CN117625748A - 一种检测基因序列中单核苷酸多态性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，涉及分析化学技术领域。本发明的检测方法识别元件采用的是与突变基因对应的核酸序列，通过设计双碱基对错配来识别突变目标物，实现了无酶体系下的单碱基突变识别；本发明的检测方法不需要酶的参与，设计巧妙，方便快捷；本发明的检测方法引入了磁珠，通过磁吸可以实现降低空白、去除干扰物，特异性更强；本发明的检测方法利用荧光基团的荧光共振能量转移作为显色原理，体系稳定，受外界环境干扰较小；本发明的检测方法亦可提供一种用于单核苷酸多态性检测的无酶传感体系设计思路，通过目标物识别序列及辅助探针序列，即可实现其他突变位点的检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及基于双碱基对错配策略的竞争性链置换反应生物传感技术，具体涉及一种检测基因序列中单核苷酸多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多样性，其数量很多，多态性丰富，是人类基因组中最常见的遗传变异形式之一。由于SNP引起的基因组差异是导致人类表型差异和耐药性差异以及相关疾病发生的诱导因素，而这些基因组中的罕见碱基突变的高选择性和高灵敏度检测对于早期诊断、预防、药物开发等至关重要，因此，SNP不仅可以作为定位靶基因的高分辨率生物标志物，而且可以作为识别高危人群、检测疾病相关基因和设计药物的强大生物标志物，在疾病易感性和个体对治疗的反应中起着重要作用。如果SNP变化能够被主动感知，医生就有可能实现对相关疾病的早期发现和准确诊断，并有针对性地采取措施。随着研究者对基因组功能认识的不断深入，SNP正在成为新一代的生物标志物和治疗靶点，需要有效、灵敏的方法进行检测和量化。
近年来，基于DNA的非酶生物传感器因其低成本的DNA合成和纯化、优越的可编程性和良好的生物相容性等优点，在生物检测领域受到广泛关注。DNA作为一种替代蛋白酶的生物分子工程建筑材料正受到越来越多的关注。目前，脚趾链介导的链置换(toeholdmediated strand displacement，TMSD)反应已成为构建DNA或RNA序列检测的无酶检测体系的一种相对成熟的技术。其基本原理是利用精心设计的脚趾结构域，将目标DNA与暴露在外的双链DNA的脚趾结构域结合，然后触发链置换反应，释放互补的单链DNA。TMSD具有常温、无酶反应的特点，可以通过调节脚趾结构域长度和序列组成来调节反应动力学速率，是一种良好的无酶序列识别和转化技术。基于脚趾链介导的链置换技术目前主要应用于DNA或RNA序列的检测，受限于TMSD对于相同序列中单碱基差异低的分辨率，因此利用TMSD检测DNA或者RNA序列中单碱基突变的方法较少，仍有待进一步开发。
在基于DNA的反应中，催化发夹自组装(CHA)是一种由两个互补DNA发夹和一个入侵的寡核苷酸组成的系统。本质上，CHA反应由单链催化链引发，导致两个发夹通过分支迁移连续打开。这个过程导致热力学稳定的双相体的形成。值得注意的是，释放的催化链可以催化进一步的发夹杂交，使CHA反应的自主操作成为可能。由于自由能驱动和无酶等温特性，CHA策略的分析应用已经得到了广泛的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于双碱基错配的无酶识别单碱基突变序列的方法，以实现溶液中单核苷酸碱基突变的简易灵敏检测。
本发明旨在创造性地将一种新的双碱基对错配策略、催化发夹组装(CHA)、荧光共振能量转移(FRET)相结合，该策略能够在无酶条件下特异性识别DNA序列中的单碱基错配，因此可以用于检测基因序列中单核苷酸多态性。该策略基于竞争性链置换反应机制，受热力学稳定性的影响，该热力学稳定性源于合理设计的双碱基对错配，用于特异性识别突变型DNA。该策略可以解决现有检测技术的一些缺陷，并且创造性的提出双碱基对错配策略，实现了基因序列中的单核苷酸多态性的高灵敏度与高特异性检测。
为了实现上述目的，本发明的所述的检测方法包括以下步骤：
(1)将一端具有脚趾链结构的捕获探针CP与磁珠SMB偶联获得SMB-CP复合物；
(2)将辅助探针SP与所述SMB-CP复合物共孵育获得SMB-CP-SP复合物，所述辅助探针SP与捕获探针CP脚趾链结构之外的部分序列互补结合；
(3)在步骤(2)中获得的SMB-CP-SP复合物中加入待测样品，待测样品中的目标DNA与CP的脚趾链结构结合发生脚趾链介导的链置换反应，使目标DNA结合到SMB-CP复合物并解离出辅助探针SP，磁吸后取上清液；
(4)将步骤(3)中得到的上清液与发夹DNA链H1和发夹DNA链H2共同孵育，辅助探针SP与发夹DNA链H1杂交打开其发夹结构，打开的发夹DNA链H1与发夹DNA链H2杂交形成H1-H2双链体并释放辅助探针SP，孵育后，再加入量子点QD进行孵育得到混合溶液，其中，发夹DNA链H1和发夹DNA链H2中的至少一个的一端与量子点QD之间设有在孵育后能发生偶联的偶联单元；另一个发夹靠近量子点QD的一端修饰有能与量子点QD形成荧光共振能量转移的荧光基团；
(5)检测步骤(4)中混合溶液的荧光强度，得出待测样品中突变序列的具体浓度。
对于突变KRAS基因检测，在1×10-1-106fM的待测样本(MT)浓度范围内实现了线性关系：y＝-0.00465+0.02916x(R2＝0.997)，其中y是Cy5/QD光致发光强度比，x是MT浓度的对数。
优选的，所述捕获探针CP序列为与KRAS基因突变互补的序列，所述KRAS基因突变序列为：5’-CTACGCCATCAGCTCC-3’；
所述捕获探针CP的序列从5’端到3’端依次包括过渡序列、脚趾链结构序列和捕获序列；所述过渡序列为3-12个碱基的随机序列；所述脚趾链结构序列：5’-GGAGCTGA-3’；所述捕获序列为：5’-TAGCGTAGGCAAG-3；所述辅助探针SP的序列：5’-GACGTGACTTGCCTACGCTA-3；
所述发夹DNA链H1的序列：5’-CTTGCCTACGCTAGAGCTTGCGATAGTAGCGTAGGCAAGTCACGTC-3；
所述发夹DNA链H2的序列：5’-GAGCTTGCGATAGGACTTGCCTACGCTACTATCGCAAGCTCTAGCGTAG-3’。
所有核酸链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，采用HPLC方法纯化。
优选的，步骤(1)中所述磁珠SMB的尺寸为100～1000nm，浓度为1～10mg/mL；所述捕获探针CP的浓度为1～5μM；偶联孵育时间为20～60min。
步骤(1)中，捕获探针CP与磁珠偶联的方式很多，本发明实施例中选择将捕获探针CP生物素修饰，磁珠进行链霉亲和素修饰，之后进行偶联孵育。
优选的，步骤(2)中在共孵育时，即在分子杂交时，所述捕获探针CP与所述辅助探针SP的分子摩尔比为1∶1；共孵育的条件为：在25～35℃孵育30～60min，可以保证DNA双链充分杂交。
具体的，步骤(3)中加入待测样品后在25～35℃孵育30～60min。
优选的，步骤(4)中，所述发夹DNA链H1与发夹DNA链H2分别在95℃下退火5min，并冷却至25℃；
发夹DNA链H1与发夹DNA链H2的分子摩尔比为1∶1；
将上清液与发夹DNA链H1和发夹DNA链H2在25℃下孵育15～45min；
加入量子点QD后在40℃下孵育15～45min。所述量子点QD为QdotTM605链霉亲和素偶联物(80μL，2nM)。
优选的，步骤(5)中所述荧光光谱仪的测试波长为量子点QD和发夹DNA链H1或发夹DNA链H2上修饰的荧光基团对应的发射波长。在本发明实施例中使用Cy5荧光基团，使用荧光光谱仪测量Cy5/QD光致发光强度的波长为605nm和670nm。
另一方面，本发明还提供了一种检测基因序列中单核苷酸多态性的试剂盒，包括SMB-CP-SP复合物、发夹DNA链H1、发夹DNA链H2和量子点QD；
所述SMB-CP-SP复合物的制备方法为：
S1、将一端具有脚趾链结构的捕获探针CP与磁珠SMB偶联获得SMB-CP复合物；
S2、将辅助探针SP与所述SMB-CP复合物共孵育获得SMB-CP-SP复合物，所述辅助探针SP与捕获探针CP脚趾链结构之外的部分序列互补结合。
优选的，所述捕获探针CP序列为与KRAS基因突变互补的序列，所述KRAS基因突变序列为：5’-CTACGCCATCAGCTCC-3’；
所述捕获探针CP的序列从5’端到3’端依次包括过渡序列、脚趾链结构序列和捕获序列；所述过渡序列为3-12个碱基的随机序列；所述脚趾链结构序列：5’-GGAGCTGA-3’；所述捕获序列为：5’-TAGCGTAGGCAAG-3’。
所述辅助探针SP的序列：5’-GACGTGACTTGCCTACGCTA-3’；所述发夹DNA链H1的序列：5’-CTTGCCTACGCTAGAGCTTGCGATAGTAGCGTAGGCAAGTCACGTC-3；
所述发夹DNA链H2的序列：
5’-GAGCTTGCGATAGGACTTGCCTACGCTACTATCGCAAGCTCTAGCGTAG-3’。
本发明的技术方案所涉及的原理是：如图1A和1B所示，DNA单链结合TMSD反应启动对突变产物的识别，创新性地提出双碱基错配作为开关，同时巧妙地设计CHA放大反应信号，从而有效地提高了灵敏度，此外，结合Cy5-QD介导的FRET效应可以将转化的荧光信号稳定的输出。
因此，本发明首先将含有CP和SP的双链复合物通过链霉亲和素-生物素相互作用紧密锚定在磁珠(SMB)表面，以增加其局部浓度，这可以为链置换反应提供强大的驱动力。双链复合体中存在一个暴露的粘性末端，即脚趾结构域，有利于目标DNA入侵并触发链置换反应释放SP。为了动态和选择性地控制链置换，在双链结合区域故意引入额外的碱基对错配，以减弱链置换反应的竞争力。如图1A所示，当双链复合物与野生型目标物共孵育时，由于CP与野生型目标物存在双碱基错配致使杂交呈现热力学不利状态从而抑制了链置换反应发生；当双链复合物与突变型目标物共孵育时，由于CP与突变型目标物仅存在一个碱基错配不影响链置换反应进行。随后，链置换反应产生的SP接着与H1杂交以打开其发夹结构。打开的H1与H2杂交，导致H1-H2双链体形成和CP的释放。随后，释放的CP开始H1和H2之间杂交的下一个周期，导致信号扩增。添加链霉亲和素修饰的QDs后，扩增的H1-H2双链体被QD表面吸附，触发QD与Cy5之间的FRET信号。相反，WT(野生型序列)阻断了链置换反应，保持了CP-SP双链的完整性，抑制了CHA反应。
与现有检测方法相比，本发明具有以下有益技术效果：
1)本发明的检测方法识别元件采用的是与突变基因对应的核酸序列，通过设计双碱基对错配来识别突变目标物，实现了无酶体系下的单碱基突变识别；
2)本发明的检测方法不需要酶的参与，设计巧妙，方便快捷；
3)本发明的检测方法引入了磁珠，通过磁吸可以实现降低空白、去除干扰物，特异性更强；
4)本发明的检测方法利用荧光基团的荧光共振能量转移作为显色原理，体系稳定，受外界环境干扰较小；
5)本发明的检测方法亦可提供一种用于单核苷酸多态性检测的无酶传感体系设计思路，通过目标物识别序列及辅助探针序列，即可实现其他突变位点的检测。
附图说明
图1为本发明检测单碱基突变的生物传感方法的原理示意图，其中，A为链置换反应发生和抑制原理图，B为检测单碱基突变的生物传感方法的原理示意图。
图2为本发明实施例中突变型序列和野生型序列检测原理验证的荧光光谱图。
图3为本发明实施例中突变型序列和野生型序列检测原理验证的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4为本发明实施例中不同TMSD反应时间下突变型序列与野生型序列DF比值变化图。
图5为本发明实施例中不同TMSD反应温度下突变型序列与野生型序列DF比值变化图。
图6为本发明实施例中不同CHA反应温度下突变型序列与野生型序列DF壁纸变化图。
图7为本发明实施例中不同CHA反应时间下突变型序列与野生型序列DF比值变化图。
图8为本发明实施例中加入量子点后不同反应时间下突变型序列与野生型序列DF比值变化图。
图9为本发明实施例中加入不同浓度量子点后突变型序列与野生型序列DF比值变化图。
图10为本发明实施例所得不同浓度的KARS基因SNP检测的荧光光谱图。
图11为本发明实施例所得KARS基因SNP检测的标准曲线图。
图12为本发明的实施例中不同细胞系KRAS基因突变水平的差异。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特别说明，本发明实施例中使用药品及试剂均来源为正规而易购渠道。其中，所有核酸链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并进行相应修饰，具体序列如下：
KRAS基因突变序列MT(5’-3’)：CTACGCCATCAGCTCC，
KRAS基因野生序列WT(5’-3’)：CTACGCCACCAGCTCC，
捕获探针序列CP(5’-3’)：Biotin’-TTTTTTTTTGGAGCTGATAGCGTAGGCAAG，
辅助探针序列SP(5’-3’)：GACGTGACTTGCCTACGCTA，
发夹DNA链序列H1(5’-3’)：Biotin’-CTTGCCTACGCTAGAGCTTGCGATAGTAGCGTAGGCAAGTCACGTC，
发夹DNA链序列H2(5’-3’)：GAGCTTGCGATAGGACTTGCCTACGCTACTATCGCAAGCTCTAGCGTAG-Cy5’。
图1为本发明检测单碱基突变的生物传感方法的原理示意图。
实施例1：SNP检测的生物传感体系构建
1)取浓度为10mg/mL，尺寸为200nm的链霉亲和素磁珠10μL，磁吸，弃去上清液，加入100μL PBST溶液，混匀，磁吸，弃去上清液，重复三次，弃去上清液，磁珠备用；
2)取4μL 100μM捕获探针链CP，加入到96μL PBST溶液中，混合均匀，加入到步骤1)中制备的链霉亲和素磁珠中，室温震荡孵育30min，磁吸，弃去上清液，加入100μL PBST溶液，混匀，磁吸，弃去上清液，重复三次，弃去上清液，得到磁珠-CP复合物备用；
3)取4μL 100μM的辅助探针SP，加入到96μL PBST溶液中，混合均匀，加入到步骤2)中制备的磁珠-CP复合物中，室温震荡孵育30min，磁吸，弃去上清液，加入100μL PBST溶液，混匀，磁吸，弃去上清液，重复三次，弃去上清液，得到磁珠-CP-SP复合物备用；
4)取一定量3)中的磁珠-捕获链CP-辅助探针混合复合物，加入待测溶液，室温震荡孵育30min；磁吸，保留上清液，弃去磁珠。
5)发夹探针H1的序列与发夹探针H2先分别取1μM在95℃下退火5min，并冷却至25℃以供进一步使用。将4)中链置换产物的上清液与5μL H1(1μM)5μL H2(1μM)在25℃下孵育1h。再加入QdotTM 605链霉亲和素偶联物(80μL，2nM，Thermo Fisher Scientific，货号：Q10101MP)在40℃下孵育30min，得到稳定的溶液体系用于检测。
实施例2：检测原理验证
取实施例1中步骤5)中制备好的磁珠-捕获链CP-辅助探针复合体系150μL，均分到三个离心管中，每管50μL；在三管中分别加入100μL PBST、100μL突变DNA链溶液、100μL野生DNA链溶液，混合均匀，孵育30min后，磁吸，取上清液到新的离心管中，每管再分别加入发卡链H1与H2，室温震荡孵育1h，再加入链霉亲和素包裹的605QDs(80μL，2nM)在40℃下孵育30min，得到的溶液测荧光光谱。
由图2可以看出，同等条件下，突变型序列样品加入到体系中，FRET效果明显，说明待测样品含有突变序列时，触发了TMSD反应，置换出的大量辅助探针SP随即开启CHA循环，最终与量子点QDs引起FRET效应，Cy5荧光基团信号被大量检测到，而野生型序列的溶液只能检测到QDs的信号。
将5μL样品和2μL DNA上样缓冲液的混合物加载到12％聚丙烯酰胺凝胶上，将10μL样品和4μL DNA上样缓冲液的混合物加载到1％琼脂糖凝胶上，分别在110V下运行45min。腔内充满缓冲溶液(2mm EDTA，89mM Tris-Borate，pH 8.3)。凝胶用GelRed染料(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)染色30min，用荧光化学发光凝胶成像系统成像。
如图3A所示，可以清晰地观察到CP(泳道1)、SP(泳道2)、MT(泳道3)和WT(泳道4)的条带。MT的存在导致与双链复合物(泳道7)孵育后产生新的条带，这表明MT作为入侵链引发了链置换。相比之下，通道6没有观察到明显的条带，证实了WT不能从双链复合物中置换SP。如图3B所示，泳道1-5分别代表CP、SP、MT、H1和H2。WT和MT在基于磁珠的TMSD反应平台上孵育后，上清液进行磁分离和电泳分析。泳道7出现明显的SP条带，而泳道6未见类似条带，证明了TMSD反应对WT和MT识别的特异性。当H1和H2混合在室温下孵育30min时，没有出现新的条带(泳道8)，表明两者之间没有相互作用。同时，将TMSD分别与MT和WT反应后磁分离上清液与H1和H2混合物孵育，可以看到，MT反应后的混合物上清液可以激活CHA(泳道10)，表明CHA确实被MT触发链置换反应替换的SP激活。相比之下，WT反应后的混合物上清液未能激活CHA，系统中仍有大量的H1和H2稳定存在(泳道9)。
实施例3：检测条件中目标物进行TMSD反应时间的优化
此处为了方便优化与检测，所用辅助探针SP添加FAM荧光基团测试，12个试管中每管捕获探针4μL CP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，分别加入野生与突变的目标物溶液(100nM)，室温震荡孵育后，磁吸，取上清液测FAM荧光强度。
设计检测体系中每组目标物进行TMSD反应时间(10、20、30、40、50、60min)，分别记录不同TMSD孵育时间下FAM光致发光强度比值变化，表示由目标物触发的TMSD反应产生的荧光信号，比值越大，表示实验现象越明显，即检测条件最优。
如图4所示，随着检测体系中TMSD反应时间的增加，DF先增大后减小，说明反应时间过短或过长会导致检测结果不明显，TMSD最佳反应时间为30min。
实施例4：检测条件中目标物进行TMSD反应温度的优化
此处为了方便优化与检测，所用辅助探针SP添加FAM荧光基团测试，12个试管中每管捕获探针4μL CP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，分别加入野生与突变的目标物溶液(100nM)，室温震荡孵育后，磁吸，取上清液测FAM荧光强度。
设计检测体系中每组目标物进行TMSD反应温度(10、20、30、40、50、60min)，分别记录不同TMSD孵育温度下FAM光致发光强度比值变化，表示由目标物触发的TMSD反应产生的荧光信号，比值越大，表示实验现象越明显，即检测条件最优。
如图5所示，随着检测体系中TMSD反应时间的增加，DF先缓慢增大到达一定值后减小，说明反应温度过低或过高会导致检测结果不明显，TMSD最佳反应时间为40℃。
实施例5：检测条件中加入发夹链后反应温度的优化
12个试管分为6组，其中每管捕获探针4μLCP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，每组分别加入突变目标物和野生目标物(100nM)室温震荡孵育30min后，磁吸取上清液。在上清液中。发夹探针H1的序列与发夹探针H2先分别取1μM在95℃下退火5min，并冷却至25℃以供进一步使用。将磁吸后的上清液与5μL H1(1μM)5μL H2(1μM)在不同温度下孵育1h。再加入链霉亲和素包裹的605QDs(80μL，2nM)在40℃下孵育30min，得到稳定的溶液体系测定605nm和670nm的荧光光谱。
设计检测体系中加入发夹链H1和H2后的反应温度分别为20、25、30、35、40、45℃，使用荧光光谱仪测量Cy5/QD光致发光强度比值，分别记录不同反应温度比值变化，比值越大，表示FRET效应越明显，即检测条件最优。
如图6所示，随着检测体系中加入发夹链后反应温度的增加，Cy5/QD光致发光强度比值先增大后减小，最佳的孵育温度为40℃。
实施例6：检测条件中加入发夹链后反应时间的优化
12个试管分为6组，其中每管捕获探针4μL CP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，每组分别加入突变目标物和野生目标物(100nM)室温震荡孵育30min后，磁吸取上清液。在上清液中。发夹探针H1的序列与发夹探针H2先分别取1μM在95℃下退火5min，并冷却至25℃以供进一步使用。将磁吸后的上清液与5μL H1(1μM)5μL H2(1μM)在40℃下孵育不同时间。再加入链霉亲和素包裹的605QDs(80μL，2nM)在40℃下孵育30min，得到稳定的溶液体系测定605nm和670nm的荧光光谱。
设计检测体系中加入发夹链H1和H2后的反应时间分别为30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，使用荧光光谱仪测量Cy5/QD光致发光强度比值，分别记录不同反应温度比值变化，比值越大，表示FRET效应越明显，即检测条件最优。
如图7所示，随着检测体系中加入发夹链后反应时间的增加，Cy5/QD光致发光强度比值最大时为1h，所以最佳的孵育时间为1h。
实施例7：检测条件中加入量子点FRET反应的时间优化
12个试管分为6组，其中每管捕获探针4μL CP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，每组分别加入突变目标物和野生目标物(100nM)室温震荡孵育30min后，磁吸取上清液。在上清液中。发夹探针H1的序列与发夹探针H2先分别取1μM在95℃下退火5min，并冷却至25℃以供进一步使用。将磁吸后的上清液与5μL H1(1μM)5μL H2(1μM)在40℃下孵育1h。再加入链霉亲和素包裹的605QDs(80μL，2nM)在40℃下孵育不同时间，得到稳定的溶液体系测定605nm和670nm的荧光光谱。
设计检测体系中加入量子点QD后的反应时间分别为10、15、20、25、30、35，使用荧光光谱仪测量Cy5/QD光致发光强度比值，分别记录不同反应时间比值变化，比值越大，表示FRET效应越明显，即检测条件最优。
如图8所示，随着检测体系中加入QD后反应时间的增加，Cy5/QD光致发光强度比值最大时为30min，所以最佳的孵育时间为30min。
实施例8：检测条件中加入量子点的浓度优化
12个试管分为6组，其中每管捕获探针4μL CP(10μM)、10μL SMB和96μL 1×PBST，使用室温25℃孵育半小时后，每组分别加入突变目标物和野生目标物(100nM)室温震荡孵育30min后，磁吸取上清液。在上清液中。发夹探针H1的序列与发夹探针H2先分别取1μM在95℃下退火5min，并冷却至25℃以供进一步使用。将磁吸后的上清液与5μL H1(1μM)5μL H2(1μM)在40℃下孵育1h。再加入链霉亲和素包裹的不同浓度的605QDs在40℃下孵育30min，得到稳定的溶液体系测定605nm和670nm的荧光光谱。
设计检测体系中加入量子点QD浓度与发夹H1浓度比例分别为：1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50，使用荧光光谱仪测量Cy5/QD光致发光强度比值，分别记录不同浓度的比值变化，比值越大，表示FRET效应越明显，即检测条件最优。
如图9所示，随着检测体系中加入QD后反应时间的增加，Cy5/QD光致发光强度比值最大时为1∶30，所以取与发夹H1浓度比例1∶30时最佳。
实施例9：标准曲线的建立
按照实施例3～8中优化的检测条件，配制不同浓度的KRAS基因突变序列溶液(0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、1000pM)，利用本发明的生物传感器进行检测。用荧光分光光度计记录每个浓度下的荧光光谱。
如图10、11所示，可得，在一定的浓度范围内，随着突变序列浓度的增加，Cy5/QD光致发光强度比增加；在1×10-1-106fM的MT浓度范围内实现了线性关系：y＝-0.00465+0.02916x(R2＝0.997)，其中y是Cy5/QD光致发光强度比，x是MT浓度的对数。MT的检测限为4.3fM。
实施例10：真实样本检测
取对数生长期细胞(人胰腺癌细胞PANC-1、人非小细胞肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞HCT-116、人肾上皮细胞293T)10000个，根据DNA Kit细胞/组织DNA提取试剂盒(翌圣生物，货号：18700ES70)、/>(翌圣生物，货号：12907ES24)操作说明书对细胞中DNA进行提取、纯化并进行碎片化后备用。
根据上述优化后的检测方法对碎片后的样本溶液进行检测。每个样本重复三次。用荧光光谱仪记录每个样本的荧光光谱。
如图12所示，这五种细胞系在KRAS基因中表现出不同的突变表达水平。与其他肿瘤细胞相比，PANC-1细胞突变KRAS基因表达量较高，而正常的293T细胞突变KRAS基因表达最低。
上述结果表明，使用上述方法，能够检测细胞中KRAS基因突变水平，通过监测细胞中KARS基因突变水平，能够区分生物样品中的癌细胞和正常细胞。
Claims (9)
1.一种检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将一端具有脚趾链结构的捕获探针CP与磁珠SMB偶联获得SMB-CP复合物；
(2)将辅助探针SP与所述SMB-CP复合物共孵育获得SMB-CP-SP复合物，所述辅助探针SP与捕获探针CP脚趾链结构之外的部分序列互补结合；
(3)在步骤(2)中获得的SMB-CP-SP复合物中加入待测样品，待测样品中的目标DNA与捕获探针CP的脚趾链结构结合发生脚趾链介导的链置换反应，使目标DNA结合到SMB-CP复合物并解离出辅助探针SP，磁吸后取上清液；
(4)将步骤(3)中得到的上清液与发夹DNA链H1和发夹DNA链H2共同孵育，辅助探针SP与发夹DNA链H1杂交打开其发夹结构，打开的发夹DNA链H1与发夹DNA链H2杂交形成H1-H2双链体并释放辅助探针SP，孵育后，再加入量子点QD进行孵育得到混合溶液，其中，发夹DNA链H1和发夹DNA链H2中的至少一个的一端与量子点QD之间设有在孵育后能发生偶联的偶联单元，另一个发夹DNA链靠近量子点QD的一端修饰有能与量子点QD形成荧光共振能量转移的荧光基团；
(5)检测步骤(4)中混合溶液的荧光强度，得出待测样品中突变序列的具体浓度。
2.根据权利要求1所述检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述捕获探针CP序列为与KRAS基因突变互补的序列，所述KRAS基因突变序列为：5’-CTACGCCATCAGCTCC-3’；
所述捕获探针CP的序列从5’端到3’端依次包括过渡序列、脚趾链结构序列和捕获序列；所述过渡序列为3-12个碱基的随机序列，所述脚趾链结构序列为：5’-GGAGCTGA-3；所述捕获序列为：5’-TAGCGTAGGCAAG-3；
所述辅助探针SP的序列：5’-GACGTGACTTGCCTACGCTA-3’，
所述发夹DNA链H1的序列：5’-CTTGCCTACGCTAGAGCTTGCGATAGTAGCGTAGGCAAGTCACGTC-3；
所述发夹DNA链H2的序列：5’-GAGCTTGCGATAGGACTTGCCTACGCTACTATCGCAAGCTCTAGCGTAG-3’。
3.根据权利要求1所述检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述磁珠SMB的尺寸为100～1000nm，浓度为1～10mg/mL；
所述捕获探针CP的浓度为1～5μM；
偶联时间为20～60min。
4.根据权利要求1所述检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中在共孵育时，所述捕获探针CP与所述辅助探针SP的分子摩尔比为1∶1；共孵育的条件为：在25～35℃孵育30～60min。
5.根据权利要求1所述检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入待测样品进行孵育，孵育条件为：在25～35℃孵育30～60min。
6.根据权利要求1所述检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述发夹DNA链H1与发夹DNA链H2分别在95℃下退火5min，并冷却至25℃；
发夹DNA链H1与发夹DNA链H2的分子摩尔比为1∶1；
将上清液与发夹DNA链H1和发夹DNA链H2在25℃下孵育15～45min；
加入量子点QD后在40℃下孵育15～45min。
7.根据权利要求1所述的检测基因序列中单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤(5)中所述荧光光谱仪的测试波长为量子点QD和发夹DNA链H1或发夹DNA链H2上修饰的荧光基团对应的发射波长。
8.一种检测基因序列中单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，包括SMB-CP-SP复合物、发夹DNA链H1、发夹DNA链H2和量子点QD；
所述SMB-CP-SP复合物的制备方法为：
S1、将一端具有脚趾链结构的捕获探针CP与磁珠SMB偶联获得SMB-CP复合物；
S2、将辅助探针SP与所述SMB-CP复合物共孵育获得SMB-CP-SP复合物，所述辅助探针SP与捕获探针CP脚趾链结构之外的部分序列互补结合。
9.根据权利要求8所述检测基因序列中单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针CP序列为与KRAS基因突变互补的序列，所述KRAS基因突变序列为：5’-CTACGCCATCAGCTCC-3；
所述捕获探针CP的序列从5’端到3’端依次包括过渡序列、脚趾链结构序列和捕获序列；所述过渡序列为3-12个碱基的随机序列，所述脚趾链结构序列为：5’-GGAGCTGA-3；所述捕获序列为：5’-TAGCGTAGGCAAG-3’，
所述辅助探针SP的序列：5’-GACGTGACTTGCCTACGCTA-3；
所述发夹DNA链H1的序列：5’-CTTGCCTACGCTAGAGCTTGCGATAGTAGCGTAGGCAAGTCACGTC-3；
所述发夹DNA链H2的序列：5’-GAGCTTGCGATAGGACTTGCCTACGCTACTATCGCAAGCTCTAGCGTAG-3’。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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