KR20120123249A - 지방산 생합성에 포함된 식물 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질 - Google Patents

지방산 생합성에 포함된 식물 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 식물에서 지방산 생합성에 포함된 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질에 대한 것이다. 또한, 유전자 발현, 유전자 비활성화, 및 표적된 유전자 변형을 조절하는 이런 징크 핑거 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

지방산 생합성에 포함된 식물 유전자를 표적하는 조작된 징크 핑거 단백질{ENGINEERED ZINC FINGER PROTEINS TARGETING PLANT GENES INVOLVED IN FATTY ACID BIOSYNTHESIS}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2010년 10월 22일에 출원된, 미국 가출원 번호 제61/279,528호의 이익을 주장하며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본원의 개시 내용은 식물에서 게놈 엔지니어링 및 단백질 발현의 분야에 일반적으로 관련된 것이다. 특히, 본원의 개시 내용은 지방산 합성에 포함된 표적 유전자인 조작된 DNA-결합 도메인, 예를 들면, 징크 핑커 단백질 및 변경된 지방산 프로파일을 갖는 식물을 생성시키기 위해 유전자 발현, 유전자 비활성화, 및 표적된 유전자 변형의 조절에서 이런 징크 핑거 단백질을 사용하는 방법에 관련된 것이다.
포화지방이 높은 식단은 결국 동맥경화 및 관동맥성 심장병과 밀접하게 연관된 전제조건인, 혈관에서의 콜레스테롤의 퇴적을 유발하는 저밀도 지질단백질(LDL)을 증가시킨다(Conner et al., Coronary Heart Disease: Prevention, Complications, and Treatment, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1984 pp. 43-64,). 대조적으로, 단불포화 지방이 많은 식단은 심장 질환을 감소하는 것으로 보였다. 대부분의 섭취 가능한 식물 오일에서 유일한 단불포화 지방인, 올레산은 리놀레산만큼 효과적으로 LDL을 낮추지만, 고밀도 지질단백질(HDL)에는 영향을 주지 않는다(Mensink et al.(1989) New England J. Med., 321:436-441). 게다가, 단불포화 지방이 많은 식단은 또한 심장 수축 혈압을 감소시키는 것과 연관된다(Williams et al.(1987) J. Am. Med. Assoc., 257:3251-3256, 1987).
식단 및 건강에서 지방산의 효과를 고려하여, 섭취 및 산업적 목적을 위해 사용된 식물의 지방산 프로파일을 바꾸기 위한 시도가 있어왔다. 그러나, 돌연변이 유발(예컨대, 화학적, 방사선요법, 등.) 및/또는 번식에 의존하여 지방산 프로파일을 개선하기 위해 식물을 변경시키는 목전통적인 방법은 시간을 낭비하고, 많은 노력을 요구하며, 선별된 유전자를 특이적으로 표적하지 않는다. 예컨대, 미국 특허 번호 5,861,187을 참조하라.
최근에, 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 징크 핑거 단백질(ZFP)과 같은 조작된 DNA-결합 도메인이 식물에서 유유전자 발현을 선택적으로 조절하고, 유전자 서열의 표적된 변경을 위하여 유리하게 사용되었다(예컨대, 미국 특허 번호 7,262,054, 7,235,354, 7,220,719, 7,001,768, 및 6,534,261; 미국 공개 특허 번호 2008/0182332 및 U.S. 시리얼 번호 12/284,888 참조). 징크 핑거 단백질(ZFP)은 징크 핑거로 알려진 금속 안정화 도메인에 의해, 서열-특이적 방법으로 DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합하는 단백질이다. 예를 들면, Miller et al.(1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes et al.(1993) Sci. Amer. 268(2):56-65; 및 Klug(1999) J. Mol. Biol. 293:215-218를 참조하라. ZFP는 보통 전사 인자에서 발견되고, 지금까지, 10,000개가 넘는 징크 핑거 서열이 몇몇의 수많은 알려지거나 추정의 전사 인자에서 동정되었다.
또한, DNA-결합 도메인은 조작된 뉴클레아제를 만들기 위하여 뉴클레아제 도메인과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 도메인는 새로운 호밍 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 변경될 수 있다. 유사하게, 또한, 징크 핑거 도메인은 변형(예컨대, 결실, 돌연변이, 상동성 재조합, 또는 외래적 서열의 삽입)을 원하는 게놈의 영역에 대하여 이중-사슬 틈(break)을 특이적으로 표적하기 위한 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 생산하기 위해 뉴클레아제 절단 도메인과 조합되었다(예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0134796; 2005/0064474; 2008/0182332 참조). 조작된 ZFP는 식물에서 특이적 표적 부위의 외재적 서열의 삽입 또는 내재적 서열의 변형을 크게 촉진시키고, 전통적인 방법보다 큰 효능으로 식물 게놈의 표적된 변경을 제공한다(예컨대, 미국 특허 번호 7,262,054, 7,235,354, 7,220,719, 7,001,768, 및 6,534,261 참조).
그럼에도 불구하고, 선별된 지방산을 갖는 식물 및 식물 제품(예컨대, 식물 오일)을 생산하기 위해 지방산 합성에 포함된 유전자의 표적된 변경을 위한 조성물 및 방법이 요구되고 있다. 씨드 오일에서 낮은 수준의 개별 및 총 포화 지방을 갖는 식물 변이체를 생산함으로써, 더 적은 포화 지방을 함유하는 오일-기반 식품 제품을 생산할 수 있다. 이런 제품은 동맥경화 및 관상동맥질환의 발생 정도를 감소시킴으로써 공중 보건에 이로울 것이다.
본 개시내용은 전체 식물 또는 식물 세포에서 하나 이상의 지방산 생합성에 포함된 식물 유전자의 발현 조절 및 표적된 변경을 통해 전체 식물 또는 식물 세포에서 지방산 조성물을 변경시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 전체 식물 또는 식물 세포는 일부 특정 구체예에서, 오일-생산 식물을 포함하는 단자엽 식물(외떡잎 식물) 또는 쌍자엽 식물(쌍떡잎 식물) 종일 수 있고, 배양 세포, 임의의 발달 단계에 있는 식물에서의 세포, 및 세포가(또는 그들의 자손이) 식물로 재생될 전체 식물에서 떨어진 식물 세포를 포함할 수 있다. 식물 세포는 그 일부 또는 전체가 본원에 개시된 방법에 의한 변형을 위해 표적될 수 있는 하나 이상의 상동성 또는 상사성 유전자 서열을 함유할 수 있다.
한 측면에서, 본원은 식물 지방산 생합성 경로에 포함된 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인(예컨대, 징크 핑거 단백질(ZFP))이다. 일부 구체예에서, 유전자는 유채 유전자이다. 일부 특정 구체예에서, 유채 유전자는 아세틸-COA 카르복시라아제(ACCase), β-케토아실-ACP 합성효소(KAS, 예컨대, KAS I-KAS IV), 지방산 티오에스테라아제 B(FATB, 예컨대, FATB1-FATB5, 또는 다른 색소체 티오에스테라아제), 지방산 신타아제(FAS), 지방산 신장효소(FAE, 예컨대, FAE1), 지방산 티오에스테라아제 A(FatA), 지방산 탈포화효소(Fad2, Fad3), 색소체 G-3-P 탈수소 효소(GPDH), 글리세로키나아제(GK), 스테아로일-아실 운반 단백질 탈포화효소(S-ACP-DES), 및 올레오일-ACP 가수 분해 효소를 암호화할 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 유전자는 다른 오일-생산 식물 종에서의 이들 유전자의 오르쏘로그 또는 호모로그일 수 있다.
더 나아간 구체예에서, 본원에서 기술된 임의의 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 징크 핑거 단백질 및 ZFP TF로써 알려진 전사적 조절 도메인(예컨대, 활성화 또는 비활성화 도메인)을 포함한다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 표적 유전자를 관심 있는 게놈 영역에서 절단할 수 있는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성하기 위해 ZFP 및 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, ZFN은 식물 지방산 생합성 경로에 포함된 유전자(예컨대, ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, 또는 S-ACP-DES를 암호화하는 유전자)에 대한 특이성을 갖는 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 조작된 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 하나 이상의 절단 도메인, 및/또는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 징크 핑거 결합 도메인은 표 2 또는 표 11에서 보여준 바와 같은 표적 부위에 결합한다. 특정 구체예에서, 징크 핑거 결합 도메인은 표 1 또는 표 12에서 보여준 인식 도메인(예컨대, 단열)을 포함하는 징크 핑거 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 하프 도메인은 예를 들면, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 호밍 엔도뉴클레아제로부터 수득할 수 있다. 한 구체예에서, 절단 하프-도메인은 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제(예컨대, Fok I)로부터 유래한다.
다른 측면에서, 본원은 본원에서 기술한 임의의 DNA-결합 도메인(예컨대, 징크 핑거 단백질) 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 구체예에서, 본원은 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 본원의 ZFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ZFP 발현 벡터이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 ZFP는 ZFN이다.
ZFP 및 이들 ZFP를 포함하는 융합 단백질은 유전자의 암호화 서열 내 또는 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류 중 어느 하나의 비-전사 영역 내와 같은 유전자의 비전사 영역 내에 있거나 인접한 서열 내에서 지방산 합성에 포함된 유전자에 결합 및/또는 절단할 수 있다. 특정 구체예에서, ZFP 또는 ZFN은 지방산 생합성에 포함된 유전자의 암호화 서열 또는 조절 서열에 결합 및/또는 절단할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 본원에서 기술한 바와 같은 하나 이상의 단백질, 융합 단백질을 포함하는 조성물에 대하여 기술한다. 식물 세포는 유일한 유전자 표적 또는 동일한 유전자의 다중 상사성 복제자를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 식물 세포에서 지방산 합성에 포함된 하나 이상의 유전자를 표적하는 하나 이상의 ZFP-함유 단백질( 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. ZFP는 식물 세포에서 모든 상사성 또는 상동성 유전자, 또는 선별된 특정 상사성 또는 상동성 유전자 또는 이들의 조합을 표적할 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 본원에서 기술한 바와 같은 하나 이상의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드(예컨대, ZFP 발현 벡터)를 포함하는 식물 숙주 세포를 제공한다. 폴리뉴클레오티드에 있어서, 식물 숙주 세포는 하나 이상의 ZFP 발현 벡터로 안정적으로 형질전환되거나, 일시적으로 형질도입되거나 이들의 조합하여 형질도입될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 ZFP 발현 벡터는 식물 숙주 세포에서 하나 이상의 ZFN을 발현한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 ZFP 발현 벡터는 식물 숙주 세포에서 하나 이상의 ZFP TF를 발현한다.
다른 측면에서, 본원은 (a) 하나 이상의 유전자의 발현이 변경된 조건 하에서 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자에서 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 ZFP TF를 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 세포에서 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자의 발현을 변경하는 방법을 기술한다. 조절은 활성화 또는 비활성화일 수 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 표적 부위는 ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, 및/또는 S-ACP-DES 유전자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자가 변경된다. 본원에서 기술된 바와 같은 지방산 생합성에 포함된 유전자의 발현을 조절하는 임의의 방법에서, 방법은 변형된 지방산 함유량, 예를 들면, 식물 세포에서 포화 지방의 양의 감소가 있는 식물 세포를 야기한다. 일부 구체예에서, 식물 세포에서 변형된 지방산 함유량은 식물의 종자에서 변형된 지방산 함유량, 예를 들면, 식물의 종자에서 감소된 양의 포화 지방산을 야기한다. 일부 구체예에서, 식물은 오일 생산-식물의 종자에서 변형된 지방산 함유량(예컨대, 감소된 포화 지방)을 갖는 오일-생산 식물이다. 일부 특정 구체예에서, 식물은 유채 식물의 종자에서 변형된 지방산 함유량(예컨대, 감소된 포화 지방)을 갖는 유채 식물이다.
다른 측면에서, 본원은 (a) 뉴클레아제(예컨대, ZFN)가 발현되고, 하나 이상의 유전자가 절단된 것과 같은 조건 하에서, 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자에서 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 뉴클레아제(예컨대, ZFN)를 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 세포에서 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자를 절단하는 방법을 기술한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 표적 부위는 ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, 및/또는 S-ACP-DES를 암호화하는 유전자이다. 다른 구체예에서, 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자가 절단된다. 게다가, 본원에 기술된 임의의 방법에서, 하나 이상의 유전자의 절단이 결실, 첨가 및/또는 절단 영역에서의 뉴클레오티드의 치환으로 야기될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서 단계 (b)에서 염색체 DNA의 절단이 상동성 재조합에 의해 게놈으로의 공여자 벡터의 삽입을 촉진하도록; (a) 외재적 서열(공여자 벡터)와 세포를 접촉시키는 단계; 및 (b) 하나 이상의 뉴클레아제가 염색체 DNA를 절단할 때, 세포에서 본원에서 기술한 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제(예컨대, 징크 핑거 뉴클레아제)를 발현시키는 단계를 포함하는, 식물 세포의 게놈으로 외재적 서열을 도입하는 방법을 기술한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 타입 II 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인 및 조작된 징크 핑거 결합 도메인 사이의 융합이다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 호밍 엔도뉴클레아제, 예를 들면, 변형된 DNA-결합 도메인을 갖는 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 본원에서 기술한 임의의 방법에서, 외재적 서열은 단백질 산물을 암호화할 수 있다.
더 나아간 구체예에서, 또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 따라 수득된 트랜스제닉 또는 비-트랜스제직 식물 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같이 수득된 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물을 제공한다.
다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같이 수득된 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물로부터 유래한 종자를 제공한다.
다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같이 수득된 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물로부터 추출된 종자로부터 나온 오일을 제공한다.
도 1은 카놀라(유채(B. napus))에서 지방산 생합성 경로를 묘사하는 모식도이다. 이것은 John Shanklin, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY(Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic engineering 4:12-21)에 따라 각색되었다.
도 2는 다양한 예시적인 KASII-표적된 ZFP TF에 대한 KASII 유전자 내의 표적 부위 위치를 묘사하는 모식도이다. 숫자는 표 3에서 보여준 컨스트럭트 내에 함유된 ZFP에 대한 표적 부위를 가리킨다. ZFP 설계는 표 1 및 2에서 보여준다.
도 3은 qRT-PCR에 의해 분석된 바와 같이, KASII-활성화 ZFP TF 컨스트럭트 4695로 형질전환된 T0 식물 잎에서의 KASII mRNA 발현을 묘사하는 그래프이다. 27개 대조군 식물의 평균을 그래프에서 보여준 상향 조절 배수를 계산하기 위해 사용하였다. 3배 이상의 KASII mRNA 상향 조절이 일부 이벤트에서 관찰되었다.
도 4는 qRT-PCR에 의해 검출된 T1 식물에서 KASII-ZFP TF/튜불린 발현 비율을 묘사하는 그래프이다. 세 이벤트가 상응하는 널(null)값과 비교되었다.
도 5는 qRT-PCR에 의해 정의된 바와 같이, ZFP TF-함유에서 평균 KASII/튜불린 mRNA 발현 비율을 묘사하고, 세 이벤트 각각에서의 널 T1 식물을 분리하는 그래프이다. 2-3배의 KASII mRNA 상향 조절이 이들 T1 식물 잎에서 관찰되었다.
도 6a 및 6b는 각각의 이벤트 내에서 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기(sibling)에서 한결같이 유의한(p = <0.001) 총 C16(6A)에서의 감소 및 총 C16/총 C18 비율(6B)의 감소를 묘사하는, 표적 지방산의 원-웨이 분석을 위한 JMP 통계 소프트웨어로 그린 그래프이다. 총 C16는 C16:0 및 C16:1 함량과 비교하였고, 총 C18은 C18:0, 18:1, 18:2 및 18:3 함량과 비교하였다.
도 7은 AF318307 및 AF244520의 서열 정렬을 묘사한다. 음영은 정확한 상동성 영역 가리킨다.
도 8은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 46, 서열번호 30, AC189461, 및 BH723504의 서열 정렬을 묘사한다. β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프러이머 서열(서열번호 28 및 29)은 상응하는 서열 위해 점선으로 강조하였다. 음영은 정확한 상동성 영역을 가리킨다.
도 9는 컨스트럭트 pDAB4690-pDAB4692에서 나타난 다른 ZFP TF 설계에 대한 유채 캘러스(callus) 라인에서의 FatB4 및 FatB5 유전자 발현을 묘사한다. 대조군에 대한 17개 라인 및 각각의 ZFP 컨스트럭트에 대한 25개 라인을 분석하였다. 검정 바 = FatB4 mRNA 발현; 회색 바 = FatB5 mRNA 발현.
도 10은 qRT-PCR로 분석된 유채 T0 트랜스제닉 식물 잎에서의 FatB4 및 FatB5 발현을 보여준다. ZFP TF, pDAB4689-pDAB4691를 포함하는 세 개의 컨스트럭트를 트랜스제닉 식물에서 시험하였다. 본 실험을 위해 분석된 개별 T0 트랜스제닉 식물의 전체 번호는 pDAB 4689-pDAB4691 및 pDAB8210에 대하여 각각 40, 62, 41, 및 22이었다. Nex710 대조군은 10개 식물과 비교하였다. 3 ZFP TF 컨스트럭트에 대한 트랜스제닉 이벤트의 97%가 ZFP TF 발현 분석에 의해 정의된 바(실시예 8.3), ZFP TF 발현에 대하여 양성이었다. 천연 튜불린 mRNA 발현을 FatB 유전자 발현을 표준화하기 위해 참고로서 사용하였을 때, 유사한 결과가 관찰되었다. 검정 바 = FatB4 발현; 회색 바 = FatB5 발현.
도 11은 T1 식물에서 분석하였을 때, FatB 유전자 및 튜불린 발현 사이의 선형 연관관계를 묘사하는 그래프이다. 검정 사각형 = FatB4 발현; 회색 마름모 = FatB5 발현.
도 12는 ZFP TF 컨스트럭트 pDAB4691로 형질도입된 T1 식물 잎에서 FatB4 및 FatB5 발현에 대한 qRT-PCR을 보여준다. 검정 사각형 = FatB4 발현; 회색 마름모 = FatB5 발현.
도 13은 JMP 통계 소프트웨어를 사용한 샘플에 의한 C18:0 함유량의 원 웨이 분석이다.
도 14는 JMP 통계 분석 소프트웨어를 사용한 샘플에 의한 총 C16/C18 함유량의 원 웨이 분석을 보여준다.
도 15는 4 ZFP TF 컨스트럭트 이벤트가 JMP 통계 소프트웨어로 나타나는 것을 포함하는 성숙 종자의 T1 FA 프로파일의 분석을 묘사한다. A 및 B 패널은 각각 C18:0 함유량 및 C16:0/C18:0 함유량의 샘플(컨스트럭트)에 의한 원 웨이 분석을 나타낸다.
도 16은 4 ZFP TF 컨스트럭트 이벤트가 JMP 통계 소프트웨어로 나타나는 것을 포함하는 성숙 종자의 T1 FA 프로파일의 분석을 묘사한다. A 및 B 패널은 각각 C14:0 및 C16:1 함유량의 샘플(컨스트럭트)에 의한 웬 웨이 분석을 묘사하고, 컨스트럭트 pDAS5227의 속성을 구별하여 강조하였다.
도 17은 pDAS5227 ZFP TF 컨스트럭트로 형질도입된 T2 미성숙 종자에서 FatB5 mRNA 하향 조절(검정 바)을 나타낸다. ZFP TF 발현은 ERF3 발현(회색 바)으로 나타내었다. 25 DAF 미성숙 종자는 4개 널, 이벤트 5227-12의 3개의 이형접합(5227_12ZF-1) 및 4개의 동형접합(5227_12ZF-2) T1 식물로부터 분석하였다.
도 18은 pDAS5212 ZFP TF 컨스트럭트로 형질전환된 T2 미성숙 종자에서 FatB5 mRNA 하향 조절(검정 바)을 보여준다. ZFP TF mRNA 발현은 KRAB1 발현(회색 바)으로 나타내었다. 25개의 DAF 미성숙 종자는 5개 널, 이벤트 5212-4의 3개의 이형접합 및 4개의 동형접합 식물로부터 분석하였다.
도 19는 ZFP TF 이벤트 5227-12의 T2 종자에서 접합성(zygosity)에 의한 총 포화 지방산(sats.)의 원 웨이 분석을 보여준다. T1 널, 이형접합 및 동형접합 무모 식물에서 수득한 T2 종자는 각각 5227-12ZF 널, 5227-12ZF(1) 및 5227-12ZF(2)로 표지하였다.
도 20은 ZFP TF 이벤트 5212-4의 T2 종자에서 접합성에 의한 총 포화 지방산(sats.)의 웬 웨이 분석을 보여준다. T1 널, 이형접합 및 동형접합 부모 식물에서 수득한 T2 종자는 각각 5212-4ZF 널, 5212-4ZF(1) 및 5212-4(2)로 표지하였다.
본원의 개시 내용은 식물에서 지방산 합성에 포함된 하나 이상의 유전자의 발현의 조절 및 표적된 절단 및 변경에 유용한 조성물 및 방법이다. 이런 유전자의 조절은 예컨대, 조작된 ZFP 전사 인자의 사용 또는 유전자 조절 영역의 변형에 의해 조절할 수 있다. 유전자는 염색체 내 상동성 재조합에 의해, 또는 외재적 폴리뉴클레오티드(유전자 뉴클레오티드 서열 내의 하나 이상의 상동성 영역을 포함하는) 및 게놈 서열 사이의 상동성 재조합 이후의 표적된 절단에 의해 변경될 수 있다.
게놈 서열은 유전체, 에피솜, 세포 소기관 유전체(예컨대, 미토콘드리아, 색소체), 인공 크로모좀 및 예를 들면, 증폭된 서열, 미소쌍 염색체 및 박테리아 및 바이러스의 내재적이거나 감염된 게놈과 같이 세포에서 나타나는 임의의 다른 타입의 핵산을 포함한다. 게놈 서열은 정상(즉, 야생형)이거나 돌연변이일 수 있고; 돌연변이 서열은 예를 들면, 삽입, 결실, 전좌, 재배열, 및/또는 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 게놈 서열은 다수의 다른 대립 유전자 중 하나 일 수 있다.
본원의 조성물은 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 포함하는 하나 이상의 ZFP, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 ZFP 및 ZFP-암호화 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 징크 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 징크 핑거)를 포함할 수 있고, 지방산 생합성에 포함된 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 유전자의 임의의 게놈 서열에 결합하기 위해 조작될 수 있다.
본원에서 기술한 바와 같은 ZFP는 유전자 전사의 활성화 또는 비활성화 중 어느 하나를 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 조절 도메인에 연결된 징크 핑거 도메인의 융합을 포함하는 ZFP는 전사를 활성화하거나 비활성화하는 키메라 전사 인자를 생성하기 위해 구축될 수 있다. 또한, ZFP는 징크 핑거 뉴클레아제를 생산하기 위해 뉴클레아제 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)이 있는 징크 핑거 도메인과 연결하는 것에 의해 관심 있는 게놈 영역의 표적된 절단에 사용될 수 있다. 따라서, 유전자 조절, 절단 또는 재조합을 원할 때, 관심 있는 표적 게놈 영역을 동정함으로써, 본원에서 개시된 방법에 따라, 그 게놈 영역에서의 유전자 서열을 인식하도록 조작된 징크 핑거 도메인에 연결된 하나 이상의 조절 도메인 및/또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질을 포함하는 징크 핑거 단백질을 구축할 수 있다. 세포에서 융합 단백질(또는 단백질)을 포함하는 이런 ZFP의 존재는 융합 단백질의 결합 부위에 대한 융합 단백질의 결합 및 게놈 영역 내 또는 근처의 변경된 조절 또는 절단을 야기할 것이다. 추가적으로, 만약 게놈 영역이 절단되고, 그 게놈 영역에 대한 외재적 폴리뉴클레오티드 상동성이 세포에서 존재할 때, 상동성 재조합은 게놈 영역 및 외재적 폴리뉴클레오티드 사이에서 높은 비율로 일어난다.
도 1에서 보여준 바와 같이, 지방산 생합성에 포함된 몇몇의 유전자가 있다. 따라서, 본원에서 기술한 조성물은 식물 세포에서 ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, 또는 S-ACP-DES 유전자 및 이들 유전자의 오르쏘로그, 파라로그, 및 호모로그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이들 유전자의 하나 이상을 표적할 것이다. 예를 들면, 지방산 생합성에 포함된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 유전자가 본 발명의 단백질(예컨대, ZFP)에 의해 표적될 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 ZFP 또는 다른 특이함을 갖는 ZFP를 암호화하는 발현 벡터를 식물에서 관심 있는 원하는 유전자를 표적하기 위해 조합할 수 있다.
일반론
방법의 실시, 그리고 본 발명에 개시된 조성물의 제조와 사용에 있어서는, 달리 언급되지 않는 한, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 해당 업계 종사자의 통상적인 기술에 속하는 관련 분야의 종래 기법들이 활용된다. 이러한 기법들은 기존의 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001]; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 정례 업데이트물; 연속 간행물 [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]를 참조한다.
정의
"핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 동의어로서 사용되어, 선형 또는 고리형 구조, 그리고 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 개시 내용의 목적상, 이러한 용어는 중합체의 길이를 한정하는 것으로 해석되어서는 않는다. 상기 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 인산염 부분 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)이 변형된 뉴클레오타이드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가진다; 다시 말해서, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 동의어로서 사용되어, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.상기 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열 특이적인 비공유성 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용이 전체적으로 서열 특이적이기만 하면, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열 특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 백본의 인산염 잔기와의 접촉). 일반적으로, 이런 상호작용은 10-6M-1 또는 그 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화도"라는 것은 결합 강도를 의미하는데, 결합 친화도의 증가는 더 낮은 Kd와 상관 관계가 있다.
"결합 단백질"은 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 자기 자신과 결합할 수 있고 (동종이합체, 동종삼합체 등을 형성)/있거나, 서로 다른 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 보유한다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 징크 핑거 (징크 이온의 배위 결합을 통하여 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역)를 통하여 서열 특이적인 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이다. 징크 핑거 DNA 결합 단백질이라는 용어는 흔히 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
징크 핑거 결합 도메인은 미리 결정해 놓은 뉴클레오타이드 서열과 결합하도록 "조작"될 수 있다. 징크 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예로서 설계 및 선별을 들 수 있다. 설계된 징크 핑거 단백질은 그 설계/조성이 주로 합리적인 기준으로부터 정해지는 것으로 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준에는 치환 규칙 및 기존의 ZFP 설계와 결합 데이터의 정보를 저장하고 있는 데이터베이스 정보 처리를 위한 컴퓨터를 이용한 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; 및 6,785,613를 참조하고, 또한, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496; 및 미국 특허 6,746,838; 6,866,997; 및 7,030,215을 참조한다. 따라서, 조작된 징크 핑거 단백질 또는 비-천연 발생 징크 핑거 단백질은 하나 이상의 징크 핑거 DNA 결합 도메인 요소(인식 헬릭스)가 천연 발생된 것이 아니고, 전-선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된 것이다.
"선별된" 징크 핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선별과 같이 주로 실험적 과정의 결과로서 생산되는 것으로 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; US 6,733,970; US RE39,229; 및 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조한다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하는데, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 고리형 또는 분지형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "공여자 서열"이라는 용어는 유전체 내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2개 내지 25,000개의 뉴클레오타이드 길이 (또는 상기 범위 사이 또는 상기 범위를 초과하는 임의의 정수 값), 바람직하게는, 약 100개 내지 5,000개의 뉴클레오타이드 (또는 상기 범위 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는, 약 200개 내지 2,500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
"상동성 서열"은 제 2 서열과의 서열 동일성의 정도를 공유하고, 그 서열이 제 2 서열의 그것과 동일할 수 있는 제 1 서열을 지칭한다. "상동성 비동일 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 서열 자체는 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 돌연변이 유전자의 서열과 상동성이긴 하지만 동일하지는 않다. 특정 구체예에서, 2개 서열 간의 상동성 정도는, 정상적인 세포 기작을 이용해 이들 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 하는데 충분하다. 2개의 상동성 비동일 서열은 임의의 길이일 수 있으며, 이들의 비상동성 정도는 단일 뉴클레오타이드만큼 작거나 (예를 들어, 표적화 상동성 재조합에 의한 유전체 점 돌연변이를 보정하는 경우), 또는 10 kb 이상만큼 클 수 있다 [예를 들어, 염색체 내의 미리 정해 놓은 부위에 유전자를 삽입하는 경우]. 상동성 비동일 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 길이가 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 20개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 공여자 폴리뉴클레오타이드)가 이용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기법은 해당 업계에 공지되어 있다. 보통, 이러한 기법들은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계 및/또는 이로 인해 암호화되는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 그리고 이러한 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 유전체 서열 역시 이러한 방식으로 결정되어 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 말한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 그들의 동일성 %를 측정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 간에 2개 서열의 동일성 %는, 2개의 배열된 서열 간에 정확하게 일치(match)되는 수를 이들 중 짧은 서열의 길이로 나눈 후 여기에 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사적 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 상기 알고리즘은 데이호프 (Dayhoff) (문헌 [Atlas of Protein Sequences and Structures. M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. USA])에 의해 개발되고, 그립스코브 (Gribskov) (문헌 [Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)])에 의해 표준화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 아미노산 서열에 적용할 수 있다. 서열의 동일성 %를 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적 수행은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 "BestFit" 유틸리티 응용 프로그램으로 제공된다. 상기 방법을 위한 디폴트 매개변수들은 위스콘신 서열 분석 패키지 프로그램 매뉴얼 (Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Ver.8, 1995) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹에서 이용가능)에 기술되어 있다. 본 발명의 개시 내용과 관련해 동일성 %를 수립하는 바람직한 방법은 MPSRCH 패키지 프로그램 [저작권: 에든버러 대학 (University of Edinburgh), 개발자: 존 에프. 콜린스 (John F. Collins) 및 세인 에스. 스터록 (Shane S. Sturrok), 판매: 인텔리제네틱스 인코포레이티드 (IntelliGenetics, Inc.) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)]을 사용하는 것이다. 상기 패키지 묶음에서, 스미스-워터맨 (Smith-Wa용어an) 알고리즘은 스코어링 표에 디폴트 매개변수가 사용되는 곳에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 12의 갭 개방 벌점, 1의 갭 확장 벌점 및 6의 갭). 생성된 데이터에서 "일치" 값은 서열 동일성을 반영하는 것이다. 서열 간의 동일성 또는 유사성 %를 계산하는데 적합한 다른 프로그램도 해당 업계에 일반적으로 공지되어 있는데, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수로 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, 하기의 디폴트 매개변수를 이용한 BLASTN 및 BLASTP가 이용될 수 있다: 유전자 코드= 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 방식 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램에 관한 상세한 사항은 하기 인터넷 주소에서 확인할 수 있다:http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. 본원에서 설명된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 대략 35% 내지 100% 및 이 범위 사이에 임의의 정수 값이다. 보통, 서열 간의 동일성 %는 적어도 35%-40%; 40%-45%; 45%-50%; 50%-60%; 60%-70%; 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 이보다 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%이다.
다르게는, 폴리뉴클레오타이드 간의 서열 유사성 정도는, 상동성 영역 간 안정한 이중 가닥 (duplex)의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드를 혼성화한 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화 분해하여 상기 소화 분해된 단편의 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은, 이들 서열에 대해 상기 방법을 이용하여 측정했을 때 분자의 정해진 길이에 대하여 적어도 대략 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더욱 바람직하게는 85%-90%, 이보다 더욱 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 서로에 대하여 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에서, 실질적으로 상동성이라는 것은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 엄중 조건 하에서의 서던 혼성화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 규정하는 것은 해당 업계의 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 상기와 동일]; [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]를 참조한다.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화는 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이들 분자 간의 혼성화 현상의 효율과 강도에 영향을 준다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자와 완전하게 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로는 억제할 것이다. 완전하게 동일한 서열의 혼성화의 억제는 해당 업계에 널리 공지된 혼성화 분석법(예를 들어, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등; 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성, 예를 들어, 낮은 엄격성 내지 높은 엄격성에 이르는 다양한 조건을 이용하여 이러한 분석을 수행할 수 있다. 낮은 엄격성의 조건이 사용되는 경우, 비특이적인 결합의 부재는, 부분적인 정도의 서열 동일성조차도 결여된 2차 프로브 (예를 들어, 표적 분자와 대략 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 이용하여 평가할 수 있으며, 이로써 비특이적인 결합 현상의 부재 하에서 2차 프로브는 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화를 기반으로 한 검출 시스템을 이용하는 경우에, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브를 선택한 후, 적절한 조건을 선택하여 상기 프로브와 상기 기준 서열을 서로 선택적으로 혼성화하거나 결합시켜 이중 가닥의 분자를 형성한다. 중간 정도의 엄격성을 갖는 혼성화 조건 하에 기준 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는, 보통 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는 약 10-14개 이상인 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출이 가능한 조건 하에서 혼성화한다. 보통, 엄격한 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90-95% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 10-14개 이상인 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 해당 업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다 (예를 들어, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press 참조).
혼성화 조건은 해당 업계 종사자에게 널리 공지되어 있다. 혼성화 엄격성은, 혼성화 조건이 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 하이브리드의 형성을 꺼리는 정도를 말하며, 엄격성이 높을수록 미스매치 하이브리드에 대해 용인하는 정도(tolerance)가 낮은 상관 관계가 있다. 혼성화의 엄격성에 영향을 미치는 요인들은 해당 업계 종사자에게 널리 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매 (예컨대, 포름아미드 및 디메틸설폭사이드)의 농도를 포함한다. 해당 업계 종사자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격성은 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록 그리고 용매 농도가 낮을수록 증강된다.
혼성화를 위한 엄격성 조건에 대해, 특정한 엄격성을 수립하기 위해 예를 들어 하기의 요인들 [서열의 길이와 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염과 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중 차단제(예를 들어, 덱스트란 술페이트 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 매개변수, 그리고 세척 조건]을 변화시킴으로써 수많은 균등 조건을 이용할 수 있다는 것이 해당 업계에 공지되어 있다. 특정 세트의 혼성화 조건의 선택은 해당 업계의 표준 방법을 따라 행한다 (예를 들어, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
"재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 간에 유전 정보가 교환되는 과정을 지칭한다. 본 개시 내용의 목적상, "상동성 재조합 (HR)"이라는 것은 예를 들어, 상동성 지향 복구 기작을 통해 세포 내에서 이중 가닥 절단을 복구하는 동안 발생하는 이러한 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이러한 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성이 필요하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 거친 분자)의 주형 복구에 "공여자" 분자를 이용하며, "비교차성 (noncrossover) 유전자 전환" 또는 "숏 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있는데, 그 이유는 이러한 과정에 의해 공여자로부터 표적으로의 유전 정보의 전달이 야기되기 때문이다. 이것을 어떤 특정한 이론으로 묶으려는 것은 아니지만, 이러한 전달은, 파괴된 표적과 공여자 간에 형성되는 이형성 이중 가닥 (heteroduplex) DNA의 미스매치 보정, 및/또는 공여자를 이용하여 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는 "합성 의존성 가닥 어닐링 (synthesis-dependent strand annealing)", 및/또는 관련 공정들을 수반할 수 있다. 이런 특수화된 HR은 흔히 표적 분자 서열의 변형을 유발함으로써 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 도입된다.
"절단"이라는 말은 DNA 분자의 공유 백본이 붕괴되는 것을 지칭한다. 절단은, 다양한 방법, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 모두 가능하고, 이중 가닥 절단은 2가지 서로 다른 단일 가닥 절단 현상의 결과로써 발생할 수 있다. DNA 절단의 결과로 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단이 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 폴리펩타이드가 표적화 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매 활성을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 절단 도메인은 단일 폴리펩티드 체인에 함유될 수 있고, 절단 활성은 두 개(또는 그 이상의) 폴리펩티드와 상호작용한 결과로부터 나올 수 있다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩타이드 (동일하거나 상이함)와 함께 절단 활성 (바람직하게 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다.
"염색질"은 세포 유전체를 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 그리고 단백질, 예컨대 히스톤과 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하는데, 여기에서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머와 결합된 약 150개인 염기쌍의 DNA를 포함하며, 링커 DNA (유기체에 따라 길이가 다름)는 뉴클레오솜 코어 간에 연장된다. 일반적으로, 히스톤 H1의 분자가 링커 DNA에 결합된다. 본 개시 내용의 목적상, "염색질"이라는 용어는 모든 유형의 세포성 핵단백질 (원핵생물과 진핵생물 모두)을 망라한다. 세포 염색질은 염색체 염색질과 에피솜 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포 유전체의 전체 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 유전체는 흔히 세포의 유전체를 포함하는 모든 염색체의 집합인 그 핵형에 의해서 특정된다. 세포의 유전체는 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 기타 구조물이다. 에피솜의 예로서는 플라스미드 및 특정 바이러스 유전체가 포함된다.
"접근가능한 영역"은 핵산에 존재하는 표적 부위에서 표적 부위를 인식하는 외재적 분자에 의해 결합될 수 있는 세포내 염색질의 부위이다. 이것을 어떤 특정한 이론으로 묶으려는 것은 아니지만, 접근가능한 영역은 뉴클레오솜 구조로 포장되지 않는 것으로 여겨진다. 접근가능한 영역의 뚜렷한 구조는 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 그것의 민감성에 의해 종종 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합하게 될 (단, 결합을 위한 충분 조건이 존재해야 함) 핵산 부분을 나타내는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 보통은 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있는 분자이다. "보통 (정상적으로) 세포 내에 존재한다"라는 판단은 세포의 특정 성장 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발생 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 이와 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 기능 부전 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 부전성 형태를 포함할 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소분자, 예컨대, 조합 화학 공정에 의해 생성된 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의 변형 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산에는 이중 가닥을 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중 가닥을 형성하는 핵산도 포함된다. 예를 들어, 미국등록특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질에는, 이에 제한되지는 않으나, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라아제, 메틸라아제, 데메틸라아제, 아세틸라아제, 데아세틸라아제, 키나아제, 포스파타아제, 인테그라아제, 리콤비나아제, 리가아제, 토포이소머라아제, 자이라아제 및 헬리카아제를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 유전체, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포 내에 보통은 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 해당 업계 종사자에게 공지되어 있는데, 이에 제한되지는 않지만, 여기에는 지질 매개형 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 비롯한 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 유전자총 (particle bombardment), 인산칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란 매개형 전달 및 바이러스 벡터 매개형 전달을 포함한다. 외인성 분자는 비-식물성 분자, 예를 들면, 포유동물 (예컨대, 인간 또는 인간화된) 항체일 수 있다.
이와는 대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하의 특정 성장 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포 소기관의 유전체, 또 는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어, 전사 인자와 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 소단위 분자가 결합 (바람직하게는 공유 결합)된 분자이다. 이들 소단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자이거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 첫 번째 유형의 융합 분자의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합체) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기에서 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 두 번째 유형의 융합 분자의 예로서는, 이에 제한되지는 않지만, 삼중 가닥을 형성하는 핵산과 폴리펩타이드 간의 융합체, 그리고 좁은 그루브 (minor groove) 결합제와 핵산 간의 융합체를 포함한다.
세포 내에서 융합 단백질의 발현은, 이러한 융합 단백질을 세포에 전달함으로써, 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 유도될 수 있는데, 이로써 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성되는 것이다. 트랜스-스플라이싱 (trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰 역시 세포 내에서 단백질의 발현에 관련될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 제시된다.
본 명세서에서, "유전자"는 유전자 산물 (하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 이러한 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역 (이러한 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 상관없음)을 포함한다. 따라서, 유전자에는, 이에 반드시 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일런서(silencer), 격리자(insulator), 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자 자리 제어 영역이 포함된다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 임의 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물에는 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 그리고 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질 역시 포함된다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조절에는, 이에 제한되지는 않지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
"식물" 세포는 단자엽 식물(외떡잎 식물) 또는 쌍자엽 식물(쌍떡잎 식물) 식물의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 외떡잎 식물의 비-제한적 예시는 옥수수, 쌀, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛과 같은 곡류 식물을 포함한다. 쌍떡잎 식물의 비-제한적 예시는 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 사탕무, 감자, 상추, 멜론, 콩, 캐놀라(평지씨), 및 알팔파를 포함한다. 식물 세포는 식물의 모든 부분으로부터 유래할 수 있고 및/또는 식물 발달의 모든 단계로부터 유래할 수 있다. 그러므로, 식물 세포는 식물의 종자로부터 나온 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 식물 또는 식물 세포는 섭취 및/또는 산업적 용도를 위한 식물 오일의 생산에 포함된 식물(즉, 오일-생산 식물)이거나 오일-생산 식물로부터 유래할 수 있다. 예시적인 오일-생산 식물은 유채 종(예컨대, 카놀라 컬티바(카놀라 cultivars)를 포함하는 유채), 옥수수, 콩, 겨자과 야채, 겨자, 피마자, 땅콩, 깨, 목화, 아마씨, 잇꽃, 팜오일, 아마, 해바라기, 및 코코넛을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"관심 (대상) 영역"은 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 내부 혹은 유전자에 인접한 비암호화 서열이다. 결합은 표적화 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 목적으로 할 수 있다. 관심 대상 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피솜, 세포 소기관 유전체 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 유전체 내에 존재할 수 있다. 관심 대상 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비암호화 영역, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내에 존재할 수 있다. 관심 대상 영역은 그 길이가 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 짧거나, 또는 최대 2,000개의 뉴클레오타이드 쌍이거나, 또는 임의 정수 값의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
"작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된" (또는 "작동할 수 있도록 연결된")이라는 용어는 2개 이상의 성분(예를 들어, 서열 성분)의 병치와 관련하여 동의어로서 사용되는데, 여기에서 이들 성분은 양 성분이 정상적으로 작용하여, 이들 성분 중에서 적어도 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 정렬된다. 예로써, 이러한 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대해 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우라 한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 암호화 서열에 작동가능하게(유효하게) 연결된 것이다. 일반적으로, 전사 조절 서열은 암호화 서열과 시스(cis) 형태로 작동가능하게 연결되지만, 상기 서열에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 암호화 서열과 근접하지 않는 경우에도, 암호화 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 연결된 각 성분이 서로 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았다면 수행할 기능과 동일한 기능을 수행한다는 사실을 의미할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드와 관련하여 보면, 상기 융합 폴리펩타이드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으며, 조절 도메인은 표적 부위의 부근에서 DNA 발현을 조절할 수 있다고 한다면, ZFP DNA-결합 도메인 부위는 그것의 표적 부위 및/또는 그것의 결합 부위에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"이라는 것은, 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산을 말한다. 기능성 단편은 그에 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 그와 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 내포할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 측정하는 방법은 해당 업계에 공지되어 있다. 이와 유사하게, 단백질의 기능을 측정하는 방법도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은 예컨대, 필터-결합, 전기영동 이동도-변화, 또는 면역침전 분석법에 의해 측정할 수 있다. DNA 절단은 젤 전기 영동으로 분석할 수 있다. 문헌 [Ausubel et al., 상기와 동일]을 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 한 단백질의 능력은 예를 들어, 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석법 또는 상보성 분석법 (유전학적 및 생화학적 방법 모두 가능)으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., (1989) Nature 340:245-246]; 미국등록 특허 제5,585,245호와 PCT WO 98/44350을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 포화 지방산은 라우르산(C12:0), 미리스트산(C14:0), 팔미트산(C16:0) 및 스테아르산(C18:0)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 단불포화 지방산 및 폴리불포화 지방산은 올레산(C18:1), 환원된 리놀레산(C18:2) 및 환원된 리놀렌산(C18:3)과 같은 C18 지방산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
표적 부위
개시된 방법 및 조성물은 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP) 및 조절 도메인 또는 절단(뉴클레아제) 도메인(또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 융합 단백질이 포함되는데, 상기 DNA 결합 도메인(예컨대, 징크 핑거 도메인)에서, 세포 내 염색질에서 지방산 합성에 포함된 유전자 내의 서열에 결합함으로써, 서열의 근처로 전사적 조절 도메인 또는 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)의 활성을 지향시키고, 이로써 표적 서열의 근처에서 전사를 조절하거나 절단을 유도한다.
본 개시내용의 어딘가에 제시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인은 원하는 거의 모든 서열과 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 유전자 조절, 절단 또는 재조합을 원하는 서열을 함유하는 관심 있는 영역을 확인한 후, 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인은 관심 있는 영역에서 하나 이상의 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
징크 핑거 도메인에 의한 결합(예컨대, 표적 부위)을 위해 세포 내 염색질에서 지방선 생합성에 포함된 임의의 유전자(예컨대, 도 1 참조)의 관심 있는 게놈 영역에서 표적 부위의 선택은 또한 선별된 서열에 결합하기 위한 ZFP를 설계하는 방법을 개시하는 공동 소유의 US 특허 번호 6,453,242(Sept. 17, 2002)에서 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 단순한 시각적 검사가 표적 부위의 선택에 또한 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 표적 부위 선택을 위한 임의의 방법은 청구된 방법에서 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에서 기술하는 바와 같은 ZFP는 ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB5, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, 및/또는 S-ACP-DES를 암호화하는 유전자에서 표적부위에 결합한다.
표적 부위는 일반적으로 다수위 인접한 표적 소-부위로 구성된다. 표적 소-부위는 개별 징크 핑거에 의해 결합되는 서열(통상적으로, 뉴클레오티드 삼량체, 또는 인접한 사량체와 1개 뉴클레오티드가 중복될 수 있는 뉴클레오티드 사량체)을 지칭한다. 예를 들면, WO 02/077227를 참조하라. 징크 핑거 단백질에서 대부분의 접촉을 형성하는 사슬이 표적 사슬 일차 인식 사슬 EH는 일차 접촉 사슬로 설계될 때, 일부 징크 핑거 단백질은 표적 사슬 내의 3개 염기 삼량체 및 비표적 사슬 상의 제 4 염기와 결합한다. 표적 부위는 일반적으로 적어도 9개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 따라서 적어도 3개 징크 핑거를 포함하는 징크 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들면, 12-뉴클레오티드 표적 부위에 대한 4-핑거 결합 도메인, 15-뉴클레오티드 표적 부위에 대한 5-핑거 결합 도메인, 18-뉴클레오티드 표적 부위에 대한 6-핑거 결합 도메인이 또한 가능하다. 명백한 바와 같이, 더 긴 표적 부위에 대한 더 큰 결합 도메인(예를 들어, 7-, 8-, 9-핑거 및 그 이상)의 결합이 또한 가능하다.
표적 부위가 반드시 다양한 3개 뉴클레오티드일 필요는 없다. 예를 들어, 교차-가닥 상호 작용이 일어난 경우 (예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호 및 WO 02/077227 참조), 다중-핑거 결합 도메인의 개개의 징크 핑거 중의 하나 이상은 중복 사량체 소-부위와 결합할 수 있다. 그 결과로서, 3-핑거 단백질은 10-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는데, 제10 뉴클레오티드는 말단 핑거에 의해 결합된 사량체의 일부이고, 4-핑거 단백질은 13-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는데, 제13 뉴클레오티드는 말단 핑거에 의해 결합된 사량체의 일부이다.
다중-핑거 결합 도메인 중의 개개의 징크 핑거 간의 아미노산 링커 서열의 길이 및 성질은 또한, 표적 서열에 대한 결합에 영향을 미친다. 예를 들어, 다중-핑거 결합 도메인 중의 인접한 징크 핑거들 간에 소위 "비-표준 링커", "장 링커" 또는 "구조화 링커"가 존재하게 되면, 이들 핑거는 바로 인접하지 않은 소-부위와 결합할 수 있게 된다. 이러한 링커의 비제한적 예는, 예를 들어 미국 특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480에 기재되어 있다. 따라서, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 표적 부위 내의 하나 이상의 소-부위는 서로 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 정도 떨어져 있을 수 있다. 단지 한 가지 예를 제공하기 위해, 4-핑거 결합 도메인은, 서열상 2개의 연속되는 3-뉴클레오티드 소-부위, 개재 뉴클레오티드 및 2개의 연속되는 삼량체 소-부위를 포함하는 13-뉴클레오티드 표적 부위와 결합할 수 있다. 또한, 다른 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 표적 부위에 결합하기 위한 인공 뉴클레아제를 연결시키기 위한 조성물 및 방법에 대하여 U.S. 출원 번호 61/130,099를 참조하라. 서열 (예: 표적 부위) 간의 거리는 서로 가장 근접한 서열 가장자리로부터 측정된 바와 같이, 두 서열 간에 개입된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 수를 지칭한다.
특정 구체예에서, 전사 인자 기능을 갖는 ZFP가 설계된다. 전사 인자 기능에 대하여, 단순 결합 및 프로모터에 대한 충분한 근접성이 일반적으로 요구되는 전부이다. 프로모터와 상대적인 정확한 위치화, 방향, 거리는 제한이 있지만 큰 문제가 되지 않는다. 이런 특징은 인공 전사 인자를 구축하기 위한 표적 부위를 선별하는데 상당한 유연성을 허용한다. 그러므로, ZFP에 의해 인식되는 표적 부위는 ZFP에 의해 유전자 발현의 활성화 또는 비활성화를 허용하고, 선택적으로 조절 도메인에 연결된, 표적 유전자에서 임의의 적절한 부위일 수 있다. 바람직한 표적 부위는 전사 시작 부위의 인근, 하류 또는 상류 영역을 포함한다. 인핸서 영역, 억제자 부위, RNA 중합 효소 정지 부위 및 특이적 조절 부위(예컨대, SP-1 부위, 저산소증 반응 요소, 핵 수용체 인식 요소, p53 결합 부위)에 위치한 표적 부위는 cDNA 암호화 영역 내 또는 태그(EST) 코딩 영역 발현 서열 내 이다.
다른 구체예에서, 뉴클레아제 활성이 있는 ZFP를 설계한다. 세포에서 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질(또는 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 각각 포함하는 두 개의 융합 단백질)을 포함하는 ZFP의 발현은 표적 서열 근처의 절단에 영향을 준다. 특정 구체예에서, 절단은 표적 부위를 분리하기 위한 2개의 징크 핑거 도메인/절단 하프-도메인 융합 분자의 결합에 의존한다. 2개의 표적 부위는 상반된 DNA 사슬 상에 있을 수 있으나, 대안적으로 모든 표적 부위는 동일한 DNA 사슬 상에 있을 수 있다.
DNA 결합 도메인
임의의 DNA 결합 도메인이 본 발명의 실시를 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, DNA 결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다(Miller et al.(1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes(1993) Scientific American Feb.:56-65; US 특허 번호 6,453,242). 전형적으로, 단일 징크 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이이다. 구조 연구는 각각의 징크 핑거 도메인(모티프)가 두 개의 베타 시트(두 개의 불변의 시스테인 잔기를 함유하는 베타 턴을 유지하는) 및 알파 헬릭스(두 개의 불변의 히스티딘 잔기를 함유하는)를 함유하는데, 이들이 2개의 시스테인 및 두 개의 히스티딘에 의해 아연 원자의 배위를 통하여 특정 형태를 유지하는 것으로 입증되었다.
징크 핑거는 표준 C2H2 징크 핑거(즉, 두 개의 시스테인 및 두 개의 히스티딘에 의해 배위된 아연 이온이 있는 것) 및 C3H 및 C2HC 징크 핑거(세 개의 시스테인 잔기 및 하나의 히스테인 잔기에 의해 배위된 아연 이온이 있는 것, 예컨대, 미국 특허 공개 No. 2008/0182332를 참조하라) 및 C4 징크 핑거(네 개의 시스테인 잔기에 의해 배위된 아연 이온이 있는 것)와 같은 비-표준 징크 핑거를 포함한다. 또한, WO 02/057293를 참조하라.
징크 핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, Beerli et al.(2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al.(2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al.(2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al.(2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al.(2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416을 참조하라. 조작된(또는 비-천연 발생) 징크 핑거 결합 도메인은 천연 발생 징크 핑거 단백질과 비교하여, 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적인 설계 및 다양한 타입의 선택을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합리적 설계에는, 예를 들어 삼량체 (또는 사량체) 뉴클레오티드 서열 및 개개의 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것이 포함되는데, 여기서 각 삼량체 또는 사량체 뉴클레오티드 서열은 특별한 삼량체 또는 사량체 서열과 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연합된다. 예를 들면, 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참조하라. 추가적 설계 방법은 예를 들면, 미국 특허 6,746,838; 6,785,613; 6,866,997; 및 7,030,215에 개시되었다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 US 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; as well as WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되었다
징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들면, 공동 소유의 US 특허 번호 6,794,136에서 기술되었다.
개개의 징크 핑거는 3-뉴클레오티드 (즉, 삼량체) 서열 (또는 하나의 뉴클레오티드가, 인접한 징크 핑거의 4-뉴클레오티드 결합 부위와 중복될 수 있는 4-뉴클레오티드 서열)과 결합하기 때문에, 징크 핑거 결합 도메인이 결합되도록 조작된 서열 (예: 표적 서열)의 길이가, 조작된 징크 핑거 결합 도메인 내의 징크 핑거의 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중복 소-부위와 결합하지 않는 ZFP의 경우에는, 예를 들어 6-뉴클레오티드 표적 서열이 2-핑거 결합 도메인에 의해 결합되고; 9-뉴클레오티드 표적 서열은 3-핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 본원에서 인지된 바와 같이, 표적 부위 내에서 개개의 징크 핑거에 대한 결합 주위 (즉, 소-부위)가 반드시 연속적일 필요는 없지만, 다중-핑거 결합 도메인 내의 징크 핑거 간의 아미노산 서열 (즉, 핑거간 링커)의 길이 및 성질에 따라서 1개 또는 수 개의 뉴클레오티드 정도 떨어질 수 있다.
다중-핑거 징크 핑거 결합 도메인에서, 인접한 징크 핑거는 대략 5개 아미노산의 아미노산 링커 서열 (소위 "표준" 핑거간 링커)에 의해 격리될 수 있거나, 또는 대안적으로, 하나 이상의 비-표준 링커에 의해 격리될 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하라. 3개 이상의 핑거를 포함하는 조작된 징크 핑거 결합 도메인의 경우, 특정 징크 핑거 사이에 보다 긴 ("비-표준") 핑거간 링커를 삽입하는 것이 요망될 수 있는데, 이는 상기 결합 도메인에 의해 결합 친화도 및/또는 결합 특이도가 증가될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,479,626호 및 WO 01/53480을 참조하라. 따라서, 다중-핑거 징크 핑거 결합 도메인은 또한, 비-표준 핑거간 링커의 존재 및 위치에 관해서 명확히 규명할 수 있다. 예를 들어, 3개의 핑거 (2개의 표준 핑거간 링커에 의해 연결됨), 장 링커 및 3개의 부가 핑거 (2개의 표준 핑거간 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 6-핑거 징크 핑거 결합 도메인은 2x3 입체 배치를 의미한다. 유사하게, 2개의 핑거 (그 사이에 표준 링커를 수반함), 장 링커 및 2개의 부가 핑거 (표준 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 결합 도메인은 2x2 입체 배치를 의미한다. 3개의 2-핑거 단위 (각각의 경우에, 2개의 핑거는 표준 링커에 의해 연결되고, 각 2-핑거 단위는 장 링커에 의해 인접한 2개 핑거 단위에 연결된다)를 포함하는 단백질은 3x2 입체 배치로서 지칭된다.
다중-핑거 결합 도메인 내의 2개의 인접한 징크 핑거 간에 장 또는 비-표준 핑거 간 링커가 존재하면 종종, 2개 핑거는 표적 서열 내에서 바로 연속적이지 않은 소-부위와 결합할 수 있게 된다. 따라서, 표적 부위 내의 소-부위 간에 하나 이상의 뉴클레오티드의 갭이 존재할 수 있는데, 즉 표적 부위는 징크 핑거에 의해 접촉되지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2x2 징크 핑거 결합 도메인은 하나의 뉴클레오티드에 의해 격리된 2개의 6-뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있는데, 즉 이는 13-뉴클레오티드 표적 부위와 결합한다. 또한, Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441; 및 WO 01/53480을 참조하라.
앞서 언급된 바와 같이, 표적 소-부위는 단일 징크 핑거에 의해 결합되는 3- 또는 4-뉴클레오티드 서열이다. 특정의 목적상, 2-핑거 단위는 "결합 모듈"을 의미한다. 결합 모듈은, 예를 들어 특별한 6-뉴클레오티드 표적 서열과 결합하는 다중-핑거 단백질 (일반적으로, 3 핑거)에 관련해서 2개의 인접한 핑거에 대해 선별함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 모듈은 개개의 징크 핑거의 어셈블리에 의해 구축할 수 있다. 또한, WO 98/53057 및 WO 01/53480을 참조하라.
한 구체예에서, 본원은 표 1에서 보여준 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 징크 핑거 결합 도메인을 개시한다. 다른 구체예에서, 본원은 징크 핑거 결합 도메인이 표 1에서 보여준 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 때, 징크 핑거 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, ISceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acid Res. 25:3379-3388; Dujon et al.(1989) Gene 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acid Res. 22, 1125-1127; Jasin(1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al.(1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al.(1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue를 참조하라. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 결합 부위와 결합하도록 조작시킬 수 있다. 예를 들면, Chevalier et al.(2002) Molec. 세포 10:895-905; Epinat et al.(2003) Nucleic Acid Res. 31:2952-2962; Ashworth et al.(2006) Nature 441:656-659; Paques et al.(2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개 No. 20070117128을 참조하라.
다른 구체예에서, DNA-결합 도메인은 천연 발생이거나 조작된(비-천연 발생인) Tal 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병리학성 박테리아가 중요한 곡물 식물에서 많은 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 잔토모나스의 병원성은 식물 세포로 25개 이상의 다른 이펙터 단백질을 주입하는 보존된 타입 III 분비(T3S)에 의존한다. 이들 중, 주입된 단백질은 식물의 전사적 활성자를 미믹하고, 식물 전사체를 제조하는 전사 활성자-유사(TAL) 이펙터이다(Kay et al(2007) Science 318:648-651 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사적 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특징화된 TAL-이펙터 중 하나는 잔토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)에서 유래한 AvrBs3이다(Bonas et al(1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 중요한, 각 반복이 대략 34개 아미노산을 함유하는, 일렬 반복의 집중된 도메인을 함유한다. 게다가, 이들은 핵 위치화 서열 및 산성 전사적 활성화 도메인을 함유한다(리뷰를 위해 Schornack S, et al(2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272 참조). 게다가, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세룸(Ralstonia solanacearum)의 두 개 유전자에서, 설계된 brg11 및 hpx17이 R. solanacearum biovar 1 strain GMI1000 및 biovar 4 strain RS1000에서의 AvrBs3 패밀리에 상동인 것이 밝혀졌다.(Heuer et al(2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384 참조). 이들 유전자는 서로에 대하여 뉴클레오티드 서열에서 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인에서 1,575 bp의 결실이 다르다. 그러나, 두 유전자 산물은 잔토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 이하의 서열 동일성을 갖는다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 연속 반복에서 발견된 서열에 의존한다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복은 전형적으로 서로 91-100% 상동이다(Bonas et al, ibid). 반복의 다형성은 보통 위치 12 및 13에 위치하고, TAL-이펙터의 표적 서열에서 인접한 뉴클레오티드의 동일성을 갖는 위치 12 및 13에서 초가변 이잔기(diresidue) 의 동일성 사이에는 일-대-일인 것으로 나타난다(Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al(2009) Science 326:1509-1512 참조). 실험적으로, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 위치 12 및 13에서의 HD 서열이 시스테인(C)에 결합하는 것을 유도하도록 정의되고, NG는 T에 결합하고, NI는 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하고, ING는 T에 결합한다. 이들 DNA 결합 반복은 식물 세포에서 새로운 서열과 상호작용하고, 비-내재적 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 만들기 위하여, 반복의 새로운 조합 및 수를 갖는 단백질로 조립되었다(Boch et al, ibid). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 분석(플라스미드 기반 표적)에서 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합(TALEN) 존재 활성을 얻기 위하여 FokI 절단 하프 도메인에 연결되었다(Christian et al. (2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717).
조절 도메인
본원에서 기술한 DNA-결합 도메인(예컨대, ZFP)은 유전자 발현의 조절을 위한 조절 도메인과 선택적으로 연관될 수 있다. ZFP는 하나 이상의 조절 도메인, 대안적으로 두 개 또는 그 이상의 조절 도메인, 동일한 도메인 또는 두 개의 다른 도메인의 두 개 복사본인 두 개 또는 그 이상의 도메인과 공유적으로 또는 비-공유적으로 연관될 수 있다. 조절 도메인은 ZFP에 융합 단백질과 떨어져 예컨대, 아미노산 링커에 의해 ZFP에 공유적으로 연결될 수 있다. 또한, ZFP는 비-공유 이량체화 도메인, 예컨대, 루신 지퍼, STAT 단백질 N 말단 도메인, 또는 FK506 결합 단백질에 의해 조절 도메인과 연관될 수 있다(예컨대, O'Shea, Science 254: 539(1991), Barahmand-Pour et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:121-128(1996); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16:569-592(1998); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16:569-592(1998); Ho et al., Nature 382:822-826(1996); 및 Pomeranz et al., Biochem. 37:965(1998) 참조). 조절 도메인은 ZFP의 C- 또는 N-말단을 포함하는 임의의 적절한 위치에서 ZFP와 연관될 수 있다.
ZFP에 첨가하기 위한 일반적 조절 도메인은 예컨대, 전사 인자(활성자, 억제자, 공동-활성자, 공동-억제자), 사일런서, 핵 호르몬 수용체, 종양유발 전사 인자(예컨대, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 멤버 등)로부터 나온 이펙터 도메인; DNA 복구 효소 및 그들의 연관 인자 및 변형자; DNA 재배열 효소 및 그들의 연관 인자 및 변형자; 염색질 연관 단백질 및 그들의 변형자(예컨대, 키나아제, 아세틸라아제 및 탈아세틸화효소); 및 DNA 변형 효소(예컨대, 메틸트랜스퍼라아제, 토포아이소머라아제, 헬리카제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제) 및 그들의 연관 인자 및 변형자를 포함한다.
조절 도메인을 얻을 수 있는 전사 인자 폴리펩티드는 조절된 및 기본적 전사에 포함된 것들을 포함할 수 있다. 이런 폴리펩티드는 전사 인자, 그들의 이펙터 도메인, 공동활성자, 사일런서, 핵 호르몬 수용체를 포함한다(예컨대, 전사에 포함된 단백질 및 핵산 요소의 리뷰를 위해 Goodrich et al., 세포 84:825-30(1996); 일반적으로 전사인자에 대해 리뷰되는 Barnes 및 Adcock, Clin. Exp. Allergy 25 Suppl. 2:46-9(1995) 및 Roeder, Method Enzymol. 273:165-71(1996) 참조). 핵 호르몬 수용체 전사 인자는 예를 들면, Rosen et al., J Med. Chem. 38:4855-74(1995)에서 기술되었다. 전사 인자의 C/EBP 패밀리는 Wedel et al., Immunobiology 193:171-85(1995)에서 리뷰되었다. 핵 호르몬 수용체의 전사 조절을 매개하는 공동활성자 및 공동-억제자는 예를 들면, Meier, Eur. J 엔도crinol. 134(2):158-9(1996); Kaiser et al., Trends Biochem. Sci. 21:342-5(1996); 및 Utley et al., Nature 394:498-502(1998)에서 리뷰되었다. 조혈작용의 조절에 포함된 GATA 전사 인자는 예를 들면, Simon, Nat. Genet. 11:9-11(1995); Weiss et al., Exp. Hematol. 23:99-107에서 기술되었다. TATA 박스 결합 단백질(TBP) 및 그의 연관 TAP 폴리펩티드(TAF30, TAF55, TAF80, TAF 10, TAFI 50, 및 TAF250를 포함하는)는 Goodrich 및 Tjian, Curr. Opin. Cell Biol. 6:403-9(1994) 및 Hurley, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:69-75(1996)에서 기술하였다. 전사 인자의 STAT 패밀리는 예를 들면, Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:121-8(1996)에서 리뷰되었다. 질병에 포함된 전사 인자는 Aso et al., J Clin. Invest. 97:1561-9(1996)에서 리뷰되었다.
한 구체예에서, 인간 KOX-1 단백질에서 유래한 KRAB 비활성화은 전사적 억제자로서 사용된다(Thiesen et al., New Biologist 2:363-374(1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4509-4513(1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914(1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4514-4518(1994)). 다른 구체예에서, KAP-1, KRAB 공동-억제자는 KRAB와 사용된다(Friedman et al., Gene Dev. 10:2067-2078(1996)). 대안적으로, KAP-1는 ZFP와 단독으로 사용될 수 있다. 전사적 억제자로서 작용하는 다른 바람직한 전사 인자 및 전사 인자 도메인은 MAD(예컨대, Sommer et al., J. Biol. Chem. 273:6632-6642(1998); Gupta et al., Ongogene 16:1149-1159(1998); Queva et al., Ongogene 16:967-977(1998); Larsson et al., Ongogene 15:737-748(1997); Laherty et al., 세포 89:349-356(1997); 및 Cultraro et al, Mol Cell. Biol. 17:2353-2359(19977) 참조); FKHR(rhapdosarcoma 유전자에서 forkhead; Ginsberg et al., Cancer Res. 15:3542-3546(1998); Epstein et al, Mol. Cell. Biol. 18:4118-4130(1998)); EGR-1(초기 성장 반응 유전자 product-1; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:8298-8303(1998); 및 Liu et al., Cancer 유전자 Ther. 5:3-28(1998)); ets2 억제자 인자 억제자 도메인(ERD; Sgouras et al., EMBO J 14:4781-4793((19095)); MAD smSIN3 상호작용 도메인(SID; Ayer et al., Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781(1996)); 및 ERF3(에틸렌 반응 인자-3) 양친매성 비활성화 도메인, EAR(Ohta, M., et al.(2001), 식물 세포 13:1959-1968)을 포함한다.
한 구체예에서, HSV VP16 활성화 도메인은 전사적 활성자로서 사용된다(예컨대, Hagmann et al., J. Virol. 71:5952-5962(1997) 참조). 활성화 도메인을 제공할 수 있는 다른 바람직한 전사 인자는 VP64 활성화 도메인(Seipel et al., EMBO J. 11:4961-4968(1996)); 핵 호르몬 수용체(예컨대, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383(1998) 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유니트(Bitko 및 Barik, J. Virol. 72:5610-5618(1998) 및 Doyle 및 Hunt, Neuroreport 8:2937-2942(1997)); EGR-1(초기 성장 반응 유전자 산물-1; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:8298-8303(1998); 및 Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28(1998)); 및 옥수수 안토시아닌 생합성 경로 조절 단백질, C1(S.A. Goff, et al, , (1991), Genetics and Development 5:298-309)을 포함한다.
또한, 유전자 조절에 포함된 폴리펩티드를 변형시키는 키나아제, 포스파타아제, 및 다른 단백질이 ZFP에 대한 조절 도메인으로써 유용하다. 이런 변형자는 종종 예를 들면, 호르몬에 의해 온 또는 오프 전사 매개의 전환에 포함된다. 전사적 조절에 포함된 키나아제는 Davis, Mol. Reprod. Dev. 42:459-67(1995), Jackson et al., Adv. Second Messenger PhosphoProtein Res. 28:279-86(1993), 및 Boulikas, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5:1-77(1995)에서 리뷰되고, 포스파타아제는 예를 들면, Schonthal and Semin, Cancer Biol. 6:239-48(1995)에서 리뷰된다. 핵 티로신 키나아제는 Wang, Trends Biochem. Sci. 19:373-6(1994)에서 기술한다.
기술한 바와 같이, 또한, 유용한 도메인을 종양유발유전자의 산물(예컨대, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 members) 및 그들의 연관 인자 및 변형자로부터 얻을 수 있다. 종양유발유전자는 예를 들면, Cooper, Oncogenes, 2nd ed., Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, Mass., Jones and Bartlett Publishers, 1995에서 기술한다. ets 전사 인자는 Waslylk et al., Eur. J. Biochem. 211:7-18(1993) 및 Crepieux et al., Crit. Rev. Oncog. 5:615-38(1994)에서 리뷰하였다. Myc 종양유발유전자는 예를 들면, Ryan et al., Biochem. J. 314:713-21(1996)에서 리뷰하였다. jun 및 fos 전사 인자는 예를 들면, The Fos and Jun Families of Transcriptional Factor, Angel and Herrlich, eds.(1994)에서 기술하였다. max 종양유발유전자는 Hurlin et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:109-16에서 리뷰하였다. myb 유전자 패밀리는 Kanei-Ishii et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:89-98(1996)에서 리뷰하였다. mos 패밀리는 Yew et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3:19-25(1993)에서 리뷰하였다.
ZFP는 DNA 복구 효소 및 그들의 연관 인자 및 변형자에서 얻어진 조절 도메인을 포함할 수 있다. DNA 복구 시스템은 예를 들면, Vos, Curr. Opin. Cell Biol. 4:385-95(1992); Sancar, Ann. Rev. Genet. 29:69-105(1995); Lehmann, Genet. Eng. 17:1-19(1995); 및 Wood, Ann. Rev. Biochem. 65:135-67(1996)에서 리뷰하였다. DNA 재배열 및 그들의 연관 인자 및 변형자가 또한 조절 도메인으로서 사용될 수 있다(예컨대, Gangloff et al., Experientia 50:261-9(1994); Sadowski, FASEB J. 7:760-7(1993) 참조).
유사하게, 조절 도메인은 DNA 변형 효소(예컨대, DNA 메틸트랜스퍼라아제, 토포아이소머라아제, 헬리카제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 폴리머라아제) 및 그들의 연관 인자 및 변형자로부터 유래할 수 있다. 헬리카제는 Matson et al., Bioessays, 16:13-22(1994)에서 리뷰하였고, 메틸트랜스퍼라아제는 Cheng, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:4-10(1995)에서 기술하였다. 히스톤 탈아세틸화효소(Wolffe, Science 272:371-2(1996))와 같은 염색질 연관 단백질 및 그들의 변형자(예컨대, 키나아제, 아세틸라아제 및 탈아세틸화효소)가 또한 ZFP의 선택적 첨가를 위한 도메인으로서 유용하다. 한 바람직한 구체예에서, 조절 도메인은 전사적 억제자로서 작용하는 DNA 메틸 트랜스퍼라아제이다(예컨대, Van den Wyngaert et al., FEBS Lett. 426:283-289(1998); Flynn et al., J. Mol. Biol. 279:101-116(1998); Okano et al., Nucleic Acid Res. 26:2536-2540(1998); 및 Zardo 및 Caiafa, J. Biol. Chem. 273:16517-16520(1998) 참조). 다른 바람직한 구체예에서, Fok1과 같은 엔도뉴클레아제는 유전자 절단을 통해 작용하는 전사적 억제자로서 사용된다단(예컨대, WO95/09233; 및 PCT/US94/01201 참조).
염색질 및 DNA 구조, 이동 및 위치화를 조절하는 인자 및 그들의 연관 인자 및 변형자; 미생물로부터 유래한 인자(예컨대, 원핵세포, 진핵세포 및 바이러스) 및 그들과 연관되거나 그들을 변형시키는 인자가 또한 키메라 단백질을 얻는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 재조합효소 및 인테그라아제가 조절 도메인으로서 사용된다. 한 구체예에서, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제가 전사적 활성자로서 사용된다(예컨대, Jin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18:4377-4384(1998); Wolffe, Science 272:371-372(1996); Taunton et al., Science 272:408-411(1996); 및 Hassig et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:3519-3524(1998) 참조). 다른 구체예에서, 히스톤 탈아세틸화효소가 전사적 억제자로서 사용된다(예컨대, Jin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18:4377-4384(1998); Syntichaki and Thireos, J. Biol. Chem. 273:24414-24419(1998); Sakaguchi et al., Gene Dev. 12:2831-2841(1998); 및 Martinez et al, J. Biol. Chem. 273:23781-23785(1998) 참조).
폴리펩티드 도메인 사이, 예컨대 ZFP 또는 ZFP 및 조절 도메인 사이의 링커 도메인이 포함될 수 있다. 이런 링커는 전형적으로 약 5 및 200 아미노산 사이의 폴리 Gly 서열과 같은 폴리펩티드 서열이다. 링커는 재조합 융합 단백질의 일부로서 합성되는 유연하거나(flexible) 엄격한(rigid) 아미노산 서브서열일 수 있다. 예컨대, 그 전체가 참고문헌으로써 본원에 통합되는 미국 특허 번호 6,534,261; Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:5525-5530(1997); Pomerantz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:9752-9756(1995); Kim et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:1156-1160(1996)을 참조하라. 대안적으로, 유연한 링커는 DNA-결합 부위 및 펩티드 자체 모두를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하거나(Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:2256-2260(1993), Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11099-11103(1994)) 파지 디스플레이 방법으로 합리적으로 설계될 수 있다.
다른 구체예에서, 화학적 링커가 합성적 또는 재조합적으로 생산한 도메인 서열을 연결시키기 위해 사용된다. 이런 유연한 링커는 당업자에게 공지이다. 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커가 Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala에서 사용가능하다. 이들 링커는 선택적으로 아미드 연결, 설프하이드릴 연결 또는 이종 기능적 연결을 갖는다. 게다가 조절 도메인에 대한 ZFP의 공유 결합을 위해, 비-공유 방법이 조절 도메인과 연관된 ZFP가 있는 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
절단 도메인
상기 언급된 바와 같이, DNA-결합 도메인은 절단 (뉴클레아제) 도메인과 연합될 수 있다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 기능을 유지시키면서 그의 DNA-결합 특이성을 변형시킬 수 있다. 또한, 징크 핑거 단백질을 절단 도메인과 융합시켜 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성시킬 수도 있다. 본원에 기재된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 어떠한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득할 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al.(1997) Nucleic Acid Res. 25:3379-3388를 참조하라. DNA를 절단시키는 추가적인 효소가 공지되어 있다 (예컨대, S1 뉴클레아제; 녹두 (mung bean) 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스성(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). 이들 효소(또는 그의 기능적 단편)의 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 하프-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 하프-도메인은 절단 활성을 위한 이량체화에 요구되는, 상술한 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부로부터 유래할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함한다면, 두 개의 융합 단백질이 요구된다. 대안적으로, 두 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질을 사용할 수 있다. 두 개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)으로부터 유래할 수 있고, 또는 각각의 절단 하프-도메인이 다른 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능적 단편)으로부터 유래할 수 있다. 게다가, 두 개의 융합 단백질을 위한 표적 부위가 바람직하게 배치되며, 그들의 각자의 표적 부위에 대한 두 개의 융합 단백질의 결합이 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 예컨대, 이량체화를 통해 허용하는 서로의 공간적 방향에서, 서로에 대하여 절단 하프-도메인을 위치시킨다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5-8 뉴클레오티드 또는 15-18 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 그러나 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 두 표적 부위 사이(예컨대, 2 내지 50 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상)에 낄 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하고, (인식 부위에서) DNA와 서열-특이적으로 결합할 수 있으며, 결합 부위 또는 그 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다. 특정 제한 효소 (예: 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단시키고, 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서 그리고 다른 가닥 상의 그의 인식 부위로 부터 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제 5,436,150호 및 제5,487,994호; 및 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조하라. 따라서, 한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인), 및 조작시킬 수 있거나 조작시키지 않을 수 있는 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
그의 절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특별한 효소는 이량체로서 활성이다(Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575). 따라서, 본 개시내용의 목적상, 본원에 기재된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부가 절단 하프-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-FokI 융합물을 이용하여 세포성 서열의 표적화 대체 및/또는 표적화 이중 가닥 절단시키는 경우에는, 각각 FokI 절단 하프-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여, 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성시킬 수 있다. 대안적으로론, 징크 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 하프-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자를 사용할 수도 있다. 징크 핑거-FokI 융합물을 이용하여 표적화 서열 교대 및 표적화 절단시키기 위한 파라미터가 본 개시내용의 어딘가에 제공되어 있다.
절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 유지하고 있거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)될 수 있는 능력을 보유하고 있는 단백질의 모든 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 그 전문이 본 발명에 참고문헌으로써 포함되는 국제 공개 WO 2007/014275에 기술되어 있다. 또한, 추가적인 제한 효소는 분리된 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 개시 내용에 의해 예상된다. 예를 들면, Roberts et al.(2003) Nucleic Acid Res. 31:418-420을 참조하라.
특정 구체예에서, 절단 도메인은 예를 들어, 그 전체가 본 발명에 참고 문헌으로써 포함되는 미국 공개 특허 번호 20050064474; 20060188987; 20080131962에서 기술한 바와 같이, 동종이량체화를 최소화하거나 막는, 하나 이상의 조작된 절단 하프-도메인(소위 이량체화 도메인 돌연변이로 불리는)를 포함한다. Fok I에서 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 위치에서의 아미노산 잔기는 Fok I 절단 하프-도메인의 이량체화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 하프-도메인은 제 1 절단 하프-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함하고, 제 2 절단 하프-도메인에서 아미노산 잔기 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다. 절대적인 이종-이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 하프-도메인은 FokI의 위치 490 및 538에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제1 절단 하프-도메인, 위치 486 및 499에서의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제2 절단 하프-도메인의 쌍을 포함한다.
따라서, 특정 구체예에서, 490에서 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 교체하고; 538에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 교체하고; 486에서 돌연변이는 Gln(Q)를 Glu(E)로 교체하고; 그리고 499에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 교체한다. 특이적으로, 본원에서 기술한 조작된 절단 하프-도메인은 E490K:I538K로 지정된 조작된 절단 하프-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 하프-도메인에서 하는 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이시키는 것에 의해, 그리고 Q486E:I499L로 지정된 조작된 절단 하프-도메인을 생산하기 위해 다른 절단 하프-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)를 돌연변이시키는 것에 의해 제조되었다. 본원에서 기술한 조작된 절단 하프-도메인은 정도를 벗어난 절단이 최소화되거나 또는 폐지된 절대적 이종이량체 돌연변이이다. 예컨대, 모든 목적에 대하여 그 전체의 개시 내용이 참고문헌으로써 포함되는 미국 특허 공개 No. 2008/0131962의 실시예 1을 참조하라. 또한, Szczepek et al.(2007) Nat Biotechnol 25:786-793를 참조하라. 특정 구체예에서, 조작된 절단 하프-도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대한 번호)에서의 돌연변이, 예를 들면, 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로, 그리고, 위치 496에서 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기(또한, 각각 ELD 및 ELE 도메인으로 지칭되는)로 교체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 조작된 절단 하프-도메인은 위치 490, 538 및 537(numbered relative to 야생형 FokI)에서의 돌연변이, 예를 들면, 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 그리고, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 a Arg(R) 잔기(또한, 각각 KKK 및 KKR 도메인으로 지칭되는)로 교체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 조작된 절단 하프-도메인은 위치 490 및 537에서 돌연변이, 예를 들면, 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 그리고 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기(또한, 각각 KIK 및 KIR 도메인으로 지칭되는)로 교체하는 돌연변이를 포함한다(US 가출원 61/337,769 filed February 8, 2010 참조). 다른 구체예에서, 조작된 절단 하프 도메인은 샤키(Sharkey) 및/또는 샤키' 돌연변이를 포함한다(Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060 참조).
본원에서 기술한 조작된 절단 하프-도메인은 예를 들면, 미국 공개 특허 번호 20050064474 및 20080131962에서 기술한 바와 같이 야생형 절단 하프-도메인(Fok I)의 위치-지정 돌연변이유발에 의한 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
다른 바람직한 타입 IIS 제한 효소는 BfiI이다(Zaremba et al, (2004) J. Mol Biol. 336(1):81-92 참조). 이 효소의 절단 도메인은 그것의 DNA 결합 도메인으로부터 분리되었을 수 있으며, ZFN을 생성하기 위해 징크 핑거 DNA 결합 도메인에 작동가능하게 연결되어있을 수 있다.
융합 단백질
융합 단백질 (및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 설계하고 구축하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, DNA-결합 도메인 (예: 징크 핑거 도메인) 및 조절성 또는 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인)을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 설계하고 구축하는 방법은 그 전문이 본 발명에 참고문헌으로써 포함되는, 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호 및 미국 특허 공개공보 2007/0134796호 및 제 2005/0064474호에 기재되어 있다.
특정 구체예에서는, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이러한 벡터는 세포 내로 도입할 수 있다 (벡터, 및 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 방법에 관한 하기 추가적인 개시내용 참조).
앞서 언급한 바와 같이, 특정 구체예에서, 융합 단백질은 지방산 생합성에 포함된 유전자에서의 표적 부위 및 적어도 하나의 전사적 조절 도메인, 예를 들면 활성화 또는 비활성화 도메인에 결합하는 징크 핑거 단백질을 포함한다.
본원에 기재된 방법의 특정 구체예에서, 징크 핑거 뉴클레아제는 FokI 제한 효소로부터의 절단 하프-도메인 및 징크 핑거 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 이러한 2개의 융합 단백질이 세포에서 발현된다. 2개의 융합 단백질이 세포에서 발현되는 것은 이러한 2개 단백질을 세포로 전달하거나; 하나의 단백질과 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 하나의 핵산을 세포로 전달하거나; 각각 이들 단백질 중의 하나를 암호화하는 2개의 핵산을 세포로 전달하거나; 또는 양 단백질을 암호화하는 단일 핵산을 세포로 전달함으로써 비롯될 수 있다. 추가적인 구체에에서, 융합 단백질은 2개의 절단 하프 도메인 및 징크 핑거 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이러한 경우, 단일 융합 단백질이 세포에서 발현되고, 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이는 절단 하프 도메인의 분자내 이량체 형성에 따른 결과로서 DNA를 절단시키는 것으로 여겨진다.
특정 구체예에서, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP-FokI 융합)의 성분들은, 징크 핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이는 FokI 효소로부터 유래된 바와 같은 천연 발생적 이량체화 절단 도메인 내에서의 절단 도메인의 상대적 배향을 반영하고 있는데, DNA-결합 도메인은 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 하프-도메인은 카복시 말단 가장 근처에 있다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 이량체화하는 것은 융합 단백질을 대향하는 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 5' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
추가적인 구체에에서, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP-FokI 융합)의 성분들은, 절단 하프-도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 징크 핑거 도메인이 카복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 구체예에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위해 절단 하프-도메인을 이량체화하는 것은 융합 단백질을 대향하는 DNA 가닥 상의 부위와 결합시킴으로써 이루어지는데, 이러한 결합 부위의 3' 말단은 서로 가까운 곳에 있다.
또 다른 추가적인 구체에에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있는 절단 하프-도메인, 및 카복시-말단 가장 근처에 있는 징크 핑거 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 징크 핑거 도메인 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있으며 절단 하프-도메인이 카복시 말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이들 구체예에서, 양 융합 단백질은 동일한 DNA 가닥과 결합하는데, 카복시 말단 가장 근처에 있는 징크 핑거 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위는 아미노 말단 가장 근처에 있는 징크 핑거 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 대해 위치한다.
기재된 융합 단백질의 특정 구체예에서, 징크 핑거 도메인과 절단 도메인 (또는 절단 하프-도메인) 간의 아미노산 서열은 "ZC 링커"를 의미한다. 이러한 ZC 링커는 상기 논의된 핑거간 링커와 구별되어야 한다. 예를 들어, 절단을 최적화시키는 ZC 링커를 수득하는 것에 관한 상세 내역은 미국 특허 공개공보 제20050064474A1호 및 제20030232410호, 및 국제 특허 공개공보 WO05/084190을 참조할 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시내용은 표 1 또는 표 11 및 12에 제시된 인식 헬릭스 아미노산 서열 중의 하나 이상을 갖는 징크 핑거 단백질을 포함하는 ZFN을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본원에는 표 1 또는 표 11 및 12에 제시된 하나 이상의 인식 헬릭스를 갖는 ZFP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZFP 발현 벡터가 제공된다.
유전자 발현의 조절
다양한 분석을 ZFP가 유전자 발현을 조절하는지 여부를 정의하기 위해 사용될 수 있다. 특정 ZFP의 활성은 예컨대, 면역분석(예컨대, 항체를 이요한 ELISA 및 면역조직화학적 분석), 혼성화 분석(예컨대, RNase 보호, 노던, , in situ 혼성화, 올리고뉴클레오티드 어레이 연구), 비색 분석, 증폭 분석, 효소 활성 분석, 표현형 분석, 등을 사용하여, 예컨대, 단백질 또는 mRNA 수준, 산물 수준, 효소 활성; 리포터 유전자의 전사적 활성화 또는 비활성화를 측정하는 것에 의해, 다양한 in vitro 및 in vivo 분석을 사용하여 평가될 수 있다.
ZFP는 전형적으로 ELISA 분석을 사용하여 in vitro에서의 활성에 대하여 일차로 테스트하고, 이후 신장 세포를 사용한다. ZFP는 종종 리포터 유전자를 사용한 일시적인 발현 시스템을 사용하여 일차로 테스트하고, 이후 세포 및 전체 식물에서 in vivo 및 ex vivo 모두에서 표적 내재적 유전자의 조절을 시험한다. ZFP는 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있고, 식물로 이식된 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있고, 또는 트랜스제닉 식물에서 재조합적으로 발현될 수 있을뿐만 아니라, 아래에 기술한 대로 전달 담체를 사용하여 식물 또는 세포로 단백질로서 투여될 수 있다. 세포는 고정되거나, 용액에 있거나, 식물로 주입되거나, 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물에서 천연 발생될 수 있다.
유전자 발현의 조절은 본원에서 기술된 in vitro 또는 in vivo 분석의 하나를 사용하여 시험한다. 샘플 또는 분석은 ZFP로 처리되고, 조절의 정확성을 검증하기 위해 시험 화합물이 없는 대조군 샘플과 비교한다. 내재적 유전자 발현의 조절을 위해, ZFP는 전형적으로 200 nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 100 nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 50 nM, 가장 바람직하게는 25 nM 또는 그 이하의 Kd를 갖는다.
ZFP의 영향은 상술한 임의의 파라미터를 검증하는 것에 의해 측정할 수 있다. 임의의 적절한 유전자 발현, 표현형, 또는 생리학적 변화를 ZFP의 영향을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 기능적 결과가 완전한 세포 또는 식물을 사용하여 정의되었을 때, 식물 성장, 알려지거나 알려지지 않은 유전적 마커 모두에 대한 전사적 변화(예컨대, 노던 블롯 또는 올리고뉴클레오티드 어레이 연구), 세포 성장 또는 pH 변화와 같은 세포 대사의 변화, 및 cGMP와 같은 세포 내 이차 메신저의 변화와 같은 다양한 효과를 또한 측정할 수 있다.
내재적 유전자 발현의 ZFP 조절을 위한 바람직한 분석은 in vitro에서 수행될 수 있다. 한 바람직한 in vitro 분석에서, 배양된 세포에서의 배치, 내재적 유전자 발현의 ZFP 조절을 ELISA 분석을 사용한 단백질 생산을 시험하는 것에 의해 측정된다. 테스트 샘플은 빈 벡터 또는 다른 유전자를 표적하는 비연관된 ZFP로 처리된 대조군 세포와 비교한다.
다른 구체예에서, 내재적 유전자 발현의 ZFP 조절은 표적 유전자 mRNA 발현의 수준을 측정하는 것에 의해 in vitro에서 정의된다. 유전자 발현의 수준은 예컨대, PCR, LCR을 사용한 증폭, 또는 혼성화 분석, 예컨대 노던 혼성화, RNase 보호, 닷 블로팅을 사용하여 측정한다. RNase 보호를 한 구체예에서 사용하였다. 단백질 또는 mRNA의 수준은 본원에서 기술한 바와 같이 직접 또는 간접적으로 표지된 검출 제제, 예컨대 형광 또는 방사선동위원소로 표지된 핵산, 방사선동위원소 또는 효소로 표지된 항체 등을 사용하여 검출한다.
대안적으로, 리포터 유전자 시스템은 루시퍼라아제, 초록 형광 단백질, CAT 또는 β-gal과 같은 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 표적 유전자 프로모터를 사용하여 창안될 수 있다. 리포터 컨스트럭트는 전형적으로 배양된 세포로 공동-형질도입된다. 선택된 ZFP로 처리한 후, 리포터 유전자 전사, 번역 또는 활성의 양을 당업자에게 알려진 표준 기술에 따라 측정한다.
트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 식물이 또한 in vivo에서 내재적 유전자 발현의 조절을 시험하기 위해 바람직한 구체예로서 사용된다. 트랜스제닉 식물은 선택된 ZFP를 안정적으로 발현할 수 있다. 대안적으로, 선택된 ZFP를 일시적으로 발현하거나, ZFP가 전달 담체로 투여된 식물을 사용할 수 있다. 내재적 유전자의 발현은 본원에서 기술한 분석 중 임의의 하나를 사용하여 시험한다.
표적된 절단을 위한 방법
본원에서 개시된 방법 및 조성물은 세포 내 염색질 내 관심 있는 영역(게놈에서 원하거나 미리 정해진 부위, 예를 들면, 지방산 생합성에 포함된 유전자 내 또는 근처)에서 DNA를 절단하는데 사용할 수 있다. 이런 표적된 DNA 절단을 위해, 징크 핑거 결합 도메인은 미리 정해진 절단 부위나 근처의 표적 부위에 결합하도록 조작되고, 조작된 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질은 세포에서 발현된다. 표적 부위에 대한 융합 단백질의 징크 핑거 부위의 결합에서, DNA는 절단 도메인에 의해 표적 부위 근처에서 절단된다. 절단의 정확한 부위는 ZC 징커의 길이에 의존할 수 있다.
대안적으로, 각각 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질이 세포에서 발현되고, 병치된 표적 부위에 결합하는 것과 같은 방법으로 기능적 절단 도메인이 재건되고 DNA가 표적 부위의 근처에서 절단된다. 한 구체예에서, 절단은 두 개의 징크 핑거 결합 도메인의 표적 부위 사이에서 일어난다. 징크 핑거 결합 도메인의 하나 또는 모두는 조작될 수 있다.
징크 핑거 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 사용한 표적된 절단을 위해서, 결합 부위는 절단 부위를 포함할 수 있거나, 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 및 50 뉴클레오티드 사이의 임의의 정수값) 떨어질 수 있다. 절단 부위에 대한 결합 부위의 정확한 위치는 특정 절단 도메인, 및 ZC 링커의 길이에 의존할 것이다. 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 각각 두 개의 융합 폴리펩티드가 사용된 방법에 있어서, 결합 부위는 일반적으로 절단 부위를 가로지른다. 따라서 제 1 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 한 쪽에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 및 50 뉴클레오티드 사이의 임의의 정수값) 위에 있을 수 있고, 제 2 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 다른 쪽에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 1 및 50 뉴클레오티드 사이의 임의의 정수값) 위에 있을 수 있다. in vitro 및 in vivo에서 절단 부위를 매핑하는 방법은 당업자에게 공지이다.
따라서, 본원에서 기술한 방법은 절단 도메인과 융합된 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 사용할 수 있다. 이 경우에서, 결합 도메인은 절단을 원하는 자리 또는 근처에서 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포로 도입한다. 일단 세포로 도입되거나 발현되면, 융합 단백질은 표적 서열에 결합하고, 표적 서열 또는 근처에서 절단한다. 절단의 정확한 부위는 절단 도메인의 특징 및/또는 결합 및 절단 도메인 사이의 링커 서열의 특징에 의존한다. 각각 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질을 사용한 경우, 결합 부위의 가까운 가장자리 사이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 사이의 임의의 정수값 1 및 50 뉴클레오티드)일 수 있다. 또한, 절단의 최적의 수준은 두 개의 융합 단백질의 결합 부위 사이의 모든 거리(예를 들면, Smith et al.(2000) Nucleic Acid Res. 28:3361-3369; Bibikova et al.(2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297) 및 각각의 융합 단백질에서 ZC 링커의 길이에 의존할 수 있다. See, also, 미국 특허 공개 20050064474A1 및 국제 특허 공개 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809.
특정 구체예에서, 절단 도메인은 모두가 결합 도메인, 제 1 절단 하프-도메인 및 제 2 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부인, 두 개의 절단 하프-도메인을 포함한다. 절단 하프-도메인은 그들이 DNA를 절단하기 위해 기능하는 한, 동일한 아미노산 서열 또는 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 절단 하프-도메인은 분리된 분자로 제공될 수 있다. 각각의 폴리펩티드가 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함할 때, 예를 들면, 두 개의 융합 폴리펩티드는 세포 내로 도입될 수 있다. 절단 하프-도메인은 그들이 DNA를 절단하기 위해 기능하는 한, 동일한 아미노산 서열 또는 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 나아가, 결합 도메인은 융합 폴리펩티드의 결합에서, 두 개의 절단 하프-도메인은 절단 도메인의 재구성(예컨대, 하프-도메인의 이량체화에 의해)을 허용하는 각각 다른 공간적 방향으로 제시되는 것과 같은 방법으로 전형적으로 배치되는 표적 서열에 각각 결합하고, 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 서로와 연관된 하프-도메인을 위치시켜, 관심 있는 영역에서 세포 내 염색질에서 관심 있는 영역의 절단을 야기한다. 일반적으로, 재건된 절단 도메인에 의한 절단은 두 개의 표적 서열 사이에 위치한 부위에서 일어난다. 단백질의 하나 또는 둘 다는 그것의 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다.
두 개의 융합 단백질은 동일하거나 반대의 극성으로 관심 있는 영역에 결합할 수 있고, 그들의 결합 부위(즉, 표적 부위)는 임의의 수의 뉴클레오티드, 예컨대 0 내지 200 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 정수에 의해 분리될 수 있다. 특정 구체예에서, 각각 징크 핑거 결합 도메인 및 절단 하프-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질에 대한 결합 부위는 다른 결합 부위와 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 재었을 때, 5 및 18 뉴클레오티드 사이로 떨어져, 예를 들면, 5-8 뉴클레오티드 떨어지거나, 15-18 뉴클레오티드 떨어지거나, 6 뉴클레오티드 떨어지거나, 16 뉴클레오티드 떨어져 있을 수 있고, 절단은 결합 부위 사이에서 일어난다.
DNA가 절단되는 부위는 일반적으로 두 개의 융합 단백질에 대한 결합 부위 사이에 놓여진다. DNA의 이중-사슬 틈은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 상쇄되는 두 가지 단일-사슬 틈 또는 “닉”으로부터 종종 야기된다(예를 들면, 천연 Fok I에 의한 이중-사슬 DNA의 절단은 4개 뉴클레오티드에 의해 상쇄되는 단일-사슬 틈으로부터 야기된다). 따라서, 절단은 각각의 DNA 사슬에서 정확히 반대되는 부위에서 일어날 필요는 없다. 게다가, 융합 단백질의 구조 및 표적 부위 사이의 거리는 절단이 단일 뉴클레오티드 쌍에 근접하여 일어나거나 절단이 여러 부위에서 일어날 때 영향을 받을 수 있다. 그러나, 표적된 재조합 및 표적된 돌연변이 유발(상기 참조)을 포함하는 많은 적용에서, 일련의 뉴클레오티드 내의 절단이 일반적으로 충분하며, 특정 염기쌍 사이의 절단은 요구되지 않는다.
앞서 언급한 바와 같이, 융합 단백질은 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로서 도입될 수 있다. 예를 들면, 전술한 폴리펩티드 중 하나를 암호화하는 서열을 각각 포함하는 두 개의 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입시킬 수 있고, 폴리펩티드가 발현되고 각각 그것의 표적 서열에 결합할 때, 절단이 표적 서열 또는 그 근처에서 일어난다. 대안적으로, 둘다 융합 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 임의의 변형된 형태 또는 유사체 또는 DNA 및/또는 RNA일 수 있다.
절단 특이성을 향상시키기 위해, 또한 추가적 조성물을 본원에서 기술한 방법에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 단일 절단 하프-도메인은 제한된 이중-사슬 절단 활성을 보일 수 있다. 각각 3-핑거 징크 핑거 도메인 및 절단 하프-도메인을 함유하는 두 개의 융합 단백질이 세포로 도입된 방법에서, 둘 중의 하나의 단백질은 대략 9-뉴클레오티드 표적 부위를 지정한다. 18개 뉴클레오티드의 집합한 표적 서열이 포유동물 및 식물 게놈에서 유일할 것 같을지라도, 임의의 주어진 9-뉴클레오티드 표적 부위가 인간 게놈에서 대략 23,000번 평균적으로 나타난다. 따라서, 단일 하프-도메인의 부위-특이적 결합에 따른 비-특이적 절단이 일어날 수 있다. 따라서, 본원에서 기술한 방법은 두 개의 융합 단백질과 함께 세포에서 발현되는 Fok I(또는 이를 암호화하는 핵산)과 같은 절단 하프-도메인의 우성-음성 돌연변이의 사용을 심사숙고한다. 우성-음성 돌연변이는 이량체화될 수 있지만, 절단 할 수 없고, 또한 이량체화시키는 하프-도메인의 절단 활성을 막는다. 융합 단백질에 대하여 초과되는 몰농도로 우성-음성 돌연변이를 제공함으로써, 모든 융합 단백질이 결합하는 영역에서만 이량체화 및 절단이 일어나기 위한 기능적 절단 하프-도메인의 충분히 높은 국소 농도를 가질 것이다. 두 개의 융합 단백질 중 오직 하나만이 결합하는 부위에서, 그것의 절단 하프-도메인은 우성-음성 돌연변이 하프-도메인을 갖는 이량체를 형성할 것이고, 바람직하지 못한 비-특이적 절단이 일어나지 않는다.
발현 벡터
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질(예: ZFN)을 암호화하는 핵산을, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 형질전환시키기 위한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 벡터는 원핵성 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀(shuttle) 벡터, 곤충 벡터 또는 진핵성 벡터일 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 또한, 식물 세포에 투여하기 위해, 발현 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다.
융합 단백질(예: ZFN)을 발현하기 위해, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 서열을 전형적으로, 전사를 지시하기 위한 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 적합한 세균성 및 진핵성 프로모터가 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., supra. Bacterial expression systems for expressing the ZFP are available in, e.g., E. coli, Bacillus sp., and Salmonella(Palva et al., Gene 22:229- 235(1983))]에 기재되어 있다. 이러한 발현 시스템용 키트가 시판되고 있다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵성 발현 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 또한 시판되고 있다.
ZFP -암호화 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용된 프로모터는 특별한 적용에 좌우된다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성성 프로모터가 ZFP 의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
이와는 달리, 식물 유전자의 조절을 위해 융합 단백질을 생체내 투여하는 경우(하기 "식물 세포로의 핵산 전달" 섹션 참조), 융합 단백질의 특별한 용도에 따라서 구성성 또는 유도성 프로모터를 사용한다. 식물 프로모터의 비제한적 예에는 에이. 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3(ubi-3)(문헌 [Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493] 참조)로부터 유래된 프로모터 서열; 에이. 투미파시엔스(A. tumifaciens) 만노핀 합성효소(Δmas)(문헌 [Petolino et al., 미국 특허 제6,730,824호] 참조)로부터 유래된 프로모터 서열; 및/또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스(CsVMV)(문헌 [Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139] 참조)로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 또한, 실시예를 참조하라.
프로모터 이외에도, 발현 벡터는 전형적으로, 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 핵산을 발현시키는 데에 요구되는 모든 추가적인 요소를 함유하는 발현 카세트 또는 전사 단위를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터, 및 예를 들어, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 해독 종결에 요구되는 신호를 함유한다. 상기 카세트의 부가 요소에는, 예를 들어 증강인자, 이종 스플라이싱 신호 및/또는 핵 국재화 신호(NLS)가 포함될 수 있다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하기 위해 사용되어 온 특별한 발현 벡터는 융합 단백질의 의도한 용도, 예를 들어 식물, 동물, 세균, 진균, 프로토조아 등에서의 발현과 관련하여 선별된다(하기 언급되는 발현 벡터 참조). 표준 세균성 및 동물 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제 20050064474A1호 및 국제 특허 공개공보 WO 05/084190, WO 05/014791 및 WO 03/080809에 상세히 기재되어 있다.
*표준 형질감염 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 세균성, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생성시킨 다음, 표준 기술을 이용하여 이를 정제할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622(1989)]; [Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182(Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵성 및 원핵성 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라서 수행한다(예를 들어, 문헌 [Morrison, J. Bact. 132:349-351(1977)]; [Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al., eds., 1983)] 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포 내로 도입하기 위한 널리 공지된 모든 과정을 사용할 수 있다. 이들 과정에는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 [예: 소노포레이션(sonoporation)], 리포솜, 미소주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 에피솜성 및 통합성 둘 다의 바이러스성 벡터를 사용하는 방법, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하는 것으로 널리 공지된 기타 모든 방법이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 상기] 참조). 선택되는 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 하나 이상의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있는 특별한 유전자 조작 과정을 사용하는 것만이 필요하다.
식물 세포로의 핵산 전달
앞서 인지된 바와 같이, DNA 컨스트럭트를 각종 통상적인 기술에 의해 목적하는 식물 숙주 내로(예를 들어, 목적하는 식물의 게놈 내로) 도입할 수 있다. 이러한 기술에 관한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Weissbach & Weissbach Methods for Plant 분자적 Biology(1988, Academic Press, N. Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology(1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조할 수 있다.
예를 들어, DNA 컨스트럭트는 식물 세포 원형질체의 미소주사 및 전기천공과 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 컨스트럭트는 바이오리스틱(biolistic) 방법, 예컨대 DNA 입자 충격을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Klein et al.(1987) Nature 327:70-73] 참조). 대안적으로, DNA 컨스트럭트는 적합한 T-DNA 경계/플랭킹 영역과 합하고, 이를 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환 기술(이원 벡터의 사용 및 완화(disarming) 포함)은 과학 문헌에 널리 보고되었다(예를 들어, 문헌 [Horsch et al.(1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al.(1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조).
또한, 유전자 전이는 비-아그로박테리움 세균 또는 바이러스, 예컨대 리조븀 종 NGR234, 시노리조보윰 멜리로티, 메소리조븀 로티, 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Chung et al.(2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4] 참조).
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독력 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터를 이용하여 세균에 의해 감염되거나(Bevan(1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721 참조) 또는 공동-배양 과정(Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231 참조)에 의해 감염되는 경우에, 해당 컨스트럭트 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템을 사용하여 쌍자엽 식물을 조작시킨다(Bevan et al.(1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al.(1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 아그로박테리움 형질전환 시스템을 또한 사용하여, DNA를 외떡잎 식물 및 식물 세포로 전이시킬 수 있을 뿐만 아니라 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,591,616호; Hernalsteen et al.(1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al.(1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al.(1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al.(1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould et al.(1991) Plant Physiol. 95:426-434를 참조하라.
또 다른 유전자 전이 및 형질전환 방법에는 있는 그대로의(naked) DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)- 또는 전기천공-매개된 흡수를 통한 원형질체 형질전환(Paszkowski et al.(1984) EMBO J 3:2717-2722;Potrykus et al.(1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al.(1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto(1989) Nature 338:274-276 참조) 및 식물 조직의 전기천공(D'Halluin et al.(1992) Plant Cell 4:1495-1505 참조)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 식물 세포를 형질전환시키기 위한 추가적인 방법에는 미소주사, 탄화규소 매개된 DNA 흡수(Kaeppler et al.(1990) Plant Cell Reporter 9:415-418 참조), 및 미소발사체 충격(Klein et al.(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm et al.(1990) Plant Cell 2:603-618 참조) 또는 나노입자가 포함된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 외인성 서열을 식물 세포 게놈 중의 예정된 위치(예를 들어, Zp15 유전자) 내로 삽입시킬 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 트랜스-유전자의 발현이 결정적으로 그의 통합 부위에 의존하기 때문에 유용하다. 따라서, 예를 들어 제초제 내성, 해충 저항성, 영양분, 항생제 또는 치료용 분자를 암호화하는 유전자는 표적화 재조합에 의해, 그들의 발현에 호의적인 식물 게놈 영역 내로 삽입할 수 있다.
상기 모든 형질전환 기술에 의해 생성되는 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고 있으므로 목적하는 표현형을 지닌 완전 식물을 생성시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 전형적으로 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입시킨 살생제 및/또는 제초제 마커에 따라서, 조직 배양 성장 배지에서 특정의 식물 호르몬을 조작하는 것에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 Evans, et al., "protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, regeneration of Plants, Plant protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985에 기재되어 있다. 재생은 또한, 식물 캘러스, 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 수득할 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로 Klee et al.(1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 기재되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여 거의 모든 식물에 대해 목적하는 형질을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 핵산 컨스트럭트 및 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여, 본원에 기재된 목적하는 생리학적 및 농경학적 특징을 위해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작시키기 위한 표적 식물 및 식물 세포에는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물, 예컨데 낟알 작물(예: 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물(예: 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물(예: 알팔파), 근채류 작물(예: 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물(예: 상추, 시금치)을 포함한 작물; 화훼(예: 페투니아, 장미, 국화), 침엽수(conifers) 및 소나무(예: 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물 환경복원에 사용된 식물(예: 중금속 축적 식물); 오일 작물(예: 해바라기, 평지씨) 및 실험용으로 사용된 식물 [예: 아라비도프시스(Arabidopsis)]이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캡시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리게론(Erigeron), 글리신(Glycine), 고시퓸(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카(Lactuca), 롤륨(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.
당업자는 외인성 서열을 트랜스제닉 식물에 안정적으로 혼입시키고 이것이 작동 가능하다는 것을 확인한 후에, 이를 유성 교배에 의해 기타 식물 내로 도입할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 교배하고자 하는 종에 따라서, 수많은 표준 육종 기술을 사용할 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘루스, 조직 또는 식물은 형질전환성 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 형질을 알아보기 위해, 조작시킨 식물 물질을 선별 또는 스크리닝함으로써 확인하고 단리시킬 수 있다. 예를 들어, 선별은 조작시킨 식물 물질을, 형질전환성 유전자 컨스트럭트가 내성을 부여한 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한, 재조합 핵산 컨스트럭트 상에 존재할 수 있는 모든 가시적 마커 유전자(예: β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 Cl 유전자)의 활성을 알아보기 위해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이러한 선별 및 스크리닝 방법론은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 삽입된 유전자 컨스트럭트를 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이들 방법에는 1) 재조합 DNA 삽입물의 구조를 탐지하고 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 컨스트럭트의 RNA 전사체를 탐지하고 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 이러한 유전자 생성물이 유전자 컨스트럭트에 의해 암호화되는 경우, 효소 또는 리보자임 활성을 탐지하기 위한 효소적 검정; 4) 유전자 컨스트럭트 생성물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소 결합 면역검정(ELISA)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적인 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색을 또한 사용하여, 특이적 식물 기관 및 조직 내에서의 재조합 컨스트럭트의 존재 또는 발현을 탐지할 수 있다. 이들 검정 모두를 수행하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 기재된 방법을 이용하는 유전자 조작의 효과는, 예를 들어 관심 있는 조직으로부터 단리된 RNA(예: mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나 mRNA의 양이 증가하였다면, 상응하는 트랜스-유전자가 발현되는 것으로 추정될 수 있다. 유전자 및/또는 암호화된 폴리펩티드 활성을 측정하는 기타 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 탐지하는 방법에 따라서, 상이한 유형의 효소적 검정을 이용할 수 있다. 또한, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 널리 공지된 기타 항체 의거 검정, 예를 들어 전기영동적 탐지 검정(염색 또는 웨스턴 블롯팅을 이용한다)에 의해 측정할 수 있다. 한 가지 비제한적 예로서, ELISA 검정을 이용하여 AAD-1 및 PAT 단백질을 탐지하는 방법이 미국 특허원 제11/587,893호(그의 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다. 트랜스-유전자는 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스-유전자는 실질적으로 그의 전체 생활 주기를 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 어떠한 조합 발현 양식도 적용 가능하다.
본 개시내용은 또한, 원하는 변형된 오일 프로파일을 갖는 종자를 포함하여, 트랜스-유전자 또는 유전자 컨스트럭트를 갖고 있는, 상기 언급된 트랜스제닉 식물의 종자를 포괄한다. 본 개시내용은 추가로, 트랜스-유전자 또는 유전자 컨스트럭트를 갖고 있는, 상기 언급된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 포괄한다.
유효량의 투여는 처리하고자 하는 식물 세포와 궁극적으로 접촉하여 융합 단백질을 이러한 식물 세포 내로 도입하기 위해 통상 사용되고 있는 모든 경로에 의해서이다. ZFP는 바람직하게 허용되는 담체와 함께, 적합한 어떠한 방식으로든지 투여한다. 상기 조정 인자를 투여하는 데 적합한 방법은 당업자에게 이용 가능하고 널리 공지되어 있으며, 한 가지 이상의 경로를 사용하여 특별한 조성물을 투여할 수도 있지만, 특별한 경로는 종종, 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 유효한 반응을 제공할 수 있다.
운반을 또한 사용할 수 있는데, 이는 투여되는 특별한 조성물에 의해서 뿐만 아니라 이러한 조성물을 투여하기 위해 사용된 특별한 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용 가능한 광범위한 적합한 조성물의 제형이 존재한다.
적용
앞서 언급한 바와 같이, 지방산 합성에 포함된 유전자의 표적된 조절이 원하는 지방산 프로파일의 식물 오일을 빠르고 효율적으로 생성하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 카놀라와 같은 오일-생산 식물로부터 식물 오일의 지방산 조성물을 변경하는 것은 식품 생산, 나아가 음식 건강에 깊은 영향을 갖는다. 예를 들면, 시드 오일에서 포화 지방산의 감소된 수준을 갖는 카놀라-품질 오일종자 유채 종류는 심장 혈관 건강을 촉진하는 식제품을 생산하는데 사용될 수 있다. 본원에서 기술한 방법 및 조성물은 식물 오일에서 포화 지방산의 수준을 감소시키는 낮은 팔림트산 및/또는 스테아르산 함유량을 갖는 오일-생산 식물을 생성하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 또한 올레산 함유량의 증가된 수준을 갖는 오일-생산 식물을 생성하는 것이 식물 오일에서 포화 지방산의 양을 감소시킬 것이다.
게다가, 본원에서 기술한 방법 및 조성물은 예를 들면, 이런 식물에서 생산된 오일에서 팔미트산을 증가시키는데 사용될 수 있다. 팔미트산 함유량이 높은 오일은 마가린의 제형에 특히 유용하다.
게다가, 본원에서 기술한 바와 같은 지방산 프로파일의 표적된 변경은 리놀렌산이 낮은 식물(또는 식물 오일)을 생성하는데 유용하게 사용될 수 있다. 낮은 리놀렌산 오일은 증가된 안전성을 보이고; 이들 오일을 사용하여 만든 음식은 높은 리놀렌산이 있는 식물 재료로 만든 음식만큼 빨리 맛이나 향기에 있어서 떨어지지 않는다.
실시예
하기는 본 개시 내용을 실시하기 위한 특이적 구체예의 실시예이다. 실시예는 설명의 목적으로만 오직 제공되고 어떤 방법으로도 본 개시 내용의 범주를 제한하는 것으로 의도하지 않는다.
사용된 수치 (예: 양, 온도 등)에 관해서는 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 물론 일부 실험상의 오차 및 편차도 허용되어야 한다.
실시예 1: 유채 L에서 표적 서열 식별
1.1 표적 서열 식별
본 실시예에서, 유채 L(카놀라) 고유의 β-케토아실-ACP 합성효소 II(KAS II) 효소를 암호화하는 내재적 DNA 서열을 확인하였다. 이들 유전자는 지방산 생합성의 원하는 변형 및 수반하여 변경된 씨드 오일 프로파일을 야기하는 조작된 징크-핑거 단백질 전사 인자(ZFP TF)에 의한 전사적 조절을 설명하기 위한 예시적인 표적으로서 선별되었다. 효소 β-케토아실-ACP 합성효소 II는 16:0-ACP에서 18:0-ACP로의 전환 및 올레산의 이후의 형성을 촉진시킨다(Ohlrogge and Browse, 1995, Plant Cells, 7: 957-970). β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 보고된 애기장대 fab1 돌연변이는 효소 활성을 65% 감소시켰고, 이와 수반하여 잎 및 뿌리에서 각각 7% 및 3%로 스테아르산 함유량을 증가시켰다(Wu et al., 1994, Plant Physiology, 106: 143-150). 안정적으로 발현되는 형질전환된 콩 β-케토아실-ACP 합성효소 II 트랜스유전자는 카놀라에서 종자 팔미트산 함유량을 0.8%로 감소시켰고, 담배로의 동일한 유전자의 도입은 팔미트산 함유량을 2%로 감소시켰다(일본 특허 공개 # 501446/1995).
β-케토아실-ACP 합성효소 II의 cDNA 서열은 애기장대(GenBank: AF318307) 및 유채(GenBank: AF244520)를 포함하는 다수의 식물 종으로부터 보고되었다. 애기장대 및 유채 cDNA 서열(GenBank: AF318307 및 AF244520, 각각)의 정렬은 F244520 서열이 완전하지 않음을 보여주었다(도 7). 이 불완전하게 절단된(truncated) 유채 DNA 서열은 5' 말단에서 수백개의 염기쌍이 결여되어 있었다. 게다가, 유채가 B. rapa(2n = 20, AA) 및 B. oleracea(2n = 18, CC)(Morinaga, 1934, Cytologia, 6:62-67; U.N., 1935, Japanese J. Bot., 7:389-452)의 염색체 세트의 조합으로부터 야기된 복이배체 종이므로, 이 종에서 하나 이상의 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자가 있을 것으로 예상하였다. 이들 5' β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 서열은 본 실시예에서 ZFP-TF에 의해 전사적 상향 조절의 표적으로서 제공되었다.
1.2 총 RNA 분리
총 RNA를 Qiagen's RNEASYPLANT MINI KIT(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 꽃이 만발한 지(DAF) 15일 후에 유채(카놀라) 유전자형 Nex710(Crop Certificate 99-7049208-501)의 비성숙 종자에서 분리하였다. 총 mRNA는 정량적 RT-PCR 도중에 증폭될지도 모르는 임의의 오염된 DNA를 제거하기 위해 제조사의 권고대로 RNase-프리 DNase로 처리하였다.
1.3 5' RACE 및 서열 분석
유채 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(GenBank AF244520)의 5' 끝에 특이적인 cDNA 말단 급속 증폭(RACE)을 Ambion(Ambion, Austin, TX)에서 나온 FIRSTCHOICERLM-RACE 키트를 사용하여 제조사위 권고에 따라 수행하였다. 5' cDNA 서열을 얻기 위하여, 합성 RNA 어답터를 5' 언캡(uncapped) mRNA 영역에 어닐링시켰다. 키트에서 제공된 프라이머(5'-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAA-3')(서열번호 1) 및 일부 유채 cDNA 서열(GenBank AF244520) 내에 결합하도록 설계된 제 2 프라이머(5'-CTCGAGCTGCTACTGCTAGTTCCGGTGGAGGAGCC-3')(서열번호 2)를 알려지지 않은 상류 서열을 결정하기 위해 단편을 증폭하는데 사용하였다. 5' RACE 증폭으로 새로운 유채 서열의 약 500 염기쌍을 확인하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자(서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 46, 및 서열번호 30)의 완전히 다른 4개의 5' cDNA 서열의 콘티그(Contig)를 증폭된 서열이 정렬되었을 때 확인하였다(도 8). 이들 5' 서열은 동일한 영역에서 B. rapa(GenBank: AC189461) 및 B. oleracea(GenBank: BH723504) 서열에 대한 높은 상동성 수준을 보여주었다.
ZFP TF 결합 서열은 β-케토아실-ACP 합성효소 II유전자의 5' cDNA 서열에서 확인하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 상류 영역에서 나온 서열(표 2)는 ZFP TF 결합에 대한 표적(표 1)으로서 제공되었다. 조작된 ZFP TF 설계를 함유하는 플라스미드 컨스트럭트: pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697, 및 pDAB4698을 다음 섹션에서 기술한 바와 같이 유채를 안정적으로 형질전환시키기 위해 사용하였다. 식물 세포에서의 발현에서 조작된 ZFP TF가 내재적 β-케토아실-ACP 합성효소 II 표적에 결합하고, 표적의 변형된 mRNA 발현을 야기할 것으로 가정하였다.
실시예 2: β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자에 특이적인 ZFP DN결합 도메인의 설계
징크 핑거 단백질을 유채 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 프로모터 영역 및 5' 비번역 및 번역 영역에서 다양한 표적 부위에 대하여 설계하였다. 도 2를 참조하라. 대표적인 ZFP 설계에 대한 인식 헬릭스는 아래 표 1에서 보여준다. 징크 핑거 설계의 표적 부위는 아래 표 2에서 보여준다.
β-케토아실-ACP 합성효소 II징크 핑거 설계
ZFP F1 F2 F3 F4 F5 F6
14025 RSDNLSV
(서열번호 5) 		QKINLQV
(서열번호 6) 		RSDTLSE(서열번호 7) TRSSRIN
(서열번호 8) 		RSDALAR(서열번호 9) N / A
14033 RSDHLSA(서열번호 10) TSSSRIN
(서열번호 11) 		RSDNLAR(서열번호 12) DRSHLAR(서열번호 13) RSDNLSE(서열번호 14) RNAHRTT
(서열번호 15)
14035 QSGNLAR(서열번호 16) RSDHLSE(서열번호 17) QKANRTK(서열번호 18) RSDDLTR(서열번호 19) TSANLSR
(서열번호 20)		 N / A
14047 RSDDLSK(서열번호 21) RSANLTR(서열번호 22) RSDDLTR(서열번호 19) RSDHLSE(서열번호 17) DKSNRKK(서열번호 23) N / A
β-케토아실-ACP 합성효소 II 징크 핑거의 표적 부위
ZFP 표적 부위(5' 내지 3') 서열번호에서 나타나는 ZFP 표적 / 결합 부위
14025 cGTGGAGACGtCAAAAGa(서열번호 24) 3, 4, 46 및 30
14033 aAGGAAGGGCGAGAAAAGGg(서열번호 25) 3 및 4
14035 aGATGCGTAACAGGAAg(서열번호 26) 3, 4, 46 및 30
14047 cTACCGGGCGGAGTCGt(서열번호 27) 3, 4 및 30
β-케토아실-ACP 합성효소 II 설계는 CCHC 구조가 있는 적어도 하나의 핑거를 갖는 단백질을 암호화하는 징크 핑거 발현 벡터로 통합되었다. 미국 특허 공개 No. 2008/0182332를 참조하라. 특히, 각각의 단백질에서 마지막 핑거는 CCHC 구조(건축)를 가졌다.
이후 징크 핑거-암호화 서열은 VP16 활성화 도메인 및 오파크-2 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열로 융합시켰다. 융합 단백질의 발현은 애기장대 유비퀴틴 10(AtUbi10) 프로모터로부터 유래한 프로모터와 같이 상대적으로 강한 구조적 프로모터에 의해 조종되었다. 예시적인 벡터를 아래 표 3에서 보여준다.
실시예 3: 유채에서 고유한 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 ZFP TF-매개 상향 조절
식물 세포에서 설계된 징크-핑거 단백질의 기능성을 확인하기 위하여, 살아있는 식물 세포에서 이런 단백질의 발현을 위한 방법을 사용하였다. 징크-핑거 단백질을 암호화하는 DNA를 DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되지 않는 조건 하에서 식물 세포로 전달할 수 있다. 따라서, DNA 분자는 식물 세포에서 일시적으로 유지되고, 유전자 발현의 주형으로서 활동한다. 대안적으로, 징크-핑거 단백질을 암호화하는 DNA는 DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되는 것을 허용하여, 징크-핑거 단백질 암호화 유전자의 형질전환을 야기하여, DNA 분자가 식물 세포에서 안정적으로 유지되고, 유전자 발현의 주형으로서 활동하는 조건 하에서 식물 세포로 전달될 수 있다. 당업자는 살아있는 식물 세포에서 이들 단백질의 기능성을 평가하기 위해 징크-핑거 단백질 암화화 DNA의 일시적이거나 형질전환된 발현 중 어느 하나를 사용할 수 있다.
3.1 컨스트럭트 설계
본 프로젝트를 위하여 설계되고 구축된 바이너리 플라스미드를 표 3에 나열하였다.
유채 KAS II를 표적하는 ZFP TF에 대한 컨스트럭트 서술
S.N. ZFP 컨스트럭트 No. 유전자 카세트
1 14025 pDAB4695 Atubi10 / ZFP1-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1
2 14033 pDAB4696 Atubi10 / ZFP2-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1
3 14035 pDAB4697 Atubi10 / ZFP3-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1
4 14047 pDAB4698 Atubi10 / ZFP4-Vp16 / AtuORF23 / CsVMV / pat / AtuORF1
AtUbi10 = 애기장대 유비퀴틴 10 프로모터, CsVMV = 카싸바 베인 모자이크 바이러스 프로모터, ZFP = 징크 핑거 단백질 유전자, pat = 포스피노트리신 아실 트랜스퍼라아제 유전자, AtuORF1 = 아그로박테리움 투멘파시엔스3' UTR 1 및 AtuORF23 = 아그로박테리움 투멘파시엔스 3' UTR 23.
pDAB4695는 14025 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역(Thompson et al., 1997, WO9727207)) :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) :: 14025 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1(아그로박테리움 투멘파시엔스 전사해독틀 23, 3'비번역 영역(Gelvin et al., 1987, EP222493)) :: CsVMV 프로모터 v2(카싸바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139)):: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(Wohlleben et al., 1988, 유전자 70:25-37)):: AtuORF 1 3'UTR v4(아그로박테리움 투멘파시엔스 전사해독틀 1, 3'비번역 영역(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822))을 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 4025 v3 징크 핑거 / VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8221로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14025 v3 징크 핑거/ VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8221은 L-R Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4696은 14033 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8222로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14033 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8222는 L-R Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4697은 14035 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8222로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14035 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8223는 L-R Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4698은 14047 v3/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 함유하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소; RB7 MAR v3 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 :: CsVMV 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4를 포함한다. 바이너리는 NcoI-SacI 제한 부위를 통해 pDAB3916으로 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합을 함유하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구축되었다. pDAB8224로서 표지된 결과적인 컨스트럭트는 AtUbi10 프로모터 v2 :: 14047 v3 징크 핑거/VP16 융합 :: Atu ORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 함유한다. pDAB8224는 L-R Gateway반응(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB7309 바이너리로 클로닝되었다. 이 반응은 pDAB4695을 생산하였고, 제한효소 절단 반응 및 서열분석 반응을 통해 확인하였다.
3.2 아그로박테리움 형질전환
아그로박테리움 세포를 Weigel D., Glazebrook J. Arabidopsis thaliana: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002: pg123-124에서 기술된 프로토콜을 사용하여 전기천공을 위해 준비하였다. 사소한 변형을 아그로박테리움의 최적 성장을 허용하기 위해 프로토콜에 대하여 만들었다(즉 YEP 배지를 LB로 치환하였다). 독립적으로, 각각의 컨스트럭트에 대하여 1.5-3 μg의 플라스미드 DNA를 50 μl의 C58 :: Z707 아그로박테리움 투메파시엔스 세포에 첨가하였고, 부드럽게 섞었다. 혼합물을 차가운 0.2 cm 유전자 PULSERcuvettes(BioRad Hercules, CA)로 옮긴 후 얼음에 두었다. 큐벳을 차가운 유전자 PULSERrack(BioRad, Hercules, CA)에 위치시킨 후 하기 조건에서 전기천공시켰다: 정전 용량 출력 25 μFarad, 정전 용량 증량 960 μFarad, 저항 200 ohms, 및 전압 2.5 kVolts. 전기천공 바로 후에, 950 μl의 SOC 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가하였고, 혼합물을 Falcon 2059 튜브(Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) 또는 등가물로 옮겼다. 형질전환된 세포를 이후 28℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 50 μl, 100 μl, 및 200 μl의 세포를 분리된 약간의 항생제를 함유하는 YEP 배지 플레이트에 도말하였다(1리터의 물에 10 gm 효모 추출물, 10 gm 펩톤, 5 gm NaCl, 10 gm 수크로오스, 및 15 gm 아가). 플레이트를 대략 36~48시간 동안 28℃에서 거꾸로 키웠다. 단일 콜로니를 집어서 약간의 항생제를 함유하는 50 ml의 액체 YEP(1 리터의 물에 10 gm 효모 추출물, 10 gm 펩톤, 5 gm NaCl, 및 10 gm 수크로오스)에서 대략 36시간 동안 28℃에서 증식시켰다.
아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 케토락토오스 테스트를 통해 확인하였다. 추정적으로 형질전환된 콜로니를 락토오스 아가에 획선 접종하였고, 48시간 동안 28℃에서 배양하였다. 이후 플레이트를 베네틱트 용액에 담그었다. 플레이트를 모니터링하였다: 획선 접종된 분리체가 베네딕트 용액을 파란색에서 노란색으로 바꾸면 아그로박테리움으로서 확인되었다(Bouzar, H., Jones, J., Bishop, A. Simple Cultural Tests for Identification of Agrobacterium Biovars. Methods in Molecular Biology, Volume 44. Humana Press, 1995: 9-13).
QIAGEN 저카피 미니-프렙 프로토콜(Qiagen, Valencia, CA)을 마친 다음, 정제된 플라스미드 DNA를 박테리아 배양으로부터 준비하였다. DNA 완전성을 제한 절단반응을 통해 평가하였다. 예상된 밴드 패턴을 갖는 클론을 확인하였고, 500 μl의 박테리아아 배양을 500 μl의 멸균된 글리세롤(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)에 첨가하고 혼합하기 위해 인버팅하여 글리세롤 스탁으로 준비하였다. 글리세롤 스탁은 드라이아이스에서 얼린 뒤, -80℃에서 보관하였다.
3.3 ZFP TF가 있는 유채의 형질전환
하배축 부분의 준비: 유채 유전자형, Nex 710의 종자를 10%의 시판용 표백제로 10분 동안 표면-살균하고, 멸균수로 3번 헹구었다. 종자를 멸균 종이 타월로 건조시키고, MS 기초 배지(Murashige and Skoog, Physiol Plant 15(3): 473-497, 1962), 20 g/L 수크로오스, 및 8 g/L TC 아가(PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS)의 절반 농도로 구성되는 '발아 배지'를 함유하는 피타-트레이에 위치시키고 23℃, 및 16시간 명/8시간 암의 명주기로 설정된 상황 하에서 유지시켰다.
5일 째에, 묘목이 불모인지 확인하고, 피타-트레이를 불모를 유지시키기 위해 EDGEGARDlaminar flow hood(The Baker Company, Sanford, ME) 안에 위치시켰다. 멸균한 핀셋 및 해부용 가위를 사용하여, 식물을 피타-트레이로부터 제거하였고, 안테나(분열조직 및 떡잎)영역 및 뿌리를 분리하고 버렸다. 하배축을 건조를 막기 위해 요구되는 멸균수를 함유하는 100 x 25mm 페트리 디쉬에 위치시켰다. 하배축을 100 x 25mm 페트리 디쉬의 뚜껑에 위치시키고 #10 외과용 메스를 사용하여 3mm 부분으로 횡단으로 잘랐다. 하배축 부분을 멸균된 필터 종이를 포함하는 7g/L TC 아가로 굳혀진, 30 g/L 수크로오스, 1 mg/L 키네틴 및 1 mg/L 2,4-D를 함유하는 MS 배지로 구성된 캘러스 유도 배지'에 위치시켰다. 플레이트를 깨끗한 STERILITEtub 내로 위치시키고, 앞서 처리한 바와 같이, 3일 동안 동일한 성장 상황 하에서 유지시켰다.
8일 째에, 부분을 이후 30 g/L 글루코오스, ½ 스트렝스 감보르그 비타민(strength Gamborg vitamin)(1968), 215.2 mg/l 키네틴 및 221.04 mg/l 2,4-D를 함유하는 Linsmaier and Skoog 기초 배지(1965)로 구성된 20 mL의 '액체 배양 배지'를 함유하는 100 x 25 멸균 페트리 디쉬로 1시간의 전처리를 위해 옮겼다. '액체 배양 배지'를 하배축 부분으로부터 제거한 후, 50 Klett에서 40mL의 아그로박테리움 부유물(Z707에 pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697 또는 pDAB4698 중 어느 하나를 함유하는)을 약하게 와동시킨 다음 하배축 부분을 함유하는 100 x 25mm 페트리 디쉬에 30분 처리를 위해 부었다. 30분 후, 모든 아그로박테리움 부유물을 더블 스택 피펫을 사용하여 제거하였다. 처리된 하배축을 필터 종이와 함께 '캘러스 유도 배지'로 다시 옮겼고, STERILITEtub로 돌려보냈고, 어두운 뚜껑으로 덮은 뒤, 3일의 공동-경작 기간을 위해 상기와 같은 동일한 성장 상황 하의 배양 룸으로 돌려보냈다. 3일 후, 하배축을 1mg/L HERBIACE를 함유하는 '캘러스 유도 배지'로 직접 위치시켰고, 투명한 뚜껑이 있는 통으로 다시 위치시켰으며, 상기와 동일한 성장 상황을 유지하는 배양 룸으로 돌려보냈다. 1주 후, 하배축을 3 mg/L HERBIACE에서 2주간 나아간 캘러스 발달을 위해 신중히 '캘러스 유도 배지'로 직접 옮겼고, 추가적인 캘러스 발달을 위해 2-8주간 5mg/L HERBIACE에서 신중히 '캘러스 유도 배지'로 옮겼다. 일단 충분한 양의 캘러스가 사용가능하면, 분자적 분석을 위해 제출하였다.
나이든 카놀라 캘러스로부터 나온 식물의 재생: 카놀라 캘러스 조직을 5 mg/L HERBIACE에서 30 g/L 수크로오스, 3 mg/L 벤지아미노퓨린, 0.5 g/L MES[2-(N-모포리온)에탄 설폰산], 5 mg/L 실버 나이트레이트, 1mg/L 제아틴, 250 mg/L 카르베니실린, 300 mg/L 티멘틴 및 7 g/L TC 아가를 함유하는 MS 배지로 구성된'발아 재생 배지'로 신중히 위치시켰고, 플레이트를 3M 테이프로 감싸고, 23℃ 및 16시간 명/8시간 암의 명주기로 조절된 성장 상황 하에 위치하였다. 조직을 이후 5 mg/L HERBIACE에서 0.5 g/L MES, 300 mg/L 티멘틴, 20 g/L 수크로오스 및 7 g/L TC 아가를 함유하는 MS 배지로 구성된 '배아 연장 배지'로 신중히 옮겼다. 묘목을 5 mg/L HERBIACE에서 10 g/L 수크로오스, 0.5 mg/L 인돌레부티르산, 300 mg/L 티멘틴 및 8 g/L TC 아가를 함유하는 ½ MS 배지로 구성되는 '뿌리 발아 배지'로 옮겼다.
in vitro에서 묘목에서 일단 뿌리가 나오면, 그들은 Metro Mix 360을 함유하는 5 ¼ 화분에 심었다. 식물을 깨끗한 단독 컵으로 씌운 뒤, 순응을 위해 콘비론에 위치시켰다. 48-72시간 후, 공기 순환을 위해 컵을 제거하였다. 총 7일이 지난 후, 화분을 더 나아간 발달을 위해 콘비론으로부터 온실 베이로 전환하였다. 식물은 16:8 명주기, 22-24℃의 낮시간 및 밤시간 온도 하에서 자랐다. 첫 번째 꽃대가 꽃눈으로부터 올라오기 시작했을 때, 전체 식물을 이종교배를 막기 위해 셀핑 백으로 씌웠다. 자가-수분으로부터 유래한 종자를 이식 후 약 4달만에 수확하였다.
아그로박테리움의 준비: 처리하기 4일 전에 10 g/L 펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 10 g/L 수크로오스에 더하여 100 mg/L 스펙티노마이신 및 250 mg/L 스트렙토마이신으로 구성되고, 15 g/L 박토 아가로 굳혀진 '반고체 박테리아 성장 배지'로 글리세롤 스탁으로부터 아그로박테리움을 획선접종하였고, 28℃에서 2일 간 배양기(Fisher Scientific Isotemp Incubator)에서 자랐다. 2일 후, 아그로박테리움의 작은 루프를 150mL '액체 박테리아 성장 배지'(상기에서 고체화 제제만 뺌), 250mg/L의 스트렙토마이신 및 100mg/L의 스펙티노마이신을 함유하는 500mL의 멸균한 1회용 바플드 플라스크로 위치시키고, 200 rpm에서 밀봉한 교반기(New Brunswick Scientific Innova 4330 refrigerated incubator shaker), 암조건, 28℃에서 16시간 밤새 자랐다. 16시간 후 아그로박테리움 배양을 교반기에서 제거하였고, 50mL 원심기 튜브로 분주하였다(준비를 위해 35mL을 함유하는 하나, 재확인을 위해 50mL을 함유하는 두 개). 원심기 튜브를 원심기에 위치시키고, 15분 동안 6000rpm으로 원심분리하였고, 이어서 붉은 필터로 Klett 50의 최종 밀도로 '액체 배양 배지'에 재혼탁시켰다.
실시예 4: 형질전환된 캘러스 샘플의 분석
추정적으로 형질전환된 유채 캘러스 샘플을 β-케토아실-ACP 합성효소 II 내재적 유전자, 튜불린 내재적 유전자 및 ZFP TF 트랜스유전자에 대한 mRNA 발현에서의 변경에 대하여 분석하였다. 튜불린 mRNA 수준을 ZFP TF 및 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현을 평준화시키기 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. ZFP TF mRNA 발현 데이터를 형질전환된 칼리(calli)에서 적어도 하나의 기능적 ZFP TF 트랜스유전자의 존재를 확인하기 위해 사용하였다.
4.1 캘러스 샘플 준비
대략 40-50개의 8주령의 유채 캘러스 샘플을 Nex710 하배축 조직의 형질전환 후에 얻었다. 그들은 실시예 3.3에서 기술한 바와 같이 ZFP TF 컨스트럭트, pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697, 및 pDAB4698로 개별적으로 형질전환되었다. 대조군 샘플은 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v3 :: Atu ORF1 3'UTR v3)를 함유하는 대조군 바이너리 컨스트럭트의 형질전환에 의해 얻었다. 모든 샘플은 그들을 수확할 때 까지 HERBIACE보충 세포 배양 배지에서 자랐다.
총 RNA를 QIAGEN RNEASY 96 Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 신선한 캘러스 조직으로부터 준비하였다. RNA를 RNase-프리 DNase로 키트의 지침서에 EK라 임의의 게놈 DNA 오염물을 제거하기 위해 처리하였다. 첫 번째 사슬 합성은 SuperscriptIII Reverse Transcriptase 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA) 제조사의 지침서에 따라 수행하였고, 무작위 헥사머를 사용하여 준비하였다. 합성된 cDNA 사슬을 1:10 및 1:50의 비율로 물에 희석시켰다(이것은 다중 표적을 증폭시키는 PCR을 위한 충분한 주형을 제공한다). 각각의 분주를 독립적으로 20℃에서 보관하였다.
4.2 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 분석
qRT-PCR 반응 혼합을 하기와 같이 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA의 증폭을 위해 수행하였다: 7.5 μL의 2X LC480 Probes Master Buffer(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 10 μM 스탁으로부터 0.3 μL 유전자 특이적 정방향 프라이머(서열번호 28: 5'-TTGACTCGAGCTGCTACTGC-3'; 도 8 정렬에서 서열번호 3에 있어서 뉴클레오티드 위치 544-563), 10 μM 스탁으로부터 0.3 μL 유전자 특이적 역방향 프라이머(서열번호 29: 5'-TTTCCATATCCATCGCAACA-3'; 도 8 정렬에서 서열번호 3에 있어서 뉴클레오티드 위치 588-607), LIGHTCYCLER480 Probes Master(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)로부터 0.15 μL UPL 프로브 #25, 1.5 μL의 10%(w/v) 폴리비닐 피롤리돈-40(PVP-40), 및 3.9 μL 물. UPL 프로브(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)는 핵산을 잠그고, 그러므로 달리 계산된 것 보다 높은 Tm을 갖는다. 모든 성분을 표준 및 미지의 물질을 핸들링하기 전에 냉동고에 넣어두었다. 384-웰 마이크로플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 5분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 10초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 25초간 60℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 1초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 40-50번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480(Roche, Indianapolis, IN) 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 64 염기쌍이었다. 본 PCR 분석에서 사용한 정방향 및 역방향 프라이머 서열은 두 개의 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 표적, 서열번호: 3 및 30(도 8)에서 존재하는 상응하는 서열과 완벽하게 매치하였다. 그러므로, 이 분석은 두 개의 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 표적의 정량적 발현을 나타낸다.
4.3 튜불린 mRNA 발현 분석
튜불린 유전자, 유채의 고유 유전자(GenBank: AF258790 및 GenBank: DU106489)를 qRT-PCR 분석에서 mRNA 발현 신호를 정확히 평준화시키기 위한 참조 표준으로 사용하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II qRT-PCR 분석을 위해 합성된 cDNA(실시예 4.1에서 기술됨)을 또한 아래에서 기술한 바와 같이 튜불린 qRT-PCR 분석에 사용하였다.
qRT-PCR을 DNA를 검출하고 정량하기 위하여 0.3 μL의 유전자 특이적 정방향 프라이머(서열번호 31: 5'-ACAGCGATTGCCTACAAGG-3')(10 μM 스탁) 및 0.3 μL의 유전자 특이적 역방향 프라이머(서열번호 32: 5'-AGATGGTTAAGATCACCAAAGG-3')(10 μM 스탁), 1.5 μL의 10%(w/v) PVP-40, 3.9 μL 물 및 7.5 μL 2X LIGHTCYCLER480 SYBR Green I Master Mix(Roche, Indianapolis, IN)로 수행하였다. 384-웰 마이크로 플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 10분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 10초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 20초간 55.5℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 20초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 39번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 307 염기쌍이었다. 이 역방향 프라이머는 GenBank 서열에 기초하여 78 bp만큼 인트론에 걸쳤다. 그러므로 게놈 DNA로부터 증폭된 증폭 산물은 유리하지 않을 것이고, 게놈 DNA 오염물이 더 높은 분자량을 가질 것이며, 아가로즈 겔에서 내린 증폭 산물에 의해 cDNA의 그것과 쉽게 차이날 것이다.
4.4 ZFP TF mRNA 발현 분석
발현 of ZFP TF mRNA의 발현을 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA(실시예 4.1에서 기술함)를 위해 본래 합성된 cDNA 샘플로 정량하였다. TaqMan PCR 분석을 5'에서 오파크-2 NLS 서열, 3'에서 VP16 서열에 대하여 고정되는 프라이머에 의해 ZFP 카세트로부터 설계하였다. PCR 분석은 : 10 μM 스탁으로부터 0.5 μL 정방향 프라이머 OP2_NLS_F1(서열번호 33: 5'-AAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAG-3'), 10 μM 스탁으로부터 0.5 μL 역방향 프라이머 VP16_R1(SEQ ID 34: 5'-CTTCTGCTCTCCACCGTA-3'), 5 μM 스탁으로부터0.25 μL 프로브 VP16_MGB_185(서열번호 45: 5'-TTGATGGTGAAGATGT-3'), 1.5 μL의 10%(w/v) PVP-40, 1.5 μL 10x Hot Start PCR 버퍼, 1.0 μL 25mM MgCl2, 1.2 μL dNTP(2.5mM each), 0.15 L Hot Start Taq 폴리머라아제(Qiagen, Valencia, CA), 및 6.9 L 물을 사용하여 수행하였고, 칵테일을 LIGHTCYCLER480(Roche Diagnostics, USA)을 사용하여 증폭시켰다. 384-웰 마이크로 플레이트를 분리하여 표지하였고, 13.5 μL의 마스터 믹스를 웰에 첨가하였다. 씰링 포일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 3000 rpm에서 Qiagen microplate centrifuge에서 원심분리하였다. 1.5 μL의 녹인, 희석된 합성 cDNA 사슬을 첨가하였다. 추가적으로, 1.5 μL의 플라스미드 DNA 카피 수 표준을 가장 낮은 것에서 가장 높은 농도의 일련의 희석으로 웰을 분리하여 첨가하였고, 이들 표준은 카피 수를 정량하기 위해 β-케토아실-ACP 합성효소 II cDNA(총 mRNA로부터 합성된)과 비교하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II DNA 카피 수 표준 시리즈를 pCR2.1 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 표적 증폭산물을 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위한 희석 시리즈를 만듦으로써 만들었다. 포일 씰을 플레이트에 단단히 붙이고 앞서 기술한대로 원심분리하였다. PCR 프로그램을 하기와 같이 수행하였다: i. 15분 동안 95℃에서 활성화시킴; ii. 20초간 95℃에서 변성 @ 4.8℃/sec; iii. 20초간 60℃에서 어닐링/연장 @ 2.5℃/sec; iv. 55초간 72℃에서 수득 @ 4.8℃/sec; ii-iv 단계 반복, 449번 이상; 5초 동안 38℃에서 식힘. DNA를 Real-time PCR instrumentation LC480 또는 등가물에서 증폭시켰다. 증폭산물 사이즈는 775 염기쌍이었다. ZFP TF cDNA/mRNA 카피 수는 표적 증폭산물을 플라스미드로 클로닝하고, 상기 실시예에서 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린에 대하여 기술한 바와 같은 PC 분석을 위한 희석물을 만든 표준 시리즈를 사용하여 결정하였다.
4.5 캘러스 샘플의 발현 분석
ZFP TF mRNA 발현을 ZFP TF로 형질전환된 것으로 추정되고 HERBIACE선택 배지(실시예 3 참조)에서 자란 8주령 트랜스제닉 캘러스 샘흘에서 측정하였다. qRT-PCR 분석으로 측정한 것과 같이, ZFP TF 정량적 mRNA 발현은 컨스트럭트를 함유하는 오직 ZFP로만 형질전환된 샘플에서 검출되었지만, 대조군 컨스트럭트를 함유하는 샘플에서는 검출되지 않았다. 이 데이터는 분석이 ZFP TF 발현에 특이적이고 대조군 칼리는 XFP TF 트랜스유전자를 함유하지 않는 것을 가리킨다.
캘러스 샘플들 사이에서 발현 차이를 식별하기 위하여, β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린 mRNA 발현의 비율을 qRT-PCR 결과에 기초하여 계산하였다. β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 가장 높은 mRNA 상향 조절은 pDAB4695 컨스트럭트로 형질전환된 카놀라 캘러스 샘플에서 관찰되었다.(표 4). 이 27% 상향 조절은 대조군 샘플의 그것 보다 통계적으로 유의하였다(p = 0.05).
다른 ZFP TF 컨스트럭트로 형질전환된 유채 캘러스 샘플에서 KASII mRNA 발현
컨스트럭트 분석한 칼리의 수 KasII/튜불린 발현 평균 KasII/튜불린 발현 표준 편차
4695 23 3.69 1.20
4696 20 2.81 0.84
4697 24 3.18 0.93
4698 24 3.03 0.68
대조군 14 2.90 1.12
실시예 5: 형질전환된 T0 식물 샘플의 분석
5.1 β-케토아실-ACP 합성효소 II, 튜불린, 및 ZFP TF mRNA 발현의 분석
pDAB4695 트랜스유전자 컨스트럭트를 함유하는 T0 캐놀라 식물을 6-잎 식물 단계RK지 키웠고, β-케토아실-ACP 합성효소 II 내재적 유전자, 튜불린 내재적 유전자, 및 ZFP TF 트랜스유전자의 mRNA 발현에 대하여 분석하였다. 트랜스제닉 식물을 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v3 :: Atu ORF1 3'UTR v3)를 함유하는 바이너리 컨스트럭트로 형질전환된 대조군 샘플과 비교하였다. 표준 크기 종이 펀쳐로 구멍을 뚫은 6개 잎을 각각의 식물로부터 채취하여 얼음위에 두었고 총 mRNA를 제조사의 지침서에 따라 Qiagen 96-well RNeasy RNA 추출 키트로 추출하였다(Qiagen, Carlsbad, CA). β-케토아실-ACP 합성효소 II, 튜불린, 및 ZFP TF mRNA 발현 분석을 실시예 4에서 개시한 프로토콜을 사용하여 완료하였다.
β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현은 독립적인 트랜스제닉 T0 식물 중 다양하였다. 3배보다 큰 mRNA 상향 소절이 분석된 16개 이벤트 중에서 관찰되었다(도 3). 모든 식물은 ZFP TF 발현에 대하여 양성이었다. 게다가, 27개 대조군 식물을 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 베이스라인을 계산하기 위해 사용하였다. 베이스라인 대조군으로부터 나온 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 평균 발현은 발현의 배수-증가를 계산하기 위하여 개별 ZFP TF 식물 이벤트로부터의 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA의 발현과 비교하였다(도 3). 이들 식물은 T1 종자를 얻기 위해 성숙하도록 키웠다. 꽃이 피기 전에, 모든 식물을 식물 내의 꽃의 자가 수분을 촉진시키기 위해 셀핑 백으로 개별적으로 씌웠다. 이들 식물의 T1 종자를 온실로 그들을 옮긴지 대략 4달만에 수집하였다.
이벤트 3, 6 및 12.2(전후에서 이벤트 12에서 지칭된 것과 같이), 다른 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현 범위를 나타내는 것은 나아간 연구를 위해 선별하였다.
실시예 6: 형질전환된 T1 식물 샘플의 분석
6.1 T1 종자의 지방산 분석
지방산 함유량에 변경에 대한 ZFP TF의 영향을 연구하기 위하여, 단일 종자 지방산 분석을 이벤트 당 24개 각각의 T1 종자에 대하여 실시하였다(표 5). AOCS 방법 Ce2-66(97)에 근거한 지방산 메틸 에스터(FAME) 분석 방법을 사용하였으며 표 5에 모든 숫자는 카놀라 종자에 존재하는 총 지방산의 퍼센트로서 나타냈다.
FAME 분석으로 측정한 각각의 T1 종자의 지방산 프로파일
이벤트 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 총 C18
3 저 2.8 0.3 1.6 76.1 12.2 3.7 93.6
3 저 2.9 0.3 1.4 76.7 11.8 4.0 93.9
3 저 2.9 0.3 1.4 75.7 13.0 3.8 93.9
3 고 3.6 0.3 1.4 75.1 13.0 3.5 93.1
3 고 3.8 0.4 1.4 75.6 12.0 3.8 92.8
3 고 4.0 0.4 1.5 74.8 12.6 3.7 92.5
평균(n = 24) 3.3 0.3 1.5 75.7 12.4 3.8 93.3
표준편차(n = 24) 0.5 0.1 0.1 0.7 0.5 0.1 0.34
12 저 3.1 0.2 1.5 76.4 12.0 3.8 93.6
12 저 3.2 0.3 1.4 77.0 11.5 3.4 93.3
12 저 3.2 0.2 1.8 80.9 7.5 3.2 93.5
12 고 3.6 0.3 1.5 76.8 11.7 3.1 93.2
12 고 3.6 0.3 1.6 76.0 11.9 3.5 93.0
12 고 3.6 0.3 1.8 77.3 10.8 3.0 92.9
평균(n = 24) 3.4 0.3 1.6 77.4 10.9 3.3 93.2
표준편차(n = 24) 0.2 0.0 0.2 1.8 1.7 0.3 0.23
6 저 3.2 0.5 1.9 81.3 8.1 2.1 93.3
6 저 3.3 0.5 1.2 79.6 10.1 2.3 93.1
6 저 3.5 0.5 2.6 80.6 7.5 1.9 92.6
6 고 4.4 0.5 2.4 77.7 10.7 1.5 92.2
6 고 4.5 0.6 2.2 77.1 10.5 1.8 91.6
6 고 4.6 0.7 1.3 77.4 11.0 1.7 91.4
평균(n = 24) 3.9 0.5 1.9 78.9 9.6 1.9 92.4
표준편차(n = 24) 0.6 0.1 0.6 1.8 1.5 0.3 0.54
Nex710 평균(n=216) 3.8 0.4 2.3 78.1 9.5 2.5 92.5
표준편차(n=216) 0.2 0.0 0.6 1.8 1.6 0.7
샘플 준비를 위하여, 각각의 단일 종자를 하나의 1/8 강구(Small Parts, Miramar, FL)가 포함된 96-웰 추출 플레이트 상의 표지된 클러스터 튜브 내에 놓았다. 튜브를 덮고 상기 종자를 3.0분간 1300 스트로크/분으로 GenoGrinder(SPEX CertiPrep Group, Metuchen, NJ) 내 바닥에서 건조시켰다. 덮개를 제거하고 0.6 ㎖의 헵탄을 각 웰에 첨가하였다. 상기 웰을 다시 덮고 추가적인 그라인딩을 위해 2.0분간 1200 스트로크/분으로 GenoGrinder 내에 다시 놓았다. 그런 다음 상기 샘플을 제거하고 3700 rpm으로 10.0분간 6℃에서 원심분리 하였다. Beckman Coulter MC Robot를 이용하여, 상기 상층액을 유리 인서트(glass inserts)(MicroLiter, Suwanee, GA)가 있는 96 웰 플레이트에 옮겼다. 1% 메톡사이드나트륨 40 ㎕를 상기 샘플에 첨가하였다. 상기 메톡사이드나트륨은 메탄올(Fluka/Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 스톡 30% 용액으로부터 희석되었다. 상기 플레이트를 Teflon lined mat로 덮고 GC 분석 전에 4시간 동안 상온에서 배양되도록 하였다.
샘플을 J&W Scientific DB-23 컬럼, 15 m × 0.25 mm ID 컬럼 및 0.25 film thickness(J&W Scientific, Folsom, CA)가 장착된 Agilent 6890 GC-FID(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 지방산 함유량에 대해 분석하였다. 상기 초기 오븐 온도는 200℃였고, 이러한 온도는 작동 기간 동안 유지되었다. 주입구는 분할비 1:100 및 온도 280℃로 설정되었다. 0.8 ㎖/분 헬륨의 경사진 유속은 초기 2분간 유지되었다. 그런 다음 흐름은 1.0 ㎖/분 내지 2.5 ㎖/분의 속도로 증가되었고 1.5분간 지속되었다. 검출기는 일정한 운반 가스 형성을 가지는 300℃ 및 30 ㎖/분의 컬럼 흐름, 30 ㎖/분의 연료 수소 흐름, 및 400 ㎖/분의 산화제 흐름으로 설정되었다. 2 ㎕의 주입 부피가 모든 샘플에 대해 사용되었다.
각각의 지방산 메틸 에스터 피크는 Waters Corp. Empower 소프트웨어를 사용하여 메틸 에스터 참조 표준(GLC#428, Nu-Chek-Prep, Inc., Elysian, MN)의 유지 시간과 비교함으로써 확인되었다. 각각의 퍼센트 영역은 총 통합된 크로마토그래피 피크 영역을 기초로 상기 참조 표준에서 모든 분석물에 대해 산출되었다. 헵탄 블랭크는 또한 GC 상에서 임의의 오염을 확인하기 위해 시도되었다.
세 개의 가장 낮은 C16:0 수준(아마도 ZFP TF 양성 식물임) 및 세 개의 가장 높은 C16:0 수준(아마도 ZFP TF 널 식물임)과 T1 종자의 비교는 C16:0 함유량에 변화가 상기 ZFP TF 이식유전자의 분리 때문일 수 있다는 것을 나타냈다(표 5). 총 C18(C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3)에서 상응하는 변화는 또한 모든 이벤트에서 관찰되었다; 낮은 C16:0 수준을 가지는 종자는 총 C18 수준이 증가되었고, 그 반대도 또한 같았다. 이는 C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3 각각의 지방산 함유량에 가변성에도 불구하고 형질전환된 상기 Nex710 유전자형에서 fad2 및 fad3 돌연변이 유전자(Hu, X., et al. Theor. Appl. Genet. 2006, 113: 497-507)의 분리 때문이었다. 그러므로, 다음 단계는 유사한 유전적 배경에서 상기 지방산 프로파일에 실제 변화를 검출하기 위하여 각 이벤트의 T1 분리 개체군에 있어서 상기 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기(sibling)를 확인하기 위해 착수되었다.
6.2 T1 식물에서 ZFP TF 존재 분석
ZFP TF 양성 및 널 식물 동기를 확인하기 위하여 모든 세 개의 트랜스제닉 이벤트 3, 6, 및 12의 100-150개의 T1 묘목을 탐색하였다(표 6). 식물들은 상기 ZFP TF 트랜스유전자의 적어도 하나의 전장 카세트의 존재에 대해 검사되었다. QIAGEN PLANT DNEASY extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 이러한 식물의 잎으로부터 총 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 프로토콜은 1%의 최종 농도로 Qiagen 버퍼 AP1에 PVP-40을 첨가함으로써 변형하였다. 상기 정제된 gDNA는 PICOGREENDNA Quantification protocol(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)에 의해 정량하였다. 상기 DNA 샘플을 하기 시약을 포함하는 PCR 분석에 있어서 최소, ZFP TF 트랜스유전자의 하나의 전장 카피의 존재에 대해 분석하였다: 5 ㎕ 10X EX Taq 버퍼(Takara Bio Inc., Otsu, Siga, Japan), 5 ㎕ 10% 폴리바이닐 피롤리돈-40(polyvinyl pyrrolidone-40), 10 스톡으로부터 1.0 ㎕ ubi10 정방향 프라이머(서열번호 35: 5'-GGTCAACGGATCAGGATATTCTTG-3'), 1.0 ㎕ AtuORF23 역방향 프라이머(서열번호 36: 5'-CCATGTTGGCAAAGGCAACC-3'), 10 스톡, 4 ㎕의 dNTPs(각각 2.5 mM), 0.2 ㎕ TaKaRa EX Taq™ Hot Start, 31.8 ㎕ 물 및 10 ng/㎕ 농도의 2 ㎕ DNA. PCR 사이클링 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 2분간, 98℃에서 10초간, 60℃까지 매 사이클마다 0.5℃의 온도를 감소시키면서 65℃에서 20초로 터치다운 PCR 10 사이클에 이어서 72℃에서 3:00분간. 이어서 98℃에서 10초간, 60℃에서 20초 및 72℃에서 3:00분의 35 사이클과 72℃에서 10분간 최종 연장을 하였다. 예측되는 크기 2662 bp의 ZFP TF 밴드의 존재를 검출하기 위하여 각 반응의 5 ㎕를 1% 아가로스 겔 상에 흘렸다.
상기 pDAB4695 컨스트럭트에서 ZFP TF에 분자적으로 결합된 상기 pat 유전자에 대한 정량적 실시간 PCR 분석이 개발되었고 분자적으로 연결된 ZFP TF 카세트와 유전적 분리를 확인하기 위하여 pat 양성 및 널 식물을 식별하는데 사용되었다.
세 개의 이벤트의 T1 분리 개체군에서 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기의 식별
이벤트 심은 총 T1 종자 식별된 T1 ZFP TF/널 식물 T2 종자를 진출한 T1 ZFP TF/널 식물
3 150 115/7 12/7
6 100 66/27 5/5
12 150 126/6 8/6
pat TaqMan RT-PCR 분석을 위한 반응 혼합물은 하기로 구성되었고: 3 ㎕ Roche LIGHTCYCLERCycler 480 II Probes 2X master mix, 0.6 ㎕ 10% PVP-40, 10 스톡으로부터 0.2 ㎕의 각 pat 정방향 프라이머(서열번호 37: 5'-ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT-3'), 10 스톡으로부터 0.2 ㎕ PAT 역방향 프라이머(서열번호 38: 5'-CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT-3'), 5 스톡으로부터 0.2 ㎕ 프로브(서열번호 39: 5'-6FAM-CCAGCGTAAGCAATACCAGCCACAACACC-quencher-3'), HMG(GenBank: AF127919)의 내부 참조 표준을 위하여 하기와 같은, 시약으로 다중화 하였다: 10 스톡으로부터 0.2 ㎕의 각 HMG 정방향 프라이머(서열번호 40: 5'-CCTCTCTACCACCGTCTCACATG-3'), 10 스톡으로부터 0.2 ㎕ HMG 역방향 프라이머(서열번호 41: 5'-GATCTGGCCGGACTGTTTCA-3'), 5 스톡으로부터, 0.2 ㎕ 프로브(서열번호 42: 5'-6FAM-CGCTCCTCAGCTACCACCTCAACCA-quencher-3'), 1 ㎕ DNA 및 0.2 ㎕ 물. PCR 사이클링 조건은: 95℃에서 5분간 1 사이클, 95℃에서 10분간, 60℃에서 40초간 및 72℃에서 1초간의 40사이클이었다. 모든 샘플은 Roche LIGHTCYCLER480 PCR 기계에서 1-4 카피의 트랜스제닉 게놈 DNA 표준과 함께 384-웰 플레이트에 3개씩 증폭되었다.
각 이벤트 내에 상기 ZFP TF 양성 및 널 식물의 분리 비율에 기초하여, 이벤트 3, 6 및 12는 각각 상기 유채 게놈에서 ZFP TF 트랜스유전자의 대략 2, 1 및 2개의 삽입을 포함하였다(표 6, 컬럼 3). 이러한 데이터는 모든 세 개의 이벤트에서 pat 유전자 분리 데이터와 일치하였다.
6.3 T1 식물에서 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 상향 조절
그런 다음 표 6, 칼럼 3에 나타낸 모든 T1 ZFP TF 양성 및 널 식물 동기는 상기 내재적 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자, ZFP TF 트랜스유전자, 및 내재적 튜불린 유전자에 대한 mRNA 발현 분석을 하였다. 후자는 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 ZFP TF 유전자 발현에 대해 표준화하기 위하여 참조 유전자로서 사용되었다. 상기 각 6-잎 식물 단계로부터 여섯 개의 잎 펀치를 얼음에 샘플링 하였고 총 RNA를 QIAGEN RNAEASYkit를 사용하여 추출하였다. cDNA 사슬 합성 및 희석은 실시예 4.1에 기술한 바와 같이 수행하였다.
상기 합성된 cDNA의 qRT-PCR 분석은 모든 세 개의 유전자에 대하여 수행하였다. 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 튜불린 mRNA 발현 분석은 각각 실시예 4.2 및 실시예 4.3에 기술한 바와 같이 실시하였다. 상기 ZFP TF 분석은 변형되었다. 상기 PCR 반응은 하기와 같이 설정되었다: 반응 조건은 하기와 같았다: 7.5 ㎕의 2X LC480 Probes Master Buffer(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 0.3 ㎕ 유전자 특이적 정방향 프라이머 #1(서열번호 43: 5 '-TCGATCTTGATATGTTGGGAGA-3')(10 스톡), 0.3 ㎕ 유전자 특이적 역방향 프라이머 #2(서열번호 44: 5'-AGGTGCAGAATCATGTGGTG-3')(10 스톡), 0.15 ㎕ UPL 프로브 #85, 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40, 및 3.9 ㎕ 물. 384-웰 마이크로 플레이트에 경계를 표시하고 상기 기술한 혼합물 13.5 ㎕를 웰 마다 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 부착하고, 상기 플레이트를 1분간 3000 rpm으로 원심분리 하였다. 필름을 제거하고 해동된 희석된 첫 번째 사슬 1.5 ㎕를 웰 마다 첨가하였다. 게다가, cDNA 표준을 분리된 대조군 웰에 첨가하였다. 상기 포일 밀봉을 상기 플레이트에 밀봉하고 상기 원심분리 단계를 반복하였다. PCR 프로그램은 하기 조건으로 진행하였다; ⅰ. 95℃에서 5분간 활성, ⅱ. 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초), ⅲ. 60℃에서 25초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초), ⅳ. 72℃에서 1초간 수득(@ 4.8℃/초), ⅴ. 반복 단계 ⅱ-ⅳ 39-20 회 이상, ⅵ. 38℃까지 5초간 냉각.
ZFP TF mRNA 발현은 ZFP TF 양성 샘플의 이벤트 6에서 가장 낮았고, 이벤트 3에서 가장 높았다(도 4). 상기 널 식물은 상기 ZFP TF 분석이 ZFP TF 트랜스유전자 존재에 특이적임을 보여주는 ZFP TF mRNA를 발현하지 않았다. ZFP TF에 대한 표적인, 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 mRNA 수준은, 모든 이벤트의 ZFP TF 양성 식물에서 상향-조절되었다(도 5). β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현에서 3-4 배까지의 증가가 각 이벤트 내에서 상기 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 쌍대 비교에 의해 관찰되었다. β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 수준의 상향 조절은 각 이벤트 내에서, 즉 이벤트 6에서 가장 낮고 이벤트 3에서 가장 높은, ZFP TF mRNA 발현 수준에 증가에 비례하였다(도 4).
6.4 T1 식물 잎의 지방산 분석
T1 잎 샘플의 두 번째 세트는 실시예 6.3에 기술한 mRNA 분석 샘플의 수집과 동시에 지방산 분석을 위해 수집되었다. 그러나, 상기 샘플의 오직 일부분이 표 6, 컬럼 4에 나타난 오직 성숙도가 진행되는 식물에 대해 지방산이 분석되었다. 잎 재료의 지방산 메틸 에스터(FAME) 분석은 하기와 같이 수행되었다. 10-100 mg의 잎 재료를 얼음에 수집한 다음 동결건조하고 40℃에서 20분간 무수 메탄올에서 0.25 M 메톡사이드나트륨으로 메틸기전이반응을 하였다. 상기 메틸기전이반응 후에 상기 지방산을 대리 표준으로서 헵타데카노인(heptadecanoin)을 포함하는 헵탄 용액으로 3회 추출하였다. 상기 분리된 헵탄 분획물을 말리고 공지된 부피의 헵탄에 재현탁하였다. 상기 결과로 얻어진 지방산 메틸 에스터(FAME)를 SGE 유래 BPX 70 capillary 컬럼(15m × 0.25mm × 0.25μm)을 사용하여 GC-FID를 통해 분석하였다. 각 FAME를 그들의 보유 시간에 의해 식별하였고 보정 표준으로서 Matreya LLC 유래 랩시드 오일 참조 혼합물의 주입에 의해 정량하였다. 상기 반응의 완성도는 네 번째 추출/유도에서 내재적 FAMES의 존재를 점검함으로써 증명하였다.
모든 세 개의 이벤트는 각 이벤트 내에서 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 쌍대 비교에 있어서 총 C16:0 함유량에 감소, 및 총 C18 함유량에 수반되는 증가를 나타냈다(표 7). 예를 들면, 이벤트 12 ZFP TF 양성 식물은 그것 자신의 널 식물 동기와 비교하여 C16:0 함유량에 6.3%의 감소 및 총 C18 함유량에 1.44% 증가를 나타냈다.
T1 잎 지방산 프로파일
샘플 이름 분석된 식물 C16:0 총 C18
평균 표준편차 평균 표준편차
12null 6 10.98 0.31 69.93 0.91
12ZFP 8 10.29 0.39 70.94 1.02
3null 7 10.79 0.56 69.84 1.18
3ZFP 12 10.34 0.29 71.25 0.74
6null 5 11.94 0.47 70.36 1.91
6ZFP 5 10.44 0.62 72.16 2.88
실시예 7: ZFP TF 트랜스제닉 T2 종자의 분석
각 이벤트 내에서 가장 높은 β-케토아실-ACP 합성효소 II mRNA 발현을 나타내는 ZFP TF 양성 식물의 서브셋 및 널 식물 동기를 성숙시켜 T2 종자를 수득하였다(표 6, 컬럼 4). 더 낮은 발현 범위를 가지는 ZFP TF 양성 식물이 거의 성숙되지 않은 이벤트 3은 예외였다. 이들은 상기 pDAB4695 이식유전자의 다른 분리된 삽입을 나타낼지도 모른다. 각 T1 식물을 꼭 맞물리는 백으로 덮어 주어진 식물 내에서 자가수분을 촉진시켰다. 종자는 수확되었고, 지방산 수준들은 분석되었다.
T2 지방산 분석은 실시예 6.1에서 T1 종자 분석에 대한 설명에서 기술한 바와 같이, 식물 당 24개 종자의 풀 상에서 수행되었다. 상응하는 널 식물 동기와의 쌍대 비교된 세 이벤트 모두의 ZFP TF 양성 식물 내에서 상기 결과들은 C16:0 함유량의 감소를 나타냈다(표 8 및 9). 상기 C16:0 함유량의 감소는 이벤트 12, 3 및 6에 대하여 각각 12.6%, 11.2% 및 22.3%였다. 또한, C16:0 함유량에서 일정한 감소도 관찰되었다. 상기 C16:0 및 C16:1 함유량의 감소에 상응하여, 상기 상응하는 널 식물 동기와의 쌍대 비교에서 ZFP TF 양성 식물 내 총 C18(C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3) 함유량의 수반되는 증가가 관찰되었다. JMP 통계 소프트웨어를 이용한 분석 결과(도 6, 및 B), ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기와의 세 쌍대 비교 모두 총C16(C16:0 + C16:1) 함유량 및 총 C16/총 C18 함유량의 증가에 대하여 통계적으로 유의하였다(p = <0.001). 상기 세 이벤트들이 널 식물 동기 관찰에 근거한 그들의 C16:0 함유량에서 가변적임에도 불구하고(Tables 8A 및 8B), ZFP TF는 상기 대략 비슷한 수준; ~2.93 내지 3.05 사이까지 감소하는 C16:0 함유량에서 효과적이었다. 이벤트 3 및 12 세트 종자의 모든 ZFP TF 양성 식물이 종자를 만드는 동안, 이벤트 6의 식물을 포함하는 단 하나의 ZFP TF만이 종자를 만들었다. 이벤트 6의 상기 특정 식물은 T1 잎 지방산 데이터에 근거한 상기 C16:0 함유량이 가장 높았다. 표 8 및 9는 pDAB4695 ZFP TF 양성 및 상응하는 널 식물 동기의 세 유채 트랜스제닉 이벤트들의 T2 지방산 프로파일의 비교를 나타낸다. 상기 데이터는 FAME 분석에 의하여 얻어졌고, 항목 6.1에 기재된다. C12:0 내지 C24:1 지방산은 분석되었고, 주요한 것들은 상기 표들에 나타내었다. 모든 숫자들은 유채 종자에 존재하는 총 지방산의 퍼센트로서 나타냈다.
C16:0, C16:1, C18:0, C:18:1, C:18:2 및 C:18:3 지방산 분석
샘플 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
12Null 평균 3.49 0.26 1.29 76.59 11.45 3.73
Std. Dev.(n=6) 0.06 0.01 0.05 0.25 0.21 0.04
12ZFP 평균 3.05 0.20 1.33 76.53 11.63 3.87
표준편차(n=8) 0.11 0.02 0.04 0.39 0.33 0.06
3Null 평균 3.30 0.25 1.31 74.34 13.18 3.94
Std. Dev.(n=7) 0.17 0.02 0.10 1.04 0.86 0.25
3ZFP 평균 2.93 0.18 1.30 74.10 13.62 4.14
표준편차(n=12) 0.12 0.01 0.08 1.80 1.45 0.25
6Null 평균 3.77 0.38 2.02 73.46 12.42 3.66
Std. Dev.(n=4) 0.15 0.08 0.14 2.80 2.44 0.66
6ZFP(n=1) 2.93 0.17 1.07 77.89 10.65 3.24
C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0 및 C24:1 지방산 분석
샘플 C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0 C24:1
12Null 평균 0.53 1.26 0.05 0.33 0.02 0.14 0.14
Std. Dev.(n=6) 0.03 0.07 0.01 0.04 0.01 0.02 0.02
12ZFP 평균 0.55 1.37 0.06 0.36 0.02 0.15 0.16
표준편차(n=8) 0.02 0.05 0.01 0.02 0.01 0.01 0.02
3Null 평균 0.59 1.49 0.06 0.43 0.02 0.15 0.21
Std. Dev.(n=7) 0.07 0.11 0.01 0.07 0.01 0.03 0.04
3ZFP 평균 0.57 1.57 0.07 0.42 0.03 0.15 0.19
표준편차(n=12) 0.04 0.21 0.02 0.07 0.01 0.04 0.04
6Null 평균 0.80 1.49 0.07 0.54 0.03 0.30 0.24
Std. Dev.(n=4) 0.08 0.13 0.01 0.08 0.01 0.07 0.02
6ZFP(n=1) 0.52 1.86 0.07 0.42 0.04 0.20 0.22
표 10는 표 8 및 9에 나타낸 상기 개별 지방산에 근거한 총 지방산 프로파일을 나타낸다.
샘플 총 C18* 총 LC** 총 Sats***
12Null 평균 93.06 95.52 5.83
표준편차(n=6) 0.13 0.05 0.09
12ZFP 평균 93.36 96.01 5.48
표준편차(n=8) 0.11 0.13 0.09
3Null 평균 92.78 95.74 5.82
표준편차(n=7) 0.39 0.17 0.32
3ZFP 평균 93.16 96.14 5.41
표준편차(n=12) 0.41 0.13 0.19
6Null 평균 91.55 95.01 7.47
표준편차(n=4) 0.36 0.29 0.40
6ZFP( n=1) 92.85 96.18 5.17
*총 C18은 하기 탄소: C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3의 합을 나타낸다.
**총 LC 또는 장쇄는 하기 탄소: 총 C18 + 총 C20(C20:0 + C20:1 + C20:2) + 총 C22(C22:0 + C22:1) + 총 C24(C24:0 + C24:1)의 합을 나타낸다.
***총 Sats는 표 8 및 9에 나타낸 모든 포화 지방산을 나타낸다.
모든 장쇄 지방산(총 C18, 총 C20, 총 C22 및 총 C24)을 조합하면, 널 동기들과 비교된 다른 이벤트들의 ZFP TF 양성 식물에서 0.4% 내지 1.2%의 증가가 관찰되었다. 상기 장쇄 지방산 중, 이벤트 6에 대한 ZFP TF 양성 식물에서 25% 만큼의 C20:1 증가는 주목할 만하다. 또한, 모든 이벤트들에서 ZFP TF 함유 식물에서도 총 포화 지방산 함유량의 감소가 관찰되었다. 그것은 이벤트 12 내 6% 감소에서부터 이벤트 6 내 31% 감소에까지 이르렀다.
결론적으로, T0 및 T1 식물에서 상기 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 ZFP TF-매개 전사적 상향 조절 및 수반되는 총 C16의 감소 및 총 C18 지방산 함유량의 증가가 예로 들어졌다. 상기 데이터는 씨드 오일 프로파일 내에서 예상된 변화들을 야기하는 상기 지방산 생합성 경로 내 자손의 세대를 거쳐 유전되는 특정 유전자를 표적화 및 변형하는 신규한 ZFP TF 기술의 성공적인 적용을 나타낸다.
실시예 8-15: FatB 상향 조절/하향 조절
색소체는 고등 식물에서 지방산 신생합성을 위한 주요한 부위이다(Ohlrogge et al., 1979, Proc Natl Acad Sci U S A 76:1194-8; Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic Engineering 4:12-21). 상기 색소체에서 활용되지 않는 지방산은 아실-아실 운반 단백질(아실-ACP)을 가수분해하여 자유 지방산을 방출시킴으로써 아실-ACP 티오에스테라아제(FATs)의 특이적 활성을 통해 세포질로 반출된다. 식물에는 두 클래스의 FAT 효소, FATA 및 FATB가 존재한다. 상기 FATA 클래스는 인 비트로에서 18:1-ACP를 선호하는 반면, 상기 FATB 클래스는 16:0-ACP 및 18:0-ACP와 같은 포화 아실-ACP 기질을 선호할 뿐만 아니라, 서로 다른 이종적인 기질 특이성을 나타낸다(Doermann et al, 1995, Arch. Biochem. Biophys. 316:612-618; Voelker et al., 1997, Plant Physiology 114: 669-677; Salas and Ohlrogge, 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34). FATA와 유사하게, FATB도 모든 식물 조직에 존재하는 것으로 여겨지나, 발생 중인 종자에서 우세하게 발현된다(Jha et al., 2006, Plant Physiology and Biochemistry 44:645-655).
애기장대 핵 게놈은 두 FatA 유전자 및 단일의 FatB 유전자를 암호화한다. 상기 FatB 활성의 비활성화는 글리세로지질 내의 포화 지방산 함유량을 급격히 감소시킬 수 있다. 예를 들면, T-DNA의 삽입에 의하여 생성되는 FatB 돌연변이에서, 팔미테이트(palmitate)(16:0) 및 스테아레이트(stearate)(18:0) 함유량은 조직에 따라 각각 42-56% 및 30-50% 만큼 감소된다(Bonaventure et al., The Plant Cell, 2003 15:1020-1033). 야생형에 비하여 4주째에 50% 보다 낮은 생중량을 야기하는 상기 돌연변이에서 식물 성장 속도는 크게 영항을 받는다. 상기 발견은 FatB가 식물에서 상기 포화 지방산의 운명을 지배하는 주요 인자로서 작용한다는 관점을 지지한다.
상기 주요 오일씨드 작물인 유채는 모델 종인 애기장대와 가까이 연관된 복이배체 종이나, 애기장대에 비하여 약 8 배 큰 게놈 크기를 갖는다. 따라서, FatB 유전자가 1개인 애기장대에 비하여, 상기 종들에서는 6개의 FatB 유전자가 보고되었다(WO 2009/007091). 이러한 복잡성은 그들의 조작에 있어서 개별적인 FatB 유전자의 기능을 이해하기 어렵게 한다. 반대로, 많은 수의 유전자의 존재는 지방산을 완전히 제거하는 대신 원하는 지방산 목표를 향한 다중 유전자의 발현을 조절하는 것을 쉽게 한다. 징크 핑거 전사 인자는 필수적으로 특정 DNA 서열에 결합하고, 상기 표적 유전자의 유전자 기증을 조절하는 것으로 알려져 왔다(Van Eenennaam et al., Metab. Eng. 2004 6:101-108; Sanchez et al., 2006, Plant Biotechnology Journal 4:103-114). 따라서, 이러한 수단은 유채에서 FatB 유전자의 기능을 이해하기 위한 FatB 유전자에 적용될 수 있다. 이러한 지식들은 포화 지방산이 낮은 더 "건강한" 카놀라 씨드 오일을 향한 하나 내지 다중 FatB 유전자의 발현을 조절하는 것을 도울 수 있다.
하기 실시예 8-15는 종자에서 지방산 프로파일 변화를 야기하는 유채 내 FatB 유전자의 전사적 상향 조절을 입증한다.
실시예 8: 유채 L.에서 FatB 유전자에 대한 표적 서열 식별
8.1 표적 서열 식별
변형된 게놈 워킹 프로토콜을 유채 다양성 Nex710의 FatB 유전자에 대한 프로모터 서열을 발견하고 특성화하기 위해 사용하였다. ZFP TF의 설계 및 생산을 위해 이러한 뉴클레오티드 서열을 분리하여 식별하였고, 이는 상기 FatB 유전자의 유전자 발현을 변형하기 위해 사용될 수 있다. Clontech genome Walking Kit(Palo Alto, CA)를 이용하여 9개의 게놈 워킹 라이브러리를 구조화하였다. 이러한 라이브러리는 상기 FatB 유전자에 대한 전사 개시 부위의 상류 ~1kb의 서열을 획득하는데 사용하였다. 네스티드 FatB 유전자-특이적 프라이머의 정방향 쌍을 공용 데이터베이스로부터 이용가능한 FatB EST 서열에 기초하여 설계 및 합성하였다. 네스티트 프라이머의 역방향 쌍은 어댑터 서열에 혼성화할 수 있도록 설계 및 합성하였다. 다중 PCR 단편을 상기 9개의 라이브러리로부터 증폭하였다. 상기 결과로 얻어진 PCR 단편은 TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하여 FatB 프로모터 서열을 식별하기 위해 서열을 분석하였다. 두 개의 다른 FatB 유전자, FatB4 및 FatB5를, 이러한 접근법에 기초하여 식별하였다. 이러한 FatB 유전자의 암호화 서열은 매우 보존되어 있음에도 불구하고, 상기 서열은 5' UTR 및 프로모터 영역에서는 갈리는 것으로 나타났다.
발생하는 유채 종자에 있어서 FatB 발현 및 정량적 RT-PCR 분석을 통한 상기 FatB4 및 FatB5 유전자의 정량화는 유전자가 유채 종자에서 높게 발현된다는 것을 제시하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 총 RNA를 분리하여, 정량하였고, 상기 전사 개시 부위를 맵핑하였다. 이러한 두 개 유전자의 프로모터 서열은 전사적 발현 변형을 위하여 ZFP TF를 설계하는데 이용되었다.
실시예 9: FatB 유전자에 특이적인 ZFP DNA 결합 도메인의 설계
징크 핑거 단백질은 상기 FatB 유전자 내 다양한 표적 부위들에 대하여 설계되었다. 대표적인 ZFP 디자인을 위한 상기 표적 부위들 및 인식 헬릭스를 하기 표 11 및 12에 나타낸다.
FatB ZFP TF 에 대한 표적 결합 부위
ZFP FatB4 표적 부위(5' to 3') FatB 5 표적 부위(5' to 3') FatB 특이성
13685* aaCGAAAGgAGATCGAGAGAGgagagag
(서열번호 47)		 결합 부위 없음 FatB4
13714 결합 부위 없음 cgAAAGGGAGATCGAGAGAGgcaccgca
(서열번호 48)		 FatB5
13722 aaGGAGAAcTTTAGGGTTTGGggagact
(서열번호 49)		 aaGGAGAAtTTTAGGGTTTGGggagact
(서열번호 50)		 FatB4 및 FatB5
13743** ctCCGAAGAGATTGGCGTAAcacttcgt
(서열번호 51)		 ctCCGAAGAGATTGGCGTAAccttcatt
(서열번호 52)		 FatB4 및 FatB5
ZFP 인식 헬릭스 영역
ZFP 1*** 2 3 4 5 6
13685 RSDNLSA
(서열번호 75)		 QSAHRKT
(서열번호 76)		 RSDDLSK
(서열번호 21)		 QSSHRKT
(서열번호 77)		 RSDHLSV
(서열번호 78)		 QNAHRIE
(서열번호 79)
13714 RSDNLSA
(서열번호 75)		 QSAHRKT
(서열번호 76)		 RSDDLSK
(서열번호 21)		 QSSHRKT
(서열번호 77)		 RSDHLSK
(서열번호 80)		 QNANRIT
(서열번호 81)
13722 RSDHLST
(서열번호 82)		 HSNTRKN
(서열번호 83)		 RSDHLSQ
(서열번호 84)		 NSASRKN
(서열번호 85)		 QSGNLAR
(서열번호 16)		 QSGHLSR
(서열번호 86)
13743 NSDSLTE
(서열번호 87)		 RRADLSR
(서열번호 88)		 RSDSLSA
(서열번호 89)		 QNAHRKT
(서열번호 90)		 RSDHLSQ
(서열번호 84)		 RNADRIT
(서열번호 91)
*대문자는 상기 ZFP 결합 서열을 나타내는 반면, 옆의 소문자는 ZFP TF 결합 부위에 대한 상기 옆 서열 맥락을 나타낸다. 상기 대문자들 사이의 상기 이탤릭체의 소문자는 상기 ZFP 설계에서 생략된 염기들을 나타낸다.
** ZFP 결합 서열은 FatB4 및 FatB5 사이에서 동일하나, 상기 3' 측 서열은 상기 두 유전자들 사이에서 다르다.
*** 숫자들은 징크 핑거를 나타낸다(1은 핑거 1, 2는 핑거 2, 등).
실시예 10: 유채에서 네이티브 FatB 유전자의 ZFP TF-매개 상향 조절
유채 세포 내에서 FatB의 ZFP TF-매개 상향 조절을 예시하기 위하여, ZFP TF 유전자의 4가지의 설계를 포함하는 컨스트럭트를 만들었고(표 11 내지 13), 이러한 유전자를 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 유채 세포내로 안정적으로 운반하였다.
10.1 컨스트럭트 설계
설계되고 구조화된 ZFP TF 바이너리 플라스미드가 하기 표 13에 기재된다. 상기 ZFP TF 유전자의 발현은 카사바 베인 모자익 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus, CsVMV) 프로모터로부터 유래된 프로모터와 같은, 비교적 강력한 항시발현(constitutive) 프로모터에 의해 유래되었다. 상기 유채 게놈 내로 ZFP TF를 안정적으로 삽입하기 위하여 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 실시예 3.2에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
유채 FatB 유전자를 표적하는 ZFP TF의 컨스트럭트 설명
S.N. ZFP 컨스트럭트 번호 유전자 카세트
1 13685 pDAB4689 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13685 VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
2 13714 pDAB4690 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13714-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
3 13722 pDAB4691 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13722-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
4 13743 pDAB4692 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13743-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
pDAB4689는 opaque-2(Op-2) 핵 위치 서열 또는 NLS /13685/ VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역(Thompson et al., 1997, WO9727207)) :: CsVMV 프로모터 v2(카사바 베인 모자익 바이러스 프로모터(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139)) :: opaque-2 NLS(Van Eenennaam et al., 2004, Metabolic Engineering 6:101-108; Holmes-Davis et al., 2005, Plant Molecular Biology 57:411-423)/13685 징크 핑거/VP16(Jamieson et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 2006, 348:873-879) 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1(아그로박테리움 투메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) 오픈 리딩 프레임 23, 3'비번역 영역(Gelvin et al., 1987, EP222493)) :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) :: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) :: AtuORF 1 3'UTR v4(아그로박테리움 투메파시언스 오픈 리딩 프레임 1, 3'비번역 영역(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)). 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13685 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8215로서 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13685 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. L-R Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8215를 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4689를 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4690은 opaque-2 NLS/13714/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상긱 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8216로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. L-R Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8216을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4690을 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4691은 상기 opaque-2 NLS/13722/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8217로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. L-R Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8217을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4691을 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAB4692는 상기 opaque-2 NLS/13743/VP 16 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다; RB7 MAR v3(매트릭스 부착 영역 :: CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2(애기장대 유비퀴틴-10 프로모터 :: pat v5 :: AtuORF 1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 NcoI-SacI 제한부위를 통해 pDAB3912 내에 상기 opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 pDAB8218로 표지된 컨스트럭트는 CsVMV 프로모터 v2 :: opaque-2 NLS/13743 징크 핑거/VP16 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함한다. L-R Gateway Reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 pDAB8218을 상기 pDAB4668 바이너리 내로 클로닝하였다. 이러한 반응은 pDAB4692를 생산하였고 제한효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
실시예 11: 형질전환된 캘러스 샘플의 분석
실시예 3.2에서 기술한 바와 같이 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해, 트랜스제닉 유채 캘러스 라인을 4개의 ZFP TF 컨스트럭트, pDAB4689-pDAB4692, 및 대조군 컨스트럭트, pDAB8210의 형질전환에 의해 제조하였다. 상기 대조군 컨스트럭트, pDAB8210은 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 / pat / AtuORF1 3' UTR) 및 비-표적 ZFN 카세트(CsVMV 프로모터 / ZFN / AtuORF23 3' UTR)를 포함하였다. 실시예 4.1에서 기술한 바와 같이 모든 라인으로부터 총 RNA를 추출하였고, cDNA를 합성하였다. 상기 기재된 프로토콜에 대한 변형은 오직 랜덤 헥사머 대신에 상기 cDNA를 프라이밍하기 위한 올리고 dT 프라이머 및 제조사의 설명서에 따라, 상기 cDNA 반응의 상응하는 변형의 사용이었다.
11.1 FatB4 및 FatB5 mRNA 발현 분석
11.1.1 유채에 대한 FatB4 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석
PCR 혼합물은 FatB4의 cDNA 증폭을 위하여 하기와 같이 설정하였다: 1.5 ㎕ 10X Hot Start PCR 버퍼(Qiagen, Valencia, USA), 1.2 ㎕의 10 mM dNTPs, 1 ㎕의 25 mM MgCl2, 0.15 ㎕ Qiagen Hot Start Taq(5U/㎕), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ zz143 FW 프라이머(서열번호 53: CTTTGAACGCTTATCTTCCTC)(10 μM 스톡), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ FATB5_R4 REV 프라이머(서열번호 54: TTCCACAACATCTCCCCAAG), 5 μM 스톡의 0.25 ㎕ TaqMan MGB 프로브(Life Technologies, Carlsbad, California) FatB4_MGB_프로브_4( 서열번호 55: FAM-CTCAGGCTCCACCC), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 반응 당 13.5 ㎕의 H2O. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3,000 rpm으로 원심분리 하였다. 그런 다음, 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 적절한 웰에 첨가하였고, 그리고 나서 가장 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ 플라스미드 cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 마지막으로, 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 프로그램을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 15분간 활성; 2) 95℃에서 20-30초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 20-30초간 어닐(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 45-60초간 수득(@ 4.8℃/초); 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상; 5) 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 냉각.
상기 FatB4 증폭산물은 678 bp 크기였다. 이러한 서열은 게놈 서열을 기초로 79 bp 인트론을 포괄한다. 게다가, 상기 역방향 프라이머는 인트론을 포괄하도록 설계되었고 따라서 오직 FatB4 cDNA의 특이적 증폭에 유리하며, 이에 따라 상기 게놈 DNA의 증폭을 제거한다.
11.1.2 유채에 대한 FatB5 qRT-PCR 분석
FatB5의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 PCR 혼합물을 설정하였다: 1.5 ㎕ 10X Hot Start PCR 버퍼(Qiagen, Valencia, USA), 1.2 ㎕ of 10 mM dNTPs, 1 ㎕ 25 mM MgCl2, 0.15 ㎕ Qiagen Hot Start Taq(5 U/㎕), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ zz145 FW 프라이머(서열번호 56: CTTTGAAAGCTCATCTTCCTC), 10 μM 스톡의 0.5 ㎕ FATB5_R4 REV 프라이머(서열번호 57: TTCCACAACATCTCCCCAAG), 5 μM 스톡의 0.25 ㎕ TaqMan MGB 브로브(Life technologies, Carlsbad, California) FatB5_MGB_프로브_1(서열번호 58: FAM-AACCTTCATCCTCCCA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 반응 당 13.5 ㎕ 까지 H2O. 남아있는 분석 및 상기 PCR 사이클의 자세한 사항은 실시예 11.1.1에서 FatB4 qRT-PCR 분석에 대해 기술한 바와 같다.
상기 제조된 증폭산물은 678 bp 크기였다. 이러한 서열은 게놈 서열을 기초로 79 bp 인트론을 포괄한다. 게다가, 상기 역방향 프라이머는 인트론을 포괄하도록 설계되었고 따라서 FatB5의 cDNA 증폭에 유리하며, 이에 따라 상기 게놈 DNA의 증폭을 제거한다.
11.2 튜불린 mRNA 발현 분석
이 분석은 실시예 4.3에서 기술한 바와 같이 수행하였다.
11.3 ZFP TF mRNA 발현 분석
T0 캘러스 ZFP TF mRNA 분석은 실시예 4.4에 따라 수행하였다. 이 분석에서 증폭산물 크기는 상기 각 설계에 있어서 상기 ZFP 사이즈에 따라 1 kb 이하였다. T0 식물 ZFP TF 발현 정량화는 하기와 같이 VP16 활성화 도메인 기반 분석으로 실시하였다. V16 qRT-PCR 혼합물은 ZFP TF의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 설정되었다: 7.5 ㎕ LIGHTCYCLER480 Probes Master 2X Buffer(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ VP16_UPL_F1 프라이머(서열번호 59: TCGATCTTGATATGTTGGGAGA), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ VP16_UPL_R1(서열번호 60: AGGTGCAGAATCATGTGGTG), 0.15 ㎕ UPL 프로브#85(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 13.65 ㎕ 까지 H2O. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3000 rpm으로 원심분리하였다. 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 첨가하였고, 그리고 나서 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ 플라스미드 cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 프로그램을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 5분간 활성; 2) 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 25초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 1초간 수득(@ 4.8℃/초); 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상. 마지막으로, 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 상기 반응을 냉각하였다.
상기 VP16 증폭산물은 68 bp 크기였다. 이러한 단편 크기는 상기 PCR 증폭에 의해 제조될 것으로 예측되는 상기 VP16 단편에 상응한다.
11.4 캘러스 샘플의 발현 분석
HERBIACE 선택 상에서 생장한 트랜스제닉 캘러스 라인을 qRT-PCR에 의해 FatB4, FatB5, 튜불린 및 ZFP TF 발현 수준에 대해 분석하였다. 상기 튜불린 유전자는 FatB4, FatB5 및 ZFP TF mRNA의 발현 수준을 표준화하기 위하여 참조 유전자로서 사용하였다. 상기 FatB4/튜불린 및 FatB5/튜불린 비율을 mRNA 발현을 표준화하기 위해 산출하였다. 그 결과 컨스트럭트 설계 pDAB4691에 대한 통계적으로 유의한 FatB4 mRNA 및 FatB5 mRNA 상향 조절이 나타났다(p = 0.005; 도 9). pDAB4692 캘러스 라인은 FatB4 및 FatB5 mRNA에서 상향조절 경향성을 나타냈으나, 상기 경향성은 통계적으로 유의하지 않았다. 또한 pDAB4689 캘러스 라인을 분리된 실험으로 분석하였고, 이는 상향조절 경향성을 나타냈으나, 통계적으로 유의하지 않았다(데이터 나타내지 않음). 상기 ZFP TF 분석이 오직 상기 ZFP TF 발현 라인에 특이적인 것을 확인하는, 대조군 세포주는 ZFP TF 특이적 증폭산물을 증폭시키지 않았다.
실시예 12: 트랜스제닉 T 0 식물 샘플의 발현 분석
12.1 qRT-PCR에 대한 내부 대조군으로서 사용하기 위한 유채 액틴에 대한 분석
실시예 1.1에서 기술한 바와 같이 모든 라인으로부터 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. PCR 혼합물은 액틴의 cDNA 증폭을 위해 하기와 같이 설정하였다(Bo Yang et al., 2007, Plant Science 173:156-171; 액틴 유전자 Genbank accession no. AF111812): 7.5 ㎕ LIGHTCYCLER480 SYBR Green I Master 2X Buffer, 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ BN_Actin_F 프라이머(서열번호 61: ACGAGCTACCTGACGGACAAG), 10 μM 스톡의 0.3 ㎕ BN_Actin_R(서열번호 62: GAGCGACGGCTGGAAGAGTA), 1.5 ㎕의 10%(w/v) PVP-40), 및 13.5 ㎕까지 H2O로 q/s. 384-웰 마이크로 플레이트의 적절한 사분면에 경계를 표시하였고, 웰 당 13.5 ㎕의 마스터 믹스를 채웠다. 그런 다음 밀봉 호일을 상기 플레이트에 조심스럽게 부착하였다. 상기 플레이트를 Qiagen 마이크로 플레이트 원심분리기에서 1분간 3000 rpm으로 원심분리 하였다. 해동되고, 희석된 최초 사슬 cDNA 1.5 ㎕를 첨가하였고, 그리고 나서 낮은 농도에서부터 높은 온도까지 1.5 ㎕ cDNA 표준을 대조군 웰 내에 첨가하였다. 밀봉 호일을 상기 플레이트에 단단히 부착하고 원심분리 하였다. 상기 PCR 프로그램은 LIGHTCYCLER480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에서 하기 조건을 사용하여 수행하였다: 1) 95℃에서 10분간 활성; 2) 95℃에서 10초간 변성(@ 4.8℃/초); 3) 60℃에서 20초간 어닐/연장(@ 2.5℃/초); 4) 72℃에서 20초간 수득(@ 4.8℃/초); 5) 2)-4) 단계 반복, 39-49 회 이상. 마지막으로, 상기 반응을 멈추기 위하여 38℃에서 5초간 상기 반응을 냉각하였다. 상기 증폭산물은 80 bp 크기였다.
12.2 FatB4 및 FatB5 mRNA 발현 분석
pDAB4689-pDAB4691로 형질전환된 유채 식물을 FatB4 및 FatB5의 증가된 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 게다가, 두 형태의 대조군을 사용하였다. Nex710 식물로 구성된 비-트랜스제닉 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. pDAB8210으로 형질전환된 유채 Nex710 식물로 구성된 두 번째 트랜스제닉 대조군을 또한 분석하였다. 상기 pDAB8210 컨스트럭트 설계는 두 개의 유전자 발현 카세트로 구성되었다. 상기 pat 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 :: pat 유전자 :: AtuORF1 3' UTR) 및 비-표적 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 유전자 발현 카세트(AtUbi10 프로모터 :: ZFN 유전자 :: AtuORF23 3' UTR). pDAB8210에서 발현되는 상기 ZFN은 유채 Nex710 식물의 게놈에 결합하거나 절단하는 것으로 예측되지 않고 이러한 식물의 표현형을 변형시키지 않을 것이다.
HERBIACE 선택 상에서 생장한 추정상의 트랜스제닉 칼리(calli)는 식물 내에서 재형성되었다(실시예 3.3). mRNA 발현 분석을 위하여 잎 샘플은 온실에서 생장한 6-잎 단계 유채 식물로부터 수집하였다. 각 식물 유래의 여섯 개의 잎 펀치가 분리되었고 RNA 추출 전에 얼음에 놓았다. 총 RNA를 QIAGEN RNEASY 키트를 사용하여 추출하였다. cDNA 합성 및 추가 희석을 실시예 11에 기술한 바와 같이 수행하였다. qRT-PCR을 통한 FatB4 및 FatB5에 대한 발현 분석 프로토콜은 상기 기술하였다. ZFP TF 발현 분석은 상기 분석으로 플러스/마이너스였다. 상기 액틴 참조 유전자 qRT-PCR 분석은 상기 기술하였다.
FatB4 및 FatB5 유전자에 대한 T0 잎 발현은 컨스트럭트간에 다양하였다(도 10). 가장 높은 FatB4 및 FatB5 mRNA 상향 조절은 Nex710 비-트랜스제닉 및 pDAB8210 트랜스제닉 대조군과 비교하여 mRNA 발현에서 총 2.0-2.5 배 증가한 결과를 야기한 pDAB4691 트랜스제닉 식물 이벤트에서 확인되었다. 두 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다(p = 0.05 이하). 그러므로, 상기 컨스트럭트의 추가적인 특성 확인을 pDAB4691와 함께 계속하였다.
실시예 13: 트랜스제닉 T1 식물의 분석
13.1 T1 종자의 지방산 분석
이벤트 pDAB4691-003-049.1(이벤트 49)의 낮고 높은 오일 종자 사이의 C18:0 함유량에 유의적인 차이가 확인되었다(표 14). “낮은” 카테고리 종자의 C18:0 함유량은 상기 Nex710(비-트랜스제닉 대조군) 및 pDAB8210(트랜스제닉 대조군) 라인의 그것과 유사하였다. “높은” 종자에서에서 C18:0 함유량은 FatB 유전자 상향 조절의 결과를 야기하는 ZFP TF 발현과 관련되었다. 또한 C20:0, C22:0 및 C24:0에서 일부 증가가 더 장쇄 지방산 내로 C18:0의 흐름을 기초로 확인되었다. 각각의 종자에서 C16:0 함유량은 낮거나 또는 높은 카테고리 중 어느 하나 내에서 변화하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 pDAB4691 ZFP TF가 상기 C16:0-ACP 내지 C16:0 반응 보다는 C18:0 효소적 반응에 대하여 C18:0-ACP에 대해 특이적인 상기 FatB 유전자에 결합하고 상향-조절한다는 사실을 나타내는 것이다(실시예 1, 도 1 참조).
FAME 분석으로 측정된 각각의 T 1 종자의 지방산 프로파일
샘플* 총 Sats C16:0 C16:1 C18:0 C20:0 C22:0 C24:0
이벤트 49 저 6.35 4.11 0.48 1.45 0.46 0.21 0.07
이벤트 49 저 6.35 3.70 0.35 1.62 0.58 0.30 0.12
이벤트 49 저 6.49 3.64 0.36 1.66 0.62 0.32 0.18
이벤트 49 고 7.50 3.55 0.42 2.59 0.80 0.34 0.17
이벤트 49 고 7.74 3.63 0.45 2.59 0.88 0.38 0.22
이벤트 49 고 7.93 3.67 0.47 2.82 0.86 0.38 0.17
이벤트 49 평균(n=24) 6.90 3.70 0.40 2.03 0.67 0.31 0.15
이벤트 49 표준편차(n=24) 0.51 0.14 0.05 0.37 0.10 0.04 0.03
Nex710 평균(n=24) 6.47 3.70 0.45 1.79 0.57 0.26 0.11
Nex710 표준편차(n=24) 0.35 0.24 0.06 0.17 0.06 0.04 0.03
8210 평균(n=150) 6.27 3.51 0.34 1.63 0.61 0.33 0.14
8210 표준편차(n=150) 0.40 0.24 0.07 0.25 0.08 0.05 0.04
*지방산 분석을 이벤트 49 및 Nex710의 24개 각각의 T1 종자, 및 6개의 이벤트를 포함하는 pDAB8210의 114개의 종자에 대하여 실시하였다. “낮은” 및 “높은” 카테고리는 C18:0 함유량에 기초하여 분류될 때 각각의 종자의 특이적 FA 함유량을 나타낸다.
13.2 T1 식물에서 ZFP TF 존재 분석
이벤트 49의 백 개의 T1 종자를 온실에 심었다. 97개의 식물이 묘목으로 싹텄다. ZFP TF 카피 수를 2-4 잎 단계로부터 분리된 식물 재료에 대하여 실시예 6.2에서 기술한 바와 같이 pat qRT-PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 이벤트 49는 다중 삽입(~3 삽입) 및 0-7 pat 유전자를 포함하였고, 이에 따라 ZFP TF, 카피는 상기 T1 개체군 내로 분리되었다. 오직 하나의 널 식물이 상기 T1 개체군으로부터 식별되었다.
13.3 T1 식물에서 FatB4 및 FatB5 mRNA 상향 조절
네이티브 FatB 유전자 발현 분석을 상기 분리된 T1 개체군의 모든 97개의 식물에 대해 실시하였다. 동시에 심은 비-트랜스제닉 Nex710 식물은 대조군으로서 본 연구에 포함되었다. 식물 당 6-잎 펀치가 회수되었고 RNA 추출이 완료될 때까지 얼음에 놓았다. 총 RNA를 QIAGEN RNEASY 키트를 사용하여 추출하였다. cDNA 합성 및 추가 희석은 실시예 11에 기술한 바와 같이 수행하였다. FatB4, FatB5, 튜불린 및 VP16(ZFP TF)의 발현 분석은 상기 기술한 바와 같이 실시하였다.
튜불린 발현과 현저한 선형 경향성을 나타내는 FatB4/FatB5 및 튜불린의 비율의 통계적 분석은 FatB4/FatB5에 증가가 상기 내재적 대조군인, 튜불린에 증가와 1:1 관계를 가지지 않는 것을 나타낸다. 이와 같이, 상기 비율을 이러한 분석에 사용하지 않았고, 튜불린을 FatB4/FatB5의 발현 모델에 있어서 공변관계로서 포함하였다. 튜불린 및 VP16(ZFP TF) 사이의 임의의 공통-직선성을 제거하기 위하여, 상기 모델 방정식에 대한 근접행렬을 직교화하였다.
하기 모델을 본 발명에서 모든 데이터세트에 적합하였다: 여기서 statusi는 yijk의 트랜스제닉 상태이다(트랜스제닉 또는 널/대조군);
yijk = statusi + transgenic*VP16 + eijk
transgenic*VP16은 트랜스제닉 라인 내에 끼워 넣은 VP16에 대한 선형회귀이고; eijk는 랜덤 잔차이다. 각 샘플에 대하여 세 번의 반복된 측정이 주어졌고, 관련된 잔차 구조가 사용되었다:
Figure pct00001
여기에서 In은 샘플의 개수과 동일한 지위를 갖는 매트릭스를 식별한 것이고, φ는 반복된 측정의 잔차 사이의 상관관계이다.
이벤트 49에 대한 분석 결과는 매우 유의적인 양성 기울기를 나타내는 VP16에 대한 FatB4 발현의 네스티드 회귀를 갖는 FatB4에서 유의적인 상향 조절을 나타냈다(도 12, 표 15). FatB5에 대하여, 네스티드 회귀는 상향 조절에 대한 양성 기울기를 나타냈고, 상기 기울기는 통계적으로 유의하였다. 상향 조절 이벤트에 대하여, 형질전환 및 대조군 식물은 동일한 라인을 형성하지 못하였고 그래서 상기 라인 및 형질전환 효과에 일부 혼란이 있을 수 있다는 것에 특히 주의해야 한다.
상향 조절 이벤트에 대한 결과
이벤트 유전자 EffectA 용액 P-값
4691-3-049.001 FatB4 형질전환된-대조군 10331.11 <0.00001
형질전환된*VP16 0.764E-05 <0.00001
FatB5 형질전환된-대조군 5084.09 <0.00001
형질전환된*VP16 0.308E-05 <0.00001
A형질전환된-대조군 = 형질전환된 라인 및 트랜스유전자를 운반하지 않는 라인 사이의 최소 제곱 평균 발현에 차이. transgenic*VP16 = 트랜스제닉 라인 내에 끼워 넣은 VP16 발현에 대한 FatB4/FatB5 발현의 회귀.
그런 다음 이벤트 49 T1 식물을 온실에서 T2 형성하기 위한 가장 높은 발현 식물을 검색하기 위하여 상기 FatB4/튜불린, 및 그리고 나서 FatB5/튜불린 발현 미율에 기초하여 분류하였다. 가장 높게 발현하는 FatB4 식물 8개를 성숙을 위해 선별하였다. 이러한 식물 중 6개는 또한 FatB5를 가장 높게 발현하였다. 전체 T1 자손에서 분리된 상기 카피 수가 0-7 카피인 반면, 이러한 가장 높게 발현하는 식물에서 ZFP TF 카피 수는 2-4 카피가 달랐다. 대조군 식물에 대하여, 이벤트 49의 하나의 널 식물 및 10개의 Nex710 대조군 식물은 또한 T2 종자 수집을 위해 성숙되었다.
13.4 T2 종자의 지방산 분석
실시예 6.1에서 기술한 바와 같이 지방산(FA) 분석을 모든 식물의 24개의 종자 대부분에 대하여 실시하였다. 하나의 널 식물의 상기 FA 프로파일은 대조군 FA 프로파일 측정을 위하여 10개의 Nex710 대조군 식물과 결합되었다. 평균적으로, C18:0 함유량에 있어서 이벤트 49에 대해 Nex710의 것과 비교하여 12% 증가가 관찰되었다(표 16 및 17). 이러한 증가는 p = 0.05로 통계적으로 유의하였다(도 13). C20:0, C22:0 및 C24:0와 같은,장쇄 FA는, 또한 총 포화 FA 함유량에 있어서 5% 증가까지 유도하는 것으로 나타났다. FatB 효소가 C18:0 프리 FA로 C18:0 ACP의 전환을 촉매하기 때문에, FatB4 및 FatB5 전사적 상향 조절의 결과에 따라 더욱 많은 C18:0이 축적될 것이다(도 1). 상기 pDAB4691(실시예 6, 표 1 및 2)는, FatB4 및 FatB5 유전자 모두에 특이적이고, 이는 상기 FA 프로파일에 유의적인 변화의 결과를 야기한다(표 16 및 17).
이벤트 49 트랜스제닉 및 Nex710 대조군 샘플의 지방산 프로파일(C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2 및 C18:3)
S.N. 식물 ID 총 Sats C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
1 4691-3-049(8) 6.42 3.47 0.24 1.61 76.32 11.20 3.52
2 Nexera710(11) 6.11 3.40 0.23 1.44 76.26 11.25 3.76
컬럼 2에 괄호 안의 숫자는 분석된 식물의 개수를 나타낸다.
이벤트 49 트랜스제닉 및 Nex710 대조군 샘플의 지방산(C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0, C24:1) 프로파일
S.N. 식물 ID 총 Sats C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0 C24:1
1 4691-3-049(8) 6.42 0.66 1.39 0.05 0.43 0.02 0.21 0.18
2 Nexera710(11) 6.11 0.61 1.43 0.06 0.41 0.02 0.20 0.17
컬럼 2에 괄호 안의 숫자는 분석된 식물의 개수를 나타낸다.
총 C16 함유량에서 유의성이 없는 변화가 네이티브 FatB4 및 FatB5 유전자 상향 조절과 함께 관찰되었다. 이는 C16:0-ACP 내지 C16:0의 촉매작용이 다른 FatB 유전자와는 일어나지만 pDAB4691 ZFP TF 설계를 사용한 상향 조절을 위한 예시적인 표적, FatB4 및 FatB5와는 일어나지 않을 확률이 크다(도 1).
pDAB4691 ZFP TF 설계가 C16:0-ACP 내지 C16:0 반응 보다는 C18:0-ACP 내지 C18:0 효소적 반응에 대하여 더욱 특이적으로 상기 FatB 유전자에 결합한다는 사실을 나타내는(도 1), 각각의 종자 C16:0 함유량은 T1 종자 “낮은” 및“높은” 카테고리에 변화를 나타내지 않았다(표 14).
상기 네이티브 β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자의 상향조절이(실시예 1-6) 상기 네이티브 FatB4 및 FatB5 유전자 상향 조절과 비교하여 FA 프로파일에 다른 변화를 유발하는 ZFP TF에 의해 유도된다는 것에 특히 주의해야한다. 예를 들면, β-케토아실-ACP 합성효소 II 유전자 상향 조절은 그들의 널 분리 개체와 비교하여 C16:0 및 C16:1 함유량에 통계적으로 유의한 감소, 및 총 C18 함량에 수반되는 증가를 야기하였다(실시예 6, 도 6, 표 5 및 8 및 9). 비교적, ZFP-TF-매개 FatB 유전자 상향 조절은 상기 C18:0 함유량에 통계적으로 유의한 증가를 야기하였지만 상기 C16:0 함유량에는 명백한 변화가 없었다(도 14). β-케토아실-ACP 합성효소 II 및 FatB 유전자의 ZFP-TF-매개 상향 조절을 통한 상기 FA 프로파일에 반복된 이러한 변화는 FA 생합성 경로에 따라 일치한다(도 1).
실시예 14: 식물 형질전환에 대한 ZFP TF 컨스트럭트 설계
유채 L에서 상기 FatB 유전자의 전사적 하향 조절을 위하여 4개의 컨스트럭트는 설계하여 만들었다(표 18). 가장 우수한 FatB 상향 조절 ZFP 설계인, 13722 및 13714를, FatB 하향 조절의 입증을 위하여 사용하였다(실시예 9-13). 이러한 ZFP 설계는 기능적 ZFP TF를 구조화하기 위하여, KRAB1(Hanna-Rose 및 Hansen, 1996, Trends in Genetics, 12:229-234) 또는 NtERF3(Ohta et al., The Plant Cell, 2001, 13:1959-1968) 중 어느 하나로 구성된 opaque-2 핵 위치 신호 및 억제 도메인과 결합하였다. 모든 ZFP TF는 종자-특이적 프로모터 하에서 발현되었고; 애기장대 지질 운반 단백질 2 프로모터(AtLTP170 프로모터)(Genbank ID: NC_003076) 또는 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)ß-파세올린(Phaseolin) 프로모터(PvPhas 프로모터)(미국 특허 번호 5,591,605) 중 어느 하나를 사용하였다.
FatB 유전자의 표적화된 하향 조절을 위한 ZFP TF 컨스트럭트 상세 설명
S.N. ZFP 설계 컨스트럭트 No. 유전자 카세트
1 13722 pDAS5203 AtLTP170/Op-2* NLS-ZFP-13722-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
2 13714 pDAS5204 AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13714-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
3 13722 pDAS5212 PvPhas/Op-2-NLS-ZFP13722-KRAB1/Phas 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
4 13722 pDAS5227 AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13722-NtERF3/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
* Op-2 = Opaque-2 핵 위치 신호(Nuclear Localization Signal)
pDAS5203은 상기 opaque-2 NLS/13722/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 L-R Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5203을 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5204는 opaque-2 NLS/13714/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13714 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 L-R Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5204를 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5212는 opaque-2 NLS/13722/KRAB1 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: PvPhas 프로모터 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 PvPhas 프로모터 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/KRAB1 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 L-R Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5212를 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
pDAS5227은 opaque-2 NLS/13722/NtERF3 및 pat 유전자 발현 카세트를 포함하는 바이너리 플라스미드이다. 이러한 컨스트럭트는 하기 유전자 요소를 포함한다: RB7 MAR v3 :: AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 :: AtUbi10 프로모터 v2 :: pat v5 :: AtuORF1 3'UTR v4. 상기 바이너리는 게이트웨이 공여자 벡터 내로 opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합을 포함하는 DNA 단편을 클로닝함으로써 구조화하였다. 상기 결과로 얻어진 컨스트럭트는 AtLTP 프로모터 170 :: opaque-2 NLS/13722 징크 핑거/NtERF3 융합 :: AtuORF23 3'UTR v1 유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이러한 컨스트럭트는 L-R Gateway reaction(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통해 바이너리 내로 클로닝되었다. 이러한 반응은 pDAS5227을 제조하였고 제한 효소 분해 및 시퀀싱 반응을 통해 확인하였다.
상기 컨스트럭트는 배축 외식체(hypocotyl explants)의 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 유채 다양성 Nex710 내로 안정적으로 형질전환되었다(실시예 3.2-3.3). 온실에서 생장한 T0 식물은 자가 수분되었고 T1 종자는 이식 후 4개월째 수집하였다.
실시예 15: 4개의 ZFP TF 컨스트럭트에 대한 T1 종자 트랜스제닉의 분석
T1 종자는 컨스트럭트 pDAS5203, pDAS5204, pDAS5212 및 pDAS5227의 트랜스제닉 이벤트(라인) 8, 20, 37 및 15로부터 각각 수득하였다. 5개의 Nex710 식물 종자를 대조군으로서 사용하였다. FA 프로파일을 가장 효과적으로 변형하는 ZFP TF 컨스트럭트를 먼저 식별하기 위하여, FA 분석을 실시예 6.1에 먼저 기술한 바와 같이, 각 T1 트랜스제닉 이벤트의 24개 각각의 종자에 대하여 실시하였다.
15.1 T1 종자의 지방산(FA) 분석
컨스트럭트 pDAS5203, pDAS5212 및 pDAS5227은 대조군 Nex710과 비교하여 가장 낮은 총 포화 FA 프로파일을 갖는 트랜스제닉 이벤트를 제조하였다(표 19 및 20). 각각의 상기 두 개의 컨스트럭트 이벤트 사이의 쌍대 차이는, pDAS5203 및 pDAS5212, 및 Nex710 대조군이 현저하였다(p=<0.005). 그러나 pDAS5227의 쌍대 차이가 강력한 경향성(p=0.06)을 나타냈다. pDAS5203로부터 상기 이벤트 중 하나는 상기 Nex710 대조군에서 평균 6.38%와 비교하여 5.3%의 가장 낮은 총 포화 FA 함유량(나타내지 않음)을 포함하였다. 이는 총 포화 FA에 있어서 17% 감소이다.
다중 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트의 T1 종자 FA 프로파일
컨스트럭트 No. 분석의 타입 총 Sats C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
pDAS5212 평균(n=37)* 6.00 0.05 3.60 0.24 1.38 75.88 12.24 3.41
pDAS5212 표준편차(n=37) 0.21 0.01 0.20 0.02 0.14 1.36 1.03 0.41
pDAS5212 p값** 0.01 0.07 0.89 0.47 <0.0001 0.39 0.37 0.94
pDAS5204 평균(n=20) 6.26 0.05 3.52 0.25 1.65 76.33 11.52 3.58
pDAS5204 표준편차(n=20) 0.29 0.01 0.15 0.02 0.16 0.78 0.66 0.30
pDAS5204 p값 0.43 0.72 0.52 0.69 0.32 0.16 0.04 0.34
pDAS5203 평균(n=8) 5.98 0.05 3.68 0.26 1.33 75.32 12.74 3.55
pDAS5203 표준편차(n=8) 0.36 0.01 0.25 0.05 0.13 1.76 1.31 0.47
pDAS5203 p값 0.02 0.06 0.45 0.96 0.0001 0.96 0.98 0.49
pDAS5227 평균(n=15) 6.09 0.03 3.63 0.32 1.32 75.43 12.32 3.73
pDAS5227 표준편차(n=15) 0.35 0.00 0.29 0.09 0.12 1.69 1.36 0.37
pDAS5227 p값 0.07 0.002 0.69 0.012 <0.0001 0.84 0.48 0.1
Nex710 평균(n=5) 6.38 0.04 3.59 0.26 1.73 75.28 12.76 3.40
Nex710 표준편차(n=5) 0.61 0.01 0.15 0.03 0.49 3.00 2.76 0.43
* 괄호 안의 숫자는 분석에 포함된 이벤트의 개수를 나타낸다.
**0.05와 같거나 낮은 p값은 통계적으로 유위한 것으로 간주되었고 JMP 소프트웨어로 측정되었다.
다중 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트의 T1 종자 FA 프로파일
컨스트럭트 No. 분석의 타입 총 Sats C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
pDAS5212 평균(n=37)* 6.00 0.54 1.33 0.06 0.30 0.13 0.08
pDAS5212 표준편차(n=37) 0.21 0.04 0.11 0.01 0.03 0.05 0.04
pDAS5212 p값** 0.01 0.03 0.003 0.14 0.76 0.26 0.23
pDAS5204 평균(n=20) 6.26 0.59 1.20 0.05 0.32 0.13 0.11
pDAS5204 표준편차(n=20) 0.29 0.06 0.17 0.01 0.05 0.05 0.03
pDAS5204 p값 0.43 0.79 0.20 0.87 0.68 0.29 0.63
pDAS5203 평균(n=8) 5.98 0.51 1.28 0.05 0.29 0.12 0.11
pDAS5203 표준편차(n=8) 0.36 0.03 0.15 0.01 0.02 0.01 0.05
pDAS5203 p값 0.02 0.006 0.048 0.42 0.56 0.55 0.84
pDAS5227 평균(n=15) 6.09 0.56 1.39 0.06 0.39 0.15 0.16
pDAS5227 표준편차(n=15) 0.35 0.07 0.23 0.01 0.10 0.08 0.05
pDAS5227 p값 0.07 0.21 0.0005 0.066 0.008 0.081 0.004
Nex710 평균(n=5) 6.38 0.60 1.10 0.05 0.31 0.11 0.10
Nex710 표준편차(n=5) 0.61 0.13 0.09 0.01 0.07 0.05 0.08
* 괄호 안의 숫자는 분석에 포함된 이벤트의 개수를 나타낸다.
**0.05와 같거나 낮은 p값은 통계적으로 유위한 것으로 간주되었고 JMP 소프트웨어로 측정되었다.
이벤트 pDAS5203, pDAS5212 및 pDAS5227의 특이적인 FA 프로파일은 Nex710과 비교하여 C18:0에서 21-25% 감소를 야기하였다(도 15A). 이러한 모든 차이는 p = 0.001에서 또는 그 이하에서 통계적으로 유의하였다(표 19 및 20). 다른 장쇄 FA, C20:0, C22:0 및 C24:0는 또한 농도에 감소를 나타냈다. 그러나, C16:0 함유량에는 변화가 없는 것으로 관찰되었고 이는 모든 세 가지의 컨스트럭트 트랜스제닉 이벤트에서 C16:0/C18:0 함유량에 유의적인 증가를 야기하였다(도 165B).
pDAS5227 트랜스제닉 종자의 FA 프로파일은 pDAS5203 및 pDAS5212와 비교하여 구분되는 차이를 나타냈다. C14:0에서 23% 감소(p = 0.002) 및 C16:1에서 19% 증가(p = 0.01) 함유량이 Nex710과 비교하여 pDAS5227 종자에서 관찰되었다(도 16A 및 B, 표 19 및 20). 상기 pDAS5227 ZFP TF 설계는 KRAB1 도메인 대신에 ZFP에 융합된 ERF3 하향 조절 도메인의 존재를 제외하고 pDAS5203 및 pDAS5212와 동일하다(표 18).
pDAS5204에 존재하는 다른 ZFP 설계, 13714는, 13722 설계와 비교하여 C18:0 감소에 있어서 효과적이지 않았다(표 16). FatB4 및 FatB5 유전자에 모두 결합하는 상기 13722 설계와 다르게, 상기 13714 설계는 오직 상기 FatB5 유전자에만 결합한다(실시예 9, 표 12).
15.2 mRNA 분석을 위한 식물의 식별
두 트랜스제닉 이벤트인, 5212[1]-004 및 5227[4]-012는, 각각 컨스트럭트 pDAS5212 및 pDAS5227로 형질전환됨으로써 제조되었고, FatB5 전사적 하향 조절 분석을 위해 선별되었다. 50 내지 100개의 T1 종자를 온실에 심었고 식물을 길렀다. 4개의 잎 펀치를 2-3 잎 단계에 있는 식물로부터 수집하였다. 이러한 식물 재료를 pat qRT-PCR 분석을 사용하여 ZFP TF 카피 수에 대하여 분석하였다(실시예 6.2). 그런 다음 랜덤 ZFP 널 및 ZFP 양성 식물을 T2 종자를 수집하기 위해 성숙시키기 위하여 선별하였다(표 21). FatB mRNA 분석을 위하여 상기 동일한 식물 유래의 비성숙한 꼬투리를 개화(flowering(DAF)) 후 25일에 수집하였다. 두 이벤트는 단일 카피로서 분리하였다. 이러한 이벤트는 5212-4 및 5227-12로서 표지하였다.
ZFP 양성 및 널 식물의 식별을 위한 트랜스제닉 이벤트 스크리닝
이벤트 이름 T1 종자/식물 식물 No. 카피 수 #Plants to T2 seed
5212-004 심은 종자 50 카피수
발아한 종자 49
pat카피수에 대한 스크리닝 17 널 5
26 1 카피 3
5 2 카피 4
1 NT *
ChiTest 0.04
5227-12 심은 종자 100
발아한 종자 96
pat 카피수에 대한 스크리닝 19 널 4
32 1 카피 3
27 2 카피 4
18 NT *
ChiTest 0.034
* NT = 검사하지 않음(Not tested).
15.3 RNA 추출 및 qRT-PCR 분석 개발
RNA를 Qiagen(Valencia, CA)으로부터 입수한 식물 RNAEASYkit로 비성숙 유채 종자로부터 분리하였다. 종자를 RLT 버퍼(Qiagen) /β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol,BME) 및 스테인리스 강구가 포함된 클러스터 튜브에 넣었다. 샘플을 클러스터 튜브 랙 내에 놓고 1분당 500 스트로크로 5분간 비드 밀(bead mill)(Kleco, Visalia, CA)에서 균질화하였다. 상기 튜브 랙을 180도로 회전시키고 추가로 5분간 균질화하였다. 그런 다음 샘플을 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 옮기고 5분간 20,000 × g에서 원심분리하였고 상기 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. RNA는 제조사의 프로토콜(Qiagen; Valencia, CA)에 기술된 바에 따라 분리하였다. RNA를 50 ㎕의 RNase free water를 이용하여 상기 컬럼으로부터 용출하였고 상기 RNA 샘플을 Thermo Scientific(Wilmington, DE)의 NanoDrop 8000으로 정량하였다.
게놈 DNA를 제거하기 위하여 10 내지 12 ㎍의 RNA를 1.5 ㎖의 RNase/DNase 프리 튜부에서 TURBO DNA-free(catalog number AM1907; Applied Biosystems, Foster City, CA) DNase로 처리하였다. 각 RNA 샘플에 대하여, RNA, 1X DNase 버퍼, 및 2 units의 TURBO DNase를 포함하는 50 ㎕의 반응물을 준비하였다. 반응물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 5 ㎕의 DNase 비활성화 시약을 각 튜브에 첨가하여 혼합하였다. 샘플을 상온에서 3분간 배양하였고, 다시 혼합하여, 상온에서 추가로 2분간 배양하였다. 샘플을 20,000 × g에서 5분간 원심분리하였다. 상기 DNase 비활성화 슬러리를 남겨 놓고 40 ㎕의 상층액을 제거하였다. DNase 처리된 각 샘플은 RNA의 등가물 양이 cDNA 합성을 위해 사용하기 위하여 Nanodrop으로 정량하였다.
cDNA High Capacity kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용함으로써 각 RNA 샘플에 대해 상보적 DNA(cDNA)를 준비하였다. 요컨대, 1.5 ㎍의 RNA를 1X 역전사 버퍼, 1X dNTPs, 1X 랜덤 올리고머, 및 125 units의 Multiscribe 역전사효소가 포함된 50 ㎕의 반응물에서 주형으로서 사용하였다. 추가적으로, Multiscribe 역전사효소 없이 상기와 같은 동일한 조건 하에서 1.5 ㎍의 DNase 처리된 RNA를 사용하여 각각에 대하여 noRT 대조군 반응을 준비하였다. 모든 샘플은 25℃에서 10분간, 37℃에서 2시간 동안, 85℃에서 5분간, 및 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
FATB, KASII, ERF3, KRAB1, 및 튜불린에 대한 프라이머 및 프로브는 Applied Biosystems(Foster City, CA)의 Primer Express 3 소프트웨어로 설계하였다. 프라이머는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)에서 합성하였다. 하기는 상기 프라이머에 대한 서열이다:
서열번호 63: FATB5 fwd-5' TCGCTGCCATAACAACCATTT 3';
서열번호 64: FATB5 rev-5' CGCCTGGGTTTCCAGTCA 3';
서열번호 65: KRAB1 fwd-5' AAGGATGTGTTCGTGGATTTCA 3';
서열번호 66: KRAB1 rev-5' CACAATCTGCTGTGCAGTATCAAG 3';
서열번호 67: ERF3 fwd-5' GCGGGCGGGAGTTGTTA 3';
서열번호 68: ERF3 rev-5' CCCCATCGGCGTTACATG 3';
서열번호 69: 튜불린 fwd-5' GAAGCTGAGAACAGCGATTGC 3';
서열번호 70: 튜불린 rev-5' GTTCCTCCTCCCAACGAATG 3'.
프로브는 Applied Biosystems(Foster City, CA)에서 합성된 6FAM/MGB이었다:
서열번호 71: FATB5 프로브 6FAM TTTCTCAGCCGCCA;
서열번호 72: KRAB1 프로브 6FAM TAGGGAAGAGTGGAAGCT;
서열번호 73: ERF3 프로브 6FAM CAGGCCTCAGCCTT; 및
서열번호 74: 튜불린 프로브 6FAM TACAAGGTTTCCAAGTTT.
FatB, ERF3, KRAB1 및 튜불린의 유전자 발현은 Applied Biosystem 7900HT(Foster City, CA)를 이용하여 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 표준 곡선은 역동적인 범위 및 분석의 효율성을 확립하기 위하여 다른 그룹 내에서 몇몇 cDNA 샘플의 부분 표본을 사용하여 준비하였다. 최초 희석의 그 후 1:5 및 1:4 연속 희석을 만들었다. 각 cDNA 샘플은 10mM Tris, pH7.5로 1:50으로 희석하였다. PCR 반응물은 1X 유전자 발현 마스터 믹스(Applied Biosystems; Foster City, CA), 0.8 μM의 정방향 및 역방향 프라이머, 0.2 μM의 유전자 특이적 6FAM/MGB 프로브 및 4 ㎕의 희석된 cDNA를 포함하는 12 ㎕의 부피로 준비하였다. 모든 반응은 SDS version 2.4 소프트웨어를 이용하여 Applied Biosystem 7900HT에서 하기 조건 하에서 수행하였다: 단계 1) 50℃에서 2분간; 단계 2)95℃에서 10분간; 단계 3)95℃에서 15초간, 및 단계 4)60℃에서 1분간. 단계 3 및 4는 39의 추가적인 사이클로 반복하였다. 튜불린 유전자 발현은 각 플레이트에 대해 측정하였지만 FatB, ERF3, 및 KRAB1은 분리되어 진행하였다. 모든 반응은 3회 반복 실시하였다.
표준 곡선은 회귀 및 기울기 및 필요에 따라 조정된 임계값에 대해 측정되었고 5 내지 7의 Ct 차이가 존재하는 것을 확인하기 위하여 상기 noRT 샘플(상기 역전사효소를 제외하고 모든 cDNA 반응과 함께 RNA를 함유하는 마이너스 역전사효소 대조군)을 상응하는 샘플과 비교하였다. 상기 데이터는 분석을 위해 엑셀로 불러왔다. FatB, ERF3, 및 KRAB1의 평균 정량값은 튜불린 및 FatB와 튜불린 발현 비율로서 보고된 정량 평균에 대하여 표준화하였다.
15.4 비성숙 종자들에서 종자-특이적 Fat5 mRNA 하향 조절의 분석
결과들은 비성숙 종자에서 25 개화일(day after flowering, DAF)의 FatB mRNA 하향-조절은 T1 식물의 접합성(zygosity) 상태에 의존적이었다. 예를 들면, 5227-12 비성숙 종자의 이형접합 식물(1 카피)에서는 명확한 FatB5 mRNA 하향 조절이 관찰되지 않았다(도 17). 그러나, 동형접합 식물(2 카피)에서 상기 ZFP TF 발현이 2-배까지 증가할 때, FatB5 mRNA 발현의 21% 감소가 관찰되었다(p = 0.025). 유사한 결과들이 다른 이벤트, 다른 컨스트럭트인 pDAS5212의 5212-4에서 얻어졌다. 상기 이벤트에서, 다시, 상기 이형접합 식물 내 명확한 Fat5 하향 조절은 관찰되지 않았다(도 18). 그러나, ZFP TF 발현이 증가될 때, 상기 동형접합 식물 내 상기 FatB5 전사체의 15% 감소가 관찰되었다.
상기 두 이벤트들의 널, 이형접합 및 동형접합 식물들을 성숙시켰고, FA 프로파일은 각 식물의 24 종자 풀에서 측정되었다. ZFP TF-함유 계통에서부터 널 계통을 분리하는 상기 과정은 상기 ZFP TF의 존재를 더욱 가깝게 반영하는 FA 프로파일 차이를 허용했다.
15.4 T2 성숙 종자에서 FA 프로파일의 분석
T2 성숙 종자 FA 프로파일은 이벤트 5227-12(표 22 및 23)에 대한 상기 T1 부모 식물의 ZFP TF 접합성에 따라 변한다. 비록 상기 이형접합 T1 식물이 25 DAF 비성숙 종자에서 어떤 명확한 FatB mRNA 하향조절을 나타내지는 않았지만, 그들의 종자 FA 프로파일은 C18:0 함유량에서 8%의 감소를 나타내었다. C16:0 함유량의 현저한 감소는 관찰되지 않았다. 게다가, 총 포화 FA의 전반적인 5.5% 감소를 야기하면서, C18:1(올레산의(oleic)) 및 뒤이은 하류 FAs의 미세한 증가들이 관찰되었다. 5227-12 T1 식물이 ZFP TF에 대하여 동형접합이었을 때, 상기 FatB mRNA는 현저하게 하향 조절되었다. 상기 T2 종자의 FA 프로파일은 다르다. 총 포화 FA의 전반적인 2.7% 감소를 야기하면서, C16:1 함유량의 11% 증가가 관찰되었다(Tables 18A 및 18B). 그러나, 상기 이형접합 식물과 비교하여 C18:0의 추가적인 감소는 관찰되지 않았다. 상기의 변화들은 상기 T1 성숙 종자 FA 프로파일과 일치하였다(실시예 15.1).
이벤트 5227-12의 T2 성숙 종자의 표시된(indicated) FA 프로파일
식물 ID Copy # 총 Sats C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1(Oleic) C18:1(vaccenic) 총 C18:1 C18:2 C18:3
5227-12 평균(n=4) 0 7.21 0.05 4.00 0.28 2.06 71.47 5.27 76.74 10.92 3.22
5227-12 표준편차(n=4) 0 0.21 0.01 0.09 0.02 0.10 0.56 0.29 0.62 0.29 0.34
5227-12 평균(n=3) 1 6.84 0.05 3.82 0.25 1.88 71.99 4.88 76.87 11.03 3.33
5227-12 표준편차(n=3) 1 0.33 0.01 0.33 0.03 0.04 0.50 0.19 0.32 0.05 0.31
5227-12 평균(n=4) 2 7.00 0.05 3.96 0.30 1.91 70.99 5.09 76.08 11.62 3.30
5227-12 표준편차(n=4) 2 0.29 0.00 0.47 0.03 0.40 1.50 0.25 1.44 1.21 0.26
이벤트 5227-12의 T2 성숙 종자의 FA 프로파일
식물 ID 카피 수 총 Sats C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
5227-12 평균(n=4) 0 7.21 0.64 1.01 0.04 0.27 0.13 0.09
5227-12 표준편차(n=4) 0 0.21 0.03 0.02 0.01 0.01 0.03 0.01
5227-12 평균(n=3) 1 6.84 0.62 1.07 0.04 0.28 0.12 0.09
5227-12 표준편차(n=3) 1 0.33 0.02 0.11 0.00 0.03 0.02 0.01
5227-12 평균(n=4) 2 7.00 0.62 1.06 0.04 0.27 0.12 0.08
5227-12 표준편차(n=4) 2 0.29 0.09 0.03 0.01 0.03 0.03 0.01
이벤트 5212-4의 T2 성숙 종자 FA 프로파일에서도 유사한 결과들이 얻어졌다. 이형접합 식물 종자에서, 총 포화 FA의 3.2% 감소를 야기하면서, C18:0 함유량의 5.5% 감소가 관찰되었다(표 22 및 23, 도 20). C18:1의 미세한 증가도 관찰되었다; 반면 상기 잔류 FA들의 농도는 미세한 감소를 나타내었다. FatB mRNA의 현저한 하향조절에도 불구하고, 동형접합 식물은 반접합성 식물과 비교하여 C18:0 함유량에서 더 많은 감소를 나타내지 않았다.
요약하면, ZFP TF들의 종자-특이적 발현에 의한 상기 FatB5 유전자의 전사적 하향조절은 상기 실시예들에서 입증되었다. 상기 ZFP TF들은 T2 동형접합 종자에서 상기 표적 FatB5 유전자의 전사적 하향 조절을 부여하는데 효과적이었다. 그러나, T2 동형접합 종자에서 C18:0의 감소는 T2 분리 종자보다 많지 않았다. 상기 FatB 유전자는 식물 성장 및 발달에 필수적이기 때문에, 상기 결과들은 상기 동형접합 ZFP TF 카피들이 상기 FA 프로파일을 조절하기 위한 피드백 메커니즘을 야기하고 있지 않을 수 있다는 것을 암시한다(Bonaventure et al., Plant Cells, 2003 15:1020-1033). 상기 비성숙 종자에서 ZFP TF에 의해 매개되는 FatB mRNA 하향 조절이 상기 C18:0 함유량의 변화를 위한 FatB mRNA 상향 조절과 반비례 관계에 있다는 점은 주목할 만하다.
상기 실시예들은 야생형 FatB 유전자 상에 미치는 ZFP TF의 목적하는 효과가 특이적으로 FatB mRNA 양을 변화시킴으로써, 유채에서 특이적이고 유전적인 FA 프로파일 변화를 야기한다는 점을 나타낸다.
다른 접합성 수준에서 이벤트 5212-4 T2 종자의 FA 프로파일
식물 No. 카피 수 %총 Sats C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
5212-4 평균(n=5) 0 7.02 0.05 3.94 0.32 1.88 76.03 11.17 3.50
5212-4 표준편차(n=5) 0 0.29 0.01 0.18 0.02 0.12 1.44 1.06 0.56
5212-4 평균(n=5) 1 6.79 0.04 3.83 0.32 1.81 76.86 10.74 3.36
5212-4 표준편차(n=5) 1 0.19 0.00 0.07 0.01 0.17 0.26 0.31 0.11
5212-4 평균(n=5) 2 6.96 0.04 3.89 0.32 1.89 76.38 11.00 3.38
5212-4 표준편차(n=5) 2 0.24 0.00 0.08 0.01 0.16 0.81 0.78 0.30
다른 접합성 수준에서 이벤트 5212-4 T2 종자의 FA 프로파일
식물 No. 카피 수 %총 Sats C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
5212-4 평균(n=5) 0 7.02 0.64 1.16 0.04 0.33 0.20 0.11
5212-4 표준편차(n=5) 0 0.29 0.07 0.06 0.01 0.04 0.05 0.01
5212-4 평균(n=5) 1 6.79 0.62 1.11 0.04 0.31 0.18 0.10
5212-4 표준편차(n=5) 1 0.19 0.05 0.03 0.00 0.03 0.02 0.00
5212-4 평균(n=5) 2 6.96 0.63 1.12 0.05 0.31 0.21 0.10
5212-4 표준편차(n=5) 2 0.24 0.07 0.05 0.01 0.03 0.05 0.01
본원에 언급된 모든 특허, 특허원 및 공개공보는 모든 목적을 위해, 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용이 이해를 명확히 할 목적으로 예시 및 그 예로써 일부 상세히 제공되긴 하였지만, 본 개시내용의 요지 또는 범위를 벗어나지 않고서도 각종 변화 및 변형을 실시할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 따라서, 전술된 설명 및 실시예는 그로써 제한되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC et al. <120> ENGINEERED ZINC FINGER PROTEINS TARGETING PLANT GENES INVOLVED IN FATTY ACID BIOSYNTHESIS <130> 8325-4006.40 <140> PCT/US2010/002817 <141> 2010-10-22 <150> 61/279,528 <151> 2009-10-22 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatgaaa 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ctcgagctgc tactgctagt tccggtggag gagcc 35 <210> 3 <211> 736 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 3 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa atcttttgac 60 gtctccacgc acgagtttac gcatcccaga cgcctcctta gagagaagag agagatcgag 120 atcgatttcc tccctcttaa acctctctct ctctcgtgaa tctcatttcc ctttgccgct 180 agattctctc ttcacccttt tctcgccctt ccttcctctc ctcattactt ttttgtcgtc 240 ttctgctctc tctctctctc agcactcttc gccatggtgg gtgctgctgc gtcttcctgt 300 tacgcatctc cgctatgcac ctggttcgtc gccgcctgca tgtccgtctc ccacggcggc 360 ggagattccc gacaagccgt cgctctcaaa tctaccgggc ggagtcgtcg aagcagacaa 420 cagctcacca aatgctctgg atccggtagc agcactactt cctttgggcc ttgcaatcac 480 tacaatgcct tgtcttctct cttcggatcg aactctgttt ctctcaatcg aaaccagagg 540 aggttgactc gagctgctac tgctagttcc ggtggaggag ccatggctgt tgcgatggat 600 atggaaaagg aagccaaggt tgacaacaaa cctcctacgg agcagcgccg ggttgttgtg 660 acaggcatgg gagttgaaac atcactaggt catgaccctg acacctttta tgagaatctc 720 ctacaagggc gaattc 736 <210> 4 <211> 732 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 4 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa atgtatgtat 60 cttttgacgt ctccacgtac gagtttacgc atccagacgc ctcgttagag agaagagaga 120 gatcgagatc gagatcgaga tcgatttcct ccctctctct ctcgtgaatc tcatttcccc 180 ttaccgctag attctctctt cacccttttc tcgcccttcc ttctcctcat tatttttttg 240 tcgtcttctg ctctctcaca gcactcttct ctttagctat ggtgggtggt gctgcgtctt 300 cttcctgtta cgcatctccg ctatgcacct ggttcgtcgc tgcttgcatg tccgtctccc 360 acggcggcgg agattcccga caagccgtct ccctcaaatc taccgggcgg agtcgtcgaa 420 gcagacgaca gctcaccaaa tgcttggctc tttctggatc cggtagcgtt caggaggctc 480 tcgtcactac ttcctttggg ccttgcaatc actacaatgc cttgtcttct ctcttcggat 540 cgaactctgt ttctctcaat cgaaaccaga ggaggttgaa tctggctgct gctagttccg 600 gtggaggagc catggctgtt gcgatggata tgcaaaagga agccaaggtt gacaacaaac 660 cccctacgga gcagcgccgt gttgtggtga caggcatggg agttgaaaca tcactaggtc 720 aagggcgaat tc 732 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Lys Ile Asn Leu Gln Val 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Thr Arg Ser Ser Arg Ile Asn 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Arg Ser Asp Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Arg Ser Asp His Leu Ser Ala 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Thr Ser Ser Ser Arg Ile Asn 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 39 ccagcgtaag caataccagc cacaacacc 29 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 cctctctacc accgtctcac atg 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 gatctggccg gactgtttca 20 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 42 cgctcctcag ctaccacctc aacca 25 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 tcgatcttga tatgttggga ga 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 aggtgcagaa tcatgtggtg 20 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 45 ttgatggtga agatgt 16 <210> 46 <211> 718 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 46 gaattcgccc ttcgcggatc cgaacactgc gtttgctggc tttgatgaaa gcttgtatgt 60 atgtatcttt tgacgtctcc acgtacgagt ttacgcatcc agacgcctcg ttagagagaa 120 gagrgagatc gagatcgaga tcgagatcga tttcctccct ctctctctcg tgaatctcat 180 ttccccttac cgctagattc tctcttcacc cttttctcgc ccttccttct cctcattatt 240 tttttgtcgt cttctgctct ctcwcakcwc tcwkcwctct tmgcyatggt gggtgstgct 300 gcgtcttctt cctgttacgc atctccgcta tgcacctggt tcgtcgcygc ytgcatgtcc 360 gtctcccacg gcggcggaga ttcccgacaa gccgtckcyc tcaaatctac cgggcggagt 420 cgtcgaagca gacaacagct caccaaatgc tctggatccg gtagcagcac tacttccttt 480 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 ttccacaaca tctccccaag 20 <210> 58 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 58 aaccttcatc ctccca 16 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 tcgatcttga tatgttggga ga 22 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 aggtgcagaa tcatgtggtg 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 acgagctacc tgacggacaa g 21 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 gagcgacggc tggaagagta 20 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 tcgctgccat aacaaccatt t 21 <210> 64 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 gttcctcctc ccaacgaatg 20 <210> 71 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 71 tttctcagcc gcca 14 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 72 tagggaagag tggaagct 18 <210> 73 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 73 caggcctcag cctt 14 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 74 tacaaggttt ccaagttt 18 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Ala 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Gln Ser Ala His Arg Lys Thr 1 5 <210> 77 <211> 7 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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 195 200 <210> 93 <211> 1693 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 93 ctcgagctgc tactgctagt tccggtggag gagccatggc tgttgcgatg gatatggaaa 60 aggaagccaa ggttgacaac aaacctccta cggagcagcg ccgggttgtt gtgacaggca 120 tgggagttga aacatcacta ggtcatgacc ctgacacctt ttatgagaat ctcctacaag 180 gcaacagtgg tattagccag attgagaatt ttgattgttc tgcttttcct acgagaattg 240 ctggagagat caagtcattc tcgactgaag ggtgggttgc tccaaaactc tcaaagagga 300 tggacaagtt catgctctat 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tagcattcag gctctcgtca cttcttgttt ggattttggt 300 ccttgtactc actacaacaa caacaatgca ttgtcttctc tctttggatc gaatagtgtt 360 tctttgaatc gaaaccagag gagattgaat cgtgctgcta gctccggtgg agccatggca 420 gtgatggaga tggaaaagga agctgcggtt aacaagaaac cacctacgga gcagcgtcga 480 gttgtagtga caggcatggg agttgaaaca tcattgggtc atgacccaca taccttctat 540 gagaatttgc tacaaggcaa cagtggtatt agccagattg aaaattttga ttgttctgaa 600 tttcctacgc gaattgcggg agagatcaaa agcttctcga ctgaaggatg ggttgctcca 660 aaactttcta aaaggatgga caaattcatg ctctatcttc tcacagctgg taagaaagct 720 ttggctgatg gtggggttac tgatgaagta atggcagagt ttgacaaaac caaatgtgga 780 gttttgattg gctcggcaat gggaggaatg aaggtctttt acgatgctat tgaagctctg 840 agaatctctt acaagaagat gaatcctttt tgtgtacctt ttgcgacaac aaacatgggt 900 tctgctatgc ttgccatgga tctgggatgg atggggccaa actattctat ttcaactgct 960 tgtgccacaa gcaacttttg cattctgaat tcagcaaacc acattattaa aggtgaagct 1020 gatgtaatgc tctgtggtgg ctcagatgca gttattattc caatagggtt gggaggtttt 1080 gttgcatgcc gggctctttc acaaaggaat aatgatccca caaaagcttc acgtccttgg 1140 gataccaatc gagatggttt cgtgatggga gagggagctg gagttctact tttggaagaa 1200 ctcgagcatg ctaagaaaag aggtgcaact atctacgcag agttcctcgg tgggagtttc 1260 acatgtgatg cctatcacat gaccgagcct caccctgatg gggctggtgt tattctctgt 1320 attgagagag cgttagctag tgctgggatt tccaaggaac aaataaatta cataaatgca 1380 catgcaacct caacgcatgc tggagatatt aaggaatacc aagcccttgc tcactgtttt 1440 ggccaaaatc ctgagcttaa ggtaaattcc acaaaatcta tgattggaca cttgctggga 1500 gctgctgggg ccgtggaggc tgttgcaact gtgcaggcga tacggaccgg atgggttcat 1560 ccaaatatca acctcgagaa tccagacagt ggagtggata caaagctgct ggtgggtcct 1620 aagaaggaga gactggacat taaagcagcc ttgtcaaatt cattcgggtt tggtggtcat 1680 aactccagca tcatttttgc tccttacaag tgaaagcgaa agcagttgct tgtactccaa 1740 acctgattgt ataacttgct gtaaggt 1767 <210> 95 <211> 893 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 95 gacatggata ttttctgaga tttggaagtg tggatttgat ataagcaaag caaagcaagt 60 gctcgcttgt atgtatcttt tgacgtctcc acgcacgagt ttacgcatcc agacgcctcg 120 ttagagagaa gagagagatc gagatcgatt cctccctctt aaacctctct ctctctcgtg 180 aatctcattt ccccttaccg ctagattctc tcttcaccct tttctcgccc ttccttcctt 240 ctcctcatta cttttttgtc gtcttctgct ctctctctct ctcagcactc ttcgctttag 300 ctatggtggg tgctgctgcg tcttcctgct acgcatctcc gctatgcacc tggttcgtcg 360 ctgcctgcat gtccgtctcc cacggcggcg gagattcccg acaagccgtc gctctcaaat 420 ctagcgggcg gagtcgtcga agcagacaac aactcaccaa atgctctgga tccggtagca 480 gcgttcagca ggctctcgtc actacttcct ttgggccttg caatcactac aatgccttgt 540 cttctctctt cggatcgaac tctgtttctc tcaatcgaaa ccagaggagg ttgactcgag 600 ctgctactgc tagttccggt aatttaacat ttcaccaatc tgggtttttg atttgtgggt 660 attgtttgca gagttgacaa gctttgtttt tgttagtaaa gtttctcttt ttatgtgttt 720 atgttatttg gtcaaatgat tcaacttgga gatcaagttt aacgggaaag tatgctgatt 780 tggaatctca gcttaattgt caagtttcat tctttattgt gtgtgtaata tgcaaagcac 840 atttctgtga gtttgattca atattggact ctagataagg agtatgatga tac 893 <210> 96 <211> 812 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 96 acggcacttt acgcaccaat atataccata tggtagccag ttaagggtac gaagtgattt 60 tccccttttc ttatgtatac agactccaat tccccaaatt tactctggtc atcgaacatc 120 gatacgtttg tatgtatgta cgtcttatct ctctctctgg ctatctctgt gtgttttgtt 180 gttaataaca ggaggttttg ttttgttttc tttgacgtct ccacgcacga ttttaagcct 240 ccgttacgct ctgcacgcct cctgaaagag agagagagag agatcgaatc atcttaatta 300 aacctctctc gtgaatccgc tagattctct cttcaccgtt ttctcgcctc tcctctcctc 360 tccattttgt tttcttcttc ttcgtcttct tcttcttgcc attgccatgg tgggtgctgc 420 tgcgtcttcc tgttacgcat ctcccttatg caccttcttc gttgctgctt gcatgtccct 480 ctctcacggc ggcggtgata cccgtcaagc ctttgggcgg agccgtcgaa ggagacaaca 540 gctcggcaaa tgctctggat ccggtagcat tctcgtgtct tcttgtttgg agtttaagcc 600 ttgcagtcac tacaacaaga acaacaaagg caatgccttt cctctcctcg gatcgaatag 660 cctttctctg aatcgaaagc agaggaaact gaatcgagca acttcttctt cttccggtat 720 aaacattctt ctcccaaaat ctcaagtctt ggtttctggg tatcgtttgc aagctgacaa 780 gctttgtttt ttgtgtataa agtttctcct tt 812

Claims (19)

  1. 적어도 하나의 식물 유전자가 지방산 생합성에 포함되고, β-케토아실-ACP 합성효소(KAS) 유전자, 지방산 티오에스테라아제 B(FatB) 유전자, 지방산 신타아제(FAS) 유전자, 지방산 신장효소 유전자, 지방산 티오에스테라아제 A(FatA) 유전자, 색소체 G-3-P 탈수소 효소(GPDH) 유전자, 글리세로키나아제(GK) 유전자, 스테아로일-아실 운반 단백질 탈포화효소(S-ACP-DES) 유전자, 및 올레오일-ACP 가수 분해 효소 유전자로 구성되는 군으로부터 선택될 때, 적어도 하나의 내재적 식물 유전자의 발현을 조절하는 비-천연 발생 징크 핑거 단백질.
  2. 제 1항의 징크 핑거 단백질 및 기능적 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 기능적 도메인은 전사적 조절 도메인 또는 절단 도메인인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 유전자는 유채속 식물에 함유되는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질 또는 융합 단백질.
  5. 제 4항에 있어서, 징크 핑거 단백질은 표 2 또는 표 11에 나타난 바와 같은 표적 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질.
  6. 제 4항에 있어서, 징크 핑거 단백질은 표 1 또는 표 12에서 연속적으로 나타난 인식 헬릭스 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 단백질.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 징크 핑거 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 하나 이상의 징크 핑거 단백질이 발현되고, 하나 이상의 유전자가 변경된 것과 같은 조건 하에서, 제 7항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물세포에서 지방산 생합성에 포함된 하나 이상의 유전자를 변경하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 변형은 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 적어도 하나의 유전자의 발현이 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 유전자의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하고, 적어도 하나의 유전자가 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 공여자 벡터가 상동성 재조합에 의해 절단 부위로 도입되도록 공여자 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 변경된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 식물 세포.
  15. 제 14항에 있어서, 세포가 종자 내에 있고, 종자의 지방산 함량이 변경된 것을 특징으로 하는 식물 세포
  16. 제 14항 또는 제 15항에 따른 적어도 하나의 세포를 포함하는 식물.
  17. 제 16항에 따른 식물의 종자 또는 자손.
  18. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 징크 핑거 단백질 또는 제 7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함하는 식물.
  19. 제 18항에 따른 식물의 종자 또는 자손.
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