CN111440863B

CN111440863B - Kazn基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用

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Publication number: CN111440863B
Application number: CN201910045367.8A
Authority: CN
Inventors: 禹汇川; 骆衍新; 白亮亮; 唐冠楠; 王小琳; 黄品助; 黄安培; 李英杰; 黄美近; 王磊; 汪建平
Original assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Current assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN111440863A

Abstract

本发明属于本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种KAZN基因检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用，以及一种结肠直肠癌预后诊断试剂/试剂盒。本发明研究发现KAZN基因的甲基化作为代表性标记物，可以区分出具有高复发风险的高甲基化结直肠癌病例。基于独立的训练队列中确定的最佳cutoff值，所有作为二分类变量的基因在训练队列和验证队列中都具有独立预测无病生存的价值。

Description

KAZN基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种KAZN基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用，以及一种结肠直肠癌预后诊断试剂/试剂盒。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)在世界范围内很常见，并且仍然是导致癌症相关死亡的第三大原因，其中39％的病人出现I-II期疾病。根治为目的的手术是治疗I-II期结直肠癌患者的标准方法。然而，这些病人中手术后致死性疾病复发率为20-25％。一般来说，目前用于早期CRC分层风险的临床病理因素包括T4病变，组织学分化差，肠梗阻，穿孔肿瘤，少于12个的淋巴结切除术。然而，这些风险因素并未明确区分疾病复发风险高或低的患者。因此，需要为当前的风险分层系统增加预后和预测价值，这可以通过使用经过验证的分子标志物来实现。

在许多人类癌症中，随着肿瘤发生发展中异常表观遗传学改变的累积，肿瘤抑制基因的CpG岛高甲基化被用于开发生物标记物，例如WRN，MLH1和CpG岛甲基化表型(CpGisland methylator phenotype，CIMP)。然而，启动子中的CpG岛仅代表甲基化组的一小部分，广泛位于基因体中的CpG open seas在CRC患者中也呈现出显著的广泛变化，但尚未被用于分子标志物。

一些研究已经分析了CRC中的DNA甲基化谱，使用InfiniumHumanMethylation450K(HM450)芯片检测它们潜在的临床相关性。然而，HM450缺乏对CpGopen seas和参考基因的基因体的覆盖，因此该方法筛选分子标志物的价值是有限的。最近发布的Infinium MethylationEPIC(EPIC)芯片，专门针对这些区域设计了新型探针。与HM450芯片相比，EPIC芯片中新增探针绝大多数(占413,745的78.2％)位于CpG open seas。这为筛选出更多具有临床意义的CpG位点提供了有价值的工具。

发明内容

本发明目的在于提供一种结直肠癌肿瘤标记物的甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用。

本发明另一个目的在于提供一种预测结直肠癌复发的分子标志物。

本发明另一个目的在于提供一种结直肠癌预后诊断试剂。

本发明还有一个目的在于提供一种检测KAZN的基因体甲基化的方法。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了KAZN基因检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用。

作为一种优选的实施方式，所述的诊断试剂/试剂盒为结直肠癌预后用途的诊断试剂/试剂盒。

本发明还发现，KAZN基因的高甲基化和RNA表达之间存在正相关。

也就是说，作为一种可替选的实施方式，很可能该基因的低表达也可以用于结直肠癌的预后诊断。

作为一种实施方式，所述的KAZN基因检测试剂为检测KAZN基因表达量检测试剂，优选地，为检测KAZN基因mRNA的表达量的试剂。

作为另一种实施方式，所述的KAZN基因检测试剂为KAZN基因甲基化检测试剂。

上述KAZN基因检测试剂为检测KAZN基因经转化试剂修饰后的序列。

作为一种优选的实施方式，所述的转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种；

作为一种实施方式，所述的转化试剂选自亚硫酸氢盐。

本发明首次发现并系统地验证了KAZN的基因体甲基化作为代表性标记物，可以区分出具有高复发风险的高甲基化CRC病例。

本发明所述KAZN基因甲基化的检测试剂的检测区域为KAZN基因的CpG open seas和基因体区域。

作为一种优选的实施方式，上述KAZN基因甲基化的检测试剂的检测区域的序列为SEQ ID NO：1，具体序列如下：

TGTAGCAGACAATACCGTCCAGATCCTCTTAGATCCCTTCAAGCCTTTTCTTGTGCACCA[CG]CTTGCCTGCCTTGGTGTGCTTCTGATTTCAGCATCCTGCATTGTGGCTCCTCTTCCAGGA。其中，检测位点为中括号内的CG。

发明人经过深入的研究，获得了与早期结直肠癌复发相关的位于CpG open seas和基因体的DNA甲基化谱。研究发现复发特异性的差异甲基化位点(differentialmethylation position,DMP)在CpG岛和启动子中很少，但在CpG open seas和基因体中很多。肿瘤特异性的DMP却相反，其已被广泛报道主要位于CpG岛和基因启动子区域。在本发明的发现队列中，复发特异性的DMP不与肿瘤特异性的DMP重叠。然而，既往研究中肿瘤特异性的DMP被广泛用于开发预后预测的模型。

上述检测试剂含有DNA芯片。

作为一种可选的实施方式，所述的检测试剂检测KAZN基因的甲基化的检测中，甲基化程度高，则结直肠癌复发风险高；甲基化程度低，则结直肠癌复发风险低。

作为一种优选的实施方式，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值61.3％～66.51％。

作为一种更为优选的实施方式，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值为63.5％～66.45％。

作为一种更进一步优选的实施方式，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值为65.5％～66.4％。

作为一种最为优选的实施方式，所述KAZN基因甲基化程度的阈值取值为66.39％。

本发明中，所述的检测试剂的检测样品为组织。

此外，这些新的甲基化标记物还可以在其他临床样本中进行研究，包括粪便和血液样本，以探讨它们在预测早期复发中更广泛的临床应用。

作为一种优选的实施方式，所述的检测试剂的检测样品为组织。

作为一种更为优选的实施方式，所述的检测试剂的检测样品为肠粘膜组织。

另一方面，本发明提供了一种结直肠癌预后诊断试剂/试剂盒，所述的试剂/试剂盒含有KAZN基因甲基化检测试剂。

作为一种优选的实施方式，所述试剂盒还含有转化试剂。

作为一种优选的实施方式，所述试剂/试剂盒含有检测KAZN基因经转化试剂修饰后的序列的试剂。

作为一种更为优选的实施方式，所述的转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种。

作为一种最为优选的实施方式，所述的转化试剂选自亚硫酸氢盐。

作为一种可选的实施方式，所述的试剂/试剂盒还含有检测KAZN基因甲基化的一对寡核苷酸Taqman探针。

作为一种更为优选的实施方式，所述探针为包括特异性结合CG的探针和特异性结合TG的探针。

作为进一步优选的实施方式，所述探针为如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的探针对。

作为一种优选的实施方式，所述的试剂/试剂盒还含有检测KAZN基因甲基化的引物。

作为一种更为优选的实施方式，所述引物选自如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示的引物对。

作为一种可选的实施方式，所述的试剂/试剂盒还含有DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液中的一种或几种。

作为一种优选的实施方式，所述的试剂/试剂盒含有DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液。

另一方面，本发明提供了一种结肠直肠癌预后诊断试剂/试剂盒，所述的试剂/试剂盒含有检测KAZN基因的表达量的试剂。

作为一种优选的实施方式，所述的试剂/试剂盒含有检测KAZN基因mRNA表达量的试剂。

另一方面，本发明提供了一种结肠直肠癌预后诊断的芯片，所述的芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的KAZN基因甲基化的探针。

还有一方面，本发明提供了一种结肠直肠癌预后诊断系统，所述的诊断系统含有：

检测构件：所述的检测构件用以检测诊断对象的KAZN基因甲基化程度；

结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的KAZN基因甲基化程度的结果，输出甲基化百分比参数PMR或疾病风险结果。

作为一种优选的实施方式，所述的疾病风险结果为患病可能性，或者说患病概率，或者疾病类型中的一种或多种。

作为一种优选的实施方式，所述的甲基化百分比参数PMR为甲基化/(甲基化+非甲基化)×100。

作为进一步的优选实施方式，所述的甲基化百分比参数PMR＝甲基化荧光值/(甲基化荧光值+非甲基化荧光值)×100。

作为更进一步优选的实施方式，所述的甲基化百分比参数PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT甲基化荧光–CT非甲基化荧光。

作为一种优选的实施方式，所述的检测构件为超微量分光光度计、实时荧光定量PCR仪、超高灵敏度化学发光成像系统中的一种或几种。

作为一种优选的实施方式，所述的结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入KAZN基因甲基化程度；分析模块用于根据KAZN基因甲基化程度，分析出治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果。

作为一种优选的实施方式，所述的分析模块用于分析出治愈后的结肠直肠癌复发的可能性或风险值。

作为一种优选的实施方式，所述KAZN基因甲基化程度为样品中KAZN基因体区域CG位点的甲基化程度。

作为一种优选的实施方式，所述的诊断系统的诊断样品为组织、粪便或血液。

作为一种更为优选的实施方式，所述的诊断系统的诊断样品为组织。

作为一种最为优选的实施方式，所述的诊断系统的诊断样品为肠粘膜组织。

作为一种优选的实施方式，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

作为一种进一步优选的实施方式，所述的结构判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值61.3％～66.51％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值61.3％～66.51％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低；

作为一种更为优选的实施方式，所述的结构判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值63.5％～66.45％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值63.5％～66.45％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

作为一种更进一步优选的实施方式，所述的结构判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值65.5％～66.4％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值65.5％～66.4％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

作为一种最为优选的实施方式，所述的结构判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值66.39％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值66.39％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

本发明中，上面所述的结直肠癌优选为I-II期结直肠癌。

本发明的有益效果：

1、现有技术使用的大多数基于甲基化预后的标志物都靶向CpG岛。这可能是既往发现的标志物在不同队列中异质性很高的原因之一。本发明研究发现了与早期复发相关的位于CpG open seas或基因体的DNA甲基化谱。基于CpG open sea或基因体甲基化的预测模型可更好地预测CRC患者的早期复发。

2、本发明研究首次发现并系统验证了KAZN的基因体甲基化可以作为早期CRC根治性手术后复发的标志物，KAZN基因的甲基化作为代表性标记物，可以区分出具有高复发风险的高甲基化结直肠癌病例。基于独立的训练队列中确定的最佳cutoff值，所有作为二分类变量的基因在训练队列和验证队列中都具有独立预测无病生存的价值。

附图说明

图1分别为亚硫酸氢盐处理后的KAZN基因、FHIT基因、SGIP1基因检测区域序列，引物、探针和待测CpG位点的示意图。

图2KAZN基因在结直肠癌预后诊断方面与其他基因或指标的对比：

A.KAZN甲基化在预测患者预后中的检测结果；

B.CIMP表型在预测患者预后中的检测结果；

C-E.II期结直肠癌的T4病变、肿瘤肠梗阻或穿孔或淋巴结送检总数少于12个在预测早期结直肠癌预后的检测结果；

F-H.分子分型KRAS突变、BRAF突变和高度微卫星不稳定在预测早期结直肠癌预后的价值对比；

图3.KAZN基因在结直肠癌预后诊断方面与与FHIT和SGIP1基因在预测早期结直肠癌预后的价值对比。

图4结肠癌细胞中使用DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine处理后的三个候选基因的DNA甲基化和mRNA表达之间存在正相关。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

术语“诊断试剂/试剂盒”可以为诊断试剂，也可以为诊断试剂盒。

“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，预测疾病复发的可能性。

基因体：基因是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列，基因体即基因的主体部分，通常是指一个基因除去其启动子区域(通常是指转录起始位点上游和下游的2000bp区域)的全部核苷酸序列。

CpG岛：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常频率。CpG岛主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp。通常被定义为GC含量超过55％，并且实际与预期CpG双核苷酸的数量比值大于65％，预期CpG双核苷酸数量的计算方法为(C数量*G数量)/序列长度。

结直肠癌：Colorectal cancer，CRC。

甲基化程度可以采用本领域常用的方式进行确定。

在本发明的一个实施例中，甲基化程度可以根据以下方式计算或确定。例如本发明中使用如下公式进行甲基化程度的计算：PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT甲基化荧光–CT非甲基化荧光。在本发明中出现的甲基化比例或甲基化百分比参数(PMR)，也即是甲基化程度。

甲基化程度的阈值：本发明用甲基化程度的阈值来界定结直肠癌复发风险的高低的数值或数值范围，即高于既定的阈值，则结直肠癌复发高风险；低于既定的阈值则结直肠癌复发低风险。而本发明中出现的阈值，是对应于上述一个实施例中的甲基化程度计算方式而确定的。

CIMP(CpG island methylator phenotype)：指的是CpG岛甲基化表型。

DMP(differential methylation position)：指的是差异甲基化位点，即两组样品中存在甲基化统计学(q值)和生物学(△β)显著差异的CpG位点。

统计分析

主要终点是无病生存时间(disease-free survival，DFS)，定义为从手术之日到复发转移、癌症相关死亡或随访cutoff点的时间。对于每个预后标志物，训练队列患者通过使用R包'survMisc'的最小p值法来确定最佳cutoff值，分为高甲基化组和低甲基化组，其中最高χ²值(最小p值)由Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验定义。验证队列中的患者基于训练队列中定义的cutoff值分为两组。Bonferroni校正用于多个候选甲基化标记物的生存分析。候选分子标志物的预后价值也在包含多个标志物和临床病理学特征的多因素Cox回归模型中得到校正。预测性Cox模型由比例风险模型中生成的估计回归系数建立。本发明还通过使用R包“survivalROC”的时间依赖性ROC曲线分析来研究标志物预后或预测的准确性。所有统计检验均使用R software 3.0.1完成。统计显著性设定为0.05。

实施例1样本来源

病例样本患者特征

经过病理学验证为I-II期CRC并接受手术切除的患者，则可作为发现、训练或验证队列的病例纳入研究。预先接受过任何抗癌治疗的患者、除CRC外存在任何肿瘤的病史以及DNA样本存在大量降解的患者被排除在外。

首先在I-II期CRC患者中收集45例新鲜冷冻肿瘤组织和癌旁正常组织，进行全基因组甲基化芯片分析。排除肠梗阻或穿孔，脉管或神经侵犯，淋巴结切除送检数量少于12的患者。根据年龄，性别，TNM分期，手术日期(±5年)和肿瘤位置，这组45名患者包含21例随访中出现复发的患者和24例配对的随访中实现无肿瘤复发生存的患者。这45名患者组成用于寻找分子标志物的发现队列。样本于2008年6月1日至2011年6月30日，在广州中山大学附属第六医院获得。对于训练集分析，使用于2000年6月1日至2011年6月30日在广州中山大学附属第一医院和附属第六医院收集的174例福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的I-II期CRC样本进行回顾性研究。这些患者组成训练队列，从发现的候选分子标志物中确定和验证最佳预测模型。为了进一步独立验证确定的预后标志物和模型，使用了于2008年6月1日至2012年6月30日在广州中山大学肿瘤中心和广州南方医科大学南方医院收集的267例组织学证实的I-II期CRC患者的FFPE组织DNA进行回顾性分析。

一般而言，所有患者均根据TNM分期标准进行分期，并按照NCCN指南进行随访和治疗。使用了肿瘤标志物预后研究建议(Recommendations for Tumor Marker PrognosticStudies，REMARK)标准来评价预后标志物。本研究经中山大学机构审查委员会批准，所有患者均已签署书面知情同意书。

通过样本分析发现，训练和独立验证队列的详细临床病理学特征如表1所示。486名患者均接受了手术切除，组织学检测为阴性切除边缘。中位随访时间为77个月(四分位数范围IQR 54-102)，486例患者中98例(20.1％)在随访期间发生肿瘤复发。在发现队列中，21例复发和24例配对的非复发患者的临床和人口学特征相似，中位随访时间为58个月(表2)。

表1不同队列患者的基线特征

表2发现队列中复发和无复发CRC患者的基线特征

实施例2 KAZN基因的甲基化检测

使用qMSP检测基因CpG位点的甲基化水平。

所检测的基因：KAZN；

对比基因：FHIT、SGIP1。

1、定量甲基化特异性PCR

使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，51306)和EZ DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch，D5002)提取基因组DNA并进行亚硫酸氢盐修饰。

利用定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)检测不同队列中位于基因体或CpG open sea的待测CpG位点，以评估和验证其与CRC患者预后的关系。

在此检测过程中，使用引物和一对覆盖待测CpG位点的寡核苷酸探针扩增亚硫酸氢盐转化后的基因组DNA，每个寡核苷酸探针5'端连接荧光报告染料6FAM或VIC(分别为特异性结合甲基化位点和非甲基化位点)，3'端偶联淬灭-MGB基团(MGB-NFQ)。

针对KAZN，FHIT和SGIP1基因体中的三个待测位点，本发明设计了三组专门用于本发明的引物和探针，如表3所示。探针仅覆盖单个CpG二核苷酸，从而可以测量单个CpG的甲基化水平。

通过Applied Biosystems QuantStudio 7Flex实时PCR系统检测PCR反应中的荧光信号。每个样本的待测CpG位点甲基化比例(甲基化百分比参数PMR)等于甲基化信号/(甲基化信号+非甲基化信号)×100，具体计算时，本发明使用如下公式：PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT甲基化荧光–CT非甲基化荧光；

使用20uL的反应体系，体系包括500nM引物，150nM探针，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200nM，2.25mM MgCl2，0.75U HotStar Taq酶，1×PCR缓冲液。反应条件为：首先95℃15分钟，然后是94℃30秒、56～60℃1分钟和72℃1分钟的50个循环。

2、基因位点信息

(1)ID:cg06887407

UCSC_RefGene_Name:KAZN

UCSC_RefGene_Accession:NM_201628；NM_015209

chr:chr1

pos:15086357

strand:+

Relation_to_Island:OpenSea

UCSC_RefGene_Group:Body

亚硫酸氢盐处理前序列:

SEQ ID NO：1

TGTAGCAGACAATACCGTCCAGATCCTCTTAGATCCCTTCAAGCCTTTTCTTGTGCACCA[CG]CTTGCCTGCCTTGGTGTGCTTCTGATTTCAGCATCCTGCATTGTGGCTCCTCTTCCAGGA

如图1所示，亚硫酸氢盐处理后的KAZN基因检测区域序列，引物、探针和待测CpG位点均已在图中标注。

(2)ID:cg05704547

UCSC_RefGene_Name:FHIT

UCSC_RefGene_Accession:NM_002012

chr:chr3

pos:60067722

strand:+

Relation_to_Island:OpenSea

UCSC_RefGene_Group:Body

亚硫酸氢盐处理前序列:

SEQ ID NO：40

ATGAGTTCACTGCATTGTCTACTTATCTGTTTTTGTAATTTCAACTTTTATTTTTGATTT[CG]GGGTGCACATGTGGGTTTGTTCCATAGGTATATTGCATGATGCTCATGTTTGGGGTATGA

如图1所示，亚硫酸氢盐处理后的FHIT基因检测区域序列，引物、探针和待测CpG位点均已在图中标注。

(3)ID:cg05971061

UCSC_RefGene_Name:SGIP1

UCSC_RefGene_Accession:NM_032291

chr:chr1

pos:66998484

strand:+

Relation_to_Island:N_Shore

UCSC_RefGene_Group:TSS1500

亚硫酸氢盐处理前序列:

SEQ ID NO：41

TAGGCTGCCCTGCCCTTTTCTTCCTTCGCTGTCTGAGCTTTCTTGAAGGGAACCAAGGGT[CG]TAGATCCCCCAGGGCTGGGCCCTTCTGAAAGGCTCCATGGTCTCTGGAGAGCAGTCAGGT

如图1所示，亚硫酸氢盐处理后的SGIP1基因检测区域序列，引物、探针和待测CpG位点均已在图中标注。

表3引物和探针序列

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实施例3结直肠癌患者的肿瘤组织中KAZN基因甲基化程度的检测结果

如下表4所示，在8例I-II期的结直肠癌患者的肿瘤组织中，按照实施例2的方法检测KAZN基因甲基化程度，甲基化比例高于或等于66.39％判定为高甲基化，小于66.39％判定为低甲基化。从表4中的结果可知，KAZN高甲基化的结直肠癌患者复发风险显著高于低甲基化的患者。

表4 KAZN基因甲基化程度的检测结果

实施例4 KAZN基因在结直肠癌预后诊断方面与其他基因或指标的对比

以下(1)、(2)实验中，检测样本来自同批的441例I-II期结直肠癌患者。

(1)与CpG岛甲基化表型(CIMP)的对比

CpG岛甲基化表型(CpG Island Methylator Phenotype,CIMP)是一种具有不同临床特征和分子特征的结直肠癌类型，目前CIMP被用于结直肠癌的预后和化疗敏感性的分子标志物，在西方国家应用更为广泛。本发明采用国际通用技术流程，应用荧光定量甲基化特异性PCR技术检测CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1基因的甲基化水平，确定样品的CIMP状态。([1].Shiovitz S,Bertagnolli MM,Renfro LA,et al.CpG island methylatorphenotype is associated with response to adjuvant irinotecan-based therapyfor stage III colon cancer.Gastroenterology.2014.147(3):637-45；[2].Weisenberger DJ,Siegmund KD,Campan M,et al.CpG island methylator phenotypeunderlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated withBRAF mutation in colorectal cancer.Nat Genet.2006.38(7):787-93.)。引物和探针如表3所示。结果由甲基化百分比参数表示，大于4％定义为甲基化，低于4％定义为未甲基化，3～5个基因甲基化判定为CIMP阳性，0～2个基因甲基化判定为CIMP阴性。

本发明在441例I-II期结直肠癌患者中，比较了KAZN甲基化(测试方法为实施例2中的方法)与CIMP表型在预测患者预后中的价值。在中国人群中，拥有CIMP表型(CIMP+)的结直肠癌患者比例(17/441，3.8％)明显低于文献中报道的西方人群的10～15％([1]JiaM,Jansen L,Walter V,et al.No association of CpG island methylator phenotypeand colorectal cancer survival:population-based study.Br J Cancer.2016.115(11):1359-1366；[2]Shiovitz S,Bertagnolli MM,Renfro LA,et al.CpG islandmethylator phenotype is associated with response to adjuvant irinotecan-basedtherapy for stage III colon cancer.Gastroenterology.2014.147(3):637-45.)，但与中国人群中与其阳性率基本一致的BRAF突变率大致相当。本发明实验结果如图2A、2B所示，CIMP表型预测远期复发风险的价值明显低于KAZN甲基化(HR 1.09vs.2.37,p＝0.880vs.<0.001)。

结果表明，KAZN单基因甲基化用于预测早期结直肠癌患者的复发风险，优于五个基因甲基化组成的CIMP表型。

(2)与临床病理危险因素和经典分子分型的对比

既往文献报道，II期结直肠癌的T4病变、肿瘤肠梗阻或穿孔或淋巴结送检总数少于12个，是肿瘤复发转移和死亡的高危因素。但存在争议，这些临床病理因素与预后的关系在不同队列中结果不一致(Zhang JX,Song W,Chen ZH,et al.Prognostic andpredictive value of a microRNA signature in stage II colon cancer:a microRNAexpression analysis.Lancet Oncol.2013.14(13):1295-306.)。因此，本发明进一步比较了KAZN基因甲基化与其在预测早期结直肠癌预后的价值。在441例I-II期结直肠癌患者中，测定结果如图2A、2C、2D、2E所示，肿瘤肠梗阻或穿孔或淋巴结送检总数少于12个预测远期复发风险的价值明显低于KAZN甲基化。

KRAS突变、BRAF突变和高度微卫星不稳定(high-level microsatelliteinstability,MSI-H)是结直肠癌临床诊疗中最常用的分子分型。因此，本发明同样比较了KAZN基因甲基化与它们的预后价值。结果如图2A、2F、2G、2H所示，这些分子分型的预测价值均明显低于KAZN甲基化。

(3)与FHIT和SGIP1基因的对比

本发明先后在174例和267例I-II期结直肠癌患者中，比较了KAZN甲基化与FHIT、SGIP1甲基化在预测患者预后中的价值。其中甲基化测试方法同实施例2中的方法。

在训练和验证队列中，使用qMSP检测三个候选CpG位点的甲基化水平。在训练队列中，基于Kaplan-Meier分析中通过最小p方法确定的cutoff值，将所有候选基因二分为高甲基化组或低甲基化组。在验证队列中，根据训练队列中定义的cutoff值将患者分为两组。

结果如图3所示，三个基因的甲基化在第一个队列中都与患者无病生存显著相关；KAZN在第二个独立队列中仍与患者无病生存显著相关，而FHIT和SGIP1无统计学显著性。

因此，KAZN甲基化作为分子标志物预测早期结直肠癌患者的远期复发风险的可重复性更好。

本发明还发现在结肠癌细胞中使用DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine处理后，三个候选基因的DNA甲基化和mRNA表达之间存在正相关。如图4所示，表明这些基因体甲基化可能在基因表达中发挥作用。

序列表

<110> 中山大学附属第六医院

中山大学

<120> KAZN基因甲基化检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂中的应用

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 122

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

tgtagcagac aataccgtcc agatcctctt agatcccttc aagccttttc ttgtgcacca 60

cgcttgcctg ccttggtgtg cttctgattt cagcatcctg cattgtggct cctcttccag 120

ga 122

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

amttaaggta ggtaagcgtg gmgbn 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

vcaaggtagg taagtgtggt gtmgbn 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggaagagg agttataatg taggatgttg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctcttaaat cccttcaaac cttttcttat 30

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attcgatgag tttattgtat tgtttattta tttg 34

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcatacccca aacataaaca tcataca 27

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

amtgatttcg gggtgtatam gbn 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

vctttgattt tggggtgtat mgbn 24

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttagagatt atggagtttt ttagaagggt t 31

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcataaacta ccctaccctt ttcttcctt 29

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

amgttttggg ggatttacga mgbn 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

vcgttttggg ggatttatga mgbn 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttttttcgtt tcgcgtttag gt 22

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgaaacga cttcgccg 18

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

amaaataacg ccgaatccga caaccgabh 29

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagcggtttc ggtgtcgtta 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccaactcgat ttaaaccgac g 21

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

amccctctac cgtcgcgaac ccgabh 26

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgtgtagcgt tcgggtattt gta 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgataattac gaacacactc cgaat 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

amcgataacg acctcccgcg aacataaabh 30

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgttcgatgg tggacgtgt 19

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gacgaacaac gtcttattac aacgc 25

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

amcgcacgaa ctcgcctacg taatccgbh 29

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcgtcgagtt cgtgggtatt t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccgaaaccat cttcacgcta a 21

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

amacaattcc gctaacgact atcgcgcabh 30

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggttaggtat agtggtttat atttgtaatt ttagta 36

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

attaactaaa ctaatcttaa actcctaacc tca 33

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

amcctacctt aacctcccmg bn 22

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaagccggac agactgtgaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgaaagtaga cccgcagagc 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gagtgtgcgc gtgaaggag 19

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctttggtaga gccgggttcc 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cctctgtcat ctccgacgca 20

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ggactgtcgc cgttgcag 18

<210> 40

<211> 122

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

atgagttcac tgcattgtct acttatctgt ttttgtaatt tcaactttta tttttgattt 60

cggggtgcac atgtgggttt gttccatagg tatattgcat gatgctcatg tttggggtat 120

ga 122

<210> 41

<211> 122

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

taggctgccc tgcccttttc ttccttcgct gtctgagctt tcttgaaggg aaccaagggt 60

cgtagatccc ccagggctgg gcccttctga aaggctccat ggtctctgga gagcagtcag 120

gt 122

Claims

1.KAZN基因检测试剂在制备结直肠癌预后诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的KAZN基因检测试剂为KAZN基因甲基化检测试剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的KAZN基因检测试剂为检测KAZN基因经转化试剂修饰后的序列的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的转化试剂选自肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的转化试剂选自亚硫酸氢盐。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化的检测试剂的检测区域为KAZN基因的CpGopenseas或基因体区域。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的KAZN基因甲基化的检测试剂的检测区域的序列包含SEQ ID NO：1所示的序列。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂含有DNA芯片。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化的检测中，甲基化程度高，则结直肠癌复发风险高；当甲基化程度低，则结直肠癌复发风险低。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值61.3％～66.51％。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值为63.5％～66.45％。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化程度高低的阈值取值为65.5％～66.4％。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述KAZN基因甲基化程度的阈值取值为66.39％。

13.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂的检测样品为组织、粪便或血液。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的检测样品为组织。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的检测样品为肠粘膜组织。

16.一种结肠直肠癌预后诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统含有：

17.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的疾病风险结果为患病可能性，或者说患病概率，或者疾病类型中的一种或多种。

18.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的甲基化百分比参数PMR为甲基化/(甲基化+非甲基化)×100。

19.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的甲基化百分比参数PMR＝甲基化荧光值/(甲基化荧光值+非甲基化荧光值)×100。

20.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的甲基化百分比参数PMR＝100/(1+1/2^-ΔCT)，ΔCT＝CT甲基化荧光–CT非甲基化荧光。

21.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的检测构件为超微量分光光度计、实时荧光定量PCR仪、超高灵敏度化学发光成像系统中的一种或几种。

22.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入KAZN基因甲基化程度；分析模块用于根据KAZN基因甲基化程度，分析出治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的可能性或者风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果。

23.根据权利要求22所述的诊断系统，其特征在于，所述的分析模块用于分析出治愈后的结肠直肠癌复发的可能性或风险值。

24.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述KAZN基因甲基化程度为样品中KAZN基因体区域CG位点的甲基化程度。

25.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统的诊断样品为组织、粪便或血液样本。

26.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统的诊断样品为组织。

27.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的诊断系统的检测样品为肠粘膜组织。

28.根据权利要求16所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

29.根据权利要求28所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值61.3％～66.51％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值61.3％～66.51％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

30.根据权利要求28所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值63.5％～66.45％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值63.5％～66.45％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

31.根据权利要求28所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值65.5％～66.4％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值65.5％～66.4％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

32.根据权利要求28所述的诊断系统，其特征在于，所述的结果判断构件中，当KAZN基因甲基化程度高于阈值66.39％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险高；当KAZN基因甲基化程度低于阈值66.39％时，则判断治愈后的结肠直肠癌复发或者健康者结肠直肠癌患病的风险低。

33.根据权利要求1-15任一所述的应用，或权利要求16-32任一所述的诊断系统，其特征在于，所述的结直肠癌为I-II期结直肠癌。