KR101733855B1 - Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법 및 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법 및 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서 제공하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법은 겔 전기영동에 의해서 정확한 정량이 어려운 돌연변이 융합 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량화하는데 사용될 수 있으며, 이 방법을 사용하면, 기술적으로 간단하면서도 비용-효율적으로 표적 접합 변종 유전자를 탐지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법은 산화 그래핀-기반의 형광탐지분석으로 만성 백혈병의 초기 진단 및 치료 플랜에 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법 및 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물에 관한 것이다.
만성 골수성 백혈병(Chronic myeloid leukemia, CML)은 9번 염색체와 22번 염색체 사이에 전좌에 의해 야기되는 필라델피아 염색체에 의해 특징지어지는 흔한 골수 증식성 질환이다. 이 염색체 전좌는 Bcr-Abl(breakpoint cluster region-Abelson) 돌연변이 티로신 키나아제를 코딩하는 Bcr-Abl 융합 유전자를 만들어 낸다. Bcr-Abl 융합 전사에 의해 발현된 티로신 키나아제의 돌연변이 유형은 지속적으로 활성화되어, 제어되지 않는 세포 증식 및 세포자연사의 억제로 이어지는 비정상적인 신호 전달의 결과를 야기한다. 그래서, Bcr-Abl 융합 유전자의 탐지는 치료적 처치 이후 예후를 평가하는 데 있어서뿐만 아니라 질병의 초기 진단에 있어서도 중요하다. 이러한 이유로, 가시적 분자결합화(in situ hybridization) 유래 형광, 리얼-타임 정량적 중합 효소 연쇄 반응(qPCR) 및 자기 나노분자를 활용하는 방법을 포함하는 Bcr-Abl 융합 전사 또는 융합 단백질에 대한 다양한 탐지 방법이 보고되었다.
Bcr 유전자의 절단점(breakpoint)에 좌우되는 다양한 크기를 갖는 Bcr-Abl 융합 전사의 다양한 접합 변종 유전자가 염색체 전좌 도중에 흔히 형성된다. 일반적으로, Bcr 유전자에서 3 가지 유형의 절단점 클러스터 영역으로 특징지어진다: 메이저 절단점 클러스터 영역(M-bcr), 마이너 절단점 클러스터 영역(m-bcr) 및 마이크로 절단점 클러스터 영역(μ-bcr). 메이저 유형의 Bcr-Abl 접합 변종 유전자는 b3a2 및 b2a2 전사로 구성되며, 마이너 및 마이크로 유형은 e1a2 전사 및 c3a2 전사를 각각 포함한다. Bcr-Abl 전사의 접합 변종 유전자의 유형에 따라서, Bcr-Abl 융합 단백질을 타겟으로 하는 항암제에 대한 다른 반응이 만성 골수성 백혈병 환자에서 달성된다. 따라서, 만성 골수성 백혈병 환자에서 Bcr-Abl 접합 변종 유전자를 규명하는 것은 치료 플랜 및 예후에 있어서 중대하다. 접합 변종 유전자를 탐지하는 기존의 방법 중에서, 역전사-중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 기반한 겔 전기영동은 아가로스 겔에서 중합효소 연쇄반응 산물의 크기를 구별하는 데 의존한다. 그러나, 이 방법은 힘든 겔 전기영동 후에 증폭된 중합효소 연쇄반응 산물의 정확한 양을 정량한다는 데 제한된다.
정량적 중합효소 연쇄반응은 또한 Bcr-Abl 전사의 탐지에 널리 사용된다. 비록 이 방법이 Bcr-Abl mRNA 수준을 정량화할 수 있음에도 불구하고, 이 기술은 특화된 기구와 비싼 시약을 필요로 한다. 더욱이, 정량적 중합효소 연쇄반응에서 타겟 유전자를 탐지하기 위해 사용되는 리포터 발색제 및 소광 발색제와 함께 형광 DNA 프로브가 리포터 발색제 및 소광 발색제 간의 포스터(Forster) 공명 에너지 이동(FRET)에 대해 보통 길이(최대 30 베이스 또는 그 이하)에 제한된다.
산화 그래핀(GO), 흑연(graphite)의 화학적 탈락 및 산화로부터 얻어진 sp2-혼성 탄소 물질은 최근 많은 관심을 끌고 있다. 산화 그래핀이 높은 물리적 및 열적 강도, 좋은 전기 전도성, 낮은-비용 및 용이한 표면 개질 같은 많은 유리한 점을 가지기 때문에, 전자 기술, 약물 전달 및 세포 이미징의 분야에서 널리 적용되고 있다. 중요하게, 산화 그래핀은 우선적으로 π-π 쌓기 상호작용 및 수소 결합을 통하여 단일-가닥 DNA(ssDNA)에 결합하는 반면에 이중-가닥 DNA(dsDNA)는 이중 나선 내에 숨겨진 핵염기 때문에 산화 그래핀 표면과 약한 친화성을 갖는다. 또한, 산화 그래핀 표면 근처에서 프로브 형광단의 효율적인 형광 소광 때문에 산화 그래핀은 바이오센서에 사용된다. 강력한 형광 소광 효율과 함께 핵산을 흡착하는 이러한 산화 그래핀의 독특한 성질은 바이오센서의 발달에 있어서 용이한 플랫폼을 만들었다.
이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제2011-0055929호에서 정량적 질량분석기법을 이용한 만성 골수성 백혈병의 발병 진단방법과 약제 내성 진단방법을 개시하고 있으나 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법에 대해서는 개시하고 있지 않으며, 이에 간단하면서도 비용 효육적인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자의 검출 방법에 대한 개발이 필요하다. .
따라서 본 발명의 목적은 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자의 검출 방법 및 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 a) Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자(splice variant)의 염기 서열에 특이적으로 상보적 결합하는 프로브 DNA를 제작하고 이의 5'-말단에 형광물질을 접합시켜 형광 프로브 DNA를 제작하는 단계; b) 상기 표적 접합 변종 유전자의 염기 서열을 포함하는 주형 DNA에 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍, 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍 및 DNA 중합효소를 첨가하여 네스티드(nested) 중합 효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 네스티드 중합 효소 연쇄반응 산물에 산화 그래핀(Graphene oxide, GO)을 첨가하는 단계; 를 포함하고, 상기 (c) 단계 이후에 상기 형광 프로브 DNA가 상기 주형 DNA에 결합할 경우 형광 신호는 검출되고, 주형 DNA가 아닌 다른 DNA에 결합할 경우 형광신호는 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법에 대한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서,
상기 b) 단계의 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서,
상기 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 4 및 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 5 및 7의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 8 및 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 9 및 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서,
상기 프로브 DNA는 서열번호 10, 11 및 14의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서,
상기 b) 단계의 주형 DNA는 만성 백혈병 유래일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 접합 변종 유전자는 b3a2, b2a2 및 e1a2로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또 본 발명은 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자의 염기 서열에 특이적으로 상보적 결합하는 프로브 DNA를 제작하고 이의 5'-말단에 형광물질을 접합시켜 제조한 형광 프로브 DNA; 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍; 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍; DNA 중합효소; 및 산화 그래핀을 포함하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서,
상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서,
상기 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 4 및 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 5 및 7의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 8 및 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 9 및 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서,
상기 프로브 DNA는 서열번호 10, 11 및 14의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서,
상기 접합 변종 유전자는 b3a2, b2a2 및 e1a2로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법은 겔 전기영동에 의해서 정확한 정량이 어려운 돌연변이 융합 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량화하는데 사용될 수 있으며, 이 방법을 사용하면, 기술적으로 간단하면서도 비용-효율적으로 표적 접합 변종 유전자를 탐지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법은 산화 그래핀-기반의 형광탐지분석으로 만성 백혈병의 초기 진단 및 치료 플랜에 적용될 수 있다.
도 1은 495 nm의 여기 파장에서 기록된 프로브의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. P는 FAM-표지된 프로브 DNA의 형광 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 중합효소 연쇄반응 사이클 진행에 따른 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것으로, 산화 그래핀의 존재 하에 FAM-표지된 DNA 프로브의 형광 강도의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것으로, K562 세포성 RNA의 시작 양에 대한 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것이다.
도 5는 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 시각화된 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 6은 는 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 정량화된 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 7은 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 다수의 환자 시료(n=23)의 동시 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 도 7의 시료에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Bcr-Abl 융합 유전자의 다양한 접합 변종 유전자를 나타낸 것이다.
도 10은 산화 그래핀의 원자력 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은 산화 그래핀의 높이 프로파일을 나타낸 것이다.
도 12는 다양한 프라이머 어닐링 온도를 사용한 Bcr-Abl 유전자 증폭에 대한 최적의 온도를 나타낸 것이다.
도 13은 산화 그래핀-기반 형광 분석법에서 형광 강도의 비율(F/Fo)을 측정에 의한 최적의 Mg2 +의 농도 결정을 나타낸 것이다.
도 14는 최대 F/Fo 비율에 대한 최적의 산화 그래핀농도 결정을 나타낸 것이다.
도 15는 Bcr-Abl 포지티브 및 네거티브 시료에 대한 495 nm의 여기 파장에서 기록된 DNA 프로브의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 16은 1차 중합효소 연쇄반응 및 네스티드 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 세트를 도식화해 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 접합 변종 유전자의 중합 효소 연쇄 반응 산물 밴드를 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 것이다.
도 18은 연속적으로 희석된 주형으로부터 네스티드 중합효소 연쇄반응 산물의 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
도 19는 주형 DNA 희석에 의해 얻어진 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 Bcr-Abl 융합 유전자의 형광 탐지 과정을 도식화된 다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 21은 산화 그래핀 기반의 접합 변종 유전자의 탐지 과정을 도식화된 다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 2는 중합효소 연쇄반응 사이클 진행에 따른 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것으로, 산화 그래핀의 존재 하에 FAM-표지된 DNA 프로브의 형광 강도의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것으로, K562 세포성 RNA의 시작 양에 대한 산화 그래핀-기반 형광 분석의 감도를 나타낸 것이다.
도 5는 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 시각화된 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 6은 는 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 정량화된 형광 신호를 나타낸 것이다.
도 7은 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 다수의 환자 시료(n=23)의 동시 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 다중 홈에서 접합 변종 유전자의 산화 그래핀 기반의 형광 탐지를 나타낸 것으로, 도 7의 시료에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Bcr-Abl 융합 유전자의 다양한 접합 변종 유전자를 나타낸 것이다.
도 10은 산화 그래핀의 원자력 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은 산화 그래핀의 높이 프로파일을 나타낸 것이다.
도 12는 다양한 프라이머 어닐링 온도를 사용한 Bcr-Abl 유전자 증폭에 대한 최적의 온도를 나타낸 것이다.
도 13은 산화 그래핀-기반 형광 분석법에서 형광 강도의 비율(F/Fo)을 측정에 의한 최적의 Mg2 +의 농도 결정을 나타낸 것이다.
도 14는 최대 F/Fo 비율에 대한 최적의 산화 그래핀농도 결정을 나타낸 것이다.
도 15는 Bcr-Abl 포지티브 및 네거티브 시료에 대한 495 nm의 여기 파장에서 기록된 DNA 프로브의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 16은 1차 중합효소 연쇄반응 및 네스티드 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 세트를 도식화해 나타낸 것이다.
도 17은 다양한 접합 변종 유전자의 중합 효소 연쇄 반응 산물 밴드를 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 것이다.
도 18은 연속적으로 희석된 주형으로부터 네스티드 중합효소 연쇄반응 산물의 겔 전기영동을 나타낸 것이다.
도 19는 주형 DNA 희석에 의해 얻어진 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 20은 Bcr-Abl 융합 유전자의 형광 탐지 과정을 도식화된 다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 21은 산화 그래핀 기반의 접합 변종 유전자의 탐지 과정을 도식화된 다이어그램으로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 Bcr-Abl 양성 백혈병 환자 유래의 키메라 돌연변이 유전자의 탐지를 위하여 산화 그래핀(graphene oxide, GO)을 사용하는 쉬운 형광 분석 시스템을 발명하였다. 본 발명자들은 기존의 중합효소 연쇄반응 시스템과 특정한 돌연변이 유전자를 어닐(anneal)하도록 고안된 6-카르복시플루오레세인(FAM)-표지된 형광 DNA 프로브를 채택하였다. 프로브 DNA는 중합효소 연쇄반응 도중에 Taq DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클리에이즈 활성에 의하여 분해되었으며, 프로브 DNA로부터 FAM 형광단을 방출하였다. 산화 그래핀이 중합효소 연쇄반응 산물에 첨가되었을 때, 프로브 DNA로부터 유래된 분리된 형광단은 형광 ??칭없이 산화 그래핀으로 흡착되지 않는다. Bcr-Abl 음성 및 Bcr-Abl 양성 시료 사이의 형광 강도의 차이가 관찰되었다. 뿐만 아니라, 타겟 접합 변종 유전자 및 다른 유형의 접합 변종 유전자 간의 형광 강도 차이가 다중 홈 플레이트에서 시각화 및 정량되었다. 본 발명자들은 산화 그래핀-기반 형광분석이 임상 시료로부터 접합 변종 유전자를 완벽히 확인할 수 있음을 입증하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
산화
그래핀의
단층 및
소광
능력 검증
분석의 진행을 위한 예비 단계로, 본 발명에서 사용된 산화 그래핀은 원자력 현미경(atomic force microscopy, AFM; 도 10, 도 11)로 균일한 단층 구조로 확인되었다. AFM 이미지에 의해 산화 그래핀 시트가 평균 1.09 nm 두께의 높이 프로파일을 가졌으며, 단층 시트에 해당하며 이는 두께가 0.8 내지 1.5 nm라는 것을 확인하였다.
중합효소 연쇄반응(
PCR
) 조건 확립 및 형광 핵산
프로브
설계
본 발명자들은 다음에 Bcr-Abl 유전자 증폭을 위한 적절한 온도를 찾기 위해 온도를 증가시키면서 변화도(gradient) 중합효소 연쇄반응을 수행하였으며 Bcr-Abl-포지티브 세포로부터 얻은 Bcr-Abl-포지티브 cDNA 유래의 Bcr-Abl 유전자의 중합효소 연쇄반응에 대해 60 ℃를 선택하였다(도 12) 낮은 농도의 용액에서 산화 그래핀에 흡착된 DNA의 비특이적 이동 또는 높은 농도의 용액 때문에 산화 그래핀의 응집을 피하기 위하여 적정량의 산화 그래핀을 사용하는 것은 매우 중요하다. 키메라 Bcr-Abl 돌연변이 유전자의 형광 탐지에 대해 적정한 농도의 산화 그래핀을 확인하기 위하여, 2개의 골수 세포계(cell lines)으로부터 처음 추출된 총 RNA, 즉 HL60 세포 및 K562 세포는 각각 Bcr-Abl-네거티브 및 Bcr-Abl-포지티브 세포계이다. 역전사-중합효소 연쇄반응은 이후 백혈병 세포로부터 얻어진 총 RNA 및 증폭된 Abl 유전자에 특이적인 FAM-표지된 DNA 프로브를 사용하여 수행하였다. 산화 그래핀의 첨가로 FAM-표지된 프로브 DNA의 형광 변화가 산화 그래핀 농도를 증가시킴에 따라 관찰되었다(도 13). 형광 강도 비율 F/F0(F 및 F0는 Bcr-Abl-포지티브 및 Bcr-Abl-네거티브 세포로부터 얻어진 중합효소 연쇄반응 산물의 FAM-표지된 프로브 DNA형광이다.)는 산화 그래핀 농도가 25 ㎍/mL에 도달할 때까지 상승하였다(도 13). 그래서, 추후의 실험에서 사용을 위한 최적의 산화 그래핀 농도는 25 ㎍/mL로 선택되었다. 본 발명자들은 또한 산화 그래핀에 결합하기 위한 친화력과 연관이 있는 2가 양이온(즉, Mg2 +)의 농도의 효과를 평가하였다. 신호-대-잡음 비(형광 강도 비 F/ F0)는 MgCl2의 농도가 6 mM가 될 때까지 상승했으며, 농도가 더 상승하면 수치값에 거의 영향이 없었다(도 14). 그래서, 6 mM의 MgCl2는 실험을 위한 최적의 농도로 선택되었다. 골수 세포계(Bcr-Abl-negative HL60 cells 및 Bcr-Abl-positive K562 cells)로부터 얻어진 각 RNA 시료(1 ㎍)의 중합효소 연쇄반응 증폭 후에, 상기에서 결정된 최적의 조건(즉, 25 ㎍/mL 산화 그래핀 및 6 mM MgCl2)을 사용하여 여기 파장 495 nm에서 FAM-표지된 프로브 DNA 형광 방출이 산화 그래핀의 첨가에 따라 스캔되었다. 방출 파장 517 nm에서 Bcr-Abl-포지티브 시료로부터 형광 방출은 Bcr-Abl-네거티브 시료의 형광 방출보다 5.3 배 더 높았다(도 15).
산화
그래핀의
최적 농도 조건 확인 및 중합효소 연쇄반응 진행에 따른 형광변화 관찰
산화 그래핀 첨가 후에 프로브 DNA의 형광 신호가 프로브 DNA로부터 형광단의 방출 때문인지 확인하기 위하여, FAM-표지된 프로브 DNA는 DNA-분해 효소, DNaseI와 혼합되었다. DNaseI에 의한 형광 프로브 DNA의 분해는 중합효소 연쇄반응에서 Taq 중합효소에 의한 5'→ 3' 엑소뉴클리아제 반응과 유사하다. 산화 그래핀이 FAM-표지된 프로브 DNA를 포함하는 용액에 첨가되면, 형광은 프로브 DNA의 산화 그래핀 시트로의 흡착 때문에 눈에 띄게 소광된다(97 %)(도 1a). 반면에, 산화 그래핀(25 ㎍/mL; 도 1)의 첨가 이전에 프로브 DNA가 DNaseI(0.2 U/μL)로 분해될 때 형광 회복이 관찰된다. 음성 대조군으로, 우혈청알부민(BSA)가 DNaseI 대신에 사용되었을 때, FAM-표지된 프로브 DNA의 형광이 혼합물에 산화 그래핀 첨가로 소광되었다.
다음으로, 중합효소 연쇄반응 혼합물에서 Bcr-Abl 돌연변이 유전자 앰플리콘 DNA의 축적을 반영하는 산화 그래핀-기반 분석에서 형광이 증가함을 입증하기 위하여 중합효소 연쇄반응 혼합물의 형광은 진전된 중합효소 연쇄반응 사이클로 측정되었다. 400 nM의 형광 프로브 DNA를 포함하는 중합효소 연쇄반응 혼합물 (25 μL)은 각 할당된 사이클의 끝에서 유전자 증폭장치로부터 제거되었다. 중합효소 연쇄반응 혼합물의 부분 표본(5 μL)은 산화 그래핀을 포함하는 반응 용액(25 ㎍/mL)으로 96-홈 플레이트에서 희석되었으며 형광은 멀티라벨 플레이트 리더(multilabel plate reader)를 사용하여 측정되었다. Bcr-Abl-네거티브 시료에서 프로브 DNA의 형광 신호는 중합효소 연쇄반응 사이클이 진행됨에 따라 강화되지 않는 반면에 Bcr-Abl-포지티브 시료로부터는 중합효소 연쇄반응이 지속됨에 따라 증가하였다(도 2). 겔 전기영동에 의해 분석된 중합효소 연쇄반응 산물과 함께 산화 그래핀-기반 시스템에서 형광 변화를 비교하기 위하여 각 중합효소 연쇄반응 산물은 2 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 용해되었다(도 2). Bcr-Abl-포지티브 시료의 존재 하에서, Bcr-Abl 앰플리콘의 기대되는 크기의 밴드(149 bp)가 관찰되었으며, 그 강도는 중합효소 연쇄반응 사이클이 진행되면서 증가하였다. 그래서, 산화 그래핀-기반 분석 시스템에서 산화 그래핀-기반 돌연변이 유전자 탐지 시스템의 감도를 확인하기 위하여, 증가하는 Bcr-Abl-포지티브 세포의 수 (102 에서 106 K562 세포)를 포함하는 일련의 세포 혼합물 및 고정된 양의 Bcr-Abl-네거티브 세포(1x106 HL60 세포)가 역전사-중합효소 연쇄반응을 위해 사용되었다. 형광 강도는 Bcr-Abl-포지티브 K562 세포의 밀도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하였으며, 이는 형광 및 세포 밀도 사이에 로그 스케일로 선형 관계가 있음을 보여주었다(도 3). 이 시스템을 사용하여 돌연변이 세포 탐지의 정량적인 감도를 평가하기 위하여, 검출 한계(LOD)가 계산되었으며, 1x106 HL60 세포에서 K562 세포는 8.7 카운트로 확인되었으며, 1 % 신뢰 수준으로 등식 LOD=3.3x(S.D./S)에 의해 얻어졌다(여기서, S.D.는 Y-절편에 대한 표준 편차; 184.3, S는 선형 곡선의 기울기; 647.3, LOD=로그 스케일에서 0.94). 이 LOD 값은 105 정상 세포에서 단일 돌연변이 백혈병 세포의 감도와 부합한다.
본 발명자들은 세포성 RNA의 시작량의 측면에서 산화 그래핀-기반의 돌연변이 유전자의 감도를 평가하였다. 중합효소 연쇄반응 주형으로 사용된 세포성 RNA의 양이 50 ng 부터 0.05 ng 으로 연속적으로 감소되며 시료는 Abl 유전자에 특이적인 FAM-표지된 형광 프로브 DNA의 존재 하에서 역전사-중합효소 연쇄반응의 대상이 된다. 각 반응 혼합물의 부분 시료는 산화 그래핀-포함 용액으로 96-홈 플레이트에서 이동되었다. 형광 강도가 측정되었고 초기 Bcr-Abl-포지티브 세포성 RNA 양에 대하여 그래프로 나타내었다(도 4). 형광 강도는 Bcr-Abl-포지티브 세포성 RNA의 양이 쌍곡선으로 증가하였으며 0.05-1.50 ng의 범우에서는 선형 관계가 관찰되었다(도 4). 돌연변이 RNA에 대한 검출 한계(LOD)가 Bcr-Abl-포지치브 세포성 RNA의 68 pg로 계산되었다(S.D.=14.01; S=609.6)
산화 그래핀-기반의 돌연변이 유전자 탐지 시스템의 신뢰도는 Bcr 유전자에서 상이한 절단점 부분에 의해만들어진 Bcr-Abl 융합 유전자의 다양한 접합 변종 유전자의 탐지를 위한 전략을 탐구하도록 한다(도 9). 융합 유전자에서 병치 영역에 특이적인 FAM-표지된 형광 DNA 프로브가 중합효소 연쇄반응에 첨가되었다(도 21). 프로브 DNA에 완전히 상보적인 타겟 접합 변종 유전자의 존재 하에, 프로브는 상보적인 접합 서열(즉, 도 21에 b3a2)에 어닐한다. 완전히 어닐된 DNA 프로브는 이후 중합효소 연쇄반응 증폭 도중에 Taq 중합 효소의 5'-뉴클리아제 활성에 의해 소화되어, FAM 형광단의 방출을 야기한다. 그래서, 방출된 FAM 형광단은 산화 그래핀 표면으로 흡착되지 않고 비소광 형광을 만든다. 반대로, 다른 유형의 접합 변종 유전자(즉, b2a2 또는 도 21의 다른 것)는 프로브 DNA가 부분적으로 어닐되도록 하거나 주형 DNA에 전혀 결합되지 않도록 한다. 부분적으로 어닐된 프로브는 5'-비상보적 DNA 꼬리가 첨부되어, 프로브 DNA의 조각을 방출하는 어닐된 부위의 길이와 관계없이 Taq 중합 효소에 의해 소화된다. 파편이 된 또는 소화되지 않은 DNA 프로브는 산화 그래핀으로 흡착되고, 형광의 소광을 야기한다.
다양한 접합 변종 유전자의 탐지에 대한 감도를 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 2 세트의 프라이머와 함께 2번의 연속적인 중합효소 연쇄반응을 수반하는 네스티드 중합효소 연쇄반응 기술을 사용하였다. 1차 중합효소 연쇄반응에서, 한 쌍의 프라이머가 타겟 DNA를 포함하는 외부 영역을 증폭시켰다. 이 첫 중합효소 연쇄반응 산물은 이후 두 번째 프라이머 쌍으로 타겟 DNA를 재증폭시키는 두 번째 네스티드 중합효소 연쇄반응에서 주형으로 사용된다(도 4). 각 접합 변종 유전자(b3a2, b2a2, e1a2)에 대해서, 1차 중합효소 연쇄반응 산물 및 2차 중합효소 연쇄반응 산물은 겔 전기영동에 의해 분석되었다(도 16, 도 17). 네스티드 중합효소 연쇄반응은 각 앰플리콘 DNA 밴드의 특이적인 축적을 보여 주었으며, 이는 1차 중합효소 연쇄반응 도중에 특유의 접합 변종 유전자로부터 증폭된 각각의 주형으로부터 증폭된 기대되는 크기와 상응한다.
본 발명자들은 96-홈 플레이트에서 광학 형광 이미지를 관찰하는 데 기초하여 접합 변종 유전자의 탐지를 용이하게 하는 탐지 전략을 적용하였다. 접합 변종 유전자(b3a2, b2a2, e1a2)를 하버링하는 백혈병 환자의 시료에서 얻은 상보적 DNA(cDNA)는 중합효소 연쇄반응 주형으로 사용되었다. 상이한 접합 부위 서열의 증폭 및 탐지를 위해 고안된 각 프라이머 세트 및 형광 프로브 DNA는 각각 중합효소 연쇄반응에 사용되었다(서열은 하기 표 1에 나열함). 네스티드 중합효소 연쇄반응 이후에, 실험 부분에 설명된 바와 같이, 중합효소 연쇄반응 산물 용액의 부분 시료는 산화 그래핀(25 ㎍/mL)을 포함하는 다중홈 플레이트로 이동되었으며, 다중홈 플레이트에서 형광 이미징 시스템을 사용하여 형광 강도가 시각하되었다(도 5). 강한 형광 신호가 선택적으로 중합효소 연쇄반응-증폭된 타겟 접합 변종 유전자를 함유하는 홈에서 관찰되었으며 상응하는 형광 프로브에 혼성되었다. 그러나, 맞지 않는 시료를 포함하는 다중홈 플레이트에서 형광은 산화 그래핀에 프로브 DNA가 흡착되기 때문에 소광되었다. 다중홈 플레이트에서 형광 이미지는 정량화되었으며 비교를 위해 3D 그래프로 나타내었다(도 6). 다중홈 플레이트에서 이러한 매우 선택적인 형광 이미지는 산화 그래핀-기반 중합효소 연쇄반응 탐지 분석이 단일 플레이트에서 b3a2, b2a2 및 e1a2 같은 다양한 접합 변종 유전자를 동시에 구별할 수 있음을 보여주었다.
이는 접합 변종 유전자와 함께 다수의 환자 시료(n=23)에서 맹검 시험을 사용하여 방법을 탐구하도록 한다. 미지의 접합 변종 유전자 유형의 환자 시료는 접합 변종 유전자의 산화 그래핀-기반의 중합효소 연쇄반응 탐지의 대상이 된다. 형광 이미지는 b3a2, b2a2 및 e1a2 접합 변종 유전자에 대한 정해진 프로브 세트가 수직선으로 배열된 96-홈 플레이트에서 각 접합 변종 유전자의 확인을 위해 시각화되었다(도 7). 광학 이미징은 명확하게 포지티브 및 네거티브 시료 간의 형광 신호의 차이를 보여주었다. 중요하게, 스크램블된 시료로부터 접합 변종 유전자의 동질성은 완전히 매치되었다. 이 결과는 상이한 접합 변종 유전자가 상이한 앰플리콘 크기의 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동에 의한 선택 가능한 분석과 동일하다(도 8). 또한, 산화 그래핀-기반의 접합 변종 유전자 탐지 시스템의 정량적 감도는 기존의 겔 전기영동 분석의 감도보다 우수한 것으로 관찰되었다(도 18, 도 19).
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.
실시예
1.
DNA
올리고뉴클레오타이드
및 산화
그래핀
본 발명에서 사용된 DNA 올리고뉴클레오타이드는 Cosmogenetech Inc. (서울, 대한민국)에서 구매하였으며 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)로 더 정제되었다. Bcr-Abl 유전자의 탐지를 위한 프라이머 및 Abl-특이적 형광 프로브 DNA(서열은 하기 표 1에 나열함)는 Europe Against Cancer (EAC) 프로그램 내에서 Bcr-Abl mRNA 정량을 위해 개발된 표준화된 프로토콜로부터 선택되었다. Bcr-Abl 접합 변종 유전자의 탐지를 위해서, 1차 중합효소 연쇄반응 도중에 사용된 프라이머는 H. G. Goh, J. Y. Hwang, S. H. Kim, Y. H. Lee, Y. L. Kim and D. W. Kim, Transl. Res., 2006, 148, 249; 에 기재된 것과 동일하게 사용되었다. 네스티드 중합효소 연쇄반응을 위한 프라이머 및 접합 서열에 특이적인 형광 DNA 프로브 세트는 Genbank 데이터베이스 (Bcr 유전자 서열에 대해 GenBank No. X02596.1, b3a2 접합 변종 유전자를 포함하는 Bcr-Abl 유전자 서열에 대해서 GenBank No. EU216071.1, b2a2 접합 변종 유전자에 대해서 GenBank No. AJ131467.1, 그리고 e1a2 접합 변종 유전자에 대해서 GenBank No. AF113911.1)에 따라서 고안되었다. 6-카복시플루오르세인(FAM)-표지된 프로브 DNA는 3' 말단에서 Taq 중합효소에 의한 DNA 합성 도중에 신장을 종결하기 위하여 인산으로 변형되었다(하기 표 1). 산화 그래핀(조각 크기: 0.5 ~ 5 μm, cat. #: HCGO-W-175) 는 Graphene Laboratories, Inc. (Ronkonkoma, NY, USA)로부터 구입하였다.
| Bcr-Abl 융합 유전자의 탐지 | |||
| 이름 | 서열(5'→3') | 산물 크기(bp) | |
| Bcr 센스 프라이머 | TCC GCT GAC CAT CAA CAA GGA(서열식별번호: 1) | 149 | |
| Abl 안티-센스 프라이머 | CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA(서열식별번호: 2) | ||
| Abl 프로브 | FAM-CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTGA-P(서열식별번호: 3) | ||
| 접합 변종 유전자의 탐지 | |||
| 이름 | 서열(5'→3') | 산물 크기(bp) | |
| 1차 중합효소 연쇄반응 | b3a2/b2a2 센스 프라이머 | GCT ACG GAG AGG CTG AAG AA(서열식별번호: 4) | 627/552 |
| b3a2/b2a2 안티센스 프라이머 | CGT GAT GTA GTT GCT TGG GA(서열식별번호: 5) | ||
| 1차 중합효소 연쇄반응 | e1a2 센스 프라이머 |
ACC GCA TGT TCC GGG ACA AAA G(서열식별번호: 6) | 483 |
| e1a2 안티센스 프라이머 | TGT TGA CTG GCG TGA TGT AGT TGC TTG G(서열식별번호: 7) | ||
| 2차(네스티드) 중합효소 연쇄반응 | b3a2/b2a2 센스 프라이머 | AGT GTT TCA GAA GCT TCT CCC TGA CA(서열식별번호: 8) | 236/161 |
| b3a2/b2a2 안티센스 프라이머 | TTC ACT CAG ACC CTG AGG CTC AAA GT(서열식별번호: 9) | ||
| b3a2 프로브 | FAM-TTA AGC AGA GTT CAA AAG CCC TTC AGC GGC-P(서열식별번호: 10) | ||
| b2a2 프로브 | FAM-CCA TCA ATA AGG AAG AAG CCC TTC AGC GGC-P(서열식별번호: 11) | ||
| 2차(네스티드) 중합효소 연쇄반응 | e1a2 센스 프라이머 |
CAG ATC TGG CCC AAC GAT GGC GA(서열식별번호: 12) | 277 |
| e1a2 안티센스 프라이머 |
TTT GGG CTT CAC ACC ATT CCC CAT TG(서열식별번호: 13) | ||
| e1a2 프로브 | FAM-TCC ATG GAG ACG CAG AAG CCC TTC AGC GGC-P(서열식별번호: 14) | ||
FAM: 6-카르복시플루오레세인
P: Taq 중합효소에 의한 가닥 신장을 멈추기 위한 3' 말단에서 인산화
실시예
2. 세포 배양 및 백혈병 환자 혈액 샘플링
인간 만성 골수성 백혈병 세포 라인 K562는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구매하였으며 Bcr-Abl-포지티브 세포 라인으로 사용되었다. 인간 전골수성 백혈병 세포 라인 HL60은 윤도영 교수(건국대학교, 서울, 대한민국)로부터 제공되었으며 Bcr-Abl-네거티브 세포 라인으로 사용되었다. 두 백혈병 세포 라인은 10 % 우태아혈청(WelGene, 대구, 대한민국), 1 % 항생제(100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신; Welgene, 대구, 대한민국)로 보충된 RPMI 1640 배양액(Hyclone, Logan, UT, USA), 5 % CO2, 37 ℃에서 배양되었다. 접합 변종 유전자(b3a2, b2a2, e1a2)를 갖는 Bcr-Abl(+) 백혈병 환자(n=23)로부터 추출된 혈액 시료는 대한민국의 국립암센터(고양시, 경기도, 대한민국)로부터 제공되었다. 본 연구에서 혈액 샘플링 및 이 물질의 추후의 사용은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 대한민국의 국립암센터의 윤리위원회로부터 승인되었다.
실시예
3.
RNA
추출 및
역전사
총 RNA는 Trizol® 용액(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)을 사용하여 용해된 K562 세포 및 HL60 세포로부터 추출되었다. 이 RNA에서, 1 ㎍이 PrimeScript™ 1st 가닥 cDNA 합성 키트(TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)로 역전사(RT)에 사용되었으며, M-MLV 역전사효소 반응은 제조자의 지시에 따라 수행되었다. RNA(3 mL 혈액 시료로부터 ca. 9 ㎍)는 제조자의 지시에 따라 QIAamp® RNA 혈액 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 골수 또는 백혈병 환자로부터 추출된 말초혈액 시료로부터 추출되었다. 30 μL 부피에서 얻어진 총 RNA에서, 10 μL(ca. 3 ㎍) RNA는 100 U M-MLV 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 를 사용하여 20 μL의 부피, 37 ℃에서 60분 간 역전사에 의하여 cDNA를 합성하기 위해 사용되었다.
실시예
4. 중합효소 연쇄반응 증폭
1) Bcr-Abl 융합 유전자의 탐지를 위하여, 2 μL의 합성된 cDNA(세포성 RNA 100 ng과 동일)는 중합효소 연쇄반응 증폭에서 주형으로 사용되었다. 모든 중합효소 연쇄반응은 Ex Taq® 중합 효소 (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) 2.5 U 및 0.2 mM dNTP, 1× Ex Taq® 완충액, 각 프라이머 200 nM, 그리고 형광 프로브 400 nM 를 포함하는 25 μL 반응 부피에서 수행되었다. 중합효소 연쇄반응 증폭은 하기 사이클링 조건에서 수행되었다: 95 ℃ 에서 3 분간 전변성, 이후 각각 95 ℃에서 30 초간, 60 ℃에서 30 초간 그리고 72 ℃에서 30 초간, 그리고 마지막 단계로 72 ℃에서 5 분.
2) Bcr-Abl 접합 변종 유전자의 탐지를 위하여, Bcr-Abl 접합 변종 유전자의 중합효소 연쇄반응-기반 탐지가 사소한 변형을 거쳐 Bcr-Abl 유전자의 탐지에 사용된 것과 동일한 조건 하에서 수행되었다. cDNA(0.5 μL; 환자 시료로부터 RNA 75 ng 과 동일)가 제시된 프라이머와 함께 1차 중합효소 연쇄반응에 대한 주형으로 사용되었다; b3a2 및 b2a2에 대한 400 nM의 프라이머, e1a2에 대한 100 nM의 프라이머. 1차 중합효소 연쇄반응 이후에, 증폭된 중합효소 연쇄반응 산물은 1:1,000으로 희석되었으며 2차 (네스티드) 중합효소 연쇄반응 주형으로 사용되었다. 2차 중합효소 연쇄반응 은 각 프라이머 200 nM, 및 b3a2 및 b2a2 증폭을 위한 400 nM 형광 프로브, 각 프라이머 100 nM 및 e1a2 증폭을 위한 200 nM 형광 프로브를 포함했다. 1차 중합효소 연쇄반응 앰플리콘 DNA 밴드의 크기는 하기와 같다: b3a2에 대해 627 bp; b2a2에 대해 552 bp, e1a2에 대해 483 bp. 네스티드 중합효소 연쇄반응에 의해 얻어진 앰플리콘의 크기는 하기와 같다: b3a2에 대해 236 bp; b2a2에 대해 161 bp, e1a2 에 대해 277 bp (도 16, 17).
실시예
5. 겔 전기영동
중합효소 연쇄반응 산물은 2 % 아가로스 겔에서 전기영동되었다; 밴드는 ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 시각화되었으며, 밴드의 밀도는 Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 반-정량되었다.
실시예
6. 원자력 현미경(
atomic
force
microscopy
,
AFM
) 측정
AFM 이미지는 NanoScope V controller (Bruker Multimode 8, Bruker AXS Inc., Madison, WI, USA)와 함께 원자력 현미경을 사용하여 용수철 상수 40 N/m의 태핑 모드 및 선단 반경(tip radius) ≤ 8 nm, 실온에서 얻어졌다. 10 μL의 산화그래핀 용액(10 ㎍/mL)이 시료에 첨가되었으며, 시료는 Piranha 세척 방법을 사용하여 갓 세척된 실리콘 웨이퍼에 놓여졌다. 시료는 이후 실온에서 건조되었다. 스캐닝 속도는 선주파수 1.0 Hz였고, 원(original) 이미지는 256 x 256 픽셀의 해상도로 샘플되었다.
실시예
7. 분광형광분석(
Spectrofluorometric
analysis
)
FAM-표지된 프로브(최종 농도 40 nM)는 산화 그래핀 완충 용액(10 mM Tris-HCl [pH 7.0], 50 mM KCl, 6 mM MgCl2)을 포함하는 1 mL 반응 용액으로 희석되었다. 반응 용액의 방출 형광 스펙트럼은 506 nm 부터 660 nm 까지 분광형광광도계(model RF-53-1PC; Shimadzu Inc., Kyoto, Japan)를 사용하여 여기 상태, 495 nm 에서 스캔되었다. 형광 프로브 및 1x산화 그래핀 완충 용액을 포함하는 반응 용액에 산화 그래핀(최종 농도 25 ㎍/mL)을 첨가한 후에 방출 스펙트럼 변화가 스캔되었다. 프로브 DNA를 분해(digest)시키기 위해서, 형광 프로브는 37 ℃에서 30분간 DNaseI 반응 완충 용액(40 mM Tris-HCl [pH 7.5], 8 mM MgCl2, 5 mM DTT) 내에서 DNaseI(0.2 U/μL)와 함께 배양되었다. 음성 대조군으로, BSA의 동일한 부피가 DNaseI 대신에 사용되었다. Bcr-Abl-네거티브 시료로부터 얻어진 중합효소 연쇄반응 산물과 Bcr-Abl-포지티브 시료로부터 얻어진 중합효소 연쇄반응 산물 간의 방출 스펙트럼의 차이를 확인하기 위하여, 상기에 언급된 Bcr-Abl 중합효소 연쇄반응 혼합물(1 mL에서 40 nM 형광 프로브 DNA를 하버링) 및 산화 그래핀 완충 용액 내에 산화 그래핀(25 ㎍/mL)을 함유하는 용액 (1 mL)의 방출 스펙트럼 가 분광형광광도계(model RF-53-1PC)에 의하여 여기 상태, 495 nm에서 스캔되었다.
실시예
8. 96-홈 플레이트에서 산화
그래핀
-기반 형광분석법(
GO
-
based
fluorometric
assay
in
a 96-
well
plate
)
5 μL 부분 표본이 400 nM의 형광 프로브 DNA를 포함하는 중합효소 연쇄반응 산물(25 μL)로부터 얻어졌으며, 이는 96-홈 플레이트(SPL Life Sciences Inc., Gyeonggi-do, Korea)에서 산화 그래핀 완충 용액(10 mM Tris-HCl [pH 7.0], 50 mM KCl, 6 mM MgCl2) 및 산화 그래핀(25 ㎍/mL)을 포함하는 반응 용액(45 μL)에 첨가되었다. 반응 혼합물은 15분간 실온에서 배양되었으며, 반응 혼합물의 형광 강도는 다중-라벨 플레이트 리더기(VICTOR X3®; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 535 nm 에서 고정된 필더 휠을 통하여 측정되었다. 96-홈 플레이트(SPL Life Sciences, 경기도, 대한민국)에서 형광 이미지는 형광 이미징 시스템(IVIS-LuminaII; Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 얻어졌다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp
<120> METHOD FOR DETECTING SPLICE VARIANTS OF BCR-ABL FUSION GENE AND
PCR COMPOSITION FOR DETECTING THEREOF
<130> HY150036
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
tccgctgacc atcaacaagg a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
cactcagacc ctgaggctca a 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 3
cccttcagcg gccagtagca tctga 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gctacggaga ggctgaagaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cgtgatgtag ttgcttggga 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
accgcatgtt ccgggacaaa ag 22
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
tgttgactgg cgtgatgtag ttgcttgg 28
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
agtgtttcag aagcttctcc ctgaca 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ttcactcaga ccctgaggct caaagt 26
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 10
ttaagcagag ttcaaaagcc cttcagcggc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 11
ccatcaataa ggaagaagcc cttcagcggc 30
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
cagatctggc ccaacgatgg cga 23
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tttgggcttc acaccattcc ccattg 26
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 14
tccatggaga cgcagaagcc cttcagcggc 30
Claims (15)
- a) Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자(splice variant)의 염기 서열에 특이적으로 상보적 결합하는 프로브 DNA를 제작하고 이의 5' 말단에 형광물질을 접합시키고 3'말단에서 인산화시킨 형광 프로브 DNA를 제작하는 단계;
b) 상기 표적 접합 변종 유전자의 염기 서열을 포함하는 주형 DNA에 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍, 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍 및 DNA 중합효소를 첨가하여 네스티드(nested) 중합 효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
c) 네스티드 중합 효소 연쇄반응 산물에 산화 그래핀(Graphene oxide, GO)을 첨가하는 단계;
를 포함하고, 상기 (c) 단계 이후에 상기 형광 프로브 DNA가 상기 주형 DNA에 결합할 경우 형광 신호는 검출되고, 주형 DNA가 아닌 다른 DNA에 결합할 경우 형광신호는 검출되지 않고,
상기 b) 단계의 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 4 및 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 5 및 7의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 8 및 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 9 및 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 프로브 DNA는 서열번호 10, 11 및 14의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 b) 단계의 주형 DNA는 만성 백혈병 유래인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 접합 변종 유전자는 b3a2, b2a2 및 e1a2로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출 방법. - Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자의 염기 서열에 특이적으로 상보적 결합하는 프로브 DNA를 제작하고 이의 5'말단에 형광물질을 접합시키고 3'말단에서 인산화시켜 제조한 형광 프로브 DNA; 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍; 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍; Taq DNA 중합효소; 및 산화 그래핀을 포함하는 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물.
- 청구항 9에 있어서,
상기 형광물질은 6-카르복시플루오레세인(6-FAM)인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물. - 삭제
- 청구항 9에 있어서,
상기 1차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 4 및 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 5 및 7의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물. - 청구항 9에 있어서,
상기 2차 중합 효소 연쇄반응용 프라이머쌍은 서열번호 8 및 12의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 및 서열번호 9 및 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물. - 청구항 9에 있어서,
상기 프로브 DNA는 서열번호 10, 11 및 14의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물. - 청구항 9에 있어서,
상기 접합 변종 유전자는 b3a2, b2a2 및 e1a2로 이루어진 군에서 선택된 1종인 Bcr-Abl 융합 유전자의 표적 접합 변종 유전자 검출용 중합효소 연쇄반응 조성물.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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-
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Non-Patent Citations (2)
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| Chin. Sci. Bull., Vol. 58, No. 21, pp. 2634-2639 (2012.12.26.) |
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