NMP de todos os tipos.

[00169] Em resumo, verificou-se que as deleções in-frame do éxon 9 de CALR ocorreram em 0,6% das amostras submetidas para o tratamento de neoplasias mieloides e estavam sempre presentes em níveis heterozigóticos, favorecendo a classificação como variantes de sequência normal. Verificou-se também que 50% dessas variantes apresentavam mutação adicional em outro gene associado à NMP. A deleção em quadro p.D397_D400>D foi a alteração mais comum, mas outras deleções in-frame envolvendo a região ácida C- terminal foram observadas. Esses polimorfismos de tamanho relativamente comum em CALR indicam que os ensaios de dimensionamento para o diagnóstico de mutações patogênicas de deslocamento de quadro de leitura +1 podem precisar ser complementados por sequenciamento de DNA definitivo para identificar as mutações de deleção. As amostras RO NMP com deleções in-frame da CALR podem ser associadas a uma maior frequência de mutações da via patogênica JAK-STAT.

[00170] Deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferidas e características opcionais, a modificação, melhoria e variação das invenções aqui incorporadas aqui descritas podem ser recorridas pelos versados na técnica e que tais modificações, melhorias e as variações são consideradas dentro do escopo desta invenção. Os materiais, métodos e exemplos providos aqui são representativos de modalidades particulares, são exemplificativos e não se destinam a limitar o alcance da invenção.

[00171] A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies mais estreitas e agrupamentos subgenéricos que se enquadram na descrição genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma limitação provisória ou negativa que remove qualquer assunto do gênero, independentemente de o material excisado ser ou não explicitamente descrito neste documento.

[00172] Além disso, quando características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que a invenção também é descrita desse modo em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[00173] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporadas por referência na sua totalidade, na mesma extensão que se cada uma delas fosse incorporada por referência individualmente. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, irá controlar.

[00174] As invenções aqui descritas de forma ilustrativa podem ser adequadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente descritos aqui. Dessa forma, por exemplo, os termos “compreendendo”, “incluindo”, contendo “, etc., devem ser lidos de forma expansiva e sem limitação. Além disso, os termos e expressões aqui utilizados foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas porções, mas é reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do escopo da invenção reivindicada.

[00175] Modalidades adicionais são apresentadas nas seguintes reivindicações. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS >SEQ ID NO:1 >Sequência de codificação de nucleotídeos de CALR ATGCTGCTATCCGTGCCGCTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGCCG TCGCCGAGCCTGCCGTCTACTTCAAGGAGCAGTTTCTGGACGGAG ACGGGTGGACTTCCCGCTGGATCGAATCCAAACACAAGTCAGATT TTGGCAAATTCGTTCTCAGTTCCGGCAAGTTCTACGGTGACGAGGA GAAAGATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAGGATGCACGCTTTTATGC TCTGTCGGCCAGTTTCGAGCCTTTCAGCAACAAAGGCCAGACGCTG GTGGTGCAGTTCACGGTGAAACATGAGCAGAACATCGACTGTGGG GGCGGCTATGTGAAGCTGTTTCCTAATAGTTTGGACCAGACAGAC ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCT GTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGG GCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATG AGTTTACACACCTGTACACACTGATTGTGCGGCCAGACAACACCTA TGAGGTGAAGATTGACAACAGCCAGGTGGAGTCCGGCTCCTTGGA AGACGATTGGGACTTCCTGCCACCCAAGAAGATAAAGGATCCTGA TGCTTCAAAACCGGAAGACTGGGATGAGCGGGCCAAGATCGATGA TCCCACAGACTCCAAGCCTGAGGACTGGGACAAGCCCGAGCATAT CCCTGACCCTGATGCTAAGAAGCCCGAGGACTGGGATGAAGAGAT GGACGGAGAGTGGGAACCCCCAGTGATTCAGAACCCTGAGTACAA GGGTGAGTGGAAGCCCCGGCAGATCGACAACCCAGATTACAAGGG CACTTGGATCCACCCAGAAATTGACAACCCCGAGTATTCTCCCGAT CCCAGTATCTATGCCTATGATAACTTTGGCGTGCTGGGCCTGGACC TCTGGCAGGTCAAGTCTGGCACCATCTTTGACAACTTCCTCATCAC CAACGATGAGGCATACGCTGAGGAGTTTGGCAACGAGACGTGGGG CGTAACAAAGGCAGCAGAGAAACAAATGAAGGACAAACAGGACG AGGAGCAGAGGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAAGAAACGCAAA GAGGAGGAGGAGGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGGACAAAG ATGAGGATGAGGAGGATGAGGAGGACAAGGAGGAAGATGAGGAG GAAGATGTCCCCGGCCAGGCCAAGGACGAGCTG >SEQ ID NO:2 >gi|4757900|ref|NP_004334.1| precursor de calreticulina [Homo sapiens] MLLSVPLLLGLLGLAVAEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFG KFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQ FTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGT KKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNS QVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDW DKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNP DYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLI TNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK EEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL >SEQ ID NO:3 >gi|209862753|ref|NM_004343.3| calreticulina (CALR) de Homo sapiens, RNAm GCGGCGTCCGTCCGTACTGCAGAGCCGCTGCCGGAGGGTCGTTTTA AAGGGCCCGCGCGTTGCCGCCCCCTCGGCCCGCCATGCTGCTATCC GTGCCGCTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGCCGTCGCCGAGCCTG CCGTCTACTTCAAGGAGCAGTTTCTGGACGGAGACGGGTGGACTT CCCGCTGGATCGAATCCAAACACAAGTCAGATTTTGGCAAATTCGT TCTCAGTTCCGGCAAGTTCTACGGTGACGAGGAGAAAGATAAAGG TTTGCAGACAAGCCAGGATGCACGCTTTTATGCTCTGTCGGCCAGT TTCGAGCCTTTCAGCAACAAAGGCCAGACGCTGGTGGTGCAGTTC ACGGTGAAACATGAGCAGAACATCGACTGTGGGGGCGGCTATGTG AAGCTGTTTCCTAATAGTTTGGACCAGACAGACATGCACGGAGAC TCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCA CCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGC TGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACC TGTACACACTGATTGTGCGGCCAGACAACACCTATGAGGTGAAGA TTGACAACAGCCAGGTGGAGTCCGGCTCCTTGGAAGACGATTGGG ACTTCCTGCCACCCAAGAAGATAAAGGATCCTGATGCTTCAAAAC CGGAAGACTGGGATGAGCGGGCCAAGATCGATGATCCCACAGACT CCAAGCCTGAGGACTGGGACAAGCCCGAGCATATCCCTGACCCTG ATGCTAAGAAGCCCGAGGACTGGGATGAAGAGATGGACGGAGAG TGGGAACCCCCAGTGATTCAGAACCCTGAGTACAAGGGTGAGTGG AAGCCCCGGCAGATCGACAACCCAGATTACAAGGGCACTTGGATC CACCCAGAAATTGACAACCCCGAGTATTCTCCCGATCCCAGTATCT ATGCCTATGATAACTTTGGCGTGCTGGGCCTGGACCTCTGGCAGGT CAAGTCTGGCACCATCTTTGACAACTTCCTCATCACCAACGATGAG GCATACGCTGAGGAGTTTGGCAACGAGACGTGGGGCGTAACAAAG GCAGCAGAGAAACAAATGAAGGACAAACAGGACGAGGAGCAGAG GCTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAAGAAACGCAAAGAGGAGGAGG AGGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGGACAAAGATGAGGATGAG GAGGATGAGGAGGACAAGGAGGAAGATGAGGAGGAAGATGTCCC CGGCCAGGCCAAGGACGAGCTGTAGAGAGGCCTGCCTCCAGGGCT GGACTGAGGCCTGAGCGCTCCTGCCGCAGAGCTGGCCGCGCCAAA TAATGTCTCTGTGAGACTCGAGAACTTTCATTTTTTTCCAGGCTGGT TCGGATTTGGGGTGGATTTTGGTTTTGTTCCCCTCCTCCACTCTCCC CCACCCCCTCCCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACTGGTATTTT ATCTTTGATTCTCCTTCAGCCCTCACCCCTGGTTCTCATCTTTCTTG ATCAACATCTTTTCTTGCCTCTGTCCCCTTCTCTCATCTCTTAGCTC CCCTCCAACCTGGGGGGCAGTGGTGTGGAGAAGCCACAGGCCTGA GATTTCATCTGCTCTCCTTCCTGGAGCCCAGAGGAGGGCAGCAGA AGGGGGTGGTGTCTCCAACCCCCCAGCACTGAGGAAGAACGGGGC TCTTCTCATTTCACCCCTCCCTTTCTCCCCTGCCCCCAGGACTGGGC CACTTCTGGGTGGGGCAGTGGGTCCCAGATTGGCTCACACTGAGA ATGTAAGAACTACAAACAAAATTTCTATTAAATTAAATTTTGTGTC TCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA >SEQ ID NO:4 >gi|332853291|ref|XP_003316194.1| PREVISTO: calreticulina [Pan troglodytes] MLLSVPLLLGLLGLAVAEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFG KFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQ FTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGT KKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNS QVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDW DKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNP DYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLI TNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK EEEEAEDKEDDEDKDEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL >SEQ ID NO:5 >gi|386780961|ref|NP_001248060.1| precursor de calreticulina [Macaca mulatta] MLLSVPLLLGLLGLAAAEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFG KFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQ FTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGT KKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNS QVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDW DKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNP DYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLDLWQVKSGTIFDNFLI TNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK EEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL >SEQ ID NO:6 >gi|345787749|ref|XP_867310.2| PREVISTO: isoforma de calreticulina 4 [Canis lupus familiaris] MLLPVPLLLGLVGLAAAEPAIYFKEQFLDGDGWTDRWIESKHKSDFG KFVLSSGKFYNDQEKDKGLQTSQDARFYALSARFEPFSNKGQTLVVQ FTVKHEQNIDCGGGYVKLFPDGLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGT KKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNS QVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDW DKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNP DYKGTWIHPEIDNPEYSPDSNIYAYENFAVLGLDLWQVKSGTIFDNFL ITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK EEEEADKEDEEDKDEDEEDEDDKEEEEEDDAAAGQAKDEL >SEQ ID NO:7 >gi|27806723|ref|NP_776425.1| precursor de calreticulina [Bos taurus] MLLPVPLLLGLLGLAAADPTVYFKEQFLDGDGWTERWIESKHKPDFG KFVLSSGKFYGDQEKDKGLQTSQDARFYALSARFEPFSNKGQTLVVQ FTVKHEQNIDCGGGYVKLFPAGLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGT KKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPNNTYEVKIDNS QVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDDRAKIDDPTDSKPEDW DKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNP EYKGIWIHPEIDNPEYSPDSNIYAYENFAVLGLDLWQVKSGTIFDNFLI TNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLHEEEEEKKGK EEEEADKDDDEDKDEDEEDEDEKEEEEEEDAAAGQAKDEL >SEQ ID NO:8 >gi|6680836|ref|NP_031617.1| precursor de calreticulina [Mus musculus] MLLSVPLLLGLLGLAAADPAIYFKEQFLDGDAWTNRWVESKHKSDF GKFVLSSGKFYGDLEKDKGLQTSQDARFYALSAKFEPFSNKGQTLVV QFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPSGLDQKDMHGDSEYNIMFGPDICGPG TKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDN SQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDERAKIDDPTDSKPED WDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQID NPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLDLWQVKSGTIFDN FLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKK RKEEEEAEDKEDDDDRDEDEDEEDEKEEDEEESPGQAKDEL >SEQ ID NO:9 >gi|11693172|ref|NP_071794.1| precursor de calreticulina [Rattus norvegicus] MLLSVPLLLGLLGLAAADPAIYFKEQFLDGDAWTNRWVESKHKSDF GKFVLSSGKFYGDQEKDKGLQTSQDARFYALSARFEPFSNKGQTLVV QFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPGGLDQKDMHGDSEYNIMFGPDICGPG TKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDN SQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDERAKIDDPTDSKPED WDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQID NPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLDLWQVKSGTIFDN FLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKK RKEEEEAEDKEDEDDRDEDEDEEDEKEEDEEDATGQAKDEL >SEQ ID NO:10 >Iniciador ou sonda de nucleotídeos sintéticos AGGAGCGCTCAGGCCTCAGTCCAGCC >SEQ ID NO:11 >Iniciador ou sonda de nucleotídeos sintéticos CAGGCAGAGCACACACCTCAGG >SEQ ID NO:12 >Iniciador ou sonda de nucleotídeos sintéticos AGCTGTAGAGAGGCCTGCCTCCA >SEQ ID NO:13 >Iniciador ou sonda de nucleotídeos sintéticos TATCTTTGATTCTCCTTCAGCCCTCAC

Claims

1. Método para detectar uma mutação de deleção in-frame no éxon 9 do gene da Calreticulina (CALR), caracterizado pelo fato de que compreende: realizar um ensaio de detecção de ácido nucleico em uma amostra de paciente para detectar uma mutação de deleção in-frame de éxon 9 de CALR, em que a mutação é p.E381_A382>A, definida por uma deleção dos nucleotídeos 1142-1144 de SEQ ID NO: 1, em que a amostra de paciente é de um paciente que tem uma doença mieloproliferativa ou é suspeito de ter uma doença mieloproliferativa, em que o paciente é negativo para uma mutação JAK2 V617F, e em que o ensaio de detecção de ácido nucleico compreende usar um par de iniciadores compreendendo um iniciador direto de SEQ ID NO: 10 ou 12 e um iniciador reverso de SEQ ID NO: 11 ou 13.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende amplificação de ácido nucleico.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende amplificação de ácido nucleico utilizando o par de iniciadores.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR), a PCR em tempo real (qPCR) ou nested PCR.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende o sequenciamento de um amplicon que compreende a totalidade ou uma porção do éxon 9 de CALR compreendendo a deleção.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o amplicon é detectado utilizando uma sonda de oligonucleotídeo marcada.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA, DNA genômico de DNAc ou RNA.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra do paciente é uma amostra de sangue, soro, plasma ou biópsia.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença mieloproliferativa é selecionada dentre policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrose idiopática, e doença mieloproliferativa não classificada.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar uma ou mais mutações adicionais em um ou mais genes adicionais associados a uma doença mieloproliferativa, em que o um ou mais genes adicionais é um gene de via JAK-STAT.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o um ou mais genes adicionais são JAK2, MPL, CSFR3R, ASXL1, ou ZRSR2.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas dentre uma mutação no éxon 12 ou éxon 14 de JAK2, éxon 10 de MPL ou éxon 14 ou éxon 17 de CSFR3R.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas dentre MPL W515L, CSFR3R A470T, ASXL1 D954fs*26, e ZRSR2 S449_R450du.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso de uma sonda de oligonucleotídeo marcada para detectar a mutação de deleção in-frame, em que a sonda de oligonucleotídeo marcada compreende de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos da sequência SEQ ID NO: 1 tendo uma deleção dos nucleotídeos 1142-1144 e sobrepõe o local de deleção.