KR20140024907A

KR20140024907A - 폐암용 바이오마커

Info

Publication number: KR20140024907A
Application number: KR1020137030738A
Authority: KR
Inventors: 에도아르도 미씨알리아; 프라탸크사 위라파티; 시모나 로씨; 버너 크롤
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2014-03-03
Also published as: MX2013013746A; WO2012160177A1; CA2836844A1; HK1193637A1; PT2714926E; MX340453B; RU2013157589A; SG194615A1; IL229319A0; EP2714926B1; AU2012260785B2; CN103562409A; EP2714926A1; US20140227372A1; BR112013029787A2; JP2014516531A; AU2012260785A1; CN103562409B; ES2550192T3; PL2714926T3

Abstract

본 발명은 부분적으로, 1종 이상의 바이오마커를 사용하여 개체에서 초기 폐암의 예후를 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

폐암용 바이오마커 {BIOMARKERS FOR LUNG CANCER}

본 발명은 예후진단 방법 및 개별 요법에 관한 것이다.

폐암은 2007년 한해에만 150만건의 새로운 병증사례가 발생한 세계에서 가장 일반적으로 진단되는 암이다(문헌 [Salomon et al., Crit Rev Oncol Hematol., 19:183-232, 1995, SEER-database 05.2010]). 높은 발병률과 사망률은 폐암이 암-관련 사망의 주원인이 되게 하며, 연간 사망자 수는 975,000이 넘고 5년 생존률은 15%이다(문헌 [Salomon et al., 상기 참조]). 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(NSCLC)으로서 분류될 수 있다. NSCLC는 병증사례의 약 80%를 차지한다. NSCLC는 몇몇 조직학적 타입으로 좀더 세분될 수 있으며, 가장 일반적인 것은 선암종(40%)과 편평세포암종(25%)이다.

NSCLC의 현행 치료법은 주로 종양 형태학, 및 종양 진행의 정도에 상응하는 단계별로 배열한 카테고리(IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB 및 IV기)로 종양을 분류하는 종양절 전이(TNM)-기초 병기분류(staging) 시스템에 기초한다. 다수의 병기분류 시스템이 존재한다(예를 들어, 임상적 대 병리학적 병기분류, 및 세계폐암학회(International Association for the Study of Cancer, IASLC)에서 발행한 것들과 같은 다양한 판(edition)의 병기분류 가이드라인(문헌 [Goldstraw et al., J. Thorac. Oncol. 2, 706-714, 2007]). 병기의 빈도는, 예를 들어 임상적 병기분류 및 TNM 병기분류 권장안의 IASLC 6판에 따르면, 23% I기, 19% II기, 37% III기 및 21% IV기이다(문헌 [Goldstraw et al., 상기 참조]). 상대적인 비율은 실질적으로 가이드라인 및 임상적 병기분류가 사용되느냐 또는 병리학적 병기분류가 사용되느냐에 따라 변할 수 있다.

수술은 초기 NSCLC(I기 및 II기)에 대한 표준 치료법이며, 보조 요법, 예컨대 방사선 요법, 화학요법(II기 및 그 이상), 및 진행성 NSCLC-병기의 경우 베바시주맙 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나제 억제제(TKI)가 후속된다(문헌 [Kutikova et al., Lung Cancer; 50(2):143-154, 2005]). NSCLC의 치료에 대한 미국과 유럽에서의 임상 가이드라인은 이들 치료 옵션을 지지하고 있다(문헌 [Mendelssohn et al., 2000; NCCN-Guidelines NSCLC V1, 2010]).

초기 폐암에 대한 현행 TNM-기초 병기분류 시스템에 근거하면, I기 NSCLC 환자는 수술후 5년내 35%가 재발 가능성을 경험한다(SEER-Database, 2008). 현행 치료 가이드라인은 이들 환자에 대해 보조 화학요법을 권장하지 않는다. 반면에 TNM-기초 II기 환자의 30%는 어떠한 보조 화학요법 없이도 재발을 경험하지 않을 것이며(SEER-Database), 이는 이들 환자가 현행 치료 가이드라인에 기초한 치료중에 경험한다는 것을 의미한다(즉, ESMO (D'Addario et al., Annals of Oncology. 2009; 20 (suppl 4):iv68-iv70, 2009), NCCN V1-2010). 이러한 점은 초기 NSCLC 보유 환자의 60%가 수술후 재발을 겪지 않을 것이라고 진술하고 있는 보고와 부합한다(문헌 [Arriagada et al., NEJM, 350:351-360, 2004]). 현행 임상 데이터에 근거하면, 초기 NSCLC의 보조 화학요법 치료는 보조 화학요법에 대한 중간값 이익(median benefit)이 4%라는 증거를 제공하며(NSCLC Meta-Analysis Collaborative Group), 5년차에서 60%에서 64%로 개선된다.

현재의 단점에 근거하여, NSCLC 보유 환자를 위한 예후진단 및/또는 예측 게놈 시그너처(genomic signature)의 필요에 대한 의학적 근거가 존재한다.

본 발명은 부분적으로, 본원 기재의 1종 이상의 바이오마커를 사용하여 개체에서 초기 폐암의 예후를 측정하는 방법에 관한 것이다. 이들 발견은 보조 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻게 되는 환자를 확인하는 것과 같이 초기 폐암 환자에 대한 적절한 치료법의 결정에 도움을 주는 데에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 NSCLC를 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계; 시험 샘플 중 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 1종 이상의 바이오마커, 또는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 바이오마커의 임의의 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 발현 수준을 분석하여 위험 점수(risk score)를 생성하는 단계(여기서, 위험 점수는 대상체의 예후를 제공하거나 또는 대상체를 분류하는 데에 사용될 수 있다)를 포함하는, 비소세포 폐암(NSCLC) 보유 대상체를 예후진단 또는 분류하는 방법을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 NSCLC를 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계; 시험 샘플 중 표 1, 표 2 및 표 3으로부터의 적어도 1종의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 발현 수준을 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계(여기서, 위험 점수는 대상체의 예후를 제공하거나 또는 대상체를 분류하는 데에 사용될 수 있다)를 포함하는, 비소세포 폐암(NSCLC) 보유 대상체를 예후진단 또는 분류하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, STX1A, 및 TPX2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, TMPRSS2, STX1A, KLK6, TPX2 및 UCK를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, TMPRSS2, GPR116, STX1A, KLK6, SLC16A3, TPX2, UCK2, PHKA1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, TPX2, UCK2, PHKA1, 또는 EIF4A3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, 또는 TK1을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커는 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, 또는 CCNA2를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 위험 점수는 대상체를 폐암, 원격 전이 또는 국소 재발에 기인한 사망의 시간-특이적 확률에 대하여 맵핑(mapping)함으로써 예후진단에 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 위험 점수는 대상체를 보조 화학요법을 받는 것으로부터 이익을 얻게 되는 고-위험군으로 또는 보조 화학요법을 받는 것으로부터 이익을 얻지 못하는 저-위험군으로 분류할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 신선동결(FF) 또는 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 물질로부터의 종양 샘플로부터 mRNA의 발현 프로파일을 측정하는 단계를 포함하는, 비소세포 폐암(NSCLC) 보유 대상체에서 외과적 절제술 후에 예후를 예측하는 방법을 포함한다. 프로파일은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커를 포함하여 이루어지고, 여기서 대조군과 비교하여 표 2 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 발현 증가 및 표 1에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 발현 감소는 대상체가 생존 불량의 고-위험군 또는 생존 양호의 저-위험군에 있는지를 예측하는 데에 이용된다. 본 발명의 방법에서, 고-위험군의 대상체는 보조 화학요법을 위해 선택되고 저-위험군의 대상체는 보조 화학요법을 위해 선택되지 않으며 이어서 그에 맞게 치료된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 NSCLC를 앓고 있으며 절제술을 받은 대상체로부터 시험 샘플을 수득하는 단계; 시험 샘플 중 표 2에서 확인된 적어도 2종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 각각의 유전자에 대한 발현치를 생성하는 단계; 및 발현치를 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계(여기서, 위험 점수는 대상체가 아바스틴과 같은 혈관신생 억제제를 투여받도록 선택되는지를 분류하는 데에 이용될 수 있다)를 포함하는, NSCLC 보유 대상체에 대한 요법을 선택하는 방법을 포함한다.

본 발명의 방법에서, 본 발명은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종, 적어도 11종, 적어도 12종, 적어도 13종, 적어도 14종 또는 적어도 15종의 바이오마커, 또는 그들의 임의의 조합의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 표 1, 표 2 및 표 3의 각각으로부터의 적어도 임의 5종의 바이오마커의 발현이 선택된다(당해 실시양태에서의 시그너처는 적어도 15종의 바이오마커를 포함하게 된다).

한 실시양태에서, NSCLC는 I기 NSCLC, II기 NSCLC, 또는 이들의 조합이다. NSCLC는 편평세포암종 및/또는 선암종으로 이루어진 군에서 확인될 수 있다.

한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 신선, 동결, FFPE 세포일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 발현 수준은 정량 PCR 또는 어레이를 사용하여 측정된다.

또 다른 실시양태에서, 발현을 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계는 콕스(Cox) 회귀 또는 파라미터의(parametric) 생존 예측인자와 같은 통계 분석을 사용하여 수행된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 NSCLC를 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계; 시험 샘플 중 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 1종 이상의 바이오마커, 또는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 바이오마커의 임의의 조합의 발현 수준을 측정하여 위험 점수를 생성하는 단계; 대상체를 위험 점수에 기초하여 고-위험군 또는 저-위험군으로 분류하는 단계; 및 고-위험군에 속하는 것으로 분류된 대상체에 보조 요법을 투여하거나 또는 저-위험군에 속하는 것으로 분류된 대상체에 보조 요법을 투여하지 않는 단계를 포함하는, NSCLC 암 보유 대상체를 선택적으로 치료하는 방법을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 다수의 작용제 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 폐암 보유 대상체가 보조 요법으로부터 이익을 얻게 되는지를 예측하기 위한 키트를 포함하며, 키트는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 다수의 작용제; 및 발현을 분석하고 위험 점수를 생성하여 환자가 보조 요법으로부터 이익을 얻게 되는지를 예측하는 수단을 포함한다. 발현을 측정하는 작용제는 확인된 바이오마커의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 어레이를 포함할 수 있다. 발현을 측정하는 작용제는 qRT-PCR을 위한 다수의 PCR 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커, 예컨대 CBX7, STX1A, 또는 TPX2를 측정하는 작용제를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 나타낸 적어도 2종의 바이오마커 등의 발현 생성물에 상보적이고 그와 하이브리드화 가능한 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 어레이를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다수의 단리된 핵산 서열을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 각각의 단리된 핵산 서열은 표 1에 나타낸 바이오마커, 예를 들어 바이오마커 CBX7, STX1A 및 TPX2의 RNA 생성물과 하이브리드화되고, 여기서 조성물은 3종 유전자의 RNA 발현 수준을 측정하는 데에 사용된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 NSCLC 보유 대상체로부터의 샘플 중 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준에 상응하는 데이터를 수신하는 수단; 각각의 유전자에 대한 발현치를 생성하는 수단; 및 발현치를 예후와 관련된 참조 발현 프로파일을 포함하는 데이터베이스 중으로 입력하는 것에 기초하여 위험 점수를 생성하는 수단(여기서, 위험 점수는 대상체의 생존 예후를 예측하거나 또는 대상체를 고-위험군 또는 저-위험군으로 분류한다)을 포함하는, NSCLC 보유 대상체의 예후를 예측하거나 또는 NSCLC 보유 대상체를 분류하기 위한 컴퓨터 제품을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법 중 어느 하나의 방법과 함께 사용하기 위한 컴퓨터 제품을 포함한다.

"바이오마커"는 대상체에서의 생물학적 상태의 지표로 유용한 분자이다. 본 주제와 관련하여, 본원 개시의 바이오마커는 발현의 변화를 보여주고 자신의 존재가 예후진단에 또는 대상체가 특정 치료를 받는 것으로부터 이익을 얻게 되는지 여부를 예측하는 데 이용될 수 있는 분자일 수 있다. 관심의 대상이 되는 바이오마커는 바이오마커의 발현에 있어서 변화를 검출함으로써 측정될 수 있다. 발현의 변화란 DNA 유전자 서열 정보에서 전사된 RNA(초기의 비-스플라이싱(unspliced) RNA 전사체 또는 성숙 mRNA) 또는 코딩된 단백질 생성물로의 전환을 말하는 것이다. 본원 개시의 바이오마커는 표 1, 2 및 3에 나열된 바이오마커 중 임의의 것, 또는 그들의 임의의 조합을 포함하고 전사된 RNA 또는 코딩된 단백질 생성물일 수 있다.

도 1은 모듈 1, 2 및 3의 표준화 점수의 쌍별 산포도(pairwise scatter plot)를 도시하며, 그들이 종양에 관한 상이한 정보를 전달함을 증명해 보여준다.
도 2a 내지 d는 수술후 5년까지의 환자에 대한, 별개로 또는 조합하여 적용될 때 3개 시그너처(모듈 1, 2, 및 3)의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 전생존(overall survival) 분석 곡선을 도시한다.
도 3a 내지 f는 수술후 5년까지의 환자에 대한, 병기, 조직학 및 연령에 의한 계층화(stratification)하에서 모듈 1의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어 전생존 분석 곡선을 도시한다.
도 4a 내지 f는 수술후 5년까지의 환자에 대한, 병기, 조직학 및 연령에 의한 계층화하에서 모듈 2의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 도시한다.
도 5a 내지 f는 수술후 5년까지의 환자에 대한, 병기, 조직학 및 연령에 의한 계층화하에서 모듈 3의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 도시한다.
도 6a 내지 f는 수술후 5년까지의 환자에 대한, 병기, 조직학 및 연령에 의한 계층화하에서 합산 점수의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 도시한다.
도 7a 내지 f는 38-유전자 리스트의 서브세트로서 구축된 다수의 견본 시그너처의 예후진단 성능을 보여주는 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 도시한다.
도 8a는 청구된 시그너처의 위험 점수의 함수로서 폐암 %사망률(= 100%-생존률)을 도시하며, 1년, 2년, 3년, 4년 및 5년 추적 시간에서의 그러한 예후를 보여준다. 도 8b는 청구된 시그너처의 위험 점수의 함수로서 폐암 %사망률(= 100%-생존률)을 도시하며, 종양 1기 및 2기에 의해 계층화된, 위험 점수의 함수로서 5년 사망률을 보여준다.
도 9는 FFPE 물질로부터 수득된 엠. 디. 앤더슨 암 센터(M. D. Anderson Cancer Center)로부터의 공적으로 입수가능한 데이터세트에서의 생존 성능을 보여주는 카플란-마이어 생존 분석 곡선을 도시한다.
도 10a 및 b는 FF/어피메트릭스(Affymetrix) 대 FFPE/qNPA, 및 FF/어피메트릭스 대 FFPE/나노스트링(nanoString)을 비교하는 쌍별 산포도를 도시한다.

본 발명은 부분적으로, 초기 폐암 보유 개체의 예후진단 또는 분류에 사용될 수 있는 방법에 기초한다. 본 발명은 질환의 재발에 대한 위험성이 높고 보조 요법이 권장될 수 있는 환자, 및 보조 요법으로부터 이익을 얻지 못할지도 모르는 재발 위험성이 낮은 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시예에서, 본원 기재의 예후진단 및 예측 방법은 폐암 시험 샘플 중 다수의 바이오마커의 차별적 발현에 기초한다. 본 발명의 바이오마커로는 38개종 유전자(CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, PPFIBP2, CD302, SFTPB, HSD17B6, DLC1, ADRB2, PARM1, KLRB1, MS4A1, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, VEGFC, EEF1A2, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, CCNA2, GGH, CCNB1, MELK, HMMR, EIF2S1, TEAD4, HMGA1, RIMS2, H2AFZ), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이들은 생물학적 기능을 포함한 기준에 의거하여 3개 모듈(표 1, 2, 및 3)로 나뉠 수 있다. 표 1(본원에서는 또한 "모듈 1"로도 언급)은 종양 억제에 관여되는 유전자를 포함하고, 표 2(본원에서는 또한 "모듈 2"로도 언급)는 혈관신생에 관여되는 유전자를 포함하며, 표 3(본원에서는 또한 "모듈 3"로도 언급)는 증식에 관여되는 유전자를 포함한다.

혈관신생 또는 증식에 관여되는 마커(각각 표 2 및 표 3)와 같은 일부 바이오마커는 초기 폐암에서 과발현되는 반면에, 종양 억제에 관여되는 다른 바이오마커는 대조군(예를 들어, 초기 폐암(I기 및 II기) 환자에서 이들 유전자의 평균 발현)과 비교하여 과소발현됨(표 1)이 발견되었다.

바이오마커

본 발명의 바이오마커(들)은 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커, 또는 그들의 유전자 생성물을 포함한다. 본 발명은 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커가 차별적으로 발현된다는 발견에 기초한다. 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현 프로파일 수준을 분석함으로써, 초기 폐암 보유 개체의 예후를 측정할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명의 방법은 표 1로부터의 1종 이상 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 표 1로부터의 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종, 적어도 11종, 적어도 12종, 적어도 13종, 적어도 14종 또는 적어도 15종의 바이오마커를 측정한다. 한 실시예에서, 표 1로부터의 1종 유전자 CBX7의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 1로부터의 2종의 바이오마커 CBX7와 TMPRSS2의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 1로부터의 3종의 바이오마커 CBX7, TMPRSS2와 GPR116의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 1로부터의 4종의 바이오마커 CBX7, TMPRSS2, GPR116와 KCNJ15의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 1로부터의 5종의 바이오마커 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15와 PTPN13의 발현 수준이 측정된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 표 2로부터의 1종 이상 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 표 2로부터의 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종 또는 적어도 8종의 바이오마커의 발현을 측정한다. 한 실시예에서, 표 2로부터의 1종 유전자 STX1A의 발현 수준이 측정된다. 한 실시예에서, 표 2로부터의 2종의 바이오마커 STX1A와 KLK6의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 2로부터의 3종의 바이오마커 STX1A, KLK6와 SLC16A3의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 2로부터의 4종의 바이오마커 STX1A, KLK6, SLC16A3와 PYGL의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 2로부터의 5종의 바이오마커 STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL와 LDHA의 발현 수준이 측정된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 표 3으로부터의 1종 이상의 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 표 3으로부터의 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종, 적어도 11종, 적어도 12종, 적어도 13종, 적어도 14종 또는 적어도 15종의 바이오마커를 측정한다. 한 실시예에서, 표 3으로부터의 1종 유전자 TPX2의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 3으로부터의 2종의 바이오마커 TPX2와 UCK2의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 3으로부터의 3종의 바이오마커 TPX2, UCK2와 PHKA1의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 3으로부터의 4종의 바이오마커 TPX2, UCK2, PHKA1와 EIF4A3의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표 3으로부터의 5종의 바이오마커 TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3와 TK1의 발현 수준이 측정된다.

본 발명의 바이오마커는 또한 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 바이오마커의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 그의 발현 수준 또는 유전자 생성물은 초기 폐암 보유 개체의 예후에 대한 예측 마커 또는 바이오마커로서 작용한다. 한 실시예에서, 각각의 표, 즉 표 1, 표 2 및 표 3으로부터 선택된 1종 유전자, 예를 들어 CBX7, STX1A 및 TPX2의 발현 수준이 측정된다. 또 다른 실시예에서, 표의 각각, 즉 표 1, 표 2 및 표 3으로부터 선택된 2종의 바이오마커, 예를 들어 표 1로부터의 CBX7와 TMPRSS2, 표 2로부터의 STX1A와 KLK6 및 표 3으로부터의 TPX2와 UCK2의 발현 수준이 측정된다. 표 1, 2 및 3으로부터의 바이오마커의 다양한 조합의 예에 대하여 하기 표 4 참조. 표 4에 나타낸 조합은 제한으로서 해석되도록 의미되지 않으며 표 1 내지 3에 나타낸 바이오마커가 임의의 조합될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 각각의 표 1, 표 2, 및 표 3으로부터의 적어도 임의의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 유전자가 선택된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 적어도 15종의 바이오마커가 선택되는데, 표 1로부터의 임의의 5종의 바이오마커가 선택되고(예를 들어, CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15와 PTPN13 또는 CBX7, TMPRSS2, CTSH, PPFIBP2와 CD302; 또는 SFTPB; HSD17B6; DLC1; ADRB2와 PARM1), 표 2로부터의 임의의 5종의 바이오마커가 선택되고(예를 들어, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL와 LDHA 또는 SLC16A3, PYGL, ITGA5, VEGFC와 EEF1A2 또는 STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL와 LDHA) 및 표 3으로부터의 임의의 5종의 바이오마커가 선택된다(TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3와 TK1 또는 CCNA2, GGH, CCNB1, MELK와 HMMR 또는 EIF2S1, TEAD4, HMGA1, RIMS2와 H2AFZ).

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이오마커는 하기 유전자의 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함한다: CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, PPFIBP2, CD302, SFTPB, HSD17B6, DLC1, ADRB2, PARM1, KLRB1, MS4A1, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, VEGFC, EEF1A2, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, CCNA2, GGH, CCNB1, MELK, HMMR, EIF2S1, TEAD4, HMGA1, RIMS2, H2AFZ. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이오마커는 하기 유전자중 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37 또는 38종을 포함한다: CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, PPFIBP2, CD302, SFTPB, HSD17B6, DLC1, ADRB2, PARM1, KLRB1, MS4A1, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, VEGFC, EEF1A2, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, CCNA2, GGH, CCNB1, MELK, HMMR, EIF2S1, TEAD4, HMGA1, RIMS2, H2AFZ. 특정 실시양태에서, 하기 37종의 바이오마커가 선택된다: CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, PPFIBP2, CD302, SFTPB, HSD17B6, DLC1, ADRB2, PARM1, KLRB1, MS4A1, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, VEGFC, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, CCNA2, GGH, CCNB1, MELK, HMMR, EIF2S1, TEAD4, HMGA1, RIMS2, H2AFZ.

한 실시예에서, 발현 프로파일은 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 mRNA 수준을 나타내는 값의 세트일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 발현 프로파일은 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커에 의해 코딩된 1종 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 나타내는 값의 세트를 포함할 수 있다.

샘플의 준비

외과적 절제술을 받은 초기 폐암 보유 개체로부터 취한 세포의 임의의 적당한 시험 샘플을 사용하여 다수의 본 발명 바이오마커의 발현을 측정할 수 있다. 초기 폐암의 타입 및 분류는 다양할 수 있다. 폐암은 I기 및/또는 II기일 수 있다. 시험 샘플은 편평세포암종, 선암종, 대세포암종, 및 하위군과 관계없이 모든 조직형(histotype)을 포함하는 비소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다.

일반적으로, 세포 또는 조직 샘플의 시험 샘플은 생검 또는 외과적 절제술에 의하여 암 보유 대상체로부터 수득될 것이다. 외과적 절제술은 치료용 또는 비-치료용/RO일 수 있다. 세포, 조직, 또는 체액의 샘플은 세침흡인생검에 의해 적출해낼 수 있다. 이를 위하여, 주사기에 부착된 세침을 피부를 관통하여 관심의 대상이 되는 기관 또는 조직중으로 삽입한다. 침은 전형적으로 초음파 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상화를 이용하여 관심의 대상이 되는 영역으로 안내된다. 일단 침이 조직중으로 삽입되면, 세포 또는 체액이 침을 통해 흡입되어 주사기에 채집될 수 있도록 주사기로 진공을 생성시킨다. 세포 또는 조직의 샘플은 또한 절개 생검 또는 코어 생검에 의해 적출해낼 수도 있다. 이를 위하여, 조직의 콘, 실린더, 또는 아주 작은 조각이 관심의 대상이 되는 영역으로부터 적출된다. CT 영상화, 초음파, 또는 내시경이 일반적으로 이러한 타입의 생검 안내에 사용된다. 좀더 구체적으로는, 전체 암성 병소가 절제 생검 또는 외과적 절제술에 의해 적출될 수 있다. 본 발명에서, 시험 샘플은 전형적으로 외과적 절제술의 일환으로서 적출된 세포의 샘플이다.

예를 들어 조직의 시험 샘플은 또한 추후 사용을 위해 예를 들어 RNAlater(앰비온(Ambion); 미국 텍사스주 오스틴)에 저장되거나 또는 -80℃에서 순간 동결하여 저장될 수 있다. 생검된 조직 샘플은 또한 포름알데히드, 파라포름알데히드, 또는 아세트산/에탄올과 같은 고정액으로 고정시킬 수도 있다. 고정된 조직 샘플은 왁스(파라핀) 또는 플라스틱 수지에 포매될 수 있다. 포매된 조직 샘플 (또는 동결된 조직 샘플)은 박절편으로 절단할 수 있다. RNA 또는 단백질을 또한 고정 또는 왁스-포매 조직 샘플로부터 추출해 낼 수 있다.

암 보유 대상체는 일반적으로 영장류와 같은 포유동물 대상체일 것이다. 예시적인 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

일단 세포 샘플 또는 조직 샘플이 암 보유 대상체로부터 적출되면, 샘플은 당업계에 주지이고 후술되는 바와 같은 기술을 이용하는 RNA 또는 단백질의 단리를 위해 프로세싱될 수 있다.

한 실시예에서, RNA는 다종다양한 방법, 예를 들어 구아니듐 티오시아네이트 용해에 이은 CsCl 원심분리에 의해 조직 또는 세포 샘플로부터 추출해낼 수 있다(문헌 [Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979]). 단일 세포로부터의 RNA는 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법에 기술한 바와 같이 수득될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998]; 및 [Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996] 참조). RNA 샘플은 특정 종에 대해 추가 농축될(enriched) 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 폴리(A)+ RNA가 RNA 샘플로부터 단리될 수 있다. 특히, 폴리-T 올리고뉴클레오티드를 mRNA에 대한 친화성 리간드로서 작용하도록 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 이러한 목적을 위한 키트는 시판되고 있으며, 예를 들어 메시지메이커(MessageMaker) 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)가 있다. 한 실시양태에서, RNA 집단을 표 1 내지 3에 상세히 설명되어 있는 바와 같은 관심의 대상이 되는 서열에 대하여 농축시킬 수 있다. 농축은 예를 들어, 프라이머-특이적 cDNA 합성이나, 또는 cDNA 합성과 주형-지시성(directed) 시험관내 전사에 기초한 수회의 선형 증폭에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717, 1989] 참조).

바이오마커 발현의 검출

한 실시예에서, 방법은 시험 암 환자의 종양 샘플로부터 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상 바이오마커의 발현, 또는 그들의 유전자 생성물을 측정하는 단계를 포함한다. 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커 각각의 유전자 서열은 당업계 공지의 방법, 예를 들어 유전자 또는 그의 유전자 생성물을 특이적으로 검출해내는 데 사용될 수 있는 작용제를 사용하여 검출될 수 있다.

예시적인 검출제는 본원 개시의 유전자에 상응하는 핵산과 하이브리드화되는 핵산 프로브, 및 이들 유전자의 코딩 생성물과 결합하는 항체이다. 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커는 또한 대립유전자 변이체와 그 밖의 패밀리 멤버를 비롯한 자연발생적 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 바이오마커는 또한 코드의 축퇴성으로 발생하는 그들 나열된 서열에 상보적인 서열과 또한 충분히 상동성인 서열 및 엄중 조건하에서 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커와 하이브리드화되는 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 핵산 서열의 코딩 서열의 일부와 상보적인 코딩 서열의 적어도 10, 15, 25 또는 40 뉴클레오티드, 및 전부 또는 거의 전부까지 포함하는 핵산 프로브를 제공하는 단계; 암성 세포 보유 포유동물로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 핵산 프로브를 엄중 조건하에서 NSCLC 보유 환자에서 취한 생검으로부터 수득한 RNA와 접촉시키는 단계(예를 들어, 노던 블롯 또는 계내(in situ) 하이브리드화 검정으로); 및 프로브의 RNA와의 하이브리드화량을 측정하는 단계를 포함한다.

하이브리드화를 위한 조건은 당업자에게 공지이며 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 고-엄중 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적인 예는 6 X 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)중 약 45℃에서의 하이브리드화에 이은 0.2 X SSC, 0.1% SDS중 50 내지 65℃에서의 1회 이상의 세척이다. "충분히 상동성"이라 함은 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통의 구조 도메인 또는 모티프 및/또는 공통의 기능 활성을 공유하도록 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 동등한(예를 들어, 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 충분한 개수 또는 최소 개수 함유하는 바이오마커의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 공통의 구조 도메인을 공유하고 도메인의 아미노산 서열 전역에 걸쳐서 적어도 약 50% 상동성, 적어도 약 60% 상동성, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 및 적어도 약 90 내지 95% 상동성을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 본원에서는 충분히 상동성인 것으로 정의된다. 또한, 적어도 약 50% 상동성, 적어도 약 60 내지 70% 상동성, 적어도 약 70 내지 80%, 적어도 약 80 내지 90%, 및 적어도 약 90 내지 95% 상동성을 가지고 공통의 기능 활성을 공유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 본원에서는 충분히 상동성인 것으로 정의된다.

서열의 비교 및 두 서열간 %상동성의 측정은 수학 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 서열의 비교에 사용되는 수학 알고리즘의 바람직한 비-제한적인 예는 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 수정판: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77]의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘을 문헌 [Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 엔블라스트(NBLAST) 및 엑스블라스트(XBLAST) 프로그램(version 2.0)에 편입시킨다. 블라스트 뉴클레오티드 검색을 엔블라스트 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행하여 본 발명의 TRL 핵산 분자와 상응하는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. 블라스트 단백질 검색을 엑스블라스트 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3로 수행하여 표 1, 표 2, 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커에 의해 코딩된 단백질 서열과 상응하는 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적의 갭 정렬(gapped alignment)을 획득하기 위하여, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같은 갭 블라스트(Gapped BLAST)가 사용될 수 있다. 블라스트 및 갭 블라스트 프로그램 사용시, 각 프로그램(예를 들어, 엑스블라스트 및 엔블라스트)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 서열의 비교에 사용되는 수학 알고리즘의 또 다른 바람직한 비-제한적인 예로는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 얼라인(ALIGN) 알고리즘이 있다. 아미노산 서열의 비교에 얼라인 프로그램 사용시, PAMl 20 가중치 잔기표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다.

핵산은 RNA의 농축 및/또는 증폭 도중에 또는 그 후에 표지될 수 있다. 예를 들어, 역전사는 검출가능한 표지와 접합된 dNTP, 예를 들어 형광-표지 dNTP의 존재하에서 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, cDNA 또는 RNA 프로브는 검출가능한 표지의 부재하에서 합성될 수 있고, 그 후에 예를 들어 비오틴화 dNTP 또는 rNTP, 또는 일부 유사 수단(예를 들어, RNA에 비오틴의 프소랄렌 유도체의 광가교결합)을 혼입하고, 이어서 표지된 스트렙타비딘(예를 들어, 피코에리트린-접합 스트렙타비딘) 또는 등가물을 첨가함으로써 표지될 수 있다.

관심의 대상이 되는 형광 모이어티 또는 표지로는 다음의 것들이 포함된다: 쿠마린 및 그의 유도체(예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 아미노쿠마린); 보디피 염료, 예컨대 보디피 에프엘(Bodipy FL) 및 캐스케이드 블루; 플루오레세인 및 그의 유도체(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 오리건 그린); 로다민 염료(예를 들어, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민); 에오신 및 에리스로신; 시아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7); 플루오르엑스(FluorX), 란타나이드 이온의 대환상 킬레이트(예를 들어, 퀀텀 다이(quantum dye)^TM); 형광 에너지 전달 염료, 예컨대 티아졸 오렌지-에티디움 헤테로다이머, 토탭(TOTAB), 단실 등. 본 발명의 장치 또는 검정에서 바람직하게 검출된 요소에의 결합을 위한 기능성을 갖거나, 또는 그러한 기능성을 혼입하도록 수식될 수 있는 개개의 형광 화합물이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego; Calif.] 참조). 화학발광 표지로는 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀이 포함된다.

바이오마커 유전자 생성물의 발현 검출

표 1, 표 2 및/또는 표 3에 나열된 바이오마커 중 1종 이상에 의해 코딩된 단백질 생성물의 존재 검출은 당업계 공지의 임의의 적절한 방법을 사용하여 행해질 수 있다. 예를 들어, 예컨대 항체를 사용하여 관심의 대상이 되는 특정 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있는 관심의 대상이 되는 작용제. 본 발명에 유용한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들어 문헌 [Dymecki, et al., J. Biol. Chem. 267:4815, 1992)]; 문헌 [Boersma and Van Leeuwen, J. Neurosci. Methods 51:317, 1994)]; 문헌 [Green, et al., Cell 28:477, 1982)]; 및 문헌 [Arnheiter, et al., Nature 294:278, 1981)]에서 찾아볼 수 있다. 한 실시양태에서, 면역검정을 이용하여 세포 샘플내 단백질의 수준을 정량할 수 있다. 본 발명은 특정 검정 절차에 제한되지 않으며, 따라서 동종 및 이종 절차 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따라 수행될 수 있는 예시적인 면역검정으로는 형광 편광 면역검정(FPIA), 형광 면역검정(FIA), 효소 면역검정(EIA), 비탁(nephelometric) 억제 면역검정(NIA), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 및 방사면역검정(RIA)이 포함된다. 지표 모이어티, 또는 표지기는 대상체 항체에 부착될 수 있으며, 종종 검정 설비의 입수가능성 및 호환성 면역검정 절차에 의해 결정되는 방법의 다양한 사용의 필요성을 충족하도록 선택된다. 상기에서 언급되는 각종 면역검정의 수행에 사용될 일반 기술은 당업자에게 공지이다. 이와 달리, 폴리아크릴아미드 겔상에서 단백질의 전기영동적 분리를 포함하는 웨스턴 블롯 분석과 같은 그 밖의 방법이 사용될 수 있으며, 분리된 단백질의 염색 후, 각 단백질의 상대량은 그의 광학 밀도를 평가함으로써 정량될 수 있다. 이와 달리, 돗-블롯 검정, FACS 또는 면역조직화학과 같은 다른 방법이 사용될 수 있다.

조직 샘플을 포르말린, 글루타르알데히드, 메탄올 등과 같은 시약으로 처리하여 고정시킨다. 이어서 샘플을 마커 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 보유한 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)와 인큐베이션한다. 당해 항체는 결합의 후속 검출을 위해 표지에 접합시킬 수 있다. 샘플을 면역복합체의 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서 항체의 결합은 당해 항체에 접합된 표지에 의하여 검출된다. 항체가 표지되지 않는 경우, 예를 들어 항-마커 폴리펩티드 항체의 이소형에 특이적인 제2 표지 항체가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로는 방사성핵종, 형광제, 화학발광제, 효소 등이 포함된다.

효소가 사용되는 경우, 효소에 대한 기질을 샘플에 가하여 유색 또는 형광 생성물을 제공할 수 있다. 접합체에 사용하기 위한 적합한 효소의 예로는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 말레이트 데히드로게나제 등이 포함된다. 시판되고 있지 않은 경우, 그러한 항체-효소 접합체는 당업자 공지의 기술에 의해 쉽사리 제조된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 마커 폴리펩티드에 대항하여 생성되는 항체의 패널를 사용하는 것을 고려한다.

mRNA 검출

본 발명의 중요한 측면은 초기 폐암을 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 취한 폐암 종양 생검에서 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 것이다. 발현 수준을 분석하여 위험 점수 생성에 사용할 수 있다.

한 실시예에서, 리버스 트랜스크립타제 PCR(RT-PCR)이 상이한 샘플 집단에서의 mRNA 수준을 비교하기 위한 유전자 발현 프로파일링에 사용될 수 있다. 방법은 당해분야 공지의 임의 기술을 사용하여, 예를 들어 카이아젠(Qiagen)과 같은 상업적 제조업자로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 사용하여 제조업자의 사용 지침서에 따라 또는 완비된 DNA 및 RNA 정제 키트(에피센터(EPICENTRE)(R), 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 mRNA를 단리하는 단계를 포함한다. 역전사 단계는 전형적으로 주위 상황과 발현 프로파일링의 목적에 따라서 특이적 프라이머, 랜덤 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍되며, 이어서 유도된 cDNA는 후속 PCR 반응에서 주형으로 사용될 수 있다. 그런 다음 예를 들어, 시판 장비를 사용하여 택맨(TaqMan)(R) RT-PCR이 수행될 수 있다.

RT-PCR 기술의 좀더 최근의 별법은 이중-표지 형광발광성 프로브(즉, 택맨(R) 프로브)를 통해 PCR 생성물 축적을 측정하는 실시간 정량 PCR이다. 실시간 PCR은 각 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 정규화에 사용되는 정량적 경쟁 PCR, 및 샘플에 함유된 정규화 유전자, 또는 RT-PCR용 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 비교 PCR 둘 모두와 호환성이다. 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996)] 참조.

또 다른 실시예에서, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 바이오마커의 1종 이상에 상응하는 1종 이상의 프로브를 포함하는 마이크로어레이가 사용된다. 전술한 방법은 어레이 표면상에 표지된 표적 핵산의 하이브리드화 패턴을 생성해낸다. 표지된 핵산의 생성되는 하이브리드화 패턴은 다양한 방법으로, 표적 핵산의 특정 표지에 기초하여 선택된 특정 검출방식으로 가시화되거나 또는 검출될 수 있다. 대표적인 검출 수단에는 섬광 계수, 방사선 사진술, 형광 측정, 열량측정, 발광 측정, 광산란 등이 포함된다.

한 실시예에서, 검출의 방법은 시판되고 있는 어레이 스캐너(어피메트릭스(Affymetrix), 미국 캘리포니아주 산타클라라), 예를 들어 417어레이어(417Arrayer), 418어레이 스캐너(418Array Scanner), 또는 애질런트 진어레이 스캐너(Agilent GeneArray Scanner)를 사용한다. 당해 스캐너는 인터페이스 및 사용이 용이한 소프트웨어 툴을 구비한 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 출력은 다종다양한 소프트웨어 애플리케이션중으로 직접 임포트되거나 또는 그들 애플리케이션에 의해 직접 판독될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 비교용 대조군은 당업자에 의해 측정될 수 있다. 한 측면에서, 대조군은 컷오프 값으로 작용하는 값을 선택함으로써 측정된다. 예를 들어, 그 값은 예를 들어, 생존 양호의 시험 샘플과 생존 불량의 시험 샘플간; 또는 개체가 보조 요법으로부터 이익을 얻게 되는 시험 샘플과 개체가 보조 요법으로부터 이익을 얻지 않게 되는 시험 샘플간; 또는 개체가 혈관신생의 억제제 또는 증식의 억제제와 같은 특정 약물의 투여로부터 이익을 얻게 되는 시험 샘플간을 구별하는 값일 수 있다. 보조 요법으로부터 이익을 얻을 지도 모르는 환자란 전생존, 장기 생존, 무재발 생존, 및 원격 무재발 생존과 같이 당해분야에서 통상적으로 사용되는 척도를 비롯한 환자 상태의 임의 척도에 있어서의 개선을 의미한다.

유전자 발현의 수준을 측정하는 다른 방법으로는 시쿼놈 인코포레이티드(Sequenom, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고)에서 개발한 매스어레이(MassARRAY)-기초 유전자 발현 프로파일링 방법 및 유전자 발현의 연속분석(serial analysis of gene expression; SAGE)(문헌 [Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995)]; 및 [Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)])이 포함된다.

FFPE 물질중 유전자 발현의 수준을 측정하는 또 다른 방법으로는 qNPA^TM 기술(에이치티지 몰레큘라 다이애그노스틱스 인코포레이티드(HTG Molecular Diagnostics, Inc.), 미국 애리조나주) 및 나노스트링^TM 테크놀로지스(시애틀)가 있으며, 여기서는 RNA 추출도 증폭도 어느 것도 요구되지 않는다. qNPA 기술을 사용하여, FFPE 샘플을 우선 HTG 용해 완충제에 노출시키고, 이어서 본원 기재의 바이오마커의 mRNA에 상보적인 뉴클레아제 보호 프로브를 용액에 가한다. 프로브는 관심의 대상이 되는 가용성이고 가교결합된 모든 RNA 바이오마커와 하이브리드화한다. 하이브리드화 후, 모든 비-특이적 단일가닥 핵산을 파괴하는 S1 뉴클레아제를 가하며, 그에 따라 화학량론적 양의 바이오마커-mRNA 프로브 듀플렉스가 생성된다. 그 후에 염기 가수분해는 듀플렉스로부터 프로브를 방출시킨다. 이어서 프로브는 프로그램된 어레이플레이트(ArrayPlate)로 이송될 수 있으며, 검출 링커를 가하면, 프로브와 검출 링커 둘 모두가 어레이상에 포획된다. 이어서 어레이플레이트를 세척하고 HRP-표지 검출 프로브를 가한 다음 인큐베이션한다. 그런 다음 어레이플레이트를 세척하고 화학발광 기질을 가한다. 마지막으로, 어레이플레이트를 영상화하고 모든 웰에서 바이오마커 각각의 발현을 측정한다. 나노스트링 기술을 사용하여, 바이오마커 mRNA당 용액에서 mRNA와 하이브리드화되는 2종의 약 50 염기 프로브를 사용한다. 리포터 프로브는 신호를 운반하는 반면에, 포획 프로브는 데이터 수집을 위해 복합체가 고정화되도록 해준다. 하이브리드화 후, 과량의 프로브를 제거하고 프로브/표적 복합체를 정렬한 다음 카운터 카트리지에 고정화한다.

본 발명의 방법에서, 전술한 바와 같은 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준이 측정 및 분석되어 후술하는 바와 같이 위험 점수 생성에 사용된다. 발현 역치는 예후진단적으로, 예를 들어 생존 양호의 개체와 생존 불량의 개체를 선별하는 데에 사용될 수 있다.

검정된 RNA의 양에 있어서의 차이 및 사용된 RNA의 양에 있어서의 가변성 둘 모두를 보정(정규화)하는 것이 필요하다. 따라서, 검정은 전형적으로 GAPDH 및 Cypl과 같은 주지의 하우스키핑 유전자를 비롯한 특정 정규화 유전자의 발현을 측정하고 혼입한다. 이와 달리, 정규화는 검정된 바이오마커 전체의 평균 또는 중앙값 신호(Ct) 또는 그의 대형 서브세트에 기초할 수 있다(전체 정규화 방법). 유전자 하나 하나씩 기준으로, 환자 종양 mRNA의 측정되고 정규화한 양을 폐암 조직 참조 세트에서 발견되는 양과 비교한다. 당해 참조 세트에서의 폐암 조직의 개수(N)는, 상이한 참조 세트(전체적으로)가 본질적으로 동일한 방식으로 행동하도록 보장하기에 충분히 높아야 한다. 이 조건이 충족되면, 특정 세트에 존재하는 개별 폐암 조직의 독자성(identity)은 검정된 바이오마커의 상대량에 유의미한 영향을 주지 않을 것이다.

본 발명의 방법에서, 각 바이오마커의 발현이 측정되고 전형적으로 발현치로 변환될 것이다. 이어서 이들 발현치는 가중 평균화(weighted averaging)에 의하여 위험 점수를 생성하는 데에 사용될 것이다. 위험 점수는 보정 데이터베이스를 통해, 파라미터의 공식 또는 비-파라미터의, 데이터-구동 모델에 의하여 사망, 전이 또는 재발의 위험과 연관지어진다. 당해 데이터베이스는 발현치, 위험 점수 및 임상 경과관찰(follow up)을 알고 있는 샘플의 참조 세트로부터 구축된다. 위험 점수 보정은 각각의 모듈(표 1, 2 또는 3)에 대해 별개로 이용가능할 수 있거나 또는 조직학, 종양 병기분류 또는 기타 특징, 예컨대 환자 연령에 의해 정의되는 특정 질환 서브타입에 특이적일 수 있다. 치료 반응 예측을 위해, 특이적 요법에 의해 치료를 받았거나 (또는 치료를 받지 않은) 환자에 대하여 별도의 보정 공식 또는 데이터베이스가 구축된다. 복합 위험 점수(소정의 가중치를 부여한 표 1, 2, 또는 3의 모듈의 병합)가 또한 그 자신의 보정 공식 또는 데이터베이스와 함께 사용될 수 있다. 임상적 판단 프로토콜은 전술한 바와 같은 사건(재발 또는 전이)에 대한 보정 위험 점수 또는 예측 생존 또는 시간에 따라 행해질 수 있다.

일단 계산된 위험 점수는 또한 대상체에 대한 적절한 치료 과정의 결정에 사용될 수 있다. 높은 위험 점수(즉, 짧은 생존 시간 또는 예후 불량)를 보이는 대상체는 보조 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있다. 보조 요법은 적절한 화학요법제, 예를 들어 파라플라틴(Paraplatin) (카르보플라틴), 플라티놀(Platinol) (시스플라틴), 탁소티어(Taxotere) (도세탁셀), 아드리아마이신(Adriamycin) (독소루비신), 베페시드(VePesid) (에토포시드), 젬자르(Gemzar) (젬시타빈), 이펙스(Ifex) (이포스파미드), 캠프토사르(Camptosar) (이리노테칸), 탁솔(Taxol) (파클리탁셀), 알림타(Alimta) (페메트렉세드) 및 하이캠틴(Hycamtin) (토포테칸) 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다. 마이너스 위험 점수(즉, 긴 생존 시간 또는 예후 양호)를 보이는 대상체는 부가적 치료법으로부터 이익을 얻지 못할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 특정 표로부터의 유전자 세트를 사용하여 생성된 위험 점수는 특이적 요법의 과정을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 개체가 표 2의 바이오마커 분석에 기초하여 높은 위험 점수를 보이면, 그 개체는 아바스틴, 스라피닙, 수니티닙 또는 파조파닙과 같은 혈관신생 억제제를 포함하는 보조 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있다. 이와 달리, 개체가 표 3의 바이오마커 분석에 기초하여 높은 위험 점수를 보이면, 그 개체는 토포이소머라제 억제제(I & II), 탁산(Taxane), 안트라사이클린, 안티튜블린, 항대사물질 또는 알킬화제와 같은 항증식제를 포함하는 보조 요법을 받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있다.

데이터 분석

샘플 분석 작업을 수월하게 하기 위하여, 해당 장치로부터 판독기에 의해 수득된 데이터는 디지털 컴퓨터를 이용하여 분석될 수 있다. 전형적으로, 장치로부터 데이터의 수신과 저장을 위해, 및 수집 데이터의 분석과 보고, 예를 들어 백그라운드의 공제, 제어가 적절히 수행되었음의 확증, 신호의 정규화, 하이브리드화한 표적의 양을 측정하기 위한 형광 데이터의 해석, 백그라운드의 정규화 등을 위해 컴퓨터는 적절히 프로그램될 것이다.

키트

본 발명은 본원 기재 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 폐암 대상체의 예후 측정에 유용할 수 있다. 키트는 표 1 내지 3에서 확인되는 바이오마커의 어느 것 또는 임의의 조합의 프로브 및/또는 프로브가 부착될 수 있는 기타 고체 지지체를 포함하는 마이크로어레이를 포함할 수 있으며, 그 고체 지지체는 시험 샘플의 유전자 발현 측정에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 컴퓨터 시스템의 메모리에 로딩될 수 있는 발현 프로파일 분석 소프트웨어를 포함하고 측정된 발현치를 위험 점수로 변환할 수 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함한다. 키트는 핵산 대조군, 완충제, 및 사용 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

당업자라면 본원 기재의 것들과 유사하거나 또는 동등하고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 다수의 방법과 재료를 인지하고 있을 것이다. 사실, 본 발명은 기재된 방법과 재료에 어떤 식으로도 제한받지 않는다. 본 발명의 목적상, 다음의 용어는 하기에서와 같이 정의된다.

실시예

실시예 1

노바티스(Novartis) 데이터세트와 폐 환자 코호트(cohort)로부터의 다양한 공개 데이터세트의 조합을 연구하였다.　 환자 선발기준 및 임상적 특징에 관한 설명은 공개 데이터세트(하기 참조)에 대한 각각의 본래 문헌에서 찾아볼 수 있다.　 노바티스 데이터세트의 경우, 외과적 절제술을 받은 NSCLC 환자로부터 412 환자 샘플을 수집하였다.　 CT-스캔, 의심이 가는 림프절(CT상에서 1 cm보다 큰 것)의 FDG-PET 및 MRI를 비롯한 표준 병기분류 절차를 수행하였다.　 NSCLC 조직학을 수행하여 NSCLC이 편평세포암종,　선암종 또는 그 밖의 것, 예컨대 BAC인지를 측정하였다.　 TNM-기초 병기분류를 또한 수행하여 NSCLC이 I기인지　또는 II기인지를 규정하였다.　 신선동결 조직을 게놈 분석을 위해 예치해 두었다(banked).　 중요평가항목(primary endpoint)은 전생존이었다.　 전생존이란 1차 수술로부터의 시간(연수로 환산)을 말하며 재발이 없는 기간, 예컨대 적어도 3년, 예를 들어 5년 기간으로 규정될 수 있다.

데이터세트 참조는 다음을 포함한다:

문헌 [Bhattacharjee A et al., Proc Natl Acad Sci U S A 98:13790-5, 2001]; 문헌 [Takeuchi et al., (2006) J Clin Oncol 24:1679-88]; 문헌 [Raponi et al., (2006) Cancer Res 66:7466-72]; 문헌 [Lu et al., (2006) PLoS Med 3:e467]; 문헌 [Shedden et al., (2008) Nat Med 14:822-7]; 문헌 [Hou et al., (2010) PLoS One 5:e10312]; 문헌 [Wilkerson et al., (2010) Clin Cancer Res 16:4864-75]; 문헌 [Zhu et al., (2010) J Clin Oncol 28:4417-24]

공개 데이터세트의 유전자 발현 마이크로어레이의 프로세싱

분석용 데이터세트 적성 절차는 문헌 [Wirapati et al., 2008 Breast Cancer Research 10:R65]에 기재된 바와 유사하였으며, 하기와 같이 간략하게 약술하였다:

1. 유전자 발현 데이터의 경우, 원작자가 제공한 정규화 또는 전처리 발현치를 수정 없이 사용하였다.

2. 마이크로어레이 플랫폼내 프로브 또는 프로브세트를 동일 참조 서열 데이터베이스에 대하여 재맵핑하였다(RefSeq version 39)

3. 초기(I기 및 II기) 환자만을 당해 실시예에 참여시켰다[모든 데이터세트로부터 총 n=834(I기 n=571, 및 II기 n=263). 모든 조직학적 타입을 포함시켰지만, 대부분은 선암종(n=585) 또는 편평세포암종(n=226)이고, 불과 n=23만이 다른 조직학적 타입에서 유래하였다.

노바티스에 의해 새로 생성된 폐암 데이터세트(총 412명 환자의 2개 코호트, 미공개)와 공적으로 입수가능한 유전자 발현 데이터세트로 이루어지는 포괄적 유전자 발현 및 임상 데이터베이스의 대규모 통합 분석에 의하여 시그너처 유전자를 확인해내었다. 시그너처 유전자를 선별하여 다른 타입의 암과의 발현 패턴 유사성 및 생물학적 기능을 포함한 기준에 기초하여 3개 모듈(표 1, 2, 및 3)로 분류하였다. 예후진단 성능이 하기에 약술된 방법을 사용하여 독립적으로 입증될 수 있도록 공적으로 입수가능한 데이터세트를 선택하였다.

바이오마커 시그너처(표 1, 2, 및/또는 3으로 특정된 바와 같은 바이오마커의 세트) 적용시, 유실된 유전자는 무시하였다. 특정 플랫폼에 존재한 유전자에 대한 발현치를 평균을 냄으로써 원점수(raw score)를 각각의 시그너처에 할당하였다. 원점수의 평균을 공제한 다음 표준 편차로 나눔으로써 표준화한 점수를 생성하였다. 각각의 데이터세트에 대하여 별개로 평균과 표준 편차를 측정하였다. 각각의 환자에 대하여 3개의 상이한 점수가 생성되었다. 그들 점수를 각각 표 1, 2, 또는 3에서의 유전자 세트에 대응하여 모듈 1, 2, 또는 3으로 호칭하기로 한다.

3개 모듈로부터의 점수가 유사 정보를 제공하고 있지 않았음을 입증해보이기 위하여, 도 1에 점수의 쌍별 분포(pairwise distribution)의 산포도를 작도하였다. 종양 억제(모듈 1) 및 증식(모듈 3)에의 그들의 생물학적 관여와 일치하여, 모듈 1은 대략 모듈 3의 반대 방향으로 작용하고 있다. 비록 이들 두 모듈은 매우 유사한 예후진단 정보를 제공할 수 있지만, 기술적으로 정확한 검출을 위해서는 발현의 상호 관계가 중요하였다. 그러므로 1개 모듈로부터의 낮은 값은, 다른 하나 모듈의 높은 값이 수반되었다면, (검출시의 기술적 실패라기 보다는) 단지 낮은 평균 발현으로서 해석되었다. 모듈 2는 모듈 1 및 3과는 경미한 상관관계를 보였지만, 흥미로운 비대칭 패턴이 있었으며: 비록 모듈 1과 2의 두 낮은 값 모두를 갖는 것이 가능하였지만, 양측 모두에서 높은 값을 가질 것 같지는 않았다. 한편, 모듈 2의 높은 값은 모듈 3의 높은 값을 요구하는 것으로 보이지만, 그의 역은 참이 아니다(즉, 모듈 3의 높은 값을 갖는 일부 종양은 모듈 2의 낮은 값을 가질 수 있다).

시그너처의 예후진단 성능 평가

모듈 점수 각각의 임상적 유용성을 보여주기 위하여, 카플란-마이어 곡선(문헌 [Kaplan and Meier J. Am . Statist . Assoc . 53:457-481, 1953])을 이용하고, 환자를 4분위수(환자의 25%를 포함하는 군)로 나누기 위하여 정량 점수를 사용하여 생존 분석을 수행하였다.

도 2a 내지 c는 수술후 5년까지의 환자의 전생존의 카플란-마이어 생존 분석에 의해 나타낸, 별개 적용시의 3개 시그너처(모듈 1, 2, 및 3)의 예후진단 성능을 도시한다. 환자는 각각 제1, 제2, 제3 및 제4 4분위수에 대응하여, 점수의 4분위수에 따라 4개 군 Q1, Q2, Q3, 및 Q4로 분류한다. 이러한 분류는 점수의 함수로서 위험성 변화의 검사를 가능케 해준다. 콕스 회귀 분석을 이용하여 곡선의 선택된 쌍을 비교하며, 결과는 위험비(HR)와 그의 95% 신뢰구간, 및 무효(HR = 1)에 대한 가설 검정의 p-값을 보여준다. 각 곡선의 우측에 있는 수치는 %로 환산한 5년 생존이다. 처음 3개 패널은 각각의 시그너처가 자기 스스로 예후진단치를 가지고 있음을 입증해보인다. 도 2d("조합")는 3개 모듈의 단순 조합( -모듈1 + 모듈2 + 모듈3)에 의해 수득된 위험 점수의 결과를 도시한다.

3개 점수를 병합하는 예후진단 시스템의 일례가 또한 도 2d에 도시되어 있다. 점수를 단순히 합산하였으며, 영향의 방향을 역전시키기 위하여 모듈 1에 대해서는 -1을 곱한다. 비록 일부 개별 모듈에 관해서는 어떠한 인상적인 개선도 보이지 않았지만, 점수의 함수로서 위험성의 점차적 이행은 좀더 평탄하였다.

요약하면, 각각의 개별 시그너처(모듈 1, 2 또는 3), 및 그들의 조합(모듈 1, 2 및 3)은 환자의 하위군의 생존 (또는 동등하게, 질환-관련 사망률)을 구별하는 능력을 보여주었다. 모든 경우에서, 적어도 극단 4분위수간에 실질적 및 통계적 유의차가 관찰된다.

임상병리학적 인자와 관련하여 시그너처의 성능

제안된 시그너처가 조직학, 종양 병기분류 및 진단시의 연령과 같은 확립된 인자에 새로운 예후진단 정보를 부가함을 보여주기 위하여, 전술한 바와 같이 유사한 분석을 수행하였으며, 다만 데이터를 군별로 계층화하였다. 당해 예시적인 실시예에서, 본 발명자들은 단지 각각의 인자 별개에 의한 계층화를 보여주었으며, 그들을 각각의 군에서 충분한 샘플 크기를 갖도록 두 개의 주요 군으로 나눈다. 고려되는 인자는 다음과 같다:

- 종양 병기분류: I기 대 II기

- 조직학: 선암종 대 편평세포암종

- 진단시의 연령: 65세 이하 대 65세 초과(이는 데이터에서 환자의 연령의 중앙치이다)

시그너처(모듈 1, 2, 및 3) 각각 및 조합을 각각 도 3a 내지 f, 도 4a 내지 f, 도 5a 내지 f 및 도 6a 내지 f에 별도로 도시한다. 구체적으로, 도 3a 내지 f는 병기, 조직학 및 진단시의 연령에 의한 계층화하에서 모듈 1의 예후진단 성능을 도시한다. 4분위수는 도 2에서와 동일하다(즉, 군 분류를 먼저 하고 나서 계층화를 행한다). 여기서, 도시한 바와 같이, 예후진단력이 각각의 계층내에 잔존한다. 도 4a 내지 f는 병기, 조직학 및 진단시의 연령에 의한 계층화하에서 모듈 2의 예후진단 성능을 도시한다. 도 5a 내지 f는 병기, 조직학 및 진단시의 연령에 의한 계층화하에서 모듈 3의 예후진단 성능을 도시한다. 도 6a 내지 f는 병기, 조직학 및 진단시의 연령에 의한 계층화하에서 모듈 1, 2, 및 3의 병합 점수의 예후진단 성능을 도시한다.

대부분의 경우에서, 시그너처(개별적으로 및 조합으로)의 예후진단력이 여전히 관찰되었다. 이러한 점은 제안된 시그너처가 전통적인 인자를 넘어 부가적인 예후진단을 제공하였음을 시사한다. 즉, 시그너처는 단순히 기존 인자와 고도로 상관관계가 있는 대리 마커인 것만은 아니다. 특히, 동일한 종양 병기의 환자는 위험성의 범위별로 좀더 상세하게 구별될 수 있다. 이러한 점은, 위험성 순위매김이 역전될 수도 있으므로, 단순히 병기분류 시스템의 정교화(refinement)인 것만은 아니었다. 예를 들어, I기에 있는 위험성이 최고인 환자의 군은 실제로 II기 환자의 평균 생존보다 더 열등한 생존을 보인다.

기존 임상병리학적 인자의 다양한 상황하에서의 분석은 또한 이들 인자 역시 시그너처의 적용에 편입될 수 있음을 강조한다. 예를 들어, 편평세포암종의 경우, 개별적인 시그너처는 실질적인 위험 구별을 보여주지 못했지만, 병합 점수는 나머지와 비교하여 실질적으로 최악의 결과를 갖는 상위 4분위수를 보여준다.

도 7a 내지 f는 표 1, 2, 및/또는 3으로부터 유전자의 서브세트를 선택함으로써 수득한 청구된 시그너처의 몇몇 견본 변형의 예후진단 성능을 도시한다. 생존별로 환자를 분리하는 능력은 유전자의 완전한 세트를 구비하지 않음으로써 구성되지 않는다. 3종 유전자(각각 표 1, 2 및 3으로부터 하나씩)로 만들어진 최소 시그너처는 이미 아주 잘 수행한다(패널 A). 유전자의 개수가 증가함에 따라 군들 간의 분리는 향상된다(패널 B-D). 임의로 선택된 15종 유전자가 잘 수행한다(패널 E 및 F).

개별 요법 판단

위험 예측 시스템은, 대체 치료법(무치료 포함)하에서 위험의 추정(projection)을 가능케 하기 위하여 당해 실시예에 사용된 것과 유사하게, 임상 및 유전자 발현 데이터의 데이터베이스를 사용할 것이다. 당해 시스템은 청구된 발명으로부터의 점수도 또한 포함하고 있다는 것을 제외하고는 아주반트온라인(AdjuvantOnline)(문헌 [Ravdin et al., 2001, J. Clin . Oncol . 19:980])과 유사하다.

실시예 2

폐암 보유 환자에 대한 표 1, 2 및/또는 3에 개시한 바이오마커의 전형적인 적용

1. 작고 수술이 가능한 원발성 종양을 보유한 폐암 진단 환자는 병소 제거를 위해 수술을 받는다. 종양 조직의 일부를 종양 크기, 종양 조직학적 타입(예컨대 선암종, 편평세포암종, 또는 기타 타입)의 측정과 같은 표준 병리학 절차에 의하여 검사한다. 종양 병기분류는 종양 크기, 림프절 전이의 존재 또는 전이의 다른 원격 부위에 기초하여 표준 가이드라인을 이용하여 결정된다. 표준 임상병리학적 측정으로부터 수득된 정보는 본 발명의 예후진단 및 예측 적용을 수정 및 증진시킬 수 있지만, 그것은 필요 조건도 아니고 필수 부분도 아니다.

2. 종양 조직의 일부가 청구된 발명을 위한 원료 물질로서, 동결, 파라핀-포매 또는 신선 조직으로서 사용된다. 전 트랜스크립톰(transcriptome) RNA 추출이 조직에 대해 수행된다.

3. 유전자의 특정 세트(본 발명에서 청구된)에 대한 RNA의 상대량의 측정은 다음 절차중 어느 것에 의해 수행된다:

- qNPA 기술 또는 나노스트링 기술

- 특이적 유전자의 정량 RT-PCR

- 선택된 프로브 또는 전 트랜스크립톰을 함유하는 마이크로어레이에의 하이브리드화

- RNA의 고-처리량 서열분석(RNA-seq), 후속하여 관련 유전자의 계산적 선택과 정량

4. 각각에 대한 RNA의 상대존재량(relative abundance)은 모든 환자에 걸쳐서 일정한 발현을 가질 것으로 예상되는 대조군 유전자의 세트에 대한 계산적 정규화 절차(문헌 [Popovici et al., (2009) Selecting control genes for RT-QPCR using public microarray data. BMC Bioinformatics. 2009 Feb 2;10:42])에 의하여, 또는 기존 폐종양으로부터의 유사 측정의 데이터베이스에 대한 정규화(문헌 [McCall et al., (2010) Biostatistics. 2010 Apr;11(2):242-53. Epub 2010 Jan 22.])에 의하여 보정된다.

5. 상대존재량은 대수변환되며, 세트내 다중 유전자로부터의 가중평균이 산정된다. 가중치는 +1 또는 -1과 같이 단순할 수 있거나(유전자 발현의 변화가 결과에 미치는 영향에 따라, 플러스 또는 마이너스 부호)(문헌 [Sotiriou et al., (2006) J Natl Cancer Inst. 2006 Feb 15;98(4):262-72]) 또는 그들은 특이적 측정 기술에 맞춰 보정한 수치일 수 있다. 이들 가중평균은 후속 위험 계산시에 입력으로 사용될 미가공 위험 점수인 것으로 생각된다. 각각의 시그너처 모듈은 그 자체의 위험 점수를 갖는다.

6. 위험 프로파일 계산기는 장래의 어느 시점에 대한(수술후 연수로 측정) 개별 환자의 무질환 상태, 무전이 상태 또는 생존의 확률의 추정/예측을 제공한다. 추정의 신뢰성은 참조 데이터베이스의 양과 질에 좌우되는 시간-특이적 신뢰구간에 의해 특징지어진다. 장기 예측에 비하여 단기 추정은 전형적으로 더 많은 데이터에 의해 지지되며 따라서 (더 좁은 신뢰구간으로 표시되듯이) 더 많이 신뢰할 수 있다. 위험 프로파일 계산기 도표의 일례를 도 8a에 도시하였으며, 여기서 특이적 환자에 대한 측정된 위험 점수는 폐암 사망률로 전환되어 있다(참조 데이터베이스에 기초, 최근접 카플란-마이어 추정량 사용).

7. 위험 추정은 본 발명이 제공한 위험 점수 이외의 정보, 예컨대 환자의 연령 및 성별, 카르노프스키(Karnofsky) 성능 점수, 종양 크기 및 림프절 상태에 의해 조정될 수 있다. 소정 환자에 대한 특이적 위험 프로파일에의 모든 이들 인자의 통합은 확립된 생존 회귀법(문헌 [Therneau TM, Grambsch PM (2000) Modelling survival data: extending the Cox model. Springer, New York]), 예컨대

- 파라미터의 회귀 모델(예를 들어, 지수 또는 와이불(Weibull) 모델 사용)

- 세미-파라미터의 방법(콕스 회귀)

- 경험적 생존 곡선 추정량, 예컨대 인자의 각각의 가능한 조합에 대한 카플란-마이어 또는 보험통계법(actuarial method)을 사용하여 행해질 수 있다.

위험 예측이 종양 병기에 의해 조정되는 방법의 일례를 도 8b에 도시하였다. 예상대로 2기 환자는 1기 환자보다 더 높은 5년 사망률을 나타낸다. 그러나, 높은 위험 점수(0보다 높은, 표준화된 위험 점수 단위로 환산)를 갖는 1기 환자의 서브세트는 평균 2기 환자의 것과 매우 유사한 사망률을 나타낸다(점괘선 곡선). 이는 병기분류 단독에 의한 보조 화학요법이 부적당할 수 있음을 시사하는데, 그 이유는 1기의 일부 환자(현행 가이드라인하에서 치료받지 않음)가 사실은 다수의 2기 환자(현행 가이드라인하에서 치료받음)와 유사한 위험성을 안고 있기 때문이다.

위험 추정은 청구된 발명의 질환 결과, 임상병리학적 변수 및 측정의 기록으로 환자의 과거 관찰기록의 데이터베이스에 대하여 보정될 수 있다. 데이터베이스는 신입 환자로부터의 정보로 주기적으로 갱신될 수 있다. 이러한 시스템은 다양한 임상병리학적 변수의 함수로서 암 환자의 생존을 추정하기 위한 널리 사용되는 도구인 아주반트온라인(문헌 [Ravdin et al., (2001) J Clin Oncol. 2001 Feb 15;19(4):980-91])과 유사하다. 본 발명자들은 게놈학 및 전사학 기술에서 유도된 다중모드 점수를 포함하도록 시스템을 확장한다.

8. 위험 계산기에 투입되는 조정 인자는 통용되는 보조 요법(예컨대, 플래티넘-기초 화학요법) 또는 항-혈관신생 약물을 포함할 수 있다. 반응-예측 적용의 이러한 시나리오에서, 대체 치료법하에 또는 무치료하에서 결과의 추정된 확률에 대응하여 둘 이상의 위험 프로파일이 제시될 것이다.

실시예 3

포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 종양 물질에의 시그너처의 적용

각각의 개개 플랫폼에 적합한 조직 준비 및 미가공 데이터 전처리 절차 후에, 청구된 시그너처(유전자의 세트 및 위험 점수를 유도하는 공식)는 어피메트릭스, qNPA 또는 나노스트링과 같은 기술 플랫폼으로부터의 발현 데이터에 직접 적용될 수 있다.

도 9는 FFPE 물질로부터 수득된 엠. 디. 앤더슨 암 센터(문헌 [Xie et al ., 2011 Clin Cancer Res 17:5705-14; Gene Expression Omnibus accession GSE29013])로부터의 공적으로 입수가능한 데이터세트에서의 생존 성능을 도시한다. 여기서, FFPE로부터의 어피메트릭스 데이터에서 일반적으로 더 낮은 품질(더 큰 노이즈 수준, 더 많은 수의 발현치의 부재중 호출(absent call)에도 불구하고, 유의미한 예후진단력이 여전히 관찰된다.

시그너처 위험 점수가 잠재적으로 신선동결 조직으로 행한 어피메트릭스에서와 동일한 예후진단치를 FFPE로 행한 qNPA 및 나노스트링 데이터에서도 제공할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 동일한 폐암 환자로부터의 물질에 대하여 비교를 수행하였다(미공개 데이터). 도 10a 및 b는 FF/어피메트릭스 대 FFPE/qNPA, 및 FF/어피메트릭스 대 FFPE/나노스트링을 비교하는 쌍별 산포도를 도시한다. 높은 상관관계(각각 0.86 및 0.87)가 관찰되었으며, 청구된 시그너처가 기술 플랫폼의 선택에도, 조직 보존 방법에도 종속되지 않음을 보여준다.

Claims

비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계;
표 1, 표 2 또는 표 3의 각각에서 확인된 적어도 3종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
발현 수준을 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 위험 점수는 대상체의 예후를 제공하는 데에 사용될 수 있는 것인,
NSCLC 보유 대상체의 예후진단 방법.
비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계;
시험 샘플 중 표 1, 표 2 및 표 3으로부터의 적어도 1종의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
발현 수준을 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 위험 점수는 대상체의 예후를 제공하는 데에 사용될 수 있는 것인,
NSCLC 보유 대상체의 예후진단 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 위험 점수가 대상체를 보조 화학요법을 받는 것으로부터 이익을 얻게 되는 고-위험군으로 또는 보조 화학요법을 받는 것으로부터 이익을 얻지 못하는 저-위험군으로 분류하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 생존 불량의 예후 또는 생존 양호의 예후를 갖는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, STX1A, 및 TPX2를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, TMPRSS2, STX1A, KLK6, TPX2, 및 UCK2를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, TMPRSS2, GPR116, STX1A, KLK6, SLC16A3, TPX2, UCK2, PHKA1을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, TPX2, UCK2, PHKA1, 또는 EIF4A3을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, 또는 TK1을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, TMPRSS2, GPR116, KCNJ15, PTPN13, CTSH, STX1A, KLK6, SLC16A3, PYGL, LDHA, ITGA5, TPX2, UCK2, PHKA1, EIF4A3, TK1, 또는 CCNA2를 포함하는 것인 방법.
표 1, 표 2 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군과 비교하여 표 2 및/또는 표 3에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 발현 증가 및 표 1에 나열된 1종 이상의 바이오마커의 발현 감소는 대상체가 생존 불량의 고-위험군에 있는지 또는 생존 양호의 저-위험군에 있는지를 예측하는 데에 사용되는 것인,
비소세포 폐암(NSCLC) 보유 대상체에서 외과적 절제술 후에 예후를 예측하는 방법.
제11항에 있어서, 고-위험군에 있는 대상체가 보조 화학요법을 위해 선택되고 저-위험군에 있는 대상체는 보조 화학요법을 위해 선택되지 않는 것인 방법.
NSCLC를 앓고 있으며 절제술을 받은 대상체로부터 시험 샘플을 수득하는 단계;
시험 샘플 중 표 2에서 확인된 적어도 2종 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 각각의 유전자에 대한 발현치를 생성하는 단계; 및
발현치를 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 위험 점수는 대상체가 혈관신생 억제제를 투여받도록 선택되는지를 분류하는 데에 사용될 수 있는 것인,
NSCLC 보유 대상체에 대한 요법을 선택하는 방법.
제13항에 있어서, 혈관신생 억제제가 아바스틴인 방법.
NSCLC를 앓고 있는 대상체로부터 외과적 절제술 후에 시험 샘플을 수득하는 단계;
시험 샘플 중 표 1, 표 2 또는 표 3에서 확인된 적어도 1종 이상의 바이오마커, 또는 표 1, 표 2 또는 표 3에서 확인된 바이오마커의 임의의 조합의 발현 수준을 측정하여 위험 점수를 생성하는 단계;
대상체를 위험 점수에 기초하여 고-위험군 또는 저-위험군으로 분류하는 단계; 및
고-위험군에 속하는 것으로 분류된 대상체에 보조 요법을 투여하거나 또는 저-위험군에 속하는 것으로 분류된 대상체에 보조 요법을 투여하지 않는 단계를 포함하는,
NSCLC 암 보유 대상체를 선택적으로 치료하는 방법.
제11항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 3종의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항, 제11항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 4종의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항, 제11항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 5종의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항, 제11항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 적어도 6종의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, NSCLC가 I기 NSCLC 또는 II기 NSCLC, 또는 이들의 조합인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, NSCLC가 편평세포암종 및 선암종으로 이루어진 군에서 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플이 신선, 동결, 파라핀 고정 포매 세포인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준을 qNPA, 나노스트링(nanoString), 정량 PCR 또는 어레이를 사용하여 측정하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 발현을 분석하여 위험 점수를 생성하는 단계를 통계 분석을 사용하여 수행하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 통계 분석이 콕스(Cox) 회귀 분석 또는 파라미터의 생존 예측인자를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 다수의 작용제 및 사용 지침서를 포함하는 키트.
표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 다수의 작용제; 및
발현을 분석하고 위험 점수를 생성하여 환자가 보조 요법으로부터 이익을 얻는지 여부를 예측하는 수단
을 포함하는, 폐암 보유 대상체가 보조 요법으로부터 이익을 얻는지 여부를 예측하기 위한 키트.
제28항에 있어서, 발현을 측정하는 작용제가 확인된 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 어레이를 포함하는 것인 키트.
제28항에 있어서, 발현을 측정하는 작용제가 qRT-PCR을 위한 다수의 PCR 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는 것인 키트.
제28항에 있어서, 표 1, 표 2 및 표 3에서 확인된 적어도 1종의 바이오마커가 CBX7, STX1A, 및 TPX2를 포함하는 것인 키트.
표 1, 표 2 및/또는 표 3에 나타낸 적어도 2종의 바이오마커의 발현 생성물에 상보적이고 그와 하이브리드화 가능한 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 어레이.
각각의 단리된 핵산 서열이 바이오마커 CBX7, STX1A, 및 TPX2의 RNA 생성물과 하이브리드화되는 다수의 단리된 핵산 서열을 포함하며, 3종 유전자의 RNA 발현 수준을 측정하는 데에 사용되는 조성물.
NSCLC 보유 대상체로부터의 샘플 중 표 1, 표 2 및/또는 표 3에서 확인된 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준에 상응하는 데이터를 수신하는 수단;
각각의 유전자에 대한 발현치를 생성하는 수단; 및
발현치를 예후와 관련된 참조 발현 프로파일을 포함하는 데이터베이스 중으로 입력하는 것에 기초하여 위험 점수를 생성하는 수단을 포함하며, 여기서 위험 점수는 생존의 예후를 예측하거나 또는 대상체를 고-위험군 또는 저-위험군으로 분류하는 것인,
NSCLC 보유 대상체의 예후를 예측하기 위한 컴퓨터 제품.
제34항에 있어서, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법과 함께 사용하기 위한 컴퓨터 제품.