JP4782854B2 - 癌患者の潜在的転移能、予後、又は全生存を予測する方法 - Google Patents

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Description

本発明はガン患者の潜在的転移能、予後、又は全生存を予測する方法に関し、より詳しくは一組の診断マーカーを用いるガン患者の転移能、予後、又は全生存を予測する方法に関する。
ガン患者の潜在的転移能、予後、又は全生存の予測に用いられる現行マーカーは、通常高い予測値を持たないか、又は矛盾した報告のため賛否両論があると考えられた（非特許文献３９）。即ちガン患者の潜在的転移能、予後、又は全生存を有意に予測する信頼性のあるマーカーや一組の診断マーカーはいまだに存在しない（非特許文献２３、３３）
低酸素マーカー（HIF -1α、HIF-2α及び CA IX）の発現は、乳ガン、肺癌、肝臓癌、胃ガン、腎臓癌、前立腺癌などを含む異なる形のヒト癌で、治療抵抗性の進行及び誤った予後と関連することが繰り返し報告されている（非特許文献３、４、８、９、１３、１６、１７、１８、２８、３２、３５、４１）。具体的には、腫瘍内低酸素状態により大量のHIF-1が安定化した腫瘍は転移がより進行し易く、特に頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)（非特許文献１５）と乳ガン（非特許文献２５）の低い生存（非特許文献１０、１１、２９）と関連する。
上皮間葉転換(EMT)制御因子（TWIST、Snail、Slug、SIP1、E47、Zeb1）の発現レベルの増加は、又乳ガン、肝臓癌、胃ガン、前立腺癌を含む異なる癌で、侵襲性表現形及びより悪い予後と関連すると報告されている（非特許文献１、２、５、６、１２、２０、２１、２６、２７、３０、３１、３６、３７、４２、４３）。具体的には、TWIST又はSnailの過剰発現は、又ガン患者のより悪い予後と相関する（非特許文献２０、２４、３７、３８）。
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記載のマーカーは、特定のガンの潜在的転移能又はより悪い予後に対する指示薬としての可能性が示されたが、臨床サンプルの分析とガン患者の予後と全生存を高い確率で予測する低酸素マーカーと上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーのような組み合わせマーカーを使用する報告はいまだにない。
本発明の目的は上に記載の問題を考慮して、ガン患者の潜在的転移能を予測する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種種の診断マーカーを提供し、それらの同時発現によりガン患者の潜在的転移能を高確率で予測することである。HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーが同時発現した患者は、高確率の転移を有すると予測された。
本発明の更なる別の目的は、HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも２種の診断マーカーを提供し、それらの同時発現によりガン患者の悪い予後とより低い全生存に対する指示薬の役割を果たすことである。
好ましくはHIF-1α、TWIST、及び Snailの三種のマーカーを同時発現する頭頚部扁平上皮癌(HNSCC)患者は９０％より高い確率で転移する。
好ましくはHIF-1α、TWIST、及び Snailの三種のマーカーを同時発現するHNSCC患者は最悪の予後を有し、広範囲な治療介入が必要と考えられた。
好ましくはHIF-1α、TWIST、及び Snailの内の二種のマーカーを同時発現する非小細胞肺癌（NSCLC）患者は５０％より高い確率で悪い全生存を予測する。
本発明の一つの目的に従うと、本発明はガン患者の潜在的転移能を予測する方法を提供する。その方法は、ガン患者から生体サンプルを得、HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーが生体サンプルで同時発現するか否かを測定することからなる。ここで生体サンプル中の診断マーカーによる同時発現は、ガン患者の潜在的転移能に対する指示薬である。
好ましくは、この生体サンプルはガン細胞から得る。
好ましくは、このガン患者はHNSCC患者である。
好ましくは、もしHNSCC患者の生体サンプル中に、HIF-1α、TWIST、及び Snailが同時発現すれば、その患者のガン転移の確率はより高いと診断される。
好ましくは、このガン患者はNSCLC患者である。
HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーの同時発現により、現行の有効なマーカーに比べHNSCC患者の転移に対し比較的高い予測の可能性が提供される。
本発明の別の目的に従うと、本発明はガン患者の予後又は全生存を予測する方法を提供する。その方法はガン患者から生体サンプルを得、HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーが生体サンプルで同時発現するか否かを測定することからなる。ここで生体サンプル中の診断マーカーによる同時発現は、ガン患者の予後または全生存に対する指示薬である。
好ましくは、この生体サンプルはガン細胞から得る。
好ましくは、このガン患者はHNSCC患者である。
好ましくは、このガン患者はNSCLC患者である。
HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーの同時発現は、現行の有効なマーカーに比べガン患者の悪い予後又はより低い全生存に対する指示薬の役割を果たしうる。
この発明のこれらや他の目的は、以下の詳細説明を付随の図面と実施例と一緒に読むことでより完全に明白になる。
HNSCCの代表的症例における対応する正常組織（N）、原発腫瘍（T）、及び転移腫瘍（M）のCA IX、HIF -1α、TWIST、及び Snailの同時発現の免疫組織化学（IHC）解析の図を示す（黒矢印はHIF -1α、TWIST、及び Snailの核質タンパクの発現を示す一方、赤矢印はCA IXの膜質タンパクの発現を示す）。 HNSCC症例のN（正常組織）、T（腫瘍組織）、及びM（転移腫瘍）サンプルのCA IX、HIF -1α、TWIST、及び Snailの免疫組織化学的検査で陽性のパーセント図を示す。 HNSCC患者１４７名の原発腫瘍におけるHIF -1α（−）対HIF -1α（＋）、TWIST （−）対TWIST（＋）、及びSnail （−）対Snail（＋）によるHNSCC症例の転移なし期間のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）分析図を示す。 図４はHNSCC患者１４７名の原発腫瘍におけるHIF -1α（−）対HIF -1α（＋）、TWIST （−）対TWIST（＋）、及びSnail （−）対Snail（＋）によるHNSCC症例の全生存確率の図を示す。 図５はHNSCC患者１４７名の原発腫瘍におけるHIF -1α（−）、HIF -1α（＋）対Snail （−）対TWIST （−）、HIF -1α（＋）対Snail（＋）対TWIST （−）、HIF -1α（＋）対Snail （−）対TWIST（＋）、HIF -1α（＋）対Snail（＋）対TWIST（＋）によるHNSCC症例の転移なし期間のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）分析図を示す。 図６はHNSCC患者１４７名の原発腫瘍におけるHIF -1α（−）、HIF -1α（＋）対Snail （−）対TWIST （−）、HIF -1α（＋）対Snail（＋）対TWIST （−）、HIF -1α（＋）対Snail （−）対TWIST（＋）、HIF -1α（＋）対Snail（＋）対TWIST（＋）によるHNSCC症例の全生存確率の図を示す。 図７はNSCLC患者におけるHIF -1α、TWIST、及び Snailの代表的免疫組織化学法の染色図を示す。 図８はNSCLC患者８７名の原発腫瘍におけるHIF -1α（−）対HIF -1α（＋）によるHSCLC症例の生存率のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）分析図を示す。 図８はNSCLC患者８７名の原発腫瘍におけるTWIST （−）対TWIST（＋）によるHSCLC症例の生存率のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）分析図を示す。 図８はNSCLC患者８７名の原発腫瘍における（a）HIF -1α（−）対HIF -1α（＋）、（b）TWIST （−）対TWIST（＋）、及び（c）Snail （−）対Snail（＋）によるHSCLC症例の生存率のカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）分析図を示す。 HIF -1α、TWIST、及び Snailの発現プロファイルに従うNSCLCの８７症例のサブグループ解析図を示し、ここではHIF -1α及び TWISTの発現プロファイルを示す。 HIF -1α、TWIST、及び Snailの発現プロファイルに従うNSCLCの８７症例のサブグループ解析図を示し、ここではHIF -1α及びSnailの発現プロファイル示す。 HIF -1α、TWIST、及び Snailの発現プロファイルに従うNSCLCの８７症例のサブグループ解析図を示し、ここではTWIST及びSnailの発現プロファイルを示す。 発現が増加したHIF -1α、TWIST、及び Snail を含むマーカー数に従うNSCLC患者におけるカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）の生存率分析図を示し、ここで患者を、HIF -1α（−）/TWIST１（−）/Snail （−）（グループ１）、HIF -1α、TWIST１又はSnailの任意の一種の過剰発現（グループ２）、HIF -1α、TWIST１、又はSnailの任意の二種の過剰発現（グループ３）、及びHIF -1α（＋）/TWIST１（＋）/Snail （＋）（グループ４）の４群に分けた。 発現が増加したHIF -1α、TWIST、及び Snail を含むマーカー数に従うNSCLC患者におけるカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）の生存率分析図を示し、ここで図１０ａの患者を全くなし又はHIF -1α、TWIST、及び Snail の任意の一種の過剰発現（グループ１）、及びHIF -1α、TWIST、及び Snail の任意の二種又は全ての過剰発現（グループ２）の二群に再分割した。
〔実施形態１〕
頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）に対する診断マーカーセット
本実施形態では、HIF -1α、Snail、及びTWISTの発現の組織−マイクロアレイ免疫組織化学解析を実施した（非特許文献３８、４０）。
１．１ 研究母集団、サンプル採取、及び組織マイクロアレイの作成
２００１年１月から２００４年１２月の間に台北マッケイ記念病院（Taipei Mackay Memorial Hospital）と台北退役軍人総合病院（Taipei Veterans General Hospital）で治療を受けたHNSCC患者１４７名を遡及的に解析した。本研究は台北退役軍人総合病院（Taipei Veterans General Hospital）機関審査委員会により承認された。HNSCC患者１４７名の臨床特性を表１に示す。
〔表１〕HNSCC１４７症例の特性と生存率の単変量解析
略称：OS, 全生存；RFS, 無再発性生存；* 生存中央値に達しなかった。
原発腫瘍サンプルと対応する非ガン性の適合組織を手術により得る一方、転移が起こった場合、転移腫瘍サンプル５６片（内臓転移３４片と頚部リンパ節２２片）を得た。高密度組織マイクロアレイ（TMA）を記載のように作成した（非特許文献３８）。
１．２ 免疫組織化学検査（IHC）
サンプル処理とIHC手順は記載のように実施した（非特許文献３８）。HIF -1α、CA IX、Snail、及びTWISTのIHCの結果の解釈は、以前に記載の基準に従い病理学者２名により別々に行った（非特許文献１５、１８、２２、３４、３５、３８）。
４種のマーカー全てのIHC染色の代表例を図１に示した。HIF -1αの機能指示薬である炭酸脱水酵素IX (CA IX)（非特許文献１４、１８、３５）を全サンプルに染色し、更に腫瘍の低酸素域と相関した。その結果低酸素域が５０％以上（CA IXが５０％以上染色）の腫瘍は、HIF -1αの過剰発現（腫瘍細胞中で５０％以上のHIF -1αが核質タンパクの発現）（P=0.001、データは示さない）と有意に相関することが示された。HIF -1αのIHCの結果とCA IXの IHCの結果との間に良好な相関があることが確認され、前報と一致する（非特許文献１４、１８、３５）。
図２にHNSCC症例のＮ（正常組織）、Ｔ（腫瘍組織）、及びＭ（転移腫瘍）におけるCA IX、HIF -1α、TWIST、及び SnailのIHC陽性のパーセントを示す。この結果により、又低酸素状態の腫瘍の患者群（原発性HNSCCの４８．３％、転移性HNSCCの９１．１％）が同定された。TWIST及びSnailの過剰発現（腫瘍細胞の核質タンパクの発現の５０％以上）が、それぞれ原発腫瘍の３５．４％と３７．４％と転移腫瘍の８５．７％と８２．１％で示された。腫瘍の低酸素状態又はHIF -1αの過剰発現とTWIST又は Snailの活性化間の相関を考慮すると、低酸素領域が５０％より高い腫瘍はTWIST又は Snailの過剰発現と有意に相関した（図１に示す代表例；それぞれP＜0.001、0.001）（データは示さない）。
記載の結果により、腫瘍の低酸素状態はHIF -1αの過剰発現と相関し、その結果TWIST及びSnailの発現に相関することが示された。更により高い割合のHIF -1α、TWIST、及び Snailの発現が、原発腫瘍サンプルより転移腫瘍サンプルで観察された（図２）。
１．３ HIF -1αの発現強度はTWIST及び Snailの核発現と相関する。
HIF -1α、TWIST、及び Snailの免疫反応性を、核質発現に従い0から3+に評点し（0, 染色されず；1+, 1-25% 核質タンパクの染色; 2+, 26-50% 核質タンパクの染色; 3+, ＞50% 核質タンパクの染色）、3+ （＞50% 核質タンパクの染色）のみがIHCで陽性な結果と考えた（非特許文献１４、１８、２２、３４、３５、３８）。
HNSCCの１４７症例の原発腫瘍サンプルにおけるHIF -1α、TWIST、及び SnailのHICの発現勾配の相関を表２に示し、HIF -1αの発現勾配は又TWIST又は Snailの発現勾配と有意に相関することが示された（それぞれP＜0.001、0.001）。
〔表２〕HNSCC１４７症例の原発腫瘍サンプルにおけるHIF -1α、TWIST、及び SnailのHICの発現勾配の相関
１．４ 統計解析
独立のスチューデントｔ検定を用いて二群間の連続変数を比較し、χ2検定を二値変数の比較に適応した。カプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）の評価を転移なしで且つ全生存の解析に用い、ログランク検定を用いてその差を比較した。コックス（Cox）の比例ハザードモデルを多変量生存率分析に適応し、独立の予後因子を試験した。統計解析の全ての対照群は、図の凡例に別に規定しない限りは通常パネルの第一群である。統計的有意性のレベルは全試験で0.05に設定した。
頚部リンパ節と内蔵から得た転移サンプルの間のHIF -1α、TWIST、及び Snailの発現パターンには統計差はなかった（データは示さない）。転移解析と生存率分析に関しては、原発性HNSCCのHIF -1α、TWIST、及び Snailの過剰発現は、より短期の転移なし期間と関連し（図３）、同様の状態が全生存分析で観察された（それぞれP＜0.001、＜0.001、＜0.001）（図４）。HNSCC患者のHIF -1α、TWIST、及び Snailの各過剰発現は、より低い確率の全生存をもたらすことが示された。
更にHNSCCのHIF -1α、TWIST、及び Snailの発現パターンの予後有意性を調べるために、HNSCC患者をHIF -1α、TWIST、及び Snailの発現プロフィルに基づいて、（１）HIF -1α(-)、（２）HIF -1α(+)Snail(-)TWIST(-)、（３）HIF -1α(+)Snail(+)TWIST(-)、（４）HIF -1α(+)Snail(-)TWIST(+)、及び（５）HIF -1α(+)Snail(+)TWIST(+)の５群に分割した。カプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）の転移なし曲線を発生し、ログランク検定を用いて群間の有意差を試験した。その結果、グループ３とグループ４は、より短期の転移なし期間を有し、HIF -1α、TWIST、及び Snail（グループ５）の同時発現は、グループ３と４に比し最短の転移なし期間を示すことが示された（図５）。即ち、グループ５の９０％を上回る患者が転移と診断された。類似のパターンが全生存分析でも観察され、又グループ５の９０％を上回る患者の死亡が示された（図６）。記載の結果により、転移を促進するHIF -1αによるTWIST及び／又は Snailの活性化が実際にHNSCC患者で起こり、HIF -1α、TWIST、及び Snailの同時発現が最も侵襲的な結果と関連することが示された。
本実施形態では、HIF -1αによるTWIST及び／又は Snailの活性化が実際にHNSCCガンで起こり、HIF -1α、TWIST、及び Snailの発現プロフィルがガン患者の予後有意性の評価可能な指示薬として使用できることが明らかになった。即ちHIF -1α、TWIST、及び Snailの同時発現は、HNSCC患者の転移及び予後又は全生存を予測する貴重なマーカーとして使用できるであろう。
〔実施形態２〕
非小細胞肺癌（NSCLC）用の予測マーカーセット
HIF -1αの過剰発現がNSCLC原発腫瘍の６２％で認められ、低い予後と僅かに関連した（非特許文献７）。HIF -1α mRNA発現が初期段階NSCLCの予後であることが示された（非特許文献１９）。この実施形態では、肺ガン細胞におけるHIF -1α、TWIST、及び Snail間の関係を調べるために、HIF -1α、TWIST、及び Snailの発現の組織―マイクロアレイ組織化学解析を実施した。
２．１ 研究母集団、サンプル採取、及び組織マイクロアレイの作成
２００３年１月から２００４年１２月の間に台北マッケイ記念病院（Taipei Mackay Memorial Hospital）と台北退役軍人総合病院（Taipei Veterans General Hospital）で外科的切除を受けたNSCLC 患者８７名を遡及的に解析した。本研究は台北退役軍人総合病院（Taipei Veterans General Hospital）機関審査委員会により承認された。NSCLC 患者８７名の臨床特性を表３に示す。
〔表３〕NSCLC 患者８７名の特性と生存率の単変量解析
* 生存の中央値に達しなかった。
２．２ 免疫組織化学検査（IHC）
実施形態１と同様の手順で実施した。HIF -1α、TWIST、及び Snailの免疫反応性を0から3+に評点し（0, 染色されず；1+, 1-25% 核質タンパクの染色; 2+, 26-50% 核質タンパクの染色; 3+, ＞50% 核質タンパクの染色）、3+ （＞50% 核質タンパクの染色）のみがIHCで陽性な結果と考えた。全マーカーのIHC染色の代表例を図７に示す。
表３に従うと、NSCLC の８７検体のHIF -1α、TWIST、及び Snailの過剰発現プロフィルは、それぞれ２８／３７（３２．２％）、３２／８７（３６．８％）、及び４８／８７（５５．２％）であった。
２．３ 統計解析
ここで実施形態１に対するのと同一の統計法を用いた。図８（ａ）〜（ｃ）に示した生存率分析において、NSCLC のHIF -1α、TWIST、及び Snailの各過剰発現はより短期の全生存と関連した。更にNSCLC におけるHIF -1α、TWIST、及び Snailのマーカーの内の任意の２種の同時発現パターンの予後の有意性を調べるために、NSCLC 症例のサブグループ分析を図９〜（ｃ）に示した。図１０（ａ）から、HIF -1α、TWIST、及び Snailの過剰発現の任意の２種（グループ３）、及びHIF -1α(+)/TWIST(+)/Snail(+)（グループ４）は、他のグループに比べより短期の全生存を有した。更に図１０（ｂ）から、HIF -1α、TWIST、及び Snailの任意の二種又は全ての同時発現（グループ２）は、より悪い全生存を有意に有した。従って図１０の結果に基づき、HIF -1α、TWIST、及び Snailの内の任意の二種又は三種のマーカーの同時発現は、発現なし又はマーカー一種の発現より悪い予後及び全生存を有した。
本実施形態では、HIF -1αによるTWIST及び／又は Snailの活性化が実際にNSCLC ガンで起こり、HIF -1α、TWIST、及び Snailの内の少なくとも二種のマーカーの同時発現が、予後の有意性に対する評価可能な指示薬として使用できることが明白である。
本発明においてIHC技術を用いてガン患者の状態を分析したが、同一の結果は逆転−ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法のような他種の分析技術により得ることができ、従って本発明の範囲はこれに限定される必要はない。
本発明は上記に基づき、ガン患者の潜在的転移能、予後又は全生存を予測する信頼性のあるマーカーセットとして、HIF -1α、TWIST、及びSnailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーを提供する。
本発明の前述の好ましい実施形態から当業者には分かるように、本発明の前述の好ましい実施形態は本発明を制限するよりはむしろ本発明を説明するためであることが分かる。付随の特許の請求項の精神と範囲内に含まれる種々の修正と同様な配置の範囲にも及ぶことを意図し、その範囲はその修正全てと同様の構造を包含するよう最大範囲の解釈と一致する必要がある。

Claims (2)

  1. 非小細胞肺癌（NSCLC）患者の予後又は全生存を予測する方法で、その方法が
    前記非小細胞肺癌（NSCLC）患者から得られた生体サンプルについて、
    HIF-1α、TWIST、及び Snailからなる一群から選択した少なくとも二種の診断マーカーが前記生体サンプルで同時発現するか否かを測定することからなり、
    ここで前記生体サンプル中の前記診断マーカーの同時発現は、前記ガン患者の予後又は全生存に対する指標である方法。
  2. 前記診断マーカーがHIF-1α、TWIST、及び Snailを含む請求項１に記載の方法。
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