CN109470854B

CN109470854B - 肺癌诊断用蛋白芯片及试剂盒

Info

Publication number: CN109470854B
Application number: CN201710806310.6A
Authority: CN
Inventors: 胡海; 许勇; 林当; 周海鹰; 黄璐; 潘敬东
Original assignee: Guangzhou Danlan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Danlan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: CN109470854A

Abstract

本发明涉及一种肺癌诊断用的蛋白芯片及试剂盒。该肺癌诊断用蛋白芯片包括固相支持物及包被于固相支持物表面的抗原。抗原包括如下十二种抗原片段：Paxillin抗原片段、CTAG1B抗原片段、SOX2抗原片段、HSPA9抗原片段、UBQLN1抗原片段、C14orf104抗原片段、ENO‑1抗原片段、RPS3抗原片段、CHK抗原片段、HNRPA1抗原片段、PCNA抗原片段及Eif4g3抗原片段。该蛋白芯片及试剂盒创造性的选择出在肺癌早期发生过程中显著表达且能够引起免疫系统产生相关抗体的抗原，并且这些抗原在非癌症的良性病变中不表达或者表达很低，通过对筛选的抗原片段进行组合使用，利用蛋白芯片技术检测人体血清中肿瘤相关的自身抗体，鉴别早期肺癌和肺部良性结节，具有较高的敏感性和特异性。

Description

肺癌诊断用蛋白芯片及试剂盒

技术领域

本发明涉及癌症诊断和治疗领域，尤其是涉及一种肺癌诊断用蛋白芯片及试剂盒。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高。目前对肺癌的诊断主要依靠影像学(如螺旋CT)和细胞学。螺旋CT可以较为敏感地探测3nm以上的肺部病变，但确诊肺癌，特别是鉴别早期肺癌和肺部良性结节，假阳性率高。其他检测技术，如痰细胞学、细针穿刺细胞学、荧光支纤镜等技术，均存在假阳性率高、侵入性及检测费用高等缺点，无法用于人群筛查。而传统的ELISA检测血清抗体、速度慢、效率低，需要血清样本量大具体检测起来非常不便。

发明内容

基于此，有必要提供一种使用方便，并能够有效地鉴别肺癌和肺部良性病变的肺癌诊断用的蛋白芯片及试剂盒。

一种肺癌诊断用蛋白芯片，包括固相支持物及包被于所述固相支持物表面的抗原；所述抗原包括如下十二种抗原片段：Paxillin抗原片段、CTAG1B抗原片段、SOX2抗原片段、HSPA9抗原片段、UBQLN1抗原片段、C14orf104抗原片段、ENO-1抗原片段、RPS3抗原片段、CHK抗原片段、HNRPA1抗原片段、PCNA抗原片段及Eif4g3抗原片段。

在其中一个实施例中，所述Paxillin抗原片段的序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CTAG1B抗原片段的序列包括SEQ ID No.2所示的抗原特征氨基酸序列；

所述SOX2抗原片段的序列包括SEQ ID No.3所示的抗原特征氨基酸序列；

所述HSPA9抗原片段的序列包括SEQ ID No.4所示的抗原特征氨基酸序列；

所述UBQLN1抗原片段的序列包括SEQ ID No.5所示的抗原特征氨基酸序列；

所述C14orf104抗原片段的序列包括SEQ ID No.6所示的抗原特征氨基酸序列；

所述ENO-1抗原片段的序列包括SEQ ID No.7所示的抗原特征氨基酸序列；

所述RPS3抗原片段的序列包括SEQ ID No.8所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CHK抗原片段的序列包括SEQ ID No.9所示的抗原特征氨基酸序列；

所述HNRPA1抗原片段的序列包括SEQ ID No.10所示的抗原特征氨基酸序列；

所述PCNA抗原片段的序列包括SEQ ID No.11所示的抗原特征氨基酸序列；

所述Eif4g3抗原片段的序列包括SEQ ID No.12所示的抗原特征氨基酸序列。

在其中一个实施例中，所述抗原片段为重组融合蛋白，还包括位于相应抗原特征氨基酸序列的N端的Myc-Histag以及C端的链霉亲和素。

在其中一个实施例中，所述固相支持物为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。

在其中一个实施例中，所述固相支持物为磁性微珠，所述十二种抗原片段分别包被于十二种不同颜色的磁性微珠表面。

在其中一个实施例中，所述抗原片段为亲和素化的抗原片段，所述固相支持物的表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白，所述抗原片段与所述固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。

一种肺癌诊断用试剂盒，包括上述任一实施例所述的肺癌诊断用蛋白芯片。

在其中一个实施例中，所述肺癌诊断用试剂盒还包括含有荧光物质标记的二抗试剂、标准品试剂和质控参比品试剂。

在其中一个实施例中，所述荧光物质标记的二抗试剂是抗人IgG Fc-PE抗体和抗人IgMFc-PE抗体。

在其中一个实施例中，所述标准品试剂与所述质控参比品试剂均是Anti-Myc嵌合抗体。

上述肺癌诊断用蛋白芯片及试剂盒创造性的选择出在肺癌早期发生过程中显著表达且能够引起免疫系统产生相关抗体的抗原，并且这些抗原在非癌症的良性病变中不表达或者表达很低，通过对筛选的抗原片段进行组合使用，利用蛋白芯片技术将抗原片段包被于固相支持物的表面，以检测人体血清中肿瘤相关的自身抗体，鉴别早期肺癌和肺部良性结节。通过这十二种抗原的抗原谱，检测血清中的自身抗体含量，来判断被检者是否患肺癌或肺部良性结节，比传统方法(如影像学和细胞学等)诊断肺癌，特别是早期肺癌，阳性率高，敏感性强，而且可以同时检测多个(大于100种)血清自身抗体含量，对样品需求少，结合传统的影像学等检测手段，能大大提高早期肺癌诊断的敏感性和特异性。

附图说明

图1为本发明一实施方式的肺癌诊断用蛋白芯片检测原理示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请结合图1，一实施方式的肺癌诊断用蛋白芯片，包括固相支持物及包被于固相支持物表面的抗原。在本实施方式中，所述抗原包括至少如下十二种抗原片段：Paxillin抗原片段、CTAG1B抗原片段、SOX2抗原片段、HSPA9抗原片段、UBQLN1抗原片段、C14orf104抗原片段、ENO-1抗原片段、RPS3抗原片段、CHK抗原片段、HNRPA1抗原片段、PCNA抗原片段及Eif4g3抗原片段。其中，Paxillin抗原片段的序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；CTAG1B抗原片段的序列包括SEQ ID No.2所示的抗原特征氨基酸序列；SOX2抗原片段的序列包括SEQ ID No.3所示的抗原特征氨基酸序列；HSPA9抗原片段的序列包括SEQ ID No.4所示的抗原特征氨基酸序列；UBQLN1抗原片段的序列包括SEQ ID No.5所示的抗原特征氨基酸序列；C14orf104抗原片段的序列包括SEQ ID No.6所示的抗原特征氨基酸序列；ENO-1抗原片段的序列包括SEQ ID No.7所示的抗原特征氨基酸序列；RPS3抗原片段的序列包括SEQ ID No.8所示的抗原特征氨基酸序列；CHK抗原片段的序列包括SEQ ID No.9所示的抗原特征氨基酸序列；HNRPA1抗原片段的序列包括SEQ ID No.10所示的抗原特征氨基酸序列；PCNA抗原片段的序列包括SEQ ID No.11所示的抗原特征氨基酸序列；Eif4g3抗原片段的序列包括SEQ ID No.12所示的抗原特征氨基酸序列。

各抗原片段可以是含有相应抗原特征氨基酸序列的提纯的天然蛋白、或是重组表达的蛋白，或者重组表达的含有相应抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，或者是直接合成的含相应抗原特征氨基酸序列的多肽等。优选的，在本实施方式中，抗原片段为含有相应抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，包括在相应的氨基酸序列的N端连接的Myc-Histag片段和在C端连接的链霉亲和素(SA)片段，整个抗原片段的结构为Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA。整个抗原片段的DNA片段的密码子为细菌的密码子，以适合于在细菌中表达。其中，Myc的氨基酸序列为EQKLISEEDL，具体如SEQ ID No.13所示；Myc-Histag的DNA序列为GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGCATCACCATCACCATCAC，具体如SEQ ID No.14所示，其中，Histag的DNA序列为CATCACCATCACCATCAC。

本实施方式所述的各抗原片段可采用但不限于下述方法制备得到：步骤一：合成肺癌特征抗原的DNA片段，并在5’端连接Myc和Histag对应的DNA片段，得到Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段；

步骤二：合成链霉亲和素对应的DNA片段，并将所述链霉亲和素对应的DNA片段连接在Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段的3’端，得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的目的重组融合DNA片段；

步骤三：将所述目的重组融合DNA片段克隆入重组表达载体中，转化细菌；

步骤四：挑取阳性转化克隆进行目的重组融合DNA片段的诱导表达；

步骤五：破碎菌体，离心收集含重组融合蛋白的包涵体沉淀，纯化后得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白。

在本实施方式中，所述将链霉亲和素对应的DNA片段连接在Myc-Histag-肺癌特征抗原的融合DNA片段的3’端是但不限于通过overlap PCR(overlap polymerase chainreaction)方法将相应的DNA片段连接。进一步，在overlap PCR连接DNA片段时，还可以在外侧的引物两端加上限制性内切酶的酶切位点，如两端分别加上Nde I和Xho I酶切位点。

在本实施方式中，重组表达载体可以是但不限于pET30b(+)。细菌可以是但不限于BL21大肠杆菌。

在本实施方式中，所述挑取阳性转化克隆进行重组融合DNA片段的诱导表达包括如下步骤：挑取阳性转化克隆，在LB培养基中培养至OD 600至0.6，加入终浓度为2mM的IPTG诱导表达，4小时后离心收集菌体。

在本实施方式中，所述破碎菌体，离心收集含重组融合蛋白的包涵体沉淀，纯化后得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白包括如下步骤：

超声波震荡破碎菌体，离心收集沉淀，沉淀为含有目的重组融合蛋白的包涵体；

使用浓度为8M的尿素溶解沉淀，在4℃下放置12小时以上，离心去除不溶物，与Ni亲和层析柱混合结合1小时；

结合后装柱，采用pH6.5的8M尿素洗涤层析柱20倍柱体积，然后采用pH5.9的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集，最后采用pH4.5的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集；

洗脱各组分分别上样进行SDS-PAGE分析，选择目的重组融合蛋白所在的组分进行复性；

将重组融合蛋白所在的组分合并后调整蛋白浓度至0.25mg/ml，对含2M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对含0.2M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对含0.02M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对不含尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时；

采用PEG20000吸水浓缩的方法浓缩，离心去沉淀，获得目的重组融合蛋白。

进一步，在本实施方式中，还包括将得到的Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段克隆入pBluescript SK(+/-)原核克隆载体中以进行保存的步骤。

本实施方式的固相支持物可以为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。当固相支持物为玻片、免疫印迹膜或微孔板时，抗原片段在固相支持物表面呈阵列分布，多种抗原片段可以是在同一固相支持物表面呈阵列分布或者分布于不同的固相支持物表面；当固相支持物为磁性微珠时，上述十二种抗原片段分别包被于十二种不同颜色的磁性微珠表面。

抗原片段可采用吸附或共价交联等方式固定在固相支持物的表面。在本实施方式中，抗原片段为亲和素化的抗原片段，如含链霉亲和素(streptavidin)标签的抗原片段；固相支持物表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白(biotin-BSA)，如在固相支持物的表面修饰有-COOH，通过氨基偶联试剂将biotin-BSA连接在固相支持物表面。抗原片段与固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。抗原片段与固相支持物之间间接连接，较之吸附等直接连接，可以提高蛋白芯片的检测灵敏度。在其他实施方式中，抗原片段也可以采用静电作用的方式直接吸附于固相支持物的表面。

以磁性微珠为例，磁性微珠表面包被抗原片段的过程可以但不限于如下：

步骤一：在避光震荡条件下，在羧基化的磁性微珠表面通过氨基偶联试剂连接上生物素化的牛血清白蛋白，得到磁性微珠-BSA-Biotin；

步骤二：在避光震荡条件下，将磁性微珠-BSA-Biotin与Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白混合，混合后链霉亲和素与生物素连接，即得包被有肺癌特征抗原的液相蛋白芯片。

通过将肺癌特征抗原通过重组融合蛋白的形式，带上链霉亲和素、Myc和Histag标签、并在细菌中大量表达并纯化，极大的方便了相关抗原的生产以及后续与磁性微珠的偶联过程，便于液相蛋白芯片的制作，从而为肺癌的早期诊断提供了新的技术支持。

在羧基化的磁性微珠表面通过氨基偶联试剂连接上生物素化的牛血清白蛋白可使用但不限于下述方法：

1.1磁性微珠氨基试剂及仪器：旋涡振荡仪、旋转混合仪、超声清洗机、磁性分离器、Luminex磁性微珠氨基偶联试剂盒及BSA-biotin；

1.2磁性微珠氨基偶联步骤：

1)将偶联试剂盒从冰箱取出，放置20～30min以恢复室温；

2)重悬磁性微珠：如果使用1mL小瓶保存的磁性微珠，涡旋小瓶10s，超声10s；如果使用4mL小瓶保存的磁性微珠，15～30rpm旋转混合小瓶15min；

3)根据期望偶联的磁性微珠数量，吸取适量的磁性微珠体积(原始浓度12.5×10⁶个/mL)于偶联反应管，以5×10⁶个磁性微珠为例，吸取400μl磁性微珠用于后续偶联反应；

注：一个反应管最大反应量为12.5×10⁶个磁性微珠；

4)将反应管置于磁性分离器1～2min(或置于离心机，>8000g、1～2min)，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

5)往反应管中加入500μl Activation buffer，涡旋反应管10s，超声10s；

6)重复步骤5～6一次；

7)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

8)如果磁性微珠数量大于5×10⁶个，往反应管内加入400μl Activation buffer；如果磁性微珠数量小于等于5×10⁶个，加入480μl Activation buffer；

9)将反应管涡旋10s，超声10s；

10)将Sμlfo-NHS用最低转速涡旋10s；

11)如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入50μl的Sμlfo-NHS；如果磁性微珠数小于等于5×10⁶个，往反应管加入10μl的Sμlfo-NHS；

12)用250μl Activation buffer溶解10mg EDC于一离心管，上下颠倒离心管数次，涡旋离心管10～12s以确保EDC完全溶解均匀；

注：EDC溶解后应尽快使用，一次性使用；

13)如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入50μl的EDC；如果磁性微珠数小于等于5×10⁶个，往反应管加入10μl的EDC；

14)最低转速涡旋反应管10s，铝箔包住反应管避光，置于旋转混合仪，15～30rpm、20min；

15)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

16)往管内加入500μl Activation buffer，涡旋10s，超声10s；

17)重复15～16步骤两次；

18)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

19)加入待偶联的BSA-biotin：8ug/1×10*6个磁性微珠；计算反应总体积：如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入Activation buffer至总体积为1000μl；如果磁性微珠数不大于5×10⁶个，往反应管加入Activation buffer至总体积为500μl；

20)最低转速涡旋反应管10s，铝箔包住反应管避光，置于旋转混合仪，15～30rpm、2h；

21)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

22)往管内加入500μl Wash buffer，涡旋10s，超声10s；

23)重复21～22步骤两次；

24)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

25)往反应管中加入1mL Wash buffer，涡旋10s，超声10s，2～8℃避光保存待用。

本实施方式还提供了一种肺癌诊断用试剂盒，其包括上述肺癌诊断用蛋白芯片。

进一步，在本实施方式中，该肺癌诊断用试剂盒还包括含有荧光物质标记的二抗试剂。所述荧光物质标记的二抗试剂可以但不限于是抗人IgG Fc-PE抗体和抗人IgM Fc-PE抗体。

更进一步，在本实施方式中，该肺癌诊断用试剂盒还包括标准品试剂和质控参比品试剂。标准品试剂与质控参比品试剂均可以但不限于是Anti-Myc嵌合抗体，其中，标准品为系列梯度浓度的抗体试剂以用于绘制标准曲线，质控参比品试剂为特定浓度的抗体试剂。

各种稳定液(如PBS)、稀释液(如PBS)、洗涤液(如PBS或者PBST)：在液体配制室和工作液配制室完成配制，在液体分装室除菌、分装，在包装、贴签室贴签，在试剂盒包装室包装入试剂盒的完整包装。其中，PBS及PBST的配方可采用但不限于如下：

Phosphate-buffered saline(PBS)：NaCl 137mM；KCl 2.7mM；Na₂HPO₄ 10mM；KH₂PO₄1.8mM；

Phosphate-buffered saline Tween 20(PBST)：NaCl 137mM；KCl 2.7mM；Na₂HPO₄10mM；KH₂PO₄ 1.8mM；0.1％(v/v)Tween 20。

以磁性微珠磁性微珠为例，在检测过程中，当磁性微珠包被完成后，加入被检血样品与磁性微珠混合孵育，使得被检血样品中的这十二种抗原的相应抗体与磁性微珠表面的抗原结合，从而间接地吸附于磁性微珠表面。再经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗去非特异吸附的杂蛋白，在磁性微珠表面留下相应的人抗体。最后，将磁性微珠分别与含有荧光物质标记的二抗(抗人IgG Fc-PE和抗人IgM Fc-PE)混合孵育，使得荧光物质标记的二抗与磁性微珠表面的抗体结合。可采用流式分选的方法探测与上述不同抗原反应的血清抗体，流式分选仪红色光源(如635nm光源)测量包被不同抗原的磁性微珠，绿色光源(如532nm光源)探测与抗原结合的血清抗体，结合抗原的血清抗体可通过二抗的荧光强度来定量。单个抗原结合的血清抗体是否为阳性，根据荧光定量的读数，血清抗体稀释倍数和标准品绘制的曲线加以判断。确定单个抗原是否为阳性后，联合分析12种抗原对应的自身抗体(CTT8对应结合两种血清抗体IgG和IgM)的结果，计算总的抗原阳性的个数，再与相应的判断标准进行比较，凡大于规定标准值者即可判断为肺癌患者。

以下为具体实施例部分。

实施例1含肺癌诊断用的蛋白芯片的试剂盒的制备(液态蛋白芯片诊断试剂盒)

抗原蛋白芯片的制备(液态芯片)：购买Luminex公司商品化的磁性微珠，首先将biotin-BSA通过氨基偶联试剂偶联到磁性微珠-COOH上，采用上述制备的12种抗原的纯化重组蛋白(含有Streptavidin标签)，通过磁性微珠表面的biotin与抗原含的Streptavidin标签的结合，将12种抗原分别结合到不同颜色的磁性微珠表面。然后在磁性微珠表面加上一层含20％胎牛血清的PBS，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭磁性微珠上的非特异蛋白交联或结合位点，最后分装，置于4℃下保存。以上过程制备成功液态蛋白芯片。

各种稳定、稀释、洗涤液、用于绘制标准曲线的各标准品溶液、质控参比品、荧光物质标记的二抗等均直接配制、分装。其中，标准品溶液采用特定稀释液，配制指定系列梯度浓度的Anti-Myc嵌合抗体，分装；质控参比品采用特定稀释液，配制指定浓度的Anti-Myc嵌合抗体，分装；荧光物质标记的二抗采用特定稳定液，配制指定浓度的抗人IgG Fc-PE和抗人IgM Fc-PE抗体，分装。

实施例2采用上述实施例1的试剂盒诊断肺癌以及和肺部良性结节进行鉴别诊断。

采用实施例1所述的试剂盒(采用蛋白芯片加免疫荧光法)检测肺癌患者200例、肺部良性结节300例划定肺癌诊断标准进行结果判断。结果表1所示。

表1

肺癌患者200例、肺部良性结节300例中，试剂盒检测出肺癌患者阳性的142例、肺部良性结节人阳性的27例，因此该试剂盒诊断肺癌的敏感性为71.0％，与肺部良性结节鉴别诊断特异性为91.0％，说明该试剂盒诊断肺癌的敏感性，与肺部良性结节鉴别诊断的特异性均较高。

肺癌患者200例中，I期肺癌患者有58例，其中44例试剂盒检测结果为阳性，早期肺癌(I期)的敏感性为75.9％，说明该试剂盒早期诊断肺癌的敏感较高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市丹蓝生物科技有限公司

<120> 肺癌诊断用蛋白芯片及试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Asp Leu Asp Ala Leu Leu Ala Asp Leu Glu Ser Thr Thr Ser

1 5 10 15

His Ile Ser Lys Arg Pro Val Phe Leu Ser Glu Glu Thr Pro Tyr Ser

20 25 30

Tyr Pro Thr Gly Asn His Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Val Pro Pro Pro

35 40 45

Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Glu Ala Leu Asn Gly Thr Ile Leu Asp

50 55 60

Pro Leu Asp Gln Trp Gln Pro Ser Gly Ser Arg Phe Ile His Gln Gln

65 70 75 80

Pro Gln Ser Ser Ser Pro Val Tyr Gly Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser

85 90 95

Val Ser Asn Pro Gln Asp Ser Val Gly Ser Pro Cys Ser Arg Val Gly

100 105 110

Glu Glu Glu His Val Tyr Ser Phe Pro Asn Lys Gln Lys Ser Ala Glu

115 120 125

Pro Ser Pro Thr Val Met Ser Thr Ser Leu Gly Ser Asn Leu Ser Glu

130 135 140

Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Asn Ala Val Gln His Asn Pro Pro

145 150 155 160

Gly Phe Pro Ala Asp Glu Ala Asn Ser Ser Pro Pro Leu Pro Gly Ala

165 170 175

Leu Ser Pro Leu Tyr Gly Val Pro Glu Thr Asn Ser Pro Leu Gly Gly

180 185 190

Lys Ala Gly Pro Leu Thr Lys Glu Lys Pro Lys Arg Asn Gly Gly Arg

195 200 205

Gly Leu Glu Asp Val Arg Pro Ser Val Glu Ser Leu Leu Asp Glu Leu

210 215 220

Glu Ser Ser Val Pro Ser Pro Val Pro Ala Ile Thr Val Asn Gln Gly

225 230 235 240

Glu Met Ser Ser Pro Gln Arg Val Thr Ser Thr Gln Gln Gln Thr Arg

245 250 255

Ile Ser Ala Ser Ser Ala Thr Arg Glu Leu Asp Glu Leu Met Ala Ser

260 265 270

Leu Ser Asp Phe Lys Phe Met Ala Gln Gly Lys Thr Gly Ser Ser Ser

275 280 285

Pro Pro Gly Gly Pro Pro Lys Pro Gly Ser Gln Leu Asp Ser Met Leu

290 295 300

Gly Ser Leu Gln Ser Asp Leu Asn Lys Leu Gly Val Ala Thr Val Ala

305 310 315 320

Lys Gly Val Cys Gly Ala Cys Lys Lys Pro Ile Ala Gly Gln Val Val

325 330 335

Thr Ala Met Gly Lys Thr Trp His Pro Glu His Phe Val Cys Thr His

340 345 350

Cys Gln Glu Glu Ile Gly Ser Arg Asn Phe Phe Glu Arg Asp Gly Gln

355 360 365

Pro Tyr Cys Glu Lys Asp Tyr His Asn Leu Phe Ser Pro Arg Cys Tyr

370 375 380

Tyr Cys Asn Gly Pro Ile Leu Asp Lys Val Val Thr Ala Leu Asp Arg

385 390 395 400

Thr Trp His Pro Glu His Phe Phe Cys Ala Gln Cys Gly Ala Phe Phe

405 410 415

Gly Pro Glu Gly Phe His Glu Lys Asp Gly Lys Ala Tyr Cys Arg Lys

420 425 430

Asp Tyr Phe Asp Met Phe Ala Pro Lys Cys Gly Gly Cys Ala Arg Ala

435 440 445

Ile Leu Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Leu Asn Thr Leu Trp His Pro Glu

450 455 460

Cys Phe Val Cys Arg Glu Cys Phe Thr Pro Phe Val Asn Gly Ser Phe

465 470 475 480

Phe Glu His Asp Gly Gln Pro Tyr Cys Glu Val His Tyr His Glu Arg

485 490 495

Arg Gly Ser Leu Cys Ser Gly Cys Gln Lys Pro Ile Thr Gly Arg Cys

500 505 510

Ile Thr Ala Met Ala Lys Lys Phe His Pro Glu His Phe Val Cys Ala

515 520 525

Phe Cys Leu Lys Gln Leu Asn Lys Gly Thr Phe Lys Glu Gln Asn Asp

530 535 540

Lys Pro Tyr Cys Gln Asn Cys Phe Leu Lys Leu Phe Cys

545 550 555

<210> 2

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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180

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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35 40 45

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

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<212> PRT

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<400> 4

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195 200 205

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245 250 255

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Ile Val His Val Ser Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Arg Glu Gln Gln

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565 570 575

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<210> 5

<211> 589

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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485 490 495

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<210> 6

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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435

<210> 7

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ser Ile Leu Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly

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420 425 430

Ala Lys

<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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Phe Lys Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Thr Arg Glu Leu Ala Glu Asp

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Gly Tyr Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro Thr Arg Thr Glu Ile

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65 70 75 80

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85 90 95

Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly Val Leu Arg Phe Ile Met Glu

115 120 125

Ser Gly Ala Lys Gly Cys Glu Val Val Val Ser Gly Lys Leu Arg Gly

130 135 140

Gln Arg Ala Lys Ser Met Lys Phe Val Asp Gly Leu Met Ile His Ser

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195 200 205

Ser Ile Val Glu Pro Lys Asp Glu Ile Leu Pro Thr Thr Pro Ile Ser

210 215 220

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Pro Thr Ala

<210> 9

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Lys Thr Lys Phe Cys Thr Gly Gly Glu Ala Glu Pro Ser Pro Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Ser Cys Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala Pro Gly

20 25 30

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Gly Ser Glu Gln Ala Gln Lys Glu Asn Glu Phe Gln Gly Ala Glu Ala

165 170 175

Met Val Leu Glu Ser Val Met Phe Ala Ile Leu Ala Glu Arg Ser Leu

180 185 190

Gly Pro Lys Leu Tyr Gly Ile Phe Pro Gln Gly Arg Leu Glu Gln Phe

195 200 205

Ile Pro Ser Arg Arg Leu Asp Thr Glu Glu Leu Ser Leu Pro Asp Ile

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Ser Ala Glu Ile Ala Glu Lys Met Ala Thr Phe His Gly Met Lys Met

225 230 235 240

Pro Phe Asn Lys Glu Pro Lys Trp Leu Phe Gly Thr Met Glu Lys Tyr

245 250 255

Leu Lys Glu Val Leu Arg Ile Lys Phe Thr Glu Glu Ser Arg Ile Lys

260 265 270

Lys Leu His Lys Leu Leu Ser Tyr Asn Leu Pro Leu Glu Leu Glu Asn

275 280 285

Leu Arg Ser Leu Leu Glu Ser Thr Pro Ser Pro Val Val Phe Cys His

290 295 300

Asn Asp Cys Gln Glu Gly Asn Ile Leu Leu Leu Glu Gly Arg Glu Asn

305 310 315 320

Ser Glu Lys Gln Lys Leu Met Leu Ile Asp Phe Glu Tyr Ser Ser Tyr

325 330 335

Asn Tyr Arg Gly Phe Asp Ile Gly Asn His Phe Cys Glu Trp Met Tyr

340 345 350

Asp Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr Pro Phe Phe Arg Ala Asn Ile Arg Lys

355 360 365

Tyr Pro Thr Lys Lys Gln Gln Leu His Phe Ile Ser Ser Tyr Leu Pro

370 375 380

Ala Phe Gln Asn Asp Phe Glu Asn Leu Ser Thr Glu Glu Lys Ser Ile

385 390 395 400

Ile Lys Glu Glu Met Leu Leu Glu Val Asn Arg Phe Ala Leu Ala Ser

405 410 415

His Phe Leu Trp Gly Leu Trp Ser Ile Val Gln Ala Lys Ile Ser Ser

420 425 430

Ile Glu Phe Gly Tyr Met Asp Tyr Ala Gln Ala Arg Phe Asp Ala Tyr

435 440 445

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450 455

<210> 10

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ser Lys Ser Glu Ser Pro Lys Glu Pro Glu Gln Leu Arg Lys Leu

1 5 10 15

Phe Ile Gly Gly Leu Ser Phe Glu Thr Thr Asp Glu Ser Leu Arg Ser

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Arg Val Val Glu Pro Lys Arg Ala Val Ser Arg Glu Asp Ser Gln

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Gly Lys Ile Glu Val Ile Glu Ile Met Thr Asp Arg Gly Ser Gly Lys

130 135 140

Lys Arg Gly Phe Ala Phe Val Thr Phe Asp Asp His Asp Ser Val Asp

145 150 155 160

Lys Ile Val Ile Gln Lys Tyr His Thr Val Asn Gly His Asn Cys Glu

165 170 175

Val Arg Lys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Met Ala Ser Ala Ser Ser Ser

180 185 190

Gln Arg Gly Arg Ser Gly Ser Gly Asn Phe Gly Gly Gly Arg Gly Gly

195 200 205

Gly Phe Gly Gly Asn Asp Asn Phe Gly Arg Gly Gly Asn Phe Ser Gly

210 215 220

Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Asp Gly Tyr Asn Gly Phe Gly Asn Asp Gly Gly Tyr Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gln

260 265 270

Gly Tyr Gly Asn Gln Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Asp

275 280 285

Ser Tyr Asn Asn Gly Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ser Gly Ser

290 295 300

Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Asn Asp Phe Gly Asn Tyr Asn Asn

305 310 315 320

Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly Arg

325 330 335

Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro Arg

340 345 350

Asn Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Ser

355 360 365

Gly Arg Arg Phe

370

<210> 11

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Phe Glu Ala Arg Leu Val Gln Gly Ser Ile Leu Lys Lys Val Leu

1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Asp Leu Ile Asn Glu Ala Cys Trp Asp Ile Ser Ser

20 25 30

Ser Gly Val Asn Leu Gln Ser Met Asp Ser Ser His Val Ser Leu Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Cys Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ile Thr Leu Arg Ala Glu Asp Asn Ala

85 90 95

Asp Thr Leu Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln Glu Lys Val Ser

100 105 110

Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile

115 120 125

Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe

130 135 140

Ala Cys Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile

145 150 155 160

Ser Cys Ala Lys Asp Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly

165 170 175

Asn Gly Asn Ile

180

<210> 12

<211> 1591

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Asn Ser Gln Pro Gln Thr Arg Ser Pro Gly Gly Phe Arg Pro Ile

1 5 10 15

Gln Phe Phe Gln Arg Pro Gln Ile Gln Pro Pro Arg Ala Thr Ile Pro

20 25 30

Asn Ser Ser Pro Ser Ile Arg Pro Gly Ala Gln Thr Pro Thr Ala Val

35 40 45

Tyr Gln Ala Asn Gln His Ile Met Met Val Asn His Leu Pro Met Pro

50 55 60

Tyr Pro Val Pro Gln Gly Pro Gln Tyr Cys Ile Pro Gln Tyr Arg His

65 70 75 80

Ser Gly Pro Pro Tyr Val Gly Pro Pro Gln Gln Tyr Pro Val Gln Pro

85 90 95

Pro Gly Pro Gly Pro Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Gly Asp Phe Pro

100 105 110

Asn Ala Tyr Gly Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Gln Pro Val Tyr Gln Ser

115 120 125

Ala Pro Ile Ile Val Pro Thr Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Lys Arg

130 135 140

Glu Lys Lys Thr Ile Arg Ile Arg Asp Pro Asn Gln Gly Gly Lys Asp

145 150 155 160

Ile Thr Glu Glu Ile Met Ser Gly Gly Gly Ser Arg Asn Pro Thr Pro

165 170 175

Pro Ile Gly Arg Pro Thr Ser Thr Pro Thr Pro Pro Gln Leu Pro Ser

180 185 190

Gln Val Pro Glu His Ser Pro Val Val Tyr Gly Thr Val Glu Ser Ala

195 200 205

His Leu Ala Ala Ser Thr Pro Val Thr Ala Ala Ser Asp Gln Lys Gln

210 215 220

Glu Glu Lys Pro Lys Pro Asp Pro Val Leu Lys Ser Pro Ser Pro Val

225 230 235 240

Leu Arg Leu Val Leu Ser Gly Glu Lys Lys Glu Gln Glu Gly Gln Thr

245 250 255

Ser Glu Thr Thr Ala Ile Val Ser Ile Ala Glu Leu Pro Leu Pro Pro

260 265 270

Ser Pro Thr Thr Val Ser Ser Val Ala Arg Ser Thr Ile Ala Ala Pro

275 280 285

Thr Ser Ser Ala Leu Ser Ser Gln Pro Ile Phe Thr Thr Ala Ile Asp

290 295 300

Asp Arg Cys Glu Leu Ser Ser Pro Arg Glu Asp Thr Ile Pro Ile Pro

305 310 315 320

Ser Leu Thr Ser Cys Thr Glu Thr Ser Asp Pro Leu Pro Thr Asn Glu

325 330 335

Asn Asp Asp Asp Ile Cys Lys Lys Pro Cys Ser Val Ala Pro Asn Asp

340 345 350

Ile Pro Leu Val Ser Ser Thr Asn Leu Ile Asn Glu Ile Asn Gly Val

355 360 365

Ser Glu Lys Leu Ser Ala Thr Glu Ser Ile Val Glu Ile Val Lys Gln

370 375 380

Glu Val Leu Pro Leu Thr Leu Glu Leu Glu Ile Leu Glu Asn Pro Pro

385 390 395 400

Glu Glu Met Lys Leu Glu Cys Ile Pro Ala Pro Ile Thr Pro Ser Thr

405 410 415

Val Pro Ser Phe Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro

420 425 430

His Thr Pro Val Ile Val Pro Ala Ala Ala Thr Thr Val Ser Ser Pro

435 440 445

Ser Ala Ala Ile Thr Val Gln Arg Val Leu Glu Glu Asp Glu Ser Ile

450 455 460

Arg Thr Cys Leu Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Gln Asn Lys Ile Glu

465 470 475 480

Val Glu Ala Asp Gly Gln Thr Glu Glu Ile Leu Asp Ser Gln Asn Leu

485 490 495

Asn Ser Arg Arg Ser Pro Val Pro Ala Gln Ile Ala Ile Thr Val Pro

500 505 510

Lys Thr Trp Lys Lys Pro Lys Asp Arg Thr Arg Thr Thr Glu Glu Met

515 520 525

Leu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Lys Ala Glu Glu Glu Leu Ser Ile Asp

530 535 540

Lys Val Leu Glu Ser Glu Gln Asp Lys Met Ser Gln Gly Phe His Pro

545 550 555 560

Glu Arg Asp Pro Ser Asp Leu Lys Lys Val Lys Ala Val Glu Glu Asn

565 570 575

Gly Glu Glu Ala Glu Pro Val Arg Asn Gly Ala Glu Ser Val Ser Glu

580 585 590

Gly Glu Gly Ile Asp Ala Asn Ser Gly Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asp

595 600 605

Gly Val Thr Phe Pro Phe Lys Pro Glu Ser Trp Lys Pro Thr Asp Thr

610 615 620

Glu Gly Lys Lys Gln Tyr Asp Arg Glu Phe Leu Leu Asp Phe Gln Phe

625 630 635 640

Met Pro Ala Cys Ile Gln Lys Pro Glu Gly Leu Pro Pro Ile Ser Asp

645 650 655

Val Val Leu Asp Lys Ile Asn Gln Pro Lys Leu Pro Met Arg Thr Leu

660 665 670

Asp Pro Arg Ile Leu Pro Arg Gly Pro Asp Phe Thr Pro Ala Phe Ala

675 680 685

Asp Phe Gly Arg Gln Thr Pro Gly Gly Arg Gly Val Pro Leu Leu Asn

690 695 700

Val Gly Ser Arg Arg Ser Gln Pro Gly Gln Arg Arg Glu Pro Arg Lys

705 710 715 720

Ile Ile Thr Val Ser Val Lys Glu Asp Val His Leu Lys Lys Ala Glu

725 730 735

Asn Ala Trp Lys Pro Ser Gln Lys Arg Asp Ser Gln Ala Asp Asp Pro

740 745 750

Glu Asn Ile Lys Thr Gln Glu Leu Phe Arg Lys Val Arg Ser Ile Leu

755 760 765

Asn Lys Leu Thr Pro Gln Met Phe Asn Gln Leu Met Lys Gln Val Ser

770 775 780

Gly Leu Thr Val Asp Thr Glu Glu Arg Leu Lys Gly Val Ile Asp Leu

785 790 795 800

Val Phe Glu Lys Ala Ile Asp Glu Pro Ser Phe Ser Val Ala Tyr Ala

805 810 815

Asn Met Cys Arg Cys Leu Val Thr Leu Lys Val Pro Met Ala Asp Lys

820 825 830

Pro Gly Asn Thr Val Asn Phe Arg Lys Leu Leu Leu Asn Arg Cys Gln

835 840 845

Lys Glu Phe Glu Lys Asp Lys Ala Asp Asp Asp Val Phe Glu Lys Lys

850 855 860

Gln Lys Glu Leu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Glu Glu Arg Thr Arg Leu

865 870 875 880

His Asp Glu Leu Glu Glu Ala Lys Asp Lys Ala Arg Arg Arg Ser Ile

885 890 895

Gly Asn Ile Lys Phe Ile Gly Glu Leu Phe Lys Leu Lys Met Leu Thr

900 905 910

Glu Ala Ile Met His Asp Cys Val Val Lys Leu Leu Lys Asn His Asp

915 920 925

Glu Glu Ser Leu Glu Cys Leu Cys Arg Leu Leu Thr Thr Ile Gly Lys

930 935 940

Asp Leu Asp Phe Glu Lys Ala Lys Pro Arg Met Asp Gln Tyr Phe Asn

945 950 955 960

Gln Met Glu Lys Ile Val Lys Glu Arg Lys Thr Ser Ser Arg Ile Arg

965 970 975

Phe Met Leu Gln Asp Val Ile Asp Leu Arg Leu Cys Asn Trp Val Ser

980 985 990

Arg Arg Ala Asp Gln Gly Pro Lys Thr Ile Glu Gln Ile His Lys Glu

995 1000 1005

Ala Lys Ile Glu Glu Gln Glu Glu Gln Arg Lys Val Gln Gln Leu Met

1010 1015 1020

Thr Lys Glu Lys Arg Arg Pro Gly Val Gln Arg Val Asp Glu Gly Gly

1025 1030 1035 1040

Trp Asn Thr Val Gln Gly Ala Lys Asn Ser Arg Val Leu Asp Pro Ser

1045 1050 1055

Lys Phe Leu Lys Ile Thr Lys Pro Thr Ile Asp Glu Lys Ile Gln Leu

1060 1065 1070

Val Pro Lys Ala Gln Leu Gly Ser Trp Gly Lys Gly Ser Ser Gly Gly

1075 1080 1085

Ala Lys Ala Ser Glu Thr Asp Ala Leu Arg Ser Ser Ala Ser Ser Leu

1090 1095 1100

Asn Arg Phe Ser Ala Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Gly Ser Thr Pro

1105 1110 1115 1120

Ser Thr Pro Val Glu Phe Asp Ser Arg Arg Thr Leu Thr Ser Arg Gly

1125 1130 1135

Ser Met Gly Arg Glu Lys Asn Asp Lys Pro Leu Pro Ser Ala Thr Ala

1140 1145 1150

Arg Pro Asn Thr Phe Met Arg Gly Gly Ser Ser Lys Asp Leu Leu Asp

1155 1160 1165

Asn Gln Ser Gln Glu Glu Gln Arg Arg Glu Met Leu Glu Thr Val Lys

1170 1175 1180

Gln Leu Thr Gly Gly Val Asp Val Glu Arg Asn Ser Thr Glu Ala Glu

1185 1190 1195 1200

Arg Asn Lys Thr Arg Glu Ser Ala Lys Pro Glu Ile Ser Ala Met Ser

1205 1210 1215

Ala His Asp Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Glu Leu Glu Arg Lys Ser

1220 1225 1230

Lys Ser Ile Ile Asp Glu Phe Leu His Ile Asn Asp Phe Lys Glu Ala

1235 1240 1245

Met Gln Cys Val Glu Glu Leu Asn Ala Gln Gly Leu Leu His Val Phe

1250 1255 1260

Val Arg Val Gly Val Glu Ser Thr Leu Glu Arg Ser Gln Ile Thr Arg

1265 1270 1275 1280

Asp His Met Gly Gln Leu Leu Tyr Gln Leu Val Gln Ser Glu Lys Leu

1285 1290 1295

Ser Lys Gln Asp Phe Phe Lys Gly Phe Ser Glu Thr Leu Glu Leu Ala

1300 1305 1310

Asp Asp Met Ala Ile Asp Ile Pro His Ile Trp Leu Tyr Leu Ala Glu

1315 1320 1325

Leu Val Thr Pro Met Leu Lys Glu Gly Gly Ile Ser Met Arg Glu Leu

1330 1335 1340

Thr Ile Glu Phe Ser Lys Pro Leu Leu Pro Val Gly Arg Ala Gly Val

1345 1350 1355 1360

Leu Leu Ser Glu Ile Leu His Leu Leu Cys Lys Gln Met Ser His Lys

1365 1370 1375

Lys Val Gly Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asp Leu Ser Trp Lys Asp Phe

1380 1385 1390

Leu Pro Glu Gly Glu Asp Val His Asn Phe Leu Leu Glu Gln Lys Leu

1395 1400 1405

Asp Phe Ile Glu Ser Asp Ser Pro Cys Ser Ser Glu Ala Leu Ser Lys

1410 1415 1420

Lys Glu Leu Ser Ala Glu Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Glu Lys Leu Ile

1425 1430 1435 1440

Ile Glu Asp Lys Ala Asn Asp Glu Gln Ile Phe Asp Trp Val Glu Ala

1445 1450 1455

Asn Leu Asp Glu Ile Gln Met Ser Ser Pro Thr Phe Leu Arg Ala Leu

1460 1465 1470

Met Thr Ala Val Cys Lys Ala Ala Ile Ile Ala Asp Ser Ser Thr Phe

1475 1480 1485

Arg Val Asp Thr Ala Val Ile Lys Gln Arg Val Pro Ile Leu Leu Lys

1490 1495 1500

Tyr Leu Asp Ser Asp Thr Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Tyr Ala Leu

1505 1510 1515 1520

Gln Ala Ser Ile Val Lys Leu Asp Gln Pro Ala Asn Leu Leu Arg Met

1525 1530 1535

Phe Phe Asp Cys Leu Tyr Asp Glu Glu Val Ile Ser Glu Asp Ala Phe

1540 1545 1550

Tyr Lys Trp Glu Ser Ser Lys Asp Pro Ala Glu Gln Asn Gly Lys Gly

1555 1560 1565

Val Ala Leu Lys Ser Val Thr Ala Phe Phe Thr Trp Leu Arg Glu Ala

1570 1575 1580

Glu Glu Glu Ser Glu Asp Asn

1585 1590

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagcagaaac tcatctctga agaggatctg catcaccatc accatcac 48

Claims

1.一种蛋白芯片在制备用于非小细胞肺癌的诊断产品中的应用，其特征在于，所述蛋白芯片包括固相支持物及包被于所述固相支持物表面的抗原；所述抗原包括如下十二种抗原片段：Paxillin抗原片段、CTAG1B抗原片段、SOX2抗原片段、HSPA9抗原片段、UBQLN1抗原片段、C14orf104抗原片段、ENO-1抗原片段、RPS3抗原片段、CHK抗原片段、HNRPA1抗原片段、PCNA抗原片段及Eif4g3抗原片段；

所述Paxillin抗原片段的序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗原片段为重组融合蛋白，还包括位于相应抗原特征氨基酸序列的N端的Myc-Histag以及C端的链霉亲和素。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述固相支持物为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固相支持物为磁性微珠，所述十二种抗原片段分别包被于十二种不同颜色的磁性微珠表面。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗原片段为亲和素化的抗原片段，所述固相支持物的表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白，所述抗原片段与所述固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。

6.一种试剂盒在制备用于非小细胞肺癌的诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5中任一项所述的蛋白芯片在制备用于非小细胞肺癌的诊断产品中的应用中所使用的所述蛋白芯片。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括含有荧光物质标记的二抗试剂、标准品试剂和质控参比品试剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述荧光物质标记的二抗试剂是抗人IgGFc-PE抗体和抗人IgM Fc-PE抗体。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品试剂与所述质控参比品试剂均是Anti-Myc嵌合抗体。