BRPI0709396A2 - propagação de células primárias - Google Patents

Abstract

PROPAGAçãO DE CéLULAS PRIMáRIAS. A presente invenção refere-se a um método de propagar as células de interesse, obtidas de amostra biológica, por a) enriquecimento das células sob condições que mantenham uma viabilidade suficiente das células, e b) propagação das células sob condições efetivas para permitir a viabilidade, a proliferação e a integridade das células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROPAGAÇÃO DE CÉLULAS PRIMÁRIAS".

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se as metástases que são as causasprincipais de morte em pacientes diagnosticados com um tumor primário. Ametástase dõ câncer ocorre quando as células soltam-se do tumor primárioe disseminam-se para partes distantes do corpo através da corrente de san-gue periférico ou da drenagem linfática. A presença de CTCs no sangue pe-riférico tem sido mostrada estar associada à sobrevivência sem progressãodiminuída e à sobrevivência global diminuída em pacientes tratados paracâncer de mama metastático. Embora as forças mecânicas ou a respostaimune de um indivíduo mate diversas destas células de tumor que entram nacorrente sangüínea, sabe-se que uma porcentagem de células de tumor so-brevive e pode ser analisada. A presença, a enumeração e a caracterizaçãodestas raras células epiteliais no sangue integral poderiam proporcionar umainformação diagnostica e clínica valiosa. Aproximadamente 70-80% de todosos tumores sólidos originam-se de células epiteliais, as quais não são nor-malmente encontradas na circulação. As análises abrangentes do mRNAdas células epiteliais circulantes no sangue periférico podem proporcionarinformação valiosa sobre o prognóstico de carga de tumor e a eficácia dotratamento. Por exemplo, o receptor Her-2 é superexpresso em somente30% dos pacientes com câncer de mama, o que sugere que a Herceptinaseria uma terapia ineficaz para todos os pacientes. Assim, a definição doperfil molecular das CTCs deve resultar na caracterização aperfeiçoada dasCTCs e, em última análise, no desenvolvimento de novas estratégias tera-pêuticas personalizadas, mais efetivas.

A detecção inicial do câncer e o seu status metastático são críti-cos para o tratamento efetivo de cânceres, resultando na taxa de sobrevi-vência global e na qualidade de vida melhorada. As metástases resultam doespalhamento das células de tumor liberadas do tecido primário que atingemdiferentes tecidos através do sangue periférico, freqüentemente referidascomo células de tumor circulantes (CTCs). A presença destas CTCs no san-gue, conforme detectada pela tecnologia CelISearch®, tem sido mostradaestar associada com a taxa de sobrevivência diminuída, assim servindo co-mo "marcadores" prognosticáveis para a progressão (metástase) do câncer.

Estas CTCs poderiam ser potencialmente usadas para estudos farmacoge-nômicos (exemplo, quimiossensibilidade). Adicionalmente, estudos de defini-ção do perfil molecular podem ser realizados nas CTCs, o que adicionalmen-te leva ao melhor entendimento dos mecanismos básicos de potenci-al/progressão metastática, prognóstico e mesmo utilidade terapêutica. Osdesafios são diversos: a recuperação de ácidos nucléicos de qualidade apartir das CTCs; a sua disponibilidade em quantidade muito limitada; as limi-tações de sensibilidade dos ensaios existentes; a aplicação/validação degrupos de marcadores existentes para as CTCs. Além disso, a definição doperfil molecular sempre pode não resultar em resultados exatos devido àcontaminação das CTCs capturadas com leucócitos, cujo perfil de expressãopode interferir com os resultados. A adaptação das CTCs para desenvolve-rem-se in vitro poderia resultar na propagação das células até níveis sufici-entes e suavizar os desafios antes mencionados. As células assim propaga-das poderiam ser usadas para diversas aplicações, incluindo a avaliação daclonalidade das diferentes populações de células, a descoberta de marcas, odesenvolvimento de ensaios usando tais marcas, a hibridização fluorescentein situ (FISH) e a imunoistoquímica (IHC).

A detecção inicial do câncer e o seu status metastático são críti-cos para o tratamento efetivo de cânceres, resultando na taxa de sobrevi-vência aumentada dramaticamente e na qualidade de vida melhorada. Asmetástases resultam do espalhamento das células de tumor liberadas dotecido primário que atingem diferentes tecidos através do sangue periférico,freqüentemente referidas como células de tumor circulantes (CTCs). A pre-sença destas CTCs no sangue, conforme detectada pela tecnologia CelISe-arch®, tem sido mostrada estar associada à taxa de sobrevivência diminuída,assim servindo como "marcadores" prognosticáveis para a progressão (me-tástase) do câncer. Estas CTCs poderiam ser potencialmente usadas paraestudos farmacogenômicos (exemplo, quimiossensibilidade).A expressão gênica no câncer pode ser rompida através de alte-ração genética ou alteração epigenética, que alteram o estado hereditário daexpressão gênica. A modificação epigenética principal do genoma humano éa metilação dos resíduos de citosina dentro do contexto do dinucleotídeoCpG. A metilação do DNA é interessante a partir de um ponto de vista diag-nóstico, porque ela pode ser facilmente detectada nas células liberadas delesões neoplásticas e pré-neoplásticas no soro, urina ou esputo. E a partir deum ponto de vista terapêutico, porque os genes epigeneticamente silencio-sos podem ser reativados por inibidores da metilação do DNA e/ou histonadesacetilase.

Recentemente, foi publicado um estudo envolvendo a caracteri-zação molecular das CTCs, que utilizou a definição do perfil de expressãotanto através de análise por GeneChip® quanto por transcrição reversaquantitativa-PCR. As amostras usadas neste estudo tinham > 100 CTCs, oque é muito maior do que é tipicamente visto na triagem inicial (< 10 CTCs).Foi seguido que a tecnologia de PCR Quantitativa Específica para Metilação(QMSP) de Multiplex, para efetuar a pré-amplificação (PCR aninhada paraobter DNA alvo suficiente a partir de DNA em pequena quantidade, capturouas CTCs (<5 células).

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona métodos, aparelho e kit para oprocessamento de amostras de células de tumor circulantes (CTCs) dentrodo sangue periférico e avaliação de seus perfis de expressão gênica, aomesmo tempo proporcionando suporte para a plataforma CelISearch® para oteste de recorrência da doença. O Kit de Perfil CelISearch® é pretendido pa-ra o isolamento das CTCs de origem epitelial no sangue integral, em conjun-ção com o Sistema AutoPrep CelISearch®. O Kit de Perfil CelISearch® con-tém um reagente de captura à base de ferrofluido, que consiste em nanopar-tículas com um núcleo magnético circundado por uma camada de polímerorevestida com anticorpos que alvejam o antígeno da Molécula de Adesão deCélula Epitelial (EpCAM) para capturar as CTCs. O Sistema AutoPrep Cell-Tracks® automatiza e padroniza o processamento distribuindo precisamenteos reagentes e regulando as etapas de incubação magnética, oferecendoaos cientistas ferramentas avançadas para isolar de modo reprodutível eeficiente as CTCs para pesquisa importante em uma variedade de carcino-mas. A grande maioria dos leucócitos e de outros componentes sangüíneosé reduzida da amostra enriquecida, com isso minimizando a base. A análiseadicional é efetuada usando técnicas de biologia molecular estabelecidas,incluindo a RT-PCR e a RT-PCR de multiplex. O ensaio de caracterizaçãomolecular é um ensaio de diagnóstico molecular que é pretendido para usoapós o enriquecimento das CTCs. Este ensaio incorpora ambos os marcado-res epiteliais e de tecido de origem para confirmar que as células circulantesem um paciente previamente diagnosticado e tratado para câncer de mamasão, na realidade, de origem da mama.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um gráfico representando a estabilidade do RNAcom o tempo.

A figura 2 é um gráfico representando o mRNA específico dapróstata obtido a partir das células de tumor circulantes.

A figura 3 é um gráfico representando o mRNA específico dapróstata obtido a partir das células de tumor circulantes.

A figura 4 representa os resultados da A) Introdução em 100 ngde DNA de PBL; ou B) Introdução em 500 ng de DNA de PBL.

Descrição Detalhada

Um Biomarcador é qualquer sinal de um ácido nucléico/proteínaMarcadora indicada. Os ácidos nucléicos podem ser qualquer um conhecidona técnica, incluindo, sem limitação, nucleares, mitocondriais (homoplasmia,heteroplasmia), virais, bacterianos, fúngicos, micoplasmais, etc. O sinal podeser direto ou indireto e medir a super- ou a subexpressão do gene, dado osparâmetros fisiológicos e em comparação com um controle interno, placebo,tecido normal ou um outro carcinoma. Os Biomarcadores incluem, sem Iimi-tação, os ácidos nucléicos e as proteínas (tanto a super e a subexpressãoquanto direto e indireto). O uso de ácidos nucléicos como Biomarcadorespode incluir qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação,medição da amplificação do DNA1 remoção, inserção, duplicação, RNA, mi-cro RNA (miRNA), perda de heterozigosidade (LOH), polimorfismos de nu-cleotídeos individuais (SNPs, Brookes (1999)), polimorfismos de números decópias (CNPs) diretamente ou na amplificação do genoma, DNA microssaté-lite, alterações epigenéticas, tais como hipo- ou hipermetilação do DNA eFISH. A utilização de proteínas como Biomarcadores inclui qualquer métodoconhecido na técnica, incluindo, sem limitação, medição da quantidade, ati-vidade, modificações, tais como glicosilação, fosforilação, ribosilação doADP, ubiquitinação, etc., ou imunoistoquímica (IHC) e renovação. Os outrosBiomarcadores incluem o imageamento, a definição do perfil molecular, acontagem de células e os Marcadores da apoptose.

A "origem", conforme referida em 'tecido de origem', significa otipo de tecido (pulmão, cólon, etc.) ou o tipo histológico (adenocarcinoma,carcinoma de células escamosas, etc.), dependendo das circunstâncias mé-dicas particulares, e será entendida por qualquer um versado na técnica.

Um Gene marcador corresponde à seqüência designada poruma SEQ ID NO quando ele contiver esta seqüência. Um segmento oufragmento de gene corresponde à seqüência de tal gene quando ele contiveruma porção da seqüência referida ou do seu complemento, suficiente paradistingui-la como sendo a seqüência do gene. Um produto da expressão gê-nica corresponde a tal seqüência quando o seu RNA, mRNA, ou cDNA hibri-dizar com a composição tendo tal seqüência (por exemplo, uma sonda) ou,no caso de um peptídeo ou proteína, ele for codificado por tal mRNA. Umsegmento ou fragmento de um produto da expressão gênica corresponde àseqüência de tal gene ou produto da expressão gênica quando ele contiveruma porção do referido produto da expressão gênica ou do seu complemen-to, suficiente para distingui-la como sendo a seqüência do gene ou do produ-to da expressão gênica.

Os métodos, as composições, os artigos, e os kits inventivosdescritos e reivindicados neste relatório descritivo incluem um ou mais Ge-nes marcadores. O "Marcador" ou o "Gene marcador" é usado por todo esterelatório descritivo para referir-se aos genes e aos produtos da expressãogênica que correspondem com qualquer gene, cuja super- ou subexpressãoestá associada a uma indicação ou a um tipo de tecido.

Os métodos preferidos para estabelecer os perfis de expressãogênica incluem a determinação da quantidade de RNA que é produzido porum gene que pode codificar uma proteína ou um peptídeo. Isto é efetuadopor transcriptase reversa e PCR (RT-PCR)1 RT-PCR competitiva, RT-PCRem tempo real, RT-PCR de exposição diferencial, análise por Northern Blot eoutros testes relacionados. Embora seja possível conduzir estas técnicasusando reações PCR individuais, é melhor amplificar o DNA complementar(cDNA) ou o RNA complementar (cRNA) produzido a partir do mRNA e ana-lisá-lo via microarranjo. Diversas configurações de arranjos diferentes e mé-todos para a sua produção são conhecidos para aqueles versados na técni-ca e são descritos, por exemplo, em 5445934; 5532128; 5556752; 5242974;5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672;5527681; 5529756; 5545531; 5554501; 5561071; 5571639; 5593839;5599695; 5624711; 5658734; e 5700637.

A tecnologia do microarranjo permite a medição do nível demRNA em estado estacionário de milhares de genes simultaneamente, comisso apresentando uma ferramenta poderosa para identificar efeitos tais co-mo o início, a interrupção, ou a modulação da proliferação descontrolada decélulas. Duas tecnologias de microarranjos estão atualmente em amplo uso.A primeira são os arranjos de cDNA e a segunda são os arranjos de oligonu-cleotídeos. Embora existam diferenças na construção destes fragmentos,essencialmente toda a análise de dados a jusante e a produção são iguais.O produto destas análises são tipicamente medições da intensidade do sinalrecebido de uma sonda marcada, usada para detectar uma seqüência decDNA a partir da amostra que hibridiza com uma seqüência de ácidos nu-cléicos, em uma posição conhecida no microarranjo. Tipicamente, a intensi-dade do sinal é proporcional à quantidade de cDNA e, dessa forma, de mR-NA, expresso nas células da amostra. Um grande número de tais técnicasestá disponível e é útil. Os métodos preferidos para determinar a expressãogênica podem ser encontrados em 6271002; 6218122; 6218114; e 6004755.A análise dos níveis de expressão é conduzida comparando-setais intensidades de sinal. Isto é mais bem feito por geração de uma matrizde razão das intensidades de expressão dos genes em uma amostra de tes-te versus aquelas em uma amostra de controle. Por exemplo, as intensida-des de expressão gênica a partir de um tecido doente podem ser compara-das com as intensidades de expressão geradas a partir de tecido benigno ounormal do mesmo tipo. A razão destas intensidades de expressão indica onúmero de vezes de alteração na expressão gênica entre as amostras deteste e de controle.

A seleção pode ser baseada em testes estatísticos que produ-zem listas com pontuações relacionadas à evidência de significado para aexpressão diferencial de cada gene entre os fatores relacionados ao local deorigem original do tumor. Os exemplos de tais testes incluem o ANOVA e oKruskal-Wallis. As pontuações podem ser usadas como atribuições de pesosem um modelo projetado para interpretar a soma de tais pesos, até um corte,como a preponderância de evidência em favor de uma classe sobre outra. Aevidência prévia, como descrita na literatura, pode também ser usada paraajustar as atribuições de pesos.

Uma modalidade preferida é normalizar cada medição por identi-ficação de um grupo de controle estável e escalonamento deste grupo atévariância zero através de todas as amostras. Este grupo de controle é defi-nido como qualquer transcrito endógeno individual ou grupo de transcritosendógenos afetado por erro sistemático no ensaio, e não sabido alterar-seindependentemente deste erro. Todos os Marcadores são ajustados pelofator específico da amostra que gera variância zero para qualquer estatísticadescritiva do grupo de controle, tal como a média ou a mediana, ou parauma medição direta. Alternativamente, se a premissa de variação dos con-troles relacionada somente ao erro sistemático não for verdadeira, contudo oerro de classificação resultante será menor quando a normalização por efe-tuada, o grupo de controle ainda será usado como estabelecido. Os contro-les fixados não-endógenos poderiam também ser úteis, porém não são pre-feridos.Os perfis de expressão gênica podem ser mostrados em diver-sos modos. O mais comum é organizar as intensidades de fluorescência bru-tas ou a matriz de razão em um dendograma gráfico, onde as colunas indi-cam as amostras de teste e as linhas indicam os genes. Os dados são orga-nizados de modo que os genes que tenham perfis de expressão similaresestejam proximais um do outro. A razão de expressão para cada gene é vi-sualizada como uma cor. Por exemplo, uma razão menor do que um (infra-regulação) aparece na parte azul do espectro, enquanto que uma razãomaior do que um (supra-regulação) aparece na parte vermelha do espectro.Estão disponíveis programas de software para computadores comercialmen-te disponíveis para mostrar tais dados, incluindo o "Genespring" (Silicon Ge-netics, Inc.) e o "Discovery" e o "Infer" (Partek, Inc.).

No caso de medir os níveis de proteínas para determinar a ex-pressão gênica, qualquer método conhecido na técnica é adequado, desdeque ele resulte em especificidade e sensibilidade adequadas. Por exemplo,os níveis de proteínas podem ser medidos por ligação a um anticorpo ou aum fragmento de anticorpo específico para a proteína e para a medição daquantidade de proteína ligada ao anticorpo. Os anticorpos podem ser mar-cados por reagentes radioativos, fluorescentes ou outros reagentes detectá-veis, para facilitar a detecção. Os métodos de detecção incluem, sem limita-ção, o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA) e as técnicas deimunoblot.

Os genes modulados usados nos métodos da invenção são des-critos nos Exemplos. Os genes que são diferencialmente expressos são su-pra-regulados ou infra-regulados nos pacientes com carcinoma de uma ori-gem particular, em relação àqueles com carcinomas de origens diferentes. Asupra-regulação e a infra-regulação são termos relativos, significando queuma diferença detectável (além da contribuição do ruído no sistema usadopara medi-lo) é verificada na quantidade de expressão dos genes em rela-ção a alguma linha de base. Neste caso, a linha de base é determinada combase no algoritmo. Os genes de interesse nas células doentes são entãosupra regulados ou infra-regulados em relação ao nível da linha de base,usando o mesmo método de medição. Doente, neste contexto, refere-se auma alteração do estado de um corpo que interrompe ou perturba, ou tem opotencial de perturbar, o desempenho apropriado das funções corpóreas,conforme ocorre com a proliferação descontrolada das células. Alguém édiagnosticado com uma doença quando algum aspecto do genótipo ou dofenótipo daquela pessoa está consistente com a presença da doença. Entre-tanto, o ato de conduzir um diagnóstico ou prognóstico pode incluir a deter-minação de questões de doença/status, tal como a determinação da probabi-lidade de recorrência, o tipo de terapia e o monitoramento da terapia. Nomonitoramento da terapia, os julgamentos clínicos são feitos em relação aoefeito de um dado curso da terapia por comparação da expressão dos genescom o tempo, para determinar se os perfis de expressão gênica alteraram-seou estão se alterando para padrões mais consistentes com o tecido normal.

Os genes podem ser agrupados de modo que a informação obti-da sobre o grupo de genes no grupo proporcione uma base segura para efe-tuar um julgamento clinicamente relevante, tal como um diagnóstico, umprognóstico, ou a escolha do tratamento. Estes grupos de genes constituemos portfólios da invenção. Como com a maior parte dos Marcadores de diag-nóstico, é freqüentemente desejável usar o menor número de Marcadores,suficiente para fazer um julgamento médico correto. Isto impede um retardono tratamento que aguarda análise adicional, bem como o uso não produtivodo tempo e de recursos.

Um método de estabelecer os portfólios de expressão gênica éatravés do uso de algoritmos de otimização, tais como o algoritmo de variân-cia média, amplamente usado no estabelecimento de portfólios de estoque.Este método é descrito em detalhe em 20030194734. Essencialmente, ométodo requer o estabelecimento de um grupo de insumos (estoques emaplicações financeiras, expressão conforme medida pela intensidade aqui)que otimizará o retorno (por exemplo, o sinal que é gerado) que se recebepor utilizá-lo, ao mesmo tempo minimizando a variabilidade do retorno. Mui-tos programas comerciais de software estão disponíveis para conduzir taisoperações. O "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application",referido como "Software Wagner" por todo este relatório descritivo, é preferi-do. Este software, que utiliza funções da "Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library" para determinar uma fronteira eficiente e port-fólios ótimos no sentido de Markowitz, é preferido. Markowitz (1952). O usodeste tipo de software requer que o dado do microarranjo seja transformado,de modo que ele possa ser tratado como um insumo no retorno do caminhodo estoque, e as medições de risco são usadas quando o software for usadopara os seus propósitos de análise financeira pretendidos.

O processo de selecionar um portfólio pode também incluir aaplicação de regras heurísticas. De preferência, tais regras são formuladascom base na biologia e em um entendimento da tecnologia usada para pro-duzir os resultados clínicos. Mais preferivelmente, elas são aplicadas aoproduto do método de otimização. Por exemplo, o método de variância mé-dia de seleção de portfólio pode ser aplicado ao dado do microarranjo paradiversos genes diferencialmente expressos em pacientes com câncer. Oproduto do método seria um grupo otimizado de genes que poderia incluiralguns genes que são expressos no sangue periférico, bem como no tecidodoente. Se as amostras usadas no método de teste forem obtidas a partir dosangue periférico e certos genes diferencialmente expressos em situaçõesde câncer pudessem também ser diferencialmente expressos no sangueperiférico, então uma regra heurística pode ser aplicada, na qual um portfólioé selecionado a partir da fronteira eficiente, excluindo aqueles que são dife-rencialmente expressos no sangue periférico. Obviamente, a regra pode seraplicada antes da formação da fronteira eficiente, por exemplo, aplicando aregra durante a pré-seleção de dados.

Podem ser aplicadas outras regras heurísticas que não estejamnecessariamente relacionadas à biologia em questão. Por exemplo, pode-seaplicar uma regra que somente uma porcentagem prescrita do portfólio podeser representada por um gene ou grupo de genes particular. Um softwarecomercialmente disponível, tal como o Software de Wagner, prontamenteconcilia estes tipos de heurística. Isto pode ser útil, por exemplo, quandofatores diferentes da exatidão e da precisão (por exemplo, taxas de Iicenci-amento antecipadas) tiverem um impacto sobre a conveniência de incluir umou mais genes.

Os perfis de expressão gênica desta invenção podem tambémser usados em conjunção com outros métodos diagnósticos não-genéticos,úteis no diagnóstico, prognóstico, ou monitoramento do tratamento de cân-cer. Por exemplo, em algumas circunstâncias, é benéfico combinar a capa-cidade diagnostica dos métodos à base de expressão gênica descritos aci-ma com os dados de Marcadores convencionais, tais como os Marcadoresde proteínas do soro (por exemplo, o Antígeno do Câncer 27.29 ("CA27.29")). Existe uma faixa de tais Marcadores, incluindo tais analitos como oCA 27.29. Em tal método, o sangue é periodicamente retirado de um pacien-te tratado e então submetido a um imunoensaio de enzima para um dosMarcadores do soro descritos acima. Quando a concentração do Marcadorsugerir o retorno dos tumores ou o fracasso da terapia, retira-se uma fonteda amostra receptiva à análise da expressão do gene. Onde existir umamassa suspeita, um aspirado com agulha fina (FNA) é retirado e os perfis deexpressão gênica das células retiradas da massa são então analisados, con-forme descrito acima. Alternativamente, as amostras de tecido podem serretiradas de áreas adjacentes ao tecido a partir do qual um tumor foi anteri-ormente removido. Esta abordagem pode ser particularmente útil quandooutro teste produzir resultados ambíguos.

A presente invenção proporciona um método de propagar ascélulas de interesse obtidas de uma amostra biológica por a) enriquecimentodas células sob condições que mantenham uma viabilidade suficiente dascélulas; e b) propagação das células sob condições efetivas para a viabilida-de, a proliferação e a integridade das células.

A amostra biológica pode ser qualquer uma conhecida na técni-ca, incluindo, sem limitação, a urina, o sangue, o soro, o plasma, a linfa, oesputo, o sêmen, a saliva, as lágrimas, o fluido pleural, o fluido pulmonar, alavagem bronquial, o fluido sinovial, o fluido peritoneal, os ascites, o fluidoamniótico, a medula óssea, o aspirado da medula óssea, o fluido cérebro-espinhal, o Iisado ou o homogeneizado tecidual ou um pélete celular. Ver,por exemplo, 20030219842.

As células obtidas podem ser usadas para determinar a presen-ça ou a ausência de uma indicação. A indicação pode incluir qualquer umaconhecida na técnica, incluindo, sem limitação, o câncer, a avaliação de ris-co de predisposição genética herdada, a identificação de tecido de origemde uma célula de câncer, tal como uma CTC 60/887.625, a identificação demutações em doenças hereditárias, o status (estadiamento) da doença, oprognóstico, o diagnóstico, o monitoramento, a resposta ao tratamento, aescolha do tratamento (farmacológico), a infecção (viral, bacteriana, mico-plasmal, fúngica), a quimiossensibilidade 7112415, a sensibilidade ao fárma-co, o potencial metastático ou a identificação de mutações em doenças he-reditárias.

O enriquecimento das células pode ser por qualquer método co-nhecido na técnica, incluindo, sem limitação, por anticorpo / separação mag-nética, (Immunicon, Miltenyi, Dynal) 6602422, 5200048, classificador de cé-lulas ativado por fluorescência, (FACs) 7018804, filtração ou manualmente.O enriquecimento manual pode ser, por exemplo, através de massagem dapróstata. Goessl et al. (2001) Urol 58:335-338.

A propagação pode ser por qualquer método conhecido na téc-nica, tal como por cultivo in vitro, ex vivo ou in vivo. Os dispositivos e ascondições são descritos na técnica. 20070026519; ehttp://www.miltenyibiotec.com/en/NN_24_MACS_CelLCulture.aspx

A proliferação é pelo menos uma duplicação da célula. A integri-dade é determinada por proliferação das células de interesse versus célulascontaminantes.

As células da invenção reivindicada podem ser usadas, por e-xemplo, para determinar o potencial metastático de uma célula de uma a-mostra biológica, por isolamento do ácido nucléico e/ou da proteína das cé-lulas; e análise do ácido nucléico e/ou da proteína para determinar a presen-ça, o nível de expressão ou o status de um Biomarcador específico para opotencial metastático.

As células da invenção reivindicada podem ser usadas, por e-xemplo, para identificar mutações em doenças hereditárias de uma célula deuma amostra biológica, por isolamento do ácido nucléico e/ou da proteínadas células; e análise do ácido nucléico e/ou da proteína para determinar apresença, o nível de expressão ou o status de um Biomarcador específicopara uma doença hereditária.

As células da invenção reivindicada podem ser usadas, por e-xemplo, para obter e conservar o material celular e as suas partes constituin-tes, tais como o ácido nucléico e/ou a proteína. As partes constituintes po-dem ser usadas, por exemplo, para preparar vacinas de células de tumor ouna terapia de células imunes. 20060093612, 20050249711

As células da presente invenção podem ser propagadas paraproporcionar linhagens celulares e populações de células clonais, As célulaspodem ser usadas, por exemplo, para examinar as substâncias químicasquanto à eficácia farmacêutica e produção de produtos celulares, tais comoanticorpos e citocinas. 7015313; 685544; e 6413744

Os kits feitos de acordo com a invenção incluem ensaios forma-tados para determinar os perfis de expressão gênica. Estes podem incluirtodos ou alguns dos materiais necessários para conduzir os ensaios, taiscomo reagentes e instruções e um meio através do qual são testados os Bi-omarcadores.

Os artigos desta invenção incluem representações dos perfis deexpressão gênica, úteis para tratar, diagnosticar, prognosticar, e de outromodo avaliar as doenças. Estas representações dos perfis são reduzidas atéum meio que possa ser automaticamente lido por uma máquina, tal comomeios capazes de serem lidos por computador (magnéticos, ópticos, e simi-lares). Os artigos podem também incluir instruções para avaliar os perfis deexpressão gênica em tais meios. Por exemplo, os artigos podem compreen-der um CD ROM tendo instruções de computador para comparar os perfis deexpressão gênica dos portfólios de genes descritos acima. Os artigos podemtambém ter perfis de expressão gênica registrados digitalmente neles, demodo que eles possam ser comparados com dados de expressão de genesde amostras de pacientes. Alternativamente, os perfis podem ser registradosem diferente formato representacional. Um registro gráfico é tal formato. Al-goritmos de agrupamento, tais como aqueles incorporados no software"DISCOVERY" e "INFER" da Partek, Inc., mencionados acima, podem me-lhor auxiliar na visualização de tais dados.

Os diferentes tipos de artigos de fabricação de acordo com ainvenção são os meios ou os ensaios formatados usados para revelar osperfis de expressão gênica. Estes podem compreender, por exemplo, os mi-croarranjos, nos quais os complementos de seqüências ou as sondas sãounidas a uma matriz à qual as seqüências indicativas dos genes de interessecombinam-se, criando um determinante de sua presença capaz de ser lido.Alternativamente, os artigos de acordo com a invenção podem ser adapta-dos nos kits de reagentes para conduzir a hibridização, a amplificação, e ageração de sinais, indicativas do nível de expressão dos genes de interessepara detectar o câncer.

A presente invenção define os portfólios de marcadores especí-ficos que tenham sido caracterizados para detectar uma única célula de tu-mor de mama circulante em uma base de sangue periférico. O portfólio deensaio multiplex de caracterização molecular foi otimizado para uso comoum ensaio de multiplex QRT-PCR, onde o multiplex de caracterização mole-cular contém 2 marcadores de tecido de origem, 1 marcador epitelial e ummarcador housekeeping. A QRT-PCR será realizada no Smartcycler Il para oensaio multiplex de caracterização molecular. O portfólio de ensaio singlexde caracterização molecular foi otimizado para uso como um ensaio deQRT-PCR onde cada marcador é corrido em uma única reação que utiliza 3marcadores de status do câncer, 1 marcador epitelial e um marcador house-keeping. Diferente do ensaio multiplex RPA, o ensaio singlex de caracteriza-ção molecular será corrido no Applied Biosystems (ABI) 7900HT e utilizaráuma placa de 384 cavidades como sua plataforma. Os portfólios de ensaiomultiplex e de ensaio singlex de caracterização molecular detectam preci-samente uma única célula epitelial circulante, capacitando os médicos deprognosticar a recorrência. O ensaio multiplex de caracterização molecularutiliza a DNA polimerase de Thermus thermophilus (TTH) devido a sua ca-pacidade de realizar ambas as reações em cadeia por transcritase reversa epor polimerase em uma única reação. Em contraste, o ensaio singlex de ca-racterização molecular utiliza a Mistura Máster de Uma Etapa da AppliedBiosystems, que é uma reação de duas enzimas que incorpora MMLV para atranscrição reversa e a Taq polimerase para a PCR. Os projetos dos ensaiossão específicos para RNA pela incorporação de uma junção de éxon-íntron,de modo que o DNA genômico não seja eficientemente amplificado e detec-tado.

A presente invenção demonstra o método para capturar asCTCs e cultivá-las in vitro. O experimento e os resultados são descritos a-baixo.

Existem diversos novos aspectos desta invenção. Primeiramente,a invenção é a primeira demonstração da combinação de ensaios de qRTP-CR multiplex e a tecnologia CeIISearch para o enriquecimento das célulasepiteliais circulantes. Foi uma descrição detalhada sobre os novos métodosdesenvolvidos para isolar o RNA após o enriquecimento e o uso do RNA emum ensaio de qRTPCR. Em segundo lugar, a invenção pode ser usada comoum substituto para as células propriamente ditas. Ou seja, em indicaçõesclínicas, onde forem verificados números muito pequenos de células circu-lantes, ou em situações onde forem verificadas muito poucas células circu-lantes intactas (visto que as células danificadas não são reconhecidas peloalgoritmo de enumeração CeIISearch), o uso do ensaio de qRTPCR poderiaproporcionar uma enumeração mais sensível das células de tumor circulan-tes, porque o RNA seria isolado das células de tumor circulantes tanto intac-tas quanto danificadas, aumentando a sensibilidade da detecção, e os en-saios de qRTPCR altamente sensíveis poderiam aumentar adicionalmente asensibilidade. Um aspecto-chave final da invenção é que, por utilização deensaio multiplex quantitativo, pode-se ser capaz de gerar um algoritmo ba-seado em dois ou mais genes para gerar informação de prognóstico sobreos pacientes a partir dos quais as células de tumor circulantes foram isola-das. De modo importante, a informação molecular pode proporcionar infor-mação de prognóstico adicional, ou mesmo nova, quando combinada com aenumeração das células epiteliais circulantes.

Em uma modalidade, o ensaio singlex de caracterização Molecu-lar é baseado em Transcriptase Reversa e Reação em Cadeia Por Polime-rase Quantitativa (QRT-PCR), onde cada marcador é corrido em uma reaçãoindividual. A presente invenção descreve o uso de 3 marcadores de tecidode origem, 1 marcador epitelial para a confirmação que as células de tumorcirculantes estão presentes a partir do câncer de mama e um marcador decontrole para a verificação da qualidade da amostra. As combinações espe-cíficas de iniciadores/sondas para cada marcador são projetadas para resul-tar em análise de alta especificidade e sensibilidade para prognosticar a re-corrência nos pacientes com câncer de mama. Estas combinações de inicia-dores/sondas para marcadores específicos são otimizadas para a plataformade Applied Biosystems (ABI) 7900HT para detectar uma única célula de tu-mor de mama circulante em uma base de sangue periférico. Os resultados apartir deste ensaio mostram que ele poderia ser usado em paralelo com o kitde enumeração Kit de CTC CelISearch® e, assim, é benéfico tanto para omédico quanto para o paciente para prognosticar a recorrência.

Em uma segunda modalidade, o ensaio multiplex da mama decaracterização molecular é também baseado em QRT-PCR, entretanto, emcontraste com o ensaio singlex apresentado acima, a amostra do paciente éanalisada em uma única reação com 3 marcadores de diagnóstico, capaci-tando uma porcentagem maior de detecção. A presente invenção descreve ouso de 2 marcadores de tecido de origem, 1 marcador epitelial para a con-firmação que as células de tumor circulantes estão presentes a partir docâncer de mama e um marcador de controle para a verificação da qualidadeda amostra. As combinações específicas de iniciadores/sondas para cadamarcador são projetadas para resultar em alta sensibilidade, ao mesmotempo muito específicas em uma base de leucócitos do sangue periféricoPBLs. A viabilidade destas aplicações é demonstrada pela capacidade desteensaio de detectar <5 células SKBR3 introduzidas em 7,5 ml de sangue peri-férico. Estas combinações de iniciadores/sondas para marcadores específi-cos são otimizadas para a plataforma de Smartcycler II. Os resultados a par-tir deste ensaio apresentam um método para a detecção de células de tumorcirculantes de mama que é inigualável quando comparado aos métodos atu-ais disponíveis devido à sensibilidade do ensaio e ao uso simultâneo de 4genes. Será a intenção tornar este ensaio disponível para uso comercial emconjunção com o kit de enumeração de CTC CelISearch®.

Em uma terceira modalidade, o ensaio de caracterização mole-cular é baseado em qRTPCR para a caracterização de células da próstatacirculantes. Neste exemplo, um ensaio multiplex muito sensível incorpora 1marcador epitelial (CK19), um marcador de tecido de origem da próstata(PSA; também conhecido como calicreína 3), e um gene de controle (PBGD).Este ensaio pode também ser usado para a detecção altamente sensível decélulas da próstata.

A presente invenção proporciona um método para cultivar asCTCs a partir do sangue. O processo envolve o uso da tecnologia CeIISear-ch® e de seu sistema AutoPrep CelITracks® associado e do Kit de Perfil Cel-ISearch®. Estas células propagadas poderiam ser usadas em estudos far-macogenômicos e também para extrair os ácidos nucléicos em quantidadessuficientes para uso em estudos de definição do perfil molecular. Finalmente,este ensaio poderia também ser usado como uma ferramenta confirmatória em combinação com os resultados de enumeração das CTCs.

A presente invenção proporciona um método para detectar osmarcadores de metilação em DNA a partir de <5 equivalentes de células (3células neste estudo) seguindo a conversão com bissulfito de sódio. O pro-cesso envolve a pré-amplificação da região-alvo, seguida por um QMSP multiplex. Existem diversos novos aspectos desta invenção. Primeiramente,a invenção é a primeira demonstração da combinação de ensaios de QMSPmultiplex (envolvendo a PCR aninhada) e a sua extensão até a tecnologiaCelISearch® que enriquece as células de tumor circulantes (CTCs). Em se-gundo lugar, o ensaio de QMSP pode proporcionar informação útil sobre di-versos marcadores moleculares, assim tornando-o mais sensível quandocombinado com a tecnologia CelISearch®. Em terceiro lugar, o ensaio deQMSP multiplex pode ser capaz de proporcionar um novo método prognósti-co para a detecção de células de tumor múltiplas, por exemplo, os cânceresde próstata e de mama. Finalmente, este ensaio poderia também ser usadocomo uma ferramenta confirmatória em combinação com o resultado de e-numeração das CTCs.

A presente invenção define portfólios de marcadores específicosde metilação que tenham sido caracterizados para detectar <20 pg de DNAapós Conversão com Bissulfito de Sódio, equivalente a 3 células de tumorcirculantes, em uma base de Leucócito de sangue periférico (PBL), equiva-lente a 10.000 a 100.000 PBLs. Atualmente, o multiplex de caracterizaçãomolecular contém 1 marcador específico de metilação e um marcador hou-sekeeping (2 adicionais de marcadores específicos de metilação em DNAserão adicionados logo). O DNA genômico será submetido à conversão combissulfito de sódio e purificação usando o Kit ZymoResearch. Uma pré-amplificação de regiões-alvo usando os grupos de inicíadores aninhados(iniciadores externos) será realizada em um termociclizador. Em uma reaçãode QMSP subseqüente, um sinal fluorescente será gerado usando os inicia-dores internos com um projeto de sonda da Scorpion na plataforma deSmartcycler® da Cepheid ou plataforma equivalente.

Tabela I. Seqüências de Iniciadores da PCR

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>

Configuração Experimental:

As formulações de reagentes e as condições de ciclização daprimeira reação PCR (pré-amplificação) como a seguir:

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Tabela III. Condições de ciclização para a pré-amplificação

<table>table see original document page 20</column></row><table>

6-10% do produto da primeira PCR, conforme está, sem nenhu-ma purificação, a partir do acima descrito serão transferidos para um tubonovo para a 2- PCR, com a adição dos reagentes que se seguem (TabelaIV) e submetidos às condições de ciclização na Tabela V.

As formulações de reagentes e as condições de ciclização dasegunda reação PCR como a seguir:

Tabela IV. Reagentes para a 2- PCR

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Tabela V. Condicoes de ciclizacao para a 2a PCR

<table>table see original document page 21</column></row><table>

As amostras de DNA a seguir foram usadas neste estudo:DNA metilado Universal CpGenome (CpG M), DNA de Adeno-carcinoma da Próstata (PC) ou DNA Normal da Próstata (PN) em uma basede DNA introduzido (100 ng ou 500 ng) a partir de linfócitos de sangue peri-férico (PBLs). As reações de QMSP foram realizadas após a conversão combissulfito de sódio. Os exemplos a seguir são pretendidos para ilustrar, po-rém não limitar, a invenção.

Exemplo n° 1

Análise da Expressão Gênica de RNA de Mama diluído em sérielntroduzidoem uma Base de RNA de Leucócito

Os ensaios a partir do portfólio de ensaio singlex de caracteriza-ção molecular incluem uma sonda de PCR específica para a junção que eli-mina a amplificação do DNA genômico. As seqüências de iniciadores e desondas de hidrólise duplamente marcadas, testadas para esta amostra, sãomostradas abaixo:

Ensaios Singlex RPA

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Cada reação singlex foi realizada no Applied Biosystems7900HT, usando as condições de ciclização e as formulações de reagentesa seguir, como se segue:

<table>table see original document page 22</column></row><table><table>table see original document page 23</column></row><table>

Após o isolamento de RNA das linhagens de células de câncerde mama SKBR3 e MCF7, o RNA total foi diluído em série para representar1-400 equivalentes de células (CE). O RNA diluído em série foi então intro-duzido em um RNA total de leucócitos de base equivalente a 50.000CE. APCR Quantitativa em Tempo Real foi aplicada e os resultados dos ensaiosotimos que suportam esta invencao sao motrados abaixo.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplo n° 2

Análise da Expressão Gênica de Marcadores ou Ensaios Alternativos

Os projetos adicionais testados incluem uma sonda de PCR es-pecífica para junção que elimina a amplificação do DNA genômico. As se-qüências de iniciadores e de sondas de hidrólise duplamente marcadas, tes-tadas para esta amostra, são mostradas abaixo:

<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table> As amostras foram preparadas e os transcritos amplificados nomesmo modo como descrito no Exemplo n2 1. Os resultados destes ensaiosalternativos que suportam a invenção são mostrados abaixo. Quando com-parados ao desempenho dos marcadores no Exemplo n- 1, os resultados aseguir demonstram ensaios que têm desempenho inferior, principalmentecontribuído à ausência de especificidade e/ou sensibilidade do marcador eao projeto insatisfatorio de iniciadores ou sondas.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo n° 3

Análise por QRT-PCR das células SKBR3 e MCF7 enriquecidas

O ensaio de caracterização molecular combinará a parte de cap-tura da célula da tecnologia CeIISearch com um ensaio de detecção molecu-lar. A sensibilidade do ensaio CeIISearch pode ser melhorada utilizando umatecnologia de detecção molecular capaz de detectar a expressão do marca-dor tanto nas células intactas quanto nos fragmentos de células, tipicamentenão chamados positivos pelo ensaio CeIISearch. O isolamento do RNA u-sando as células SKBR3 e MCF7 imunomagneticamente enriquecidas, intro-duzidas no sangue de doador saudável extraído para tubos de sangue comanticoagulante de EDTA, foi efetuado conforme mostrado abaixo.

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Tradução:

Assay = Ensaio

Cell Line = Linhagem Celular

Leuk Bkgd = Base de Leuc.

PC 1000 CTC = 1000 CTC de PC )

A viabilidade do ensaio singlex de caracterização molecular foidemonstrada por sensibilidade e detecção reproduzível de transcritos demRNA específicos em <5 células SKBR3 quando enriquecidas a partir de7,5 ml de sangue de doador saudável.

Exemplo 4

Análise do Ensaio Multiplex de Caracterização Molecular de RNA de MamaDiluído em Série Introduzido em uma Base de RNA de Leucócitos

Os ensaios a partir do portfólio de ensaio multiplex RPA incluemuma sonda de PCR específica para a junção que elimina a amplificação doDNA genômico. As seqüências de iniciadores e de sondas de hidrólise du-plamente marcadas, testadas para esta amostra, são mostradas abaixo:<table>table see original document page 27</column></row><table>

Cada reação multiplex foi realizada no Smartcycler Il usando ascondições de ciclização e as formulações de reagentes a seguir, como sesegue:<table>table see original document page 28</column></row><table>

Tradução:

Cyclirig Conditions = Condições de Ciclização

sec = s

cycles of = ciclos de

for = por)

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Tradução:

Reagents = Reagentes

BLN Enzyme Mix = Mistura de Enzimas BLN

Polymerase = Polimerase

Base BLN master Mix = Mistura máster de Base BLNIniciador Mix = Mistura de Iniciadores

Sample = Amostra)

Seguindo o isolamento do RNA das linhagens de células decâncer de mama SKBR3, o RNA total foi diluído em série para representar 1-125 equivalentes de célula. O RNA diluído em série foi então introduzido emum RNA total de leucócitos de base equivalente a 50.000CE. A PCR Quanti-tativa em Tempo Real foi aplicada e os resultados que suportam esta inven-ção são mostrados abaixo.

Tradução:

Assay = Ensaio

Cell Line = Linhagem Celular

RNA Serial Dilutions Spiked in 20 ng PBL = Diluições em Série de RNA In-troduzidas em 20 ng de PBL

Leuk = Leuc

water = água)

Exemplo n- 5

Análise por QRT-PCR Multiplex RPA das células SKBR3 enriquecidas

O ensaio multiplex de caracterização molecular combinará a par-te de captura da célula da tecnologia CeIISearch com um ensaio de detec-ção molecular. A sensibilidade do ensaio CeIISearch pode ser melhoradautilizando uma tecnologia de detecção molecular capaz de detectar a ex-pressão do marcador tanto nas células intactas quanto nos fragmentos decélulas, tipicamente não chamados positivos pelo ensaio CeIISearch. O iso-lamento do RNA usando as células SKBR3 imunomagneticamente enrique-cidas, transcrevendo somente o CK19 introduzido no sangue de doadorsaudável extraído para tubos de sangue com anticoagulante de EDTA, foiefetuado conforme mostrado abaixo. Em contraste com o ensaio Singlex decaracterização molecular, onde uma amostra de paciente tem de ser divididaentre todas as reações, o ensaio Multiplex de caracterização molecular ofe-rece sensibilidade aumentada capacitando o usuário a analisar o perfil mole-cular de uma amostra inteira em uma única reação.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Tradução:

Assay = EnsaioCell Line = Linhagem CelularLeuk = Leuc.)

Exemplo n2 6

Análise da Estabilidade do RNA de Células SKBR3 enriquecidas

A estabilidade do RNA de RNA intracelular foi avaliada atravésde QRT-PCR usando o ensaio Multiplex de caracterização molecular, duran-te um curso de tempo de 48 horas. 200 células SKBR3 foram introduzidasem tubos múltiplos de 7,5 ml de sangue de doador saudável. No final de ca-da ponto de tempo, as amostras foram processadas usando a parte de cap-tura da célula da tecnologia CeIISearch e o Kit de Perfil CeIISearch. Após oisolamento do RNA, as amostras foram analisadas e os resultados são mos-trados na tabela abaixo e na figura 1.

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Tradução:

Assay = Ensaio

Cell Line = Linhagem Celular

hr = h

A presente invenção proporciona métodos, aparelho e kits parao processamento de amostras de células de tumor circulantes (CTCs) dentrodo sangue periférico e avaliação de seus perfis de expressão gênica, aomesmo tempo proporcionando suporte para a plataforma Cell search para oteste de recorrência da doença. Os exemplos mostram a capacidade de de-tectar uma única célula de tumor circulante em uma base de sangue periféri-co usando um novo ensaio multiplex que oferece vantagens aumentadassobre os ensaios de RT-PCR singlex tradicionais.

Exemplo n2 7

Células Circulantes da Próstata

O RNA da próstata foi introduzido no RNA de leucócitos e testa-do em um ensaio multiplex no Smartcycler Il da Cepheid. O dado represen-tativo é mostrado abaixo e na figura 2.Average Ct value

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Tradução:

prostate RNA = RNA da próstataAverage Ct value = Valor médio de Ct

w/ = c/

ng PBL RNA only = somente 20 ng de RNA de PBL)

Exemplo ns 7

Sensibilidade Aumentada para Análise da Expressão Gênica usando o En-saio Multiplex de QRT-PCR Aninhada RPA de Mama.

A detecção por transcrição reversa (RT)-PCR em tempo real, emuma única rodada, é geralmente inconsistente porque a concentração deRNA extraído das células de tumor circulantes é freqüentemente muito baixa.A QRT-PCR em duas rodadas usando iniciadores aninhados aumenta tantoa especificidade quanto a sensibilidade do ensaio, especificamente aquelesque trabalham com mensagens-alvo ou raras de baixa qualidade ou qualida-de insatisfatória. Este método incorpora dois pares de iniciadores que sãousados para amplificar primeiramente uma molécula de ácido nucléico demolde maior e, subseqüentemente, uma seqüência-alvo de ácidos nucléicosque está contida na molécula de molde amplificada. Assim, pelo emprego deQRT-PCR em duas rodadas, tanto a sensibilidade quanto a especificidadesão aumentadas para o ensaio concomitante molecular RPA de mama. Figu-ra 3.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Tradução:RPA Nested Iniciadores = Iniciadores Aninhados do RPAAssay = EnsaioSequence = Seqüência)

A reação de amplificação multiplex aninhada foi realizada noSmartcyeler II, usando as condições de ciclização e as formulações de rea-gentes que se seguem, como a seguir: Conforme descrito acima, o RNA deSKBR3 diluído em série, introduzido em uma base de RNA total de leucóci-tos, foi usado no exemplo a seguir.

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tradução:

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Sample = Amostra)

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tradução:

Temperature = TemperaturaTime = Tempo

sec = s

Cycles = Ciclos)

Seguindo a amplificação da primeira rodada, os tubos são gira-dos e uma alíquota de três microlitos é retirada do primeiro tubo e expelidapara um segundo tubo contendo os iniciadores, as sondas e os reagentes a

seguir.

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Tradução:

RPA Multiplex Assays = Ensaios Multiplex RPAAssays = Ensaios

Sequence = Seqüência)

A PCR Quantitativa em Tempo Real foi aplicada usando os pa-râmetros a seguir e os resultados que suportam esta invenção são mostra-dos abaixo. _

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Tradução:

Temperature = Temperatura

Time = Tempo

sec = s

Cycles = Ciclos)

Exemplo n9 8<table>table see original document page 34</column></row><table>

Tradução:

Reagents = Reagentes

BLN Enzyme Mix = Mistura de Enzimas BLN

Polymerase = Polimerase

BLN Master Mix = Mistura Máster BLN

Iniciador Mix = Mistura de Iniciadores

Sample = Amostra)

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Tradução:

Two Round RT-PCR = RT-PCR em Duas Rodadas

Sample = Amostra

Leuk = Leuc.)

Análise por QRT-PCR Aninhada RPA de Mama em Duas Rodadas das Célu-las SKBR3 enriquecidas

O ensaio de QRT-PCR aninhada RPA de mama será usado emconjunção com o enriquecimento CeIISearch para melhorar a tecnologia dedetecção molecular capaz de detectar a expressão do marcador tanto nascélulas intactas quanto nos fragmentos de células, tipicamente não chama-dos positivos pelo ensaio de CTC CeIISearch. O isolamento do RNA usandoas células SKBR3 imunomagneticamente enriquecidas, introduzidas no san-gue de doador saudável extraído para tubos de sangue com anticoagulantede EDTA1 foi efetuado conforme mostrado abaixo. Em contraste com o en-saio de QRT-PCR RPA em uma rodada, onde a sensibilidade e a especifici-5 dade são baixas, a QRT-PCR aninhada RPA de mama em duas rodadasoferece sensibilidade e especificidade aumentadas, capacitando o usuáriode ter quase sensibilidade de cópia individual.

Exemplo ng 9

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Tradução:

Breast RPA Spike In = Introdução por RPA de Mama Em

Sample ID = ID da Amostra

No Cells = Nenhuma Célula

cells = células)

Sensibilidade Aumentada para a Análise da Expressão Gênica usando oEnsaio Multiplex de QRT-PCR Aninhada MCA da Próstata.

A necessidade por sensibilidade e especificidade melhoradasnas reações PCR projetadas para amplificar as seqüências raras nas célulasde tumor da próstata circulantes é abordada na presente invenção. A tecno-logia utilizada no ensaio multiplex de QRT-PCR aninhada RPA de mama foicruzada para criar o ensaio concomitante molecular (MCA) de QRT-PCRaninhada da próstata.<table>table see original document page 36</column></row><table>

Tradução:

Prostate MCA Nested Iniciadores = Iniciadores Aninhados do MCA da prós-tata

Assay = Ensaio

Sequence = Seqüência)

A reação de amplifieação multiplex aninhada foi realizada noSmartcyeler Il usando as condições de ciclização e as formulações de rea-gentes a seguir, como se segue: Conforme descrito acima, o RNA de LN-CAP diluído em série, introduzido em uma base de RNA total de leucócitos,foi usado no exemplo a seguir.

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Tradução:

Reagents = ReagentesBLN Enzyme Mix = Mistura de Enzimas BLNPolymerase = PolimeraseBLN Master Mix = Mistura Máster BLNIniciador Mix = Mistura de IniciadoresSample = Amostra)<table>table see original document page 37</column></row><table>

Tradução:

Temperature = Temperatura

Time = Tempo

sec = s

Cycles = Ciclos)

Seguindo a amplificação da primeira rodada, os tubos são gira-dos e uma alíquota de três microlitos é retirada do primeiro tubo e expelidapara um segundo tubo contendo os iniciadores, as sondas e os reagentes aseguir.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Tradução:

Prostate MCA Multiplex Assays = Ensaios Multiplex MCA da Próstata

Assays = Ensaios

Sequence = Seqüência)

A PCR Quantitativa em Tempo Real foi aplicada usando os pa-râmetros a seguir e os resultados que suportam esta invenção são mostra-dos abaixo.

<table>table see original document page 37</column></row><table>Tradução:

Temperature = Temperatura

Time = Tempo

sec = s

Cycles = Ciclos )

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Tradução:

Reagents = Reagentes

BLN Enzyme Mix = Mistura de Enzimas BLN

Polymerase = Polimerase

BLN Master Mix = Mistura Máster BLNIniciador Mix = Mistura de Iniciadores

Sample = Amostra)

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Tradução:

Two Round RT-PCR = RT-PCR em Duas Rodadas

Sample = Amostra

Leuk = Leuc.)

Exemplo n2 10

Análise por QRT-PCR Multiplex MCA da Próstata das Células LNCAP enri-quecidasO ensaio de QRT-PCR aninhada multiplex MCA da próstata seráusado em conjunção com o enriquecimento CeIiSearch para melhorar a tec-nologia de detecção molecular capaz de detectar a expressão do marcadortanto nas células intactas quanto nos fragmentos de células, tipicamente nãochamados positivos pelo ensaio de CTC CeIISearch. O isolamento do RNAusando as células LNCAP imunomagneticamente enriquecidas, introduzidasno sangue de doador saudável extraído para tubos de sangue com anticoa-gulante de EDTA, foi efetuado conforme mostrado abaixo. Em contraste como ensaio de QRT-PCR da próstata em uma rodada, onde a sensibilidade e aespecificidade são baixas, a QRT-PCR aninhada MCA da próstata em duasrodadas oferece sensibilidade e especificidade aumentadas, capacitando ousuário de ter quase sensibilidade de cópia individual.Exemplo 11:

Introdução de SKBR3 seguida por captura pelo sistema CelISearch®

As células SKRB3 foram introduzidas, a 1000 células, em 7,5 mLde sangue de doador (Vacutainer® de topo roxo com o EDTA como conser-vante), conforme mostrado na Tabela I.

<table>table see original document page 39</column></row><table>

As CTCs foram capturadas pelos glóbulos imunomagnéticosconjugados a EpCAM usando o Kit de Perfil CelISearch® e o sistema Auto-Prep CelITracks®. Os tubos contendo as CTCs capturadas foram removidosdo sistema e colocados no ímã Magcellect®, incubados por 10 min. O sobre-nadante foi removido com o tubo ainda no Magcellect®. O precipitado foisuspenso em 200 μΙ de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Asuspensão de células foi colocada em uma placa de 48 cavidades contendo1,0 mL por cavidade de Meio Essencial Mínimo de Eagle completo com 10%de soro bovino fetal (FBS). As células foram avaliadas qualitativamente poraté 14 dias durante o crescimento e os resultados da observação são resu-midos na Tabela II. No final do período de cultura (5 dias e 14 dias), as célu-las foram lavadas duas vezes com PBS e Iisadas diretamente no poço usan-do o tampão RLT (Qiagen). O RNA total dos Iisados foi isolado utilizando oMicro Kit RNeasy (Qiagen). Estas amostras de RNA serão usadas para aná-lises adicionais, incluindo a expressão gênica global.Resultados

As CTCs capturadas usando o sistema AutoPrep CelITracks®parecem ser viáveis, embora fosse observada uma diminuição na taxa deduplicação em comparação com as células parentais.

Os leucócitos morreram dentro de 2 dias de cultura, desse modonão interferindo com o crescimento das CTCs.

As CTCs foram vistas estarem se dividindo, embora mais lenta-mente do que as células parentais de controle, conforme esperado.

O tempo de duplicação do crescimento para as CTCs foi cercade >2x, em comparação com as células parentais.

Foi observada uma diferença nas propriedades de crescimento(qualidade e viabilidade) entre as 2 réplicas, sugerindo um possível efeito apartir do sangue do doador.

Tabela lí. Resultados Qualitativos

Doador Dia 1 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 DiaIO Dia 12 Dia 14n2 1 I I H Illl ■I I I I -HH- -H- -H- + Illl Illl I Ill -H I I Hll +++ -HH- ++ -H-Contro- le Il ι ι ι I \ Hll I I Il I I I Illlll Illlll Illlll Hllll Illlll Illlll

As cavidades preparadas a partir das células que passa-

ram pelo AutoPrep CelITracks® nunca foram tão densas quanto a ca-vidade de controle.Exemplo 12

Quantidades variáveis de DNA CpG M introduzido em 100 ou 500 ng deDNA de PBLs

(25 ciclos de PCR de pré-amplificação e uso de 10% de produtoda PCR diluído transferidos para a segunda PCR). Os valores de Ct para oDNA de molde direto ou pré-amplificado (CpG M) são mostrados na tabela aseguir e na figura 4.

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tradução:

Pre-amplification (nested PCR) = Pré-amplificação (PCR aninhada)No pre-amplification (directly PCR) = Sem pré-amplificação (PCR diretamen-te)

Ct value = valor de CtActin = Actina)Exemplo 13

DNA PC e PN introduzido em 500 ng de PBL (equivalentes a(20 ciclos de PCR de pré-amplificação, seguidosde produto resultante na segunda PCR)Tabela VII. Valores de Ct para o DNA de molde direto ou

(adenocarcinoma da próstata ou normal)

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tradução:

Equivalent to Prostate cells = Equivalentes às células da Próstata

70.000 células)pelo uso de 6%

pré-amplificadoActin = Actina

only = somente

no DNA = sem DNA )

Resultados:

50 pg de DNA CpG M (equivalentes a 7 células) em uma basede 100 ng ou 500 ng de PBL (equivalentes a 10.000 ou 70.000 células, res-pectivamente) foram detectados usando QMSP com ou sem pré-amplificação. Foram geradas boas curvas de respostas lineares para ambasas reações de pré-amplificação e direta. No estudo inicial, <20 pg de DNA doadenocarcinoma da próstata, equivalentes a 3 células de tumor circulantes,geraram um sinal específico para a região GSTP1 metilado e foram detecta-dos em uma base de 70.000 células de PBL. Por outro lado, nenhum sinaldetectável do DNA da próstata normal (PN) ou do sangue (PBL) foi observa-do, sugerindo a ausência de GSTP1 metilado. A sensibilidade de detecçãopor QMSP aninhada de 1 cópia em uma base de 2,5x104 cópias (20 pg deDNA metilado em 500 ng de DNA não-metilado) é observada. Nenhum pro-duto não-específico significativo foi detectado com o método de QMSP ani-nhada e o tamanho correto dos fragmentos finais da PCR foi observado nogel (dados não-mostrados). Experimentos adicionais de otimização dos en-saios estão a caminho para aumentar a sensibilidade de detecção e reduziro valor de Ct para <3 células.Exemplo 14

Demonstração da utilidade do ensaio para as células de tumor circulantes(CTCs) no sangue por introdução das linhagens de células de câncer dapróstata (LnCAP e DU-145) no sangue do doador

As linhagens de células de tumor da próstata (LnCAP e DU-145),desenvolvidas em cultura, foram introduzidas, a 30, 100, 300 e 500 células,em 7,5 ml de sangue de doador, seguido por captura das CTCs pelo sistemaAutoPrep CelITracks® da plataforma CelISearch®, usando o Kit de Perfil. Oácido desoxirribonucléico destas células foi isolado usando as microcolunasda Qiagen e submetido à reação de conversão com bissulfeto. O DNA modi-ficado da última etapa foi usado em uma reação q-MSP de 2 rodadas, usan-do as condições na Tabela Ill (22 ciclos) e na Tabela V. Os resultados dosexperimentos são mostrados nas Tabelas Vlll e IX.

Tabela VIII. Valores de Ct das CTCs (células introduzids, LnCAP)_

<table>table see original document page 43</column></row><table>

As diferenças nas reações duplicadas foram menores do que Ct

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Tabela IX. Valores de Ct das CTCs (células introduzidas, Du-145)

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Estes resultados claramente demonstram que a q-MSP pode seraplicada com êxito às CTCs a partir de pacientes com câncer de próstata.Listagerm de Seqüências

<110> VERIDEX, LLC

Baden, Jonathan F.Choi, Chang H.Chowdary, DondapatiCurtin, Kathleen M.Vener, TatianaWang, HaiyingBurnett, Christine A.Mazumder, Abhijit<120> Propagação de Células Primárias<130> VDX5034USNP1<140> 11/717.835<141> 13-03-2007<150> 60/781.882<151> 13-03-2006<150> 60/781.901<151> 13-03-2006<160> 53

<170> PatentIn versão 3.4<210> 1<211> 18<212> DNA<213> humano<400> 1

tcggggattt tagggcgt<210> 2<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 2

acgaaaacta cgacgacgaa a<210> 3<211> 24<212> DNA<213> humano<400> 3

gatataaggt tagggatagg atag<210> 4<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 4

aaccaataaa acctactcct cc

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> humano

<400> 5

cgcacggcga actcccgccg acgtgcgtgt agcggtcgtc ggggttg<210> 6<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 6

gccccaatac taaatcacga cg

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> humano

<400> 7

ccgcgcatca ccaccccaca cgcgcgggga gtatataggt tggggaagtt tg<210> 8<211> 27<212> DNA<213> humano<400> 8aacacacaat aacaaacaca aattcac

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 9

aatggccaaa gcactgctct ta<210> 10<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 10

acttgctgtt tttgctcatg t

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> humano

<400> 11

atcgaatcaa aaaacaagca tggcctcaca<210> 12<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 12

cacccttcag ggtcttgaga tt<210> 13<211> 20<212> DNA<213> humano<400> 13

tccgtttctg ccagtgtgtc 20

<210> 14<211> 24<212> DNA

<213> humano<400> 14

acagctgagc atgaaagctg cctt 24

<210> 15<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 15

ccacacacag cctactttcc aa 22

<210> 16<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 16

tacccacgcg aatcactctc a 21

<210> 17<211> 27<212> DNA<213> humano<400> 17

aacggcaatg cggctgcaac ggcggaa 27

<210> 18<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 18

agttgctgat ggtcctcatg c 21<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 19

cacttgtgga ttgattgtct tgga<210> 20<211> 23<212> DNA<213> humano<400> 20

ccctctccca gcactgctac gca<210> 21<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 21

gagtacgtgg gcctgtctgc a<210> 22<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 22

ttgcactcct tgggggtgac a

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 23

accagtgtgc cgtgccagcc aagga<210> 24<211> 20<212> DNA<213> humano<400> 24

ctcctggttc tctgcctgca<210> 25<211> 24<212> DNA<213> humano<400> 25

gacgtactga cttgggaatg tcaa<210> 26<211> 30<212> DNA<213> humano<400> 26

aagctcagga caacactcgg aagatcattt<210> 27<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 27

ctgaggagta cgtgggcctg tc<210> 28<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 28

ttgcactcct tgggggtgac a<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> humano<400> 29

caaaccagtg tgccgtgcca gccaatt 27

<210> 30<211> 21<212> DNA

<213> humano<400> 30

gcttggtggt taaaacttac c 21

<210> 31<211> 20<212> DNA<213> humano<400> 31

tgaacagttc tgttggtgta 20

<210> 32

<211> 29<212> DNA<213> humano<400> 32

ctgcctgcct atgtgacgac aatccggtt 29

<210> 33<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 33

tgacactggc aaaacaatgc a 21

<210> 34<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 34

ggtccttttc accagcaagc t 21<210> 35

<211> 34

<212> DNA

<213> humano

<400> 35

ctttgctttc cttggtcagg cagtataatc catt

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> humano

<400> 36

aaaaacaagc atggcctac<210> 37<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 37

cagcaagttg agagcagtcc t

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> humano

<400> 38

catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt t<210> 39<211> 20<212> DNA<213> humano<400> 39

cgcccacctg gacatctgga<210> 40<211> 23<212> DNA

<213> humano

<400> 40

cactggtcga ggcacagtag tga

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> humano

<400> 41

gtcagcggcc tggatgaaag agcggtt

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> humano

<400> 42

aatggccaaa gcactgctct ta<210> 43<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 43

acttgctgtt tttgctcatg t

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> humano

<400> 44

atcgaatcaa aaaacaagca tggcctcaca<210> 45<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 45

cacccttcag ggtcttgaga tt<210> 46<211> 20<212> DNA<213> humano<400> 46

tccgtttctg ccagtgtgtc<210> 47<211> 26<212> DNA<213> humano<400> 47

acagctgagc atgaaagctg cctttt<210> 48<211> 22<212> DNA<213> humano<400> 48ccacacacag cctactttcc aa<210> 49<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 49

tacccacgcg aatcactctc a

<210> 50

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<212> DNA

<213> humano

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aacggcaatg cggctgcaac ggcggaatt<210> 51<211> 21<212> DNA<213> humano<400> 51agttgctgat ggtcctcatg c

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> humano

<400> 52cacttgtgga ttgattgtct tgga

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<211> 25

<212> DNA

<213> humano

<400> 53ccctctccca gcactgctac gcatt

Claims (23)

1. Método de propagar as células de interesse obtidas de umaamostra biológica, compreendendo as etapas de:a) enriquecer as células sob condições que mantenham umaviabilidade suficiente das células; eb) propagar as células sob condições efetivas para permitir aviabilidade, a proliferação e a integridade das células.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostrabiológica é selecionada a partir de urina, sangue, soro, plasma, linfa, esputo,sêmen, saliva, lágrimas, fluido pleural, fluido pulmonar, lavagem bronquial,fluido sinovial, fluido peritoneal, ascites, fluido amniótico, medula óssea, as-pirado da medula óssea, fluido cérebro-espinhal, Iisado ou homogeneizadotecidual ou um pélete celular.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as célulassão usadas para determinar a presença ou a ausência de uma indicação.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a indicaçãoé o câncer, a avaliação de risco de predisposição genética herdada, a identi-ficação de tecido de origem de uma célula de câncer, tal como uma CTC, aidentificação de mutações em doenças hereditárias, o status (estadiamento)da doença, o prognóstico, o diagnóstico, o monitoramento, a resposta aotratamento, a escolha do tratamento (farmacológico), a infecção (viral, bacte-riana, micoplasmal, fúngica), a sensibilidade ao fármaco por quimiossensibi-lidade, o potencial metastático ou a identificação de mutações em doençashereditárias.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as célulassão enriquecidas por anticorpo / separação magnética, classificador de célu-las ativado por fluorescência, (FACs)1 filtração ou manualmente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o enrique-cimento manual é por massagem da próstata.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a propaga-ção é por cultivo in vitro, ex vivo ou in vivo.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a prolifera-ção é pelo menos uma duplicação da célula.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a integrida-de é determinada por proliferação das células de interesse versus célulascontaminantes.

10. Método de determinar o potencial metastático de uma célulade uma amostra biológica, compreendendo as etapas de:a) enriquecer as células sob condições que mantenham umaviabilidade suficiente das células; eb) propagar as células sob condições efetivas para permitir aviabilidade, a proliferação e a integridade das células.c) isolar o ácido nucléico e/ou a proteína das células; ed) analisar o ácido nucléico e/ou a proteína para determinar apresença, o nível de expressão ou o status de um Biomarcador específicopara o potencial metastático.

11. Método de identificar mutações em doenças hereditárias deuma célula de uma amostra biológica, compreendendo as etapas de:a) enriquecer as células sob condições que mantenham umaviabilidade suficiente das células; eb) propagar as células sob condições efetivas para permitir aviabilidade, a proliferação e a integridade das células.c) isolar o ácido nucléico e/ou a proteína das células; ed) analisar o ácido nucléico e/ou a proteína para determinar apresença, o nível de expressão ou o status de um Biomarcador específicopara uma doença hereditária.

12. Método de conservar o material genético de uma célula deuma amostra biológica, compreendendo as etapas de:a) enriquecer as células sob condições que mantenham umaviabilidade suficiente das células; eb) propagar as células sob condições efetivas para permitir aviabilidade, a proliferação e a integridade das células.b) isolar o ácido nucléico e/ou a proteína das células; ec) conservar o ácido nucléico e/ou a proteína.

13. Método de preparar uma vacina de célula de tumor compre-endendo as etapas dea) enriquecer as células sob condições que mantenham umaviabilidade suficiente das células; eb) propagar as células sob condições efetivas para permitir aviabilidade, a proliferação e a integridade das células.c) isolar o ácido nucléico e/ou a proteína das células; ed) usar o ácido nucléico e/ou a proteína para formular a vacina.

14. Composição compreendendo as células obtidas pelo métodocomo definido na reivindicação 1.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que ascélulas são uma população clonal.

16. Kit compreendendo agentes de detecção de biomarcadorespara efetuar o método como definido na reivindicação 1.

17. Artigo compreendendo agentes de detecção de biomarcado-res para efetuar o método como definido na reivindicação 1.

18. Método de preparar um produto de célula compreendendopropagar as células de acordo com a reivindicação 1, e coletar um produtoproduzido pelas células.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o produtoé uma proteína.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a proteínaé um anticorpo, uma citocina, uma proteína da superfície celular ou uma pro-teína recombinante.

21. Método de examinar uma substância química quanto à eficá-cia farmacêutica, compreendendo as etapas de propagar as células de acor-do com a reivindicação 1, e submeter as células à substância química e me-dir a resposta das células à substância química.

22. Método de preparar uma linhagem de células primária com-preendendo as etapas de propagar as células de acordo com a reivindicação-1, e continuar a propagação até que as células formem uma linhagem decélulas.

23. Método de preparar uma população clonal de células com-preendendo as etapas de propagar as células de acordo com a reivindicação-1, e continuar a seleção por uma população clonal e a propagação até queas células formem uma população clonal de células.