KR102147006B1 - Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질 - Google Patents

Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질 Download PDF

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Abstract

대두 세포의 FAD2 유전자에서의 위치를 부위 지정 방식으로 절단하여 FAD2 유전자에서 파단을 생성한 다음, 관심 핵산 분자를 파단 내에 임의로 통합시킴으로써 FAD2 유전자좌 내에서 유전자를 분열시키거나, 유전자를 편집하거나 또는 유전자를 스택킹하는 방법 및 이를 위한 조성물이 개시된다.

Description

FAD2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질{FAD2 PERFORMANCE LOCI AND CORRESPONDING TARGET SITE SPECIFIC BINDING PROTEINS CAPABLE OF INDUCING TARGETED BREAKS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 2012년 9월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/697,886의 이익에 대해 우선권을 청구한다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 일반적으로 재조합 식물 기술 (예를 들어, 트랜스제닉 식물을 생성하기 위한 것)에 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 임의의 관심 핵산의 부위-특이적 도입에 사용될 수 있는 그의 게놈 내의 유전자좌를 포함하는 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.
다수의 식물은 일반적으로 목적한 형질을 도입하기 위해, 예를 들어 농업상 가치를 개선하기 위해 외인성 핵산 (예를 들어, 트랜스진)으로 유전자 형질전환된다. 유전자 형질전환을 통해 달성할 수 있는 농업상 가치의 개선의 예는 개선된 영양 품질, 증가된 수율, 해충 또는 병해 저항성, 가뭄 및 스트레스 저항성, 개선된 원예학 품질 (예를 들어, 개선된 색소침착 및/또는 성장), 제초제 저항성, 식물로부터의 산업적으로 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산, 및/또는 약제의 제조를 포함한다. 식물 세포 내로 클로닝된 유전자의 도입 및 안정한 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 회수는 여러 세대를 통해 식물의 유전자 변형을 안정하게 하는데 사용될 수 있고, 이에 따라 작물 식물의 유전자 조작을 가능하게 한다.
유전자 형질전환 및 트랜스제닉 식물 생산 방법에서는, 외인성 DNA를 전형적으로 진핵 식물 세포의 핵 또는 색소체 DNA로 무작위로 도입한 후, 통합된 외인성 DNA를 함유하는 세포를 단리시키고, 안정하게 형질전환된 식물의 후속적인 재생이 이어진다. 트랜스제닉 식물은 전형적으로 아그로박테리움-매개 형질전환 기술에 의해 생성되었다. 이들 기술을 사용한 성공은 관심 핵산 분자를 식물의 게놈 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예컨대 원형질체 내의 PEG-매개 DNA 흡수, 미세입자 투사법 (microprojectile bombardment), 및 규소 휘스커 (silicon whisker)-매개 형질전환의 개발을 자극하였다.
그러나, 이들 모든 식물 형질전환 방법에서, 식물 게놈에 혼입된 외인성 핵산은 식물 세포의 게놈에서 무작위로 예측불가능한 카피수로 통합된다 (Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93). 예를 들어, 트랜스진은 빈번하게 전체 트랜스진 또는 그의 일부의 서열 반복의 형태로 통합된다. 이러한 복합 통합 패턴은 통상적으로 통합된 핵산의 발현 수준에 유해한 영향을 미친다 (예를 들어, 전사후 유전자 침묵 메카니즘을 통한 전사 RNA의 파단에 의해, 또는 통합된 DNA의 메틸화를 유도하는 것에 의해). 또한, 통합 부위의 위치는 통합된 핵산의 발현 수준에 통상적으로 영향을 미친다. 또한, 외인성 DNA의 통합은 통합이 발생한 게놈 영역에 대한 분열 효과를 가질 수 있고, 이에 따라 표적 영역의 정상 기능에 영향을 미치거나 또는 이를 방해하여 바람직하지 않은 부작용을 생산할 수 있다. 상기를 비롯한 인자의 조합은 그것이 동일한 방법에 의해 생성된 것임에도 다양한 트랜스제닉 식물 세포 및 식물 라인들 사이에 트랜스진 또는 외인성 DNA의 발현 수준 (및 전체 농경학상 품질)에서의 광범위한 변화를 초래한다. 통합이 무작위이기 때문에, 실시자가 목적한 특징을 갖는 새로운 식물을 생산하려고 시도하지만 이들 효과는 제어할 수 없다.
상기 고려사항은, 식물 내로의 특정한 외인성 핵산의 도입의 효과가 조사될 때마다, 유의한 결과를 얻기 위해서는 다수의 트랜스제닉 식물 라인이 생성되고 분석되어야 하는 것이 필요하다. 마찬가지로, 목적한 표현형을 갖는 트랜스제닉 식물을 제공하기 위한 특정한 통합 핵산을 함유하는 트랜스제닉 식물의 생성에서는, 핵산을 최적으로 발현하고 트랜스제닉 식물의 전체 표현형 및 성능에 부작용이 최소인 또는 갖지 않는 식물 라인의 선택을 가능하게 하기 위해 독립적으로 생성된 트랜스제닉 식물 라인의 다수의 집단을 생성해야 한다. 이들 실질적인 고려사항은 다중 외인성 핵산 삽입 (즉, 유전자 스택킹)에 의해 생성된 트랜스제닉 식물에서 중요성을 더한다. 이러한 식물에서, 전사후 유전자 침묵과 같은 현상이 증폭될 수 있다.
식물에서 트랜스진 삽입을 제어하기 위한 노력으로 여러 방법이 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci. 6:155-9]을 참조한다. 이들 방법은 원핵생물 및 하등 진핵생물 둘 다에 성공적으로 적용된 상동 재조합-기반 트랜스진 통합에 의존한다 (Paszkowski et al. (1988) EMBO J. 7:4021-6). 그러나, 식물에서, 최근까지 트랜스진 통합을 위한 우세한 메카니즘은 재조합 DNA 가닥들 사이에 거의 상동성을 수반하지 않는 비정규 재조합을 기초로 한다. 따라서, 이 분야의 주요 과제는 비정규 재조합을 통해 보다 훨씬 더 효율적인 통합 사례에 의해 차폐되는 드문 상동성 재조합 사례의 검출 및 선택적 생성이다. 또한, 표적화 상동 재조합 사례의 선택적 생성 및 검출이 달성될지라도, 상기 전략의 최대 이익을 실현하기 위해 사례는 숙주 게놈에서 바람직한 위치를 표적화해야 한다.
예를 들어, 표적화 유전자 형질전환의 추정되는 이익은 무작위 통합으로부터 획득된 형질전환 사례와 비교하여 트랜스진 발현의 사례-대-사례 가변성의 감소이다. 추가로 추정되는 이익은 도입된 핵산을 스크리닝하고, 형질전환 구축물을 분류하고, 생성된 트랜스제닉 식물에서 목적하는 전체 특징에 기여하는 사례를 생산하기 위해 요구되는 사례의 수의 유의한 감소이다. 이들 이익을 실현하기 위해 요구되는 중요한 인자는 트랜스진 성능이 일정하고, 가능하다면, 숙주 식물에 대한 부작용이 제거되거나 또는 최소화되는 게놈 내 특정 위치의 확인이다.
최근에, 게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 방법 및 조성물이 기재되었다. 이러한 표적화 절단 사례를 사용하여, 예를 들어 표적화 돌연변이유발을 유도하고, 세포성 DNA 서열의 표적화 결실을 유도하며, 미리 결정된 염색체 유전자좌에서의 표적화 재조합 및 통합을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51] 및 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775; 20110239315; 20110145940; 및 국제 공보 WO 2007/014275를 참조한다. 절단은 특이적 뉴클레아제 예컨대, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 사용, 또는 특이적 절단을 유도하도록 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 통해 일어날 수 있다. 미국 특허 공개공보 번호 20080182332는 식물 게놈의 표적화 변형을 위한 비정규 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 용도가 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20090205083은 식물 EPSPS 유전자좌의 ZFN-매개 표적화 변형이 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20100199389는 식물 Zp15 유전자좌의 표적화 변형이 기재되어 있으며, 미국 특허 공개공보 번호 20110167521은 지방산 생합성에 관여하는 식물 유전자의 표적화 변형이 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9):3055-3060]은 명시된 유전자좌에서의 표적화된 유전자 부가를 위해 설계된 ZFN의 사용을 기재하고 있다. 미국 특허 공개 20110041195는 동형접합 이배체 유기체를 생성하는 방법을 기재하고 있다.
그러나, FAD2 유전자좌에서의 목적하는 트랜스진의 표적화 삽입을 사용한 식물의 생성을 포함하는 식물에서의 FAD2 유전자의 발현을 변형 및/또는 조절하기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시내용의 간단한 개요
본 개시내용은 FAD2 유전자의 발현 (예를 들어, 식물, 조류 및 진균에서)을 조절하기 위한 조성물 및 방법 및 숙주 세포 내로 관심 핵산 서열 (예를 들어, 외인성 핵산 서열)의 표적화 통합을 위한 부위로서 이들 유전자좌의 이용을 기재한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그 중 임의의 것 또는 모두가 선택적으로 변형 및/또는 분열될 수 있는 것인 하나 이상의 FAD2 서열을 갖는 하나 이상의 게놈 (예를 들어, 동조체 또는 파라로그)을 함유할 수 있다. 구체적 예에서, 본 개시내용은 FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 유전자, 뿐만 아니라 글리신 맥스(Glycine max) (예를 들어, 지.맥스 c.v. 잭(G. max c.v. Jack), 윌리암스(Williams) 82, X5, 웨스태그(Westag) 및 매버릭(Maverick))에서 상응하는 동조체 또는 파라로그 및 관심 핵산 서열의 표적화 통합을 위한 유전자좌로서의 그의 이용을 기재한다. 본원에 기재된 바와 같이, FAD2 유전자가 숙주에서 지방산 생합성에 관여하지만, 그의 변형 또는 분열 (예를 들어, FAD2 코딩 서열 내에 외인성 핵산의 통합에 의해)은 생성된 숙주 유기체에 대해 예상외로 부작용이 없거나 또는 최소화될 수 있다.
FAD2 유전자좌 내에 특이적 핵산 서열의 절단 및/또는 통합을 생성할 수 있는 폴리펩티드와 연계된 하나 이상의 특정한 FAD2 유전자좌의 사용이 또한 본원에 기재된다. FAD2 유전자좌의 절단 및/또는 통합을 수행할 수 있는 폴리펩티드와 연계된 FAD2 유전자좌의 사용의 예는 아연 핑거 단백질, 메가뉴클레아제, TAL 도메인, TALEN, RNA-유도 CRISPR-Cas9, 레콤비나제, 류신 지퍼, CRISPr/Cas 및 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 예는 부위-특이적 DNA 결합 도메인 폴리펩티드 및 절단 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, 뉴클레아제)를 포함하는 키메라 ("융합") 단백질, 예컨대 아연-핑거 폴리펩티드 및 FokI 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 ZFN 단백질을 포함한다. 예를 들어, 상응하는 동조체 또는 파라로그의 절단 없이 FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 유전자 및 그의 조합에서 결합하여 이중 가닥 파단을 유도하도록 설계된 특정한 ZFN의 시험관내 및 생체내 효능 및 특이성의 입증이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 특정한 FAD2 유전자좌는 상기 폴리펩티드 중 임의의 것과 함께 사용되어 숙주의 농업상 성능에 대해 최소한의 유해한 영향을 가지면서 숙주에서 후속적으로 발현되는 관심 핵산의 부위-특이적 통합에 영향을 미칠 수 있다.
특정 측면에서, FAD2 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드는, 또한 폴리펩티드가 표적화 이중-가닥 파단을 유도하고/거나 파단 부위에서의 관심 핵산의 재조합을 용이하게 할 수 있도록 뉴클레아제 (절단) 도메인 또는 절반-도메인 (예를 들어, ZFN, 레콤비나제, 트랜스포사제 또는 귀소 엔도뉴클레아제, 예컨대 변형된 DNA-결합 도메인, TAL 도메인, TALEN, RNA-유도 CRISPR-Cas9를 갖는 귀소 엔도뉴클레아제), 및/또는 리가제 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, FAD2 유전자좌를 표적으로 하는 DNA-결합 도메인은 DNA-절단 기능적 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 외인성 핵산을 숙주 유기체 (예를 들어, 식물 또는 동물 종)의 게놈에 하나 이상의 FAD2 유전자좌에서 도입하여 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아연 핑거)를 갖는 아연 핑거 단백질을 포함하고, FAD2 유전자 내의 임의의 서열에 결합하도록 조작 (비-자연 발생)될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 아연 핑거 단백질은 표적 유전자의 코딩 서열 내의 또는 인접한 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 다른 발현 요소) 내의 표적 부위에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 표 1에 나타낸 바와 같이, FAD2 유전자 내의 표적 부위에 결합한다. 예시적인 FAD2-결합 아연 핑거의 인식 나선 영역은 표 2에 나타낸다. 아연 핑거 단백질의 하나 이상의 성분 아연 핑거 결합 도메인은 정규 (C2H2) 아연 핑거 또는 비정규 (예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다 (예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단 아연 핑거가 비정규 핑거일 수 있음).
FAD2 유전자를 분열시키거나 또는 편집하는 방법이 또한 본원에 기재된다. 본 발명의 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된 유전자 변형된 숙주 유기체 (예를 들어, 트랜스제닉 식물)이 본원에 추가로 기재된다. 특정한 예에서, 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된 트랜스제닉 유기체는 제한 없이 조류, 진균, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 등일 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 쌍자엽 식물은 대두 (글리신 맥스) 식물일 수 있다.
본원에 개시된 FAD2 유전자는 하나 이상의 FAD2 유전자를 갖는 임의의 식물, 조류 또는 진균에서 발견된 유전자를 포함할 수 있다.
상기 및 다른 특징은 첨부 도면을 참조로 하여 진행되는, 여러 실시양태의 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 윌리암스 82 (서열 4), 웨스태그 (서열 5), X5 (서열 6), 잭 (서열 7) 및 매버릭 (서열 8)으로부터의 FAD2 2.3 코딩 서열의 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 윌리암스 82 (서열 9), 웨스태그 (서열 10), X5 (서열 11), 잭 (서열 12) 및 매버릭 (서열 13)으로부터의 FAD2 2.6 코딩 서열의 정렬을 나타낸 것이다.
도 3은 DLSSA 검정에서 FAD2 2.3 및 2.6 유전자 설계된 ZFN의 활성을 도시한 것이다. FAD2 2.3 및 2.6 유전자좌에 대해 설계된 ZFN을 리포터로서 포유동물 세포 내로 클로닝된 FAD2 2.3 및 2.6 서열의 절단 활성에 대해 평가하였다.
도 4는 pDAB115620의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pDAB115622의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pDAB7221의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 7은 유전자좌 분열 검정에 대한 프로브/프라이머를 나타낸 개략도이다. 분열 검정에 사용된 FAD2 2.3 및 2.6 유전자 및 프라이머에 대한 F2 ZFN 결합 부위를 나타낸 것이다.
도 8은 FAD2 2.3 유전자좌에서 F2 ZFN2 아연 핑거 뉴클레아제를 사용한 공여자 서열의 NHEJ 표적화로 인한 인-아웃 PCR 생성물의 서열을 나타낸 것이다. 참조 서열 (도면의 상부)은 역방향 배향에서의 공여자 벡터의 표적화 삽입의 배위를 나타낸다. FokI 소화로 인한 DNA의 단일-가닥 말단을 채워서 참조 서열을 생성하였다. 생어 서열을 나타내었다. F2 ZFN2 ZFN 결합 서열을 밑줄로 나타내었다. 명시된 서열과 유사한 서열을 갖는 플라스미드 클론은 우측에 나열하였다.
서열
핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 나타낸다. 각 핵산 서열의 단지 하나의 가닥을 나타내었지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥을 임의로 참조하여 포함된다는 것이 이해된다.
상세한 설명
I. 여러 실시양태의 개관
본 발명의 실시양태는 통합된 핵산에 의해 영향을 받은 것 이외에 숙주의 다른 표현형에 크게 유해한 영향을 미치지 않는 숙주 게놈에서 외인성 핵산 (예를 들어, 트랜스진)의 표적화 통합에 대한 접근법을 확립한다. 일부 실시양태는 단일 숙주 게놈에서의 다중 핵산 "스택킹"에 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 4가지의 상호연결 기술: 특이적 게놈 DNA 위치에서의 이중 가닥 파단의 도입을 허용하는 표적화 기술 (예를 들어, 문헌 [Puchta et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:5034-40; Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnol. J. 6(1):93-102; Cai et al. (2009) Plant Mol. Biol. 69(6):699-709; Shukla et al. (2009) Nature 459(7245):437-41); Shan et al. (2103) Nature Biotechnol. 31:686-680; Le et al. (2013) Nature Biotechnol 31: 688-691; Nekrasov et al. (2013) Nature Biotechnol. 31:691-693, Ainely et al. (2013) Plant Biotechnol. J. (On Line 19 Aug)] 참조); 최적화된 외인성 (공여자) 핵산의 전달을 허용하는 전달 기술 (Bibikova et al. (2003) Science 300(5620):764); 표적화 공여자 DNA 삽입을 위한 HDR 또는 NHEJ 빈도를 증가시키기 위한 숙주 유전자의 변형 (상동 재조합 또는 NHEJ 경로에 위치함)을 포함하는 통합 기술; 표적화 통합 사건을 풍부화 및 특성화하는 분석 툴; 및 형질전환된 숙주 유기체에 대해 크게 유해한 영향을 미치지 않고 세대에 걸쳐 유전학적으로 잘 정해지고 안정한 유전자 발현을 지지하는 목적한 특이적 숙주 게놈 위치 ("성능 유전자좌")의 개발 및 전개를 필요로 한다. 또한, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073; 2011089775; 20110239315; 20110145940; 20080182332; 20090205083; 20100199389; 20110167521을 참조한다. 예를 들어, 식물에서, 성능 유전자좌는 트랜스진이 유전자좌에 삽입된 트랜스제닉 식물의 농경학상 또는 품질 특성에 대한 부정적인 영향이 무시할 정도인 또는 존재하지 않는 유전자좌이다.
본원에 기재된 실시양태는 식물 FAD2 유전자가 외인성 핵산 (예를 들어, 유전자(들); 비-코딩 DNA 서열, 예컨대 조작된 랜딩 Pad (ELP) (미국 출원 12/011,735) 및 조작된 트랜스진 삽입 플랫폼 (ETIP) (출원중인 미국 출원 번호 61/697882); 및 식물 형질전환 유닛(들))의 표적화 삽입을 위한 성능 유전자좌라는 예상치 못한 발견의 이점을 이용한다. 식물의 FAD2 유전자좌의 보편적인 특성, 및 카놀라, 옥수수, 해바라기, 밀, 목화 및 대두에서의 FAD2의 변경 또는 녹-아웃이 농경학상 또는 품질 페널티를 수반하지 않는다는 증거는 FAD2 유전자좌가 상업적으로-관련된 식물 종에 걸친 광범위한 부류의 성능 유전자좌임을 확인시킨다.
일부 실시양태는, 예를 들어 표적-부위 특이적 DNA 인식 및 절단 단백질의 전달 및 발현에 기인한 FAD2 유전자좌에서의 부위-특이적 이중-가닥 DNA 절단을 이용한다. 구체적 예에서, 이러한 FAD2-특이적 DNA 인식 및 절단 단백질은, 예를 들어 제한 없이 ZFN; TALEN; RNA-유도 CRISPR-Cas9, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, RecA, Tre 및 FLP 레콤비나제); 메가뉴클레아제 및 상기 중 임의의 것 또는 그의 등가물로부터 유래하는 조작된 단백질일 수 있다. 절단은 특이적 절단을 유도하기 위해 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 또한 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 이중-가닥 파단은 FAD2 성능 유전자좌 내에, 예를 들어 상동성 지정 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 절단 부위로의 공여자 핵산의 통합을 통해 복구될 수 있다.
본 개시내용은, 예를 들어 대두 (글리신 맥스)에서의 FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 유전자좌 및 FAD2 2.3 및/또는 FAD2 2.6 유전자좌에 외인성 핵산을 통합하기 위해 이용될 수 있는 상응하는 FAD2-특이적 ZFN을 기재함으로써 성능 유전자좌로서의 FAD2 유전자좌의 유용성을 예시한다.
본 발명의 실시양태는 관련 기술분야에서 다수의 해결되지 않은 문제를 다룬다. 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 통합 접근법의 선택성은 원치 않는 트랜스제닉 사례의 제거에 요구되는, 이 분야에 관련된 자원 및 힘든 규제 요건으로 인한 값비싼 반복되는 실지 시험의 필요성을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 표적화된 DNA 삽입 접근법은 트랜스진 스택킹의 과정에서 특히 유익할 수 있다.
내인성 FAD2 유전자좌에서의 천연 뉴클레오티드 서열이 관심 핵산을 직접적으로 표적으로 하는데 사용될 수 있지만, 일부 실시양태에서 숙주로의 추가의 관심 핵산 분자의 통합이 용이해지도록, 핵산은 먼저 숙주의 적어도 하나의 FAD2 유전자좌를 표적으로 할 수 있다. 다른 예에서, 숙주 유기체의 천연 서열 (예를 들어, 본질적으로 무작위로 발생된 핵산 서열)과 상동이 아니고 DNA 인식 부위 (예를 들어, 아연 핑거 인식 부위)에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열이 이용될 수 있다.
II. 용어
특허청구범위를 포함하여 본원에 사용된 바와 같은 단수 및 단수 형태의 용어 (예를 들어, "a," "an," 및 "the")는 그 내용이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "식물" ("plant," "the plant," 또는 "a plant")은 또한 다수의 식물을 지칭한다. 또한, 문맥에 따라, 용어 "식물"의 사용은 또한 그 식물의 유전적으로 유사하거나 또는 동일한 자손을 지칭할 수 있다. 유사하게, 용어 "핵산"은 핵산 분자의 다수의 카피를 지칭할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "프로브"은 다수의 유사하거나 또는 동일한 프로브 분자를 지칭할 수 있다.
수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함하고, 한정 범위 내의 각각의 정수 및 비-정수 부분을 명백하게 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 전문 과학 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용에 기재된 다양한 실시양태에 관한 검토를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어의 다음 설명을 제공한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질)은 성분의 화학적 또는 기능적 변화를 초래하면서 (예를 들어, 핵산은 핵산을 염색체의 나머지 DNA에 연결시키는 화학 결합을 파단하는 것에 의해 염색체로부터 단리될 수 있음), 그 성분이 자연 발생하는 유기체 세포의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체-외 DNA 및 RNA 및 단백질)로부터 실질적으로 분리되거나, 분리되어 생성되거나, 또는 정제 분리된다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 이 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
교배시킨다: 식물에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "교배시킨다" 또는 "교배시킨"은 자손 (예를 들어, 세포, 종자 및 식물)을 생산하기 위한 수분을 통한 배우자의 융합를 지칭한다. 이 용어는 유성 교배 (즉, 또 다른 것에 의한 하나의 식물의 수분) 및 자가 수분 (즉, 예를 들어 동일한 식물로부터의 화분 및 배주를 사용한 자가-수분) 둘 다를 포함한다.
역교배: 역교배 방법을 사용하여 핵산 서열을 식물에 도입할 수 있다. 이 기술은 신규 형질을 식물에 도입하기 위해 수십년 동안 널리 사용되어 왔다 (Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988). 전형적인 역교배 프로토콜에서, 원래의 관심 품종 (반복친)을 이동시킬 관심 핵산 서열을 보유하는 제2 품종 (비-반복친)에 교배시킨다. 상기 교배로부터 생성되는 자손체는 이어서 다시 반복친과 교배되고, 이 과정을, 전환된 식물에서 반복친의 필수적으로 모든 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징 뿐만 아니라 비-반복친으로부터의 핵산 서열이 복구되는 전환된 식물이 얻어질 때까지 반복된다.
유전자이입: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자이입"은 특정한 유전자좌에서 유전적 배경으로 대립유전자 (또는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 대립유전자)의 전달을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자좌에서의 특정한 대립유전자의 유전자이입은 동일한 종의 2가지 모 사이의 유성 교배를 통해 대립유전자를 적어도 하나의 자손으로 전달함으로써 발생할 수 있고, 여기서 모 중 적어도 하나는 그의 게놈에서 특정한 대립유전자 형태를 갖는다. 특정한 대립유전자를 포함하는 자손은 바람직한 유전적 배경을 갖는 라인에 대해서 반복해서 역교배될 수 있다. 역교배 자손은 특정한 대립유전자 형태가 유전적 배경에서 고정되어 있는 새로운 품종을 생성하기 위해, 특정한 대립유전자 형태에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 대립유전자의 유전자이입은 2가지 공여자 게놈 (예를 들어, 융합된 원형질체에서) 사이의 재조합에 의해 발생할 수 있고, 여기서 공여자 게놈 중 적어도 하나는 그의 게놈에서 특정한 대립유전자 형태를 갖는다. 유전자이입은, 예를 들어 제한 없이 분열 또는 변형된 대립유전자; 트랜스진; PTU; 및 ELP일 수 있는 특정한 대립유전자 형태의 전달을 포함할 수 있다.
생식질: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생식질"은 개별 식물, 식물의 군 (예를 들어, 식물 라인, 품종 및 패밀리) 및 식물 또는 식물의 군으로부터 유래한 클론의 또는 그로부터의 유전 물질을 지칭한다. 생식질은 유기체 또는 세포의 일부일 수 있거나, 유기체 또는 세포로부터 분리될 수 있다 (예를 들어, 단리됨). 일반적으로, 생식질은 식물의 유전성 품질을 위한 기준인 특정한 분자 구성을 갖는 유전 물질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "생식질"은 특정한 식물의 세포; 종자; 특정한 식물의 조직 (예를 들어, 그로부터 새로운 식물이 성장할 수 있는 조직); 특정한 식물의 비-종자 부분 (예를 들어, 잎, 줄기, 수분 및 세포)을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "생식질"은 "유전 물질"과 동의어이고, 식물이 그로부터 전파될 수 있는 종자 (또는 다른 식물 물질)를 지칭하는데 사용될 수 있다. 그로부터 공지된 재배품종이 배양될 수 있고, 그로부터 새로운 재배품종이 생성될 수 있는 "생식질 은행"은 다양한 종자 또는 다른 유전 물질 (여기서 각각의 유전자형이 고유하게 확인됨)의 조직화된 콜렉션을 지칭할 수 있다.
유전자: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자" (또는 "유전 요소")는 기능적 중요성을 갖는 유전가능한 게놈 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 유전자는 본래 핵산 또는 게놈에 통합된 핵산일 수 있다. 용어 "유전자"는 또한, 예를 들어 제한 없이 유전가능한 게놈 DNA 서열에 의해 코딩된 cDNA 및/또는 mRNA를 지칭하는데 사용될 수 있다.
핵산 분자: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자"는 뉴클레오티드 (즉 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 상기 중 어느 하나의 변형된 형태)의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 용어는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다, 및 그의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함한다. 용어는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 이중체화된, 삼중체화된, 헤어핀, 환상 및 잠긴 입체형태를 비롯한 임의의 구조적 입체형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결될 수 있다.
통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어 제한 없이 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상을 유사체로 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트 및 카르바메이트; 하전된 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트; 펜던트 모이어티, 예를 들어 펩티드; 삽입제, 예를 들어 아크리딘 및 프소랄렌; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결, 예를 들어 알파 아노머 핵산)을 포함한다.
외인성: "외인성" 분자는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및/또는 게놈 위치 (즉, 유전자좌)와 관련하여 (및 폴리펩티드의 아미노산 서열 및/또는 세포 위치와 관련하여) 특정한 시스템 (예를 들어, 생식질, 변종, 선발 변종 및/또는 식물)에 천연이 아닌 분자이다. 실시양태에서, 외인성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 생물계 (예를 들어, 식물 세포, 식물 유전자, 특정한 식물 종 또는 품종, 및/또는 식물 염색체)에 인공적으로 공급되었고 이러한 특정한 생물계에 대해 천연이 아닌 분자일 수 있다. 따라서, 핵산을 "외인성"으로 지정하는 것은 핵산이 자연 발생 공급원 이외의 공급원으로부터 유래되었음을 가리킬 수 있거나, 또는 핵산이 비-천연의 배향, 유전자 위치, 또는 요소 배열을 갖는 것을 가리킬 수 있다.
반면, 예를 들어 "천연" 또는 "내인성" 핵산은 자연에서 정상적으로 핵산이 발견되는 염색체 또는 다른 유전 물질에 정상적으로 존재하는 것들이 아닌 다른 핵산 요소는 함유하지 않는 핵산 (예컨대 유전자)이다. 내인성 유전자 전사체는 그의 천연 염색체 유전자좌의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 인공적으로 세포에 공급되지 않는다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 때 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합 방식으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에 동일한 리딩 프레임에 존재한다. 그러나, 요소들이 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
프로모터: 프로모터는 일반적으로 핵산의 전사를 증진시키는 핵산의 상류 (5' 영역 방향으로) 위치한 DNA의 영역이다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 핵산(들)의 적절한 활성화 또는 억제를 허용한다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특정 서열을 함유한다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합하여 핵산의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 폴리머라제의 동원을 유도한다. 형질전환된: 벡터가 핵산 분자를 세포로 전달할 때 벡터는 세포를 "형질전환시킨다" 또는 "형질도입시킨다". 세포는 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 도입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해 세포에 의해 안정하게 복제될 때 핵산 분자에 의해 "형질전환"된 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 상기 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기술을 포함한다. 예는 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 및 미세입자 투사법 (Klein et al. (1987) Nature 327:70)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
도입된: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "도입된"은 세포 내로의 외인성 핵산의 전위에 관해 언급할 때, 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 방법론을 사용하는 핵산의 세포 내로의 혼입을 지칭한다. 이 용어는, 예를 들어 제한 없이 형질감염; 형질전환; 및 형질도입을 포함하는 핵산 도입 방법을 포함한다.
트랜스진: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스진"은 관심 외인성 핵산 코딩 서열을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스진은 산업적으로 또는 제약상 유용한 화합물 또는 바람직한 농업상 형질 (예를 들어, 제초제 저항성 또는 해충 저항성)에 기여하는 발현 산물을 코딩할 수 있다. 추가의 예에서, 트랜스진은 안티센스 핵산의 발현을 통해 표적 핵산 서열의 발현이 억제되는 것인, 안티센스 핵산일 수 있다. 트랜스진은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌에서의 부위-특이적 표적화에 의해 도입되는 관심 핵산 분자는 트랜스진이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 핵산 분자는 PTU, ELP, ETIP 또는 내인성 핵산 서열 (예를 들어, 여기서 내인성 핵산 서열의 추가의 외인성 게놈 카피가 바람직함)일 수 있다.
요소는 또한 구조적 RNA, 예컨대 shRNA를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 RNA는 제초제 저항성을 개시하거나 또는 부여하는데 영향을 미치는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 외인성 또는 내인성 유전자를 변형시킬 수 있다.
재조합: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 인간 개입에 의해 변경된 물질 (예를 들어, 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)를 지칭한다. 예를 들어, 그의 발현 및/또는 활성을 최적화하기 위해, 예를 들어 재조합 분자의 부분 또는 요소의 배열이 그의 천연 배열이 아닐 수 있고/거나 재조합 분자의 일차 서열이 그의 천연 서열로부터 변화될 수 있다. 물질은 그의 천연 환경 또는 상태 내에서 재조합 물질을 생성하도록 변경될 수 있거나 또는 그로부터 제거될 수 있다. 한 예로서, 핵산의 오픈 리딩 프레임은, 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열이 그 천연 상황으로부터 제거되어, 인공 핵산 분자 (예를 들어, 벡터) 내로 클로닝되는 경우에 재조합된 것이다. 재조합 분자 (예를 들어, 재조합 핵산)을 생산하기 위한 프로토콜 및 시약은 관련 기술분야에서 일반적이고, 그의 용도는 일상적이다. 용어 "재조합"은 또한 본원에서 재조합 물질을 포함하는 세포 또는 유기체 (예를 들어, 재조합 핵산을 포함하는 식물 및/또는 식물 세포)를 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 재조합 유기체는 트랜스제닉 유기체이다.
벡터: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 적어도 하나의 핵산 절편(들)을 세포 내로 전달할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 다른 분자를 지칭한다. 벡터는 벡터 유지를 매개하고/거나 그의 의도된 용도를 가능하게 하는 성분/요소 (예를 들어, 복제를 위해 필요한 서열, 약물 또는 항생제 저항성을 부여하는 유전자, 다중 클로닝 부위, 및/또는 클로닝된 유전자의 발현을 가능하게 하는 작동가능하게 연결된 프로모터/인핸서 요소)를 임의로 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래할 수 있다. "클로닝 벡터", "셔틀 벡터" 또는 "서브클로닝 벡터"는 클로닝 또는 서브클로닝 단계를 용이하게 하기 위해 작동가능하게 연결된 요소 (예를 들어, 다중 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위)를 일반적으로 포함한다.
발현 벡터: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 특정한 숙주 유기체에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 박테리아에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있다. 마찬가지로, 식물 발현 벡터는 식물 세포에서 코딩 서열의 발현을 용이하게 할 수 있다. 원핵생물에서 발현을 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 제한 없이 프로모터; 오퍼레이터; 및 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵 발현 벡터 (예를 들어, 식물 발현 벡터)는, 예를 들어 프로모터; 인핸서; 종결 신호; 및 일반적으로 원핵 발현 벡터에서 사용된 것과 상이한 폴리아데닐화 신호 (및 다른 서열)을 포함할 수 있다.
서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교창에 대해 최대로 상응하도록 정렬하였을 때, 2개의 서열 중의 동일한 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 값은 비교창에 대해 2개의 최적화로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정할 수 있고, 여기서 비교창 내의 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는 것)에 비해 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에 존재하는 위치의 개수를 결정함으로써 매칭되는 위치의 개수를 구하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 구함으로써 백분율로서 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 관련 기술분야에 익히 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기재되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 관한 상세한 고려 사항은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 찾아볼 수 있다.
여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위한 것으로 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST™; Altschul et al. (1990))은 서열을 정렬하기 위해 사용할 수 있고, 미국 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급원으로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션에서 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 사용할 수 있다. 참조 서열에 대해 보다 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 상기 방법에 의해 평가되었을 때 증가된 동일성 백분율을 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한"은 80% 초과로 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 참조 서열에 대해 적어도 85%; 적어도 86%; 적어도 87%; 적어도 88%; 적어도 89%; 적어도 90%; 적어도 91%; 적어도 92%; 적어도 93%; 적어도 94%; 적어도 95%; 적어도 96%; 적어도 97%; 적어도 98%; 적어도 99%; 또는 적어도 99.5% 동일할 수 있다.
유전자좌: 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자좌"는 측정가능한 특징 (예를 들어, 형질)에 해당하는 게놈 상의 위치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특정한 관심 유전자좌는 FAD2 유전자의 게놈 위치이며, 여기서 이 유전자의 분열이 야생형 유전자로부터 전사된 mRNA의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 유전자좌는 서던 혼성화 또는 PCR 동안 유전자좌 내에 함유된 특유한 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 프로브에 의해 정의될 수 있다.
마커: 본원에 사용된 바와 같은 "마커"는 특정한 대립유전자를 가질 가능성이 있고/거나 특정한 형질 또는 표현형을 나타낼 가능성이 있는 식물을 확인하는데 사용될 수 있는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 마커는 주어진 게놈 유전자좌에서의 변이로서 기재될 수 있다. 유전자 마커는 짧은 DNA 서열, 예컨대 단일 염기-쌍 변화 (단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 "SNP")를 둘러싸는 서열, 또는 긴 서열, 예를 들어 미소부수체/단순 서열 반복체 ("SSR")일 수 있다. "마커 대립유전자"는 특정한 식물에 존재하는 마커의 버전을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 마커는 식물 염색체 DNA의 클로닝된 절편 (예를 들어, FAD2 유전자좌, 또는 변형 및/또는 분열된 FAD2 유전자좌를 포함하는 절편)을 지칭할 수 있고, 또한 또는 대안적으로 식물 염색체 DNA의 클로닝된 절편에 상보적인 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 마커에 포함시키기 위한 부가적인 인접 뉴클레오티드 서열을 수득하는 과정은 거의 무한정 반복될 수 있으며 (염색체의 길이에 의해서만 제한됨), 이에 따라 염색체에 따른 부가적인 마커가 확인된다. 상기 기재된 임의의 모든 마커의 변이가 본 발명의 일부 실시양태에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생식질 중의 트랜스진 또는 마커의 존재 (이것은 "표적" 서열을 특징으로 함)는 핵산 프로브; 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 사용함을 통해 검출될 수 있다. 프로브는 DNA 분자, 또는 RNA 분자일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 합성하여 또는 클로닝에 의해 제조될 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 통상의 기술자에게 익히 공지되어 있다. RNA 프로브는 관련 기술분야에 공지된 수단에 의해, 예를 들어 DNA 분자 주형을 사용하여 합성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 표지될 수 있거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 예를 들어, 제한 없이 닉 번역에 의한 방사성 표지; 무작위 프라이밍; 및 말단 데옥시트랜스퍼라제를 사용한 꼬리달기를 포함하는 광범위한 기술이 핵산 분자를 표지하기 위해 존재하고, 이때 사용된 뉴클레오티드는, 예를 들어 방사성 32P로 표지된다. 사용될 수 있는 다른 표지는, 예를 들어 제한 없이 형광단; 효소; 효소 기질; 효소 보조인자; 및 효소 억제제를 포함한다. 대안적으로, 그 자체로 또는 다른 반응성 작용제와 함께 검출가능한 신호를 제공하는 표지를 사용하는 것이 수용체가 결합하는 리간드에 의해 대체될 수 있고, 이때 수용체는 그 자체로 또는 다른 시약과 함께 검출가능한 신호를 제공하도록 표지된다 (예를 들어, 상기 나타낸 표지에 의해). 예를 들어, 문헌 [Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9]을 참조한다.
프로브는 검출하고자 하는 트랜스진 또는 마커의 정확한 카피일 수 있다. 프로브는 또한 검출할 트랜스진 또는 마커를 포함하는 염색체 DNA의 클로닝된 절편과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지는 핵산 분자일 수 있다. 프로브는 추가의 핵산 서열, 예를 들어 프로모터; 전사 신호; 및/또는 벡터 서열을 추가로 포함할 수 있다.
프로브는 표적 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부 및 게놈으로부터의 추가의 인접 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이는 본원에서 "인접 프로브"로서 지칭된다. 통상적으로 이해되는 바와 같이, 염색체로부터의 인접 뉴클레오티드 서열이 최초 마커의 5'측에 있느냐 또는 3'측에 있느냐에 따라, 인접 뉴클레오티드 서열은 최초 표적의 "상류" 또는 "하류"로서 지칭된다. 프로브는 또한 최초 표적의 뉴클레오티드 서열에 인접하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있고; 상기 프로브는 본원에서 "비-인접 프로브"로서 지칭된다. 비-인접 프로브의 서열은 비-인접 프로브가 최초 마커 또는 트랜스진에 연결되도록 염색체의 최초 표적의 서열에 충분히 근접하게 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 검출할 표적의 정확한 카피에 "특이적으로 혼성화가능한" 또는 "특이적으로 상보적인" 핵산 분자이다. "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성을 가리키는 용어이다. 핵산 분자는 특이적으로 혼성화가능할 수 있는 것이 되기 위해 그의 표적 서열에 대하여 100% 상보적일 필요는 없다. 특이적 결합이 바람직한 조건 하에, 예를 들어 엄격한 혼성화 조건 하에 핵산이 비-표적 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 방지하는 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에 핵산 분자가 특이적으로 혼성화할 수 있다.
특정한 정도의 엄격성에 이르게 하는 혼성화 조건은 선택되는 혼성화 방법의 특성, 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 혼성화의 엄격성을 결정할 것이지만, 세척 시간 또한 엄격성에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격성을 달성하는데 필요한 혼성화 조건에 관한 계산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; 및 Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산 혼성화에 관한 추가의 상세한 지침서 및 안내를, 예를 들어 문헌 [Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; 및 Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 25% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 특정한 수준의 염격성을 추가로 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "온건한 엄격성" 조건은 25% 초과의 서열 미스매치가 있는 분자가 혼성화하지 않을 조건이고, "중간 엄격성"의 조건은 15% 초과의 미스매치가 있는 분자가 혼성화하지 않을 조건이며, "높은 엄격성"의 조건은 10% 초과의 미스매치가 있는 서열이 혼성화하지 않을 조건이다. "매우 높은 엄격성"의 조건은 6% 초과의 미스매치가 있는 서열이 혼성화하지 않을 조건이다.
특정한 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서 6x 염수-시트르산나트륨 (SSC) 완충제, 5x 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 μg 전단 연어 고환 DNA 중에서 혼성화한 후, 65℃에서 2x SSC 완충제 및 0.5% SDS에 이어서 1x SSC 완충제 및 0.5% SDS, 및 최종적으로 0.2x SSC 완충제 및 0.5% SDS를 사용하여 순차적으로 15-30분 세척하는 것이다.
연관 (불)평형: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연관 평형"은 마커 및 제2 핵산 (예를 들어, 트랜스진, PTU 및 제2 마커)이 독립적으로 분리된 상황을 지칭하며; 즉, 마커 및 제2 핵산이 자손 중에 무작위로 정렬되는 것이다. 연관 평형을 나타내는 핵산은 (이것이 동일한 염색체 상에 있든지 아니든지) 연관되지 않은 것으로 간주된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연관 불평형"은 마커 및 제2 핵산이 비-무작위 방식으로 분리되는 상황을 지칭하며; 즉, 핵산은 50% 미만 (및 정의에 의해 따라서 동일한 연결 기에 대해 50 cM 미만으로 분리됨)의 재조합 빈도를 갖는다. 일부 예에서, 연관 불평형을 나타내는 핵산은 연관된 것으로 간주된다.
연관된, 긴밀하게 연관된, 및 극도로 긴밀하게 연관된: 본원에 사용된 바와 같은 마커와 제2 핵산 (예를 들어, 트랜스진, PTU 및 제2 마커) 사이의 연관은 염색체 상의 핵산이 차세대에서 개체에게 함께 전달되는 측정가능한 확률을 나타내는 현상를 지칭할 수 있다. 따라서, 제2 핵산에 대한 하나의 마커의 연관은 재조합 빈도로서 측정 및/또는 표현할 수 있다. 2개의 핵산이 서로 근접할수록, 이 확률은 "1"에 근접하게 된다. 따라서, 용어 "연관된"은 제2 핵산과 함께 0.5보다 큰 확률 (마커/유전자가 상이한 염색체 상에 위치하는 독립적인 분류로부터 예상되는 것)로 전달되는 하나 이상의 유전자 또는 마커를 지칭할 수 있다. 유전자 (예를 들어, 트랜스진)의 존재가 개체에서의 표현형에 기여할 때, 그 유전자와 연관된 마커는 그 표현형과 연관되어 있는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 용어 "연관된"은 마커와 유전자, 또는 마커와 표현형 사이의 관계를 지칭할 수 있다.
상대 유전자 거리 (교차 빈도에 의해 결정되고, 센티모르간 (cM)으로 측정됨)는 일반적으로 2개의 연관된 마커 또는 유전자가 염색체 상에서 서로 분리되는 물리적 거리 (염기 쌍으로 측정됨)에 비례한다. 1 센티모르간은 1% 재조합 빈도 (즉, 교차 사례가 2개의 마커 사이에서 100개의 세포 분열마다 1회 발생)를 나타내는 2개의 유전자 마커 사이의 거리로서 정의된다. 일반적으로, 하나의 마커가 또 다른 마커 또는 유전자에 보다 근접할수록 (이들 사이의 거리가 유전자 거리 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지), 이것은 보다 긴밀하게 연관된다. 염색체 거리가 형질 사이의 재조합 사례의 빈도에 대략 비례하기 때문에, 재조합 빈도와 관련된 대략적인 물리적 거리가 존재한다. 이 상관관계는 일반적으로 공지되어 있거나 또는 주요 작물 식물 (Helentjaris and Burr (eds.) (1989) Development 및 Application of Molecular Markers to Problems in Plant Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Gresshoff (ed.) (1994) Plant Genome Analysis. CRC Press, Boca Raton, FL; Lander et al. (1987) Genomics 1:174-81; Tanksley et al. (1988) "Molecular mapping of plant chromosomes," In Chromosome Structure and Function. Gustafson and Appels (eds.) Plenum Press, NY, pp. 157-73) 및 다른 다수의 유기체에 걸쳐 용이하게 결정가능하다. 예를 들어, 1 cM은 효모에서 약 2.5-3.0 kb, 아라비돕시스(Arabidopsis)에서 약 140 kb, 해바라기의 약 400 kb 및 유칼립투스(Eucalyptus)에서 약 350 kb에 상응한다.
용어 "연관된"은 본원에서 50% 미만의 재조합 빈도 (즉, 50 cM 미만)를 나타내는 하나 이상의 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, "연관된" 핵산은 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 및 약 10% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다. 상기 재조합 빈도에 상응하는 동일한 염색체 (상이한 염색체 상의 핵산이 연관 평형에 있을 것으로 예상됨) 상의 이러한 핵산 사이의 물리적 거리는 숙주 게놈에 좌우되고, 상기 문헌에 제시된 바와 같이 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "긴밀하게-연관된"은 약 20% 이하 (즉, 약 20 cM 이하)의 재조합 빈도를 나타내는 하나 이상의 핵산를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "긴밀하게 연관된" 핵산은 22% 이하, 약 18% 이하, 약 16% 이하, 약 14% 이하, 약 12% 이하, 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 6% 이하, 약 4% 이하, 및 약 2% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "극도로 긴밀하게 연관된"은 약 10% 이하의 재조합 빈도 (즉, 약 10 cM 이하)를 나타내는 하나 이상의 핵산를 지칭할 수 있다. 예를 들어, "극도로 긴밀하게 연관된" 핵산은 11% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 및 약 1% 이하의 빈도로 재조합될 수 있다.
특정한 핵산이 특정한 표현형에 기여하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 근접할수록 (유전적 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지), 특정한 핵산은 표현형에 더 긴밀하게-연관된 것이다. 상기를 고려하여, 특정한 유전자 또는 표현형에 연관된 핵산이 유전자 또는 표현형에 긴밀하게 연관된 핵산, 및 극도로 긴밀하게 연관된 핵산을 포함한다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, 유전적 또는 물리적 거리의 관점에서 측정되든지 아니든지, 특정한 핵산이 FAD2 유전자좌 (예를 들어, 변형 또는 분열된 FAD2 유전자좌)에 더 근접할수록, 특정한 핵산은 FAD2 유전자좌에서 통합된 외인성 핵산에 의해 부여된 임의의 형질/표현형 (또는 비변형된 유전자좌의 경우에 야생형 FAD2 표현형)에 더 긴밀하게-연관된 것이다. 따라서, 통합된 외인성 핵산을 포함하는 FAD2 유전자좌에 연관된, 긴밀하게 연관된 및/또는 극도로 긴밀하게 연관된 유전자 마커는 통합된 핵산을 포함하는 유기체 (예를 들어, 식물 및 식물 품종)를 확인하고, 통합된 핵산에 의해 부여된 표현형을 포함하는 유기체를 확인하고, 이러한 통합된 핵산 및/또는 통합된 핵산에 의해 부여된 표현형을 다른 적합한 유기체 내에서 육종하기 위한 MAS 프로그램에서 유용할 수 있다.
마커-지원 육종: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "마커-지원 육종"은 직접적으로 1종 이상의 형질(들) (예를 들어, 다유전자 형질)에 대한 육종 식물에 대한 접근법을 지칭할 수 있다. 현행 실무에서, 식물 육종가는 용이하게 검출가능한 형질, 예컨대 농경학적으로 목적하는 형질과 연관되어 있는 화색, 종피 외관, 또는 동종효소 변이체를 확인하고자 시도한다. 이어서 식물 육종가들은 용이하게 검출가능한 형질의 분리를 추적함으로써 분리 육종 집단에서의 농경학상 형질을 추적한다. 그러나, 식물 육종에 사용하기 위해 이용가능한 용이하게 검출가능한 형질과 관심 형질 사이의 이들 연관 관계는 거의 없다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 마커-지원 육종은, 관심 형질에 기여하는 외인성 핵산이 통합된 FAD2 유전자좌에 연관된 하나 이상의 유전자 마커 (예를 들어, SNP, 동종효소 및/또는 SSR 마커)를 확인하고, 하나 이상의 유전자 마커의 분리를 추적함으로써 분리 육종 집단을 추적하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 유전자 마커의 분리는 하나 이상의 유전자 마커의 존재에 대해 자손 식물로부터 유전자 샘플을 분석함으로써 하나 이상의 유전자 마커에 대한 프로브를 이용하여 결정될 수 있다. 마커-지원 육종은 식물 품종의 개량을 위한 시간- 및 비용-효과적인 과정을 제공한다.
형질 또는 표현형: 용어 "형질" 및 "표현형"은 상호교환가능하게 본원에서 사용된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정한 관심 형질은, 예를 들어 작물 식물에서 발현될 수 있는 바와 같이 농경학적으로 중요한 형질, 및 표적화 통합 사례로부터의 트랜스진 발현 생성물의 제조를 포함한다. 용어 "분자 표현형"은 분자 (하나 이상)의 집단의 수준이 검출가능한 것인 표현형을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 분자 표현형은 분자 수준에서만 검출가능한 것일 수 있다. 표현형의 검출가능한 분자는 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 RNA); 단백질; 및/또는 대사물일 수 있다. 예를 들어, 분자 표현형은 하나 이상의 유전자 산물에 대한 발현 프로파일 (예를 들어, 식물 발생의 특정한 단계에서, 또는 환경 조건 또는 스트레스에 대한 반응으로)일 수 있다.
정량적 형질 유전자좌: 유전적 영향 (상가적, 우성 및 상위성) 및 환경적 영향으로 인해 계속 달라지는 형질은 통상적으로 "정량적 형질"로서 지칭된다. 정량적 형질은 2개 인자; 표현형의 연속 분포를 생성하는 유전자 발현에 대한 환경적 영향 및 다유전자성 유전에 의해 생성되는 복합 분리 패턴에 기반한 "정성적" 또는 "이산" 형질로 구별될 수 있다. 정량적 형질의 발현에 연관된 게놈의 하나 이상 영역의 확인은 정량적 형질 유전자좌 ("QTL")와 같은 영역으로 정의한다.
식물: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 전체 식물, 식물로부터 유래한 세포 또는 조직 배양물 및/또는 상기 중 임의의 것의 임의의 부분를 지칭할 수 있다. 따라서, 용어 "식물"은, 예를 들어 제한 없이 전체 식물; 식물 성분 및/또는 기관 (예를 들어, 잎, 줄기 및 뿌리); 식물 조직; 종자; 및 식물 세포를 포함한다. 식물 세포는, 예를 들어 제한 없이 식물 내의 세포 및/또는 식물 세포, 식물로부터 단리된 세포 및 식물로부터 단리된 세포의 배양을 통해 획득한 세포일 수 있다.
"트랜스제닉 식물"은 그의 세포 중 적어도 하나에 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물이다. 용어 "트랜스제닉"은 본원에서 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 그의 유전자형이 외인성 핵산의 존재에 의해 변경된 식물을 지칭하는데 사용된다. 따라서, 이 용어는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 초기에 변경되고 초기 트랜스제닉 유기체 또는 세포의 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것인 트랜스제닉 유기체 및 세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "트랜스제닉"은 종래 식물 육종 방법 (예를 들어, 단지 비-트랜스제닉 유기체의 교배) 또는 자연 발생 사례 (예를 들어, 무작위 교배-수정, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질전환, 비-재조합 전위 및 자발적 돌연변이)에 의해 도입된 게놈 (염색체 또는 염색체외) 교대를 포함하지 않는다.
식물 "라인", "품종" 또는 "균주"는 동일한 혈통을 갖는 개별 식물의 군이다. 식물 라인은 일반적으로 어느 정도로 근교배되고, 일반적으로 대부분의 유전자좌 (예를 들어, FAD2 유전자좌)에서 동형접합 및 동종이다. "서브라인"은 동일한 선조로부터 유래한 다른 유사한 근교배 하위세트와 유전적으로 구분되는 공통 선조로부터의 후손의 근교배 하위세트를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, "서브라인"은 나머지 분리 유전자좌가 유전자좌의 대부분 또는 전부에 걸쳐 동형접합일 때까지 F3 내지 F5 세대에서 선택된 개별 트랜스제닉 식물로부터 종자를 근교배시킴으로써 생성될 수 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 유형이 한가지를 초과할 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" ("반복체"로도 언급됨)는 일반적으로 33-35개 아미노산 길이이고, 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 몇몇의 서열 상동성을 나타낸다.
아연 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산의 변경)을 통해 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생 단백질이다. DNA-결합 단백질의 조작 방법의 비-제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적인 기준에 의해 이루어지는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계의 합리적인 기준은 존재하는 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보에서의 정보 처리를 위한 치환 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 그의 생산이 주로 실험 처리, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택에 의해 이루어지는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084 및 미국 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 백본의 파단을 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다 가능하고, 이중-가닥 절단은 2개의 별도의 단일-가닥 절단 사례의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 평활 말단 또는 엇갈린 말단이 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은, 제2의 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인", "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반-도메인"은 이량체화하는 절단 절반-도메인의 쌍을 지칭하는데 상호교환가능하게 사용된다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 또 다른 절단 절반-도메인 (예를 들어, 또 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 절대적 이종이량체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 또한, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474, 20070218528, 2008/0131962 및 2011/0201055를 참조한다.
이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단"은 35 U.S.C. § 112, 제6 단락에서의 의회에 의해 공인된 특별한 청구 조항을 원용하도록 의도된다. 특히, "이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단"은 이중-가닥 DNA 분자의 양쪽 가닥을 절단할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 이러한 구조는 다수의 공지된 뉴클레아제 단백질, 예를 들어 FokI 뉴클레아제 도메인 내에 포함되는 폴리펩티드 도메인을 포함하며, 촉매 도메인은 단백질 Mmel, 콜리신-E7 (CEA7_ECOLX), 콜리신-E9, APFL, EndA, 엔도 I (END1 EC0LI), 인간 엔도 G (NUCG_HUMAN), 소 엔도 G (NUCG_BOVIN), R.HinPll, l-Basl, l-Bmol, l-Hmul, l-Tevl, l-Tevll, l-Tevlll, l-Twol, R.Mspl, R.Mval, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, 스타필로코쿠스(Staphylococcal) 뉴클레아제 (NUC_STAAU), 스타필로코쿠스 뉴클레아제 (NUC_STAHY), 미크로코쿠스(Micrococcal) 뉴클레아제 (NUC_SHIFL), 엔도뉴클레아제 yncB, 엔도데옥시리보뉴클레아제 I (ENRN-BPT7), 메트나제(Metnase), Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt. BspD6l (R. BspD6l 큰 서브유닛), ss.BspD6l (R. BspD6l 작은 서브유닛), R.PIel, Mlyl, Alwl, Mval269l, Bsrl, Bsml, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, Rl.Btsl, R2.Btsl, BbvCI 서브유닛 1, BbvCI 서브유닛 2, BpulOI 알파 서브유닛, BpulOI 베타 서브유닛, Bmrl, Bfil, l-Crel, 헥솔(hExol) (EX01JHUMAN), 효모 엑솔(Exol) (EX01_YEAST), 이.콜라이(E.coli) 엑솔, 인간 TREX2, 마우스 TREX1, 인간 TREX1, 소 TREX1, 래트 TREX1, 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단: 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단"은 또한 35 U.S.C. § 112, 제6 단락에서의 의회에 의해 공인된 특별한 청구 조항을 원용하도록 의도된다. 특히, "이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단"은, 예를 들어 단일 이중-가닥 DNA 분자를 절단함으로써 생성되는 말단을 연결하거나, 또는 외인성 이중-가닥 DNA 분자의 말단으로 단일 이중-가닥 DNA 분자를 절단함으로써 생성되는 하나의 말단을 연결함으로써 이중-가닥 DNA 분자의 말단을 연결하는 것을 용이하게 하거나/촉매작용할 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 이러한 구조는 다수의 공지된 리가제 단백질, 예를 들어 Cre 레콤비나제 내에 포함된 폴리펩티드 도메인을 포함한다. 일부 예에서, 동일한 분자 구조는 이중 가닥 DNA 파단을 생성하는 수단 및 이중 가닥 DNA 파단을 복구하는 수단 둘 다로서 역할을 할 수 있으며, 여기서 동일한 구조는 이중-가닥 DNA 분자 (예를 들어, Hin 레콤비나제)의 절단 및 복구 둘 다를 용이하게 한다.
게놈에서의 부위 특이적 이중 가닥 파단의 유도는 상동성-지정 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단-연결 (NHEJ) 복구를 통해 이중 가닥 파단을 해결하는 숙주 식물 세포 DNA 복구 경로를 유도한다. 식물에서, 과학 문헌은, 본래 게놈 내로 또는 미리 조작된 위치에서의 정확한 유전자 또는 공여자 DNA 통합이 표적화 이중 가닥 파단에 플랭킹된 서열에 상동인 다양한 양의 서열을 포함하는 유입 공여자 DNA 구축물(들)을 수반한다는 것을 보고하고 있다. 특이적 표적 유전자좌로의 이러한 공여자의 통합은 아마도 HDR 경로에 의지했을 것이다. 식물에서 유전자 표적화를 위해 HDR 접근법에 전적으로 의지하는 것은 NHEJ와 비교할 때 HDR 복구 경로가 우세한 DNA 복구 경로가 아니라는 보고로 인해 제한을 가질 수 있다. NHEJ 경로를 파단시키는 표적 특이적 DNA (ZFN, TALeN 또는 조작된 메가뉴클레아제 등)를 이용하는 공개된 식물 과학 문헌은 특정한 점 돌연변이 (삽입 또는 결실)를 게놈에 도입하는 방법으로서 보고되었다. 여기서 본 발명자들은 0 내지 <10 bp의 상동성 영역을 갖는 다양한 공여자 DNA 설계의 존재 하의 부위 특이적 이중 가닥 파단 (ZFN, TALeN 등에 의해 유래함) 식물에서 NHEJ 복구 경로를 통해 표적화된 파단에서 특이적으로 삽입될 수 있음을 보고하였다. 선형 내지 원형의 단일 가닥 내지 이중 가닥의 0 상동성 내지 작은 1-10 bp의 범위를 갖는 상이한 다양한 DNA 공여자 설계는 NHEJ 경로를 사용하는 특정한 위치를 표적화할 수 있다. NHEJ 기반 공여자 DNA 식물 게놈 표적화는 "점착성 말단 포획"에 기반할 수 있고, 여기서 Fok1 (또는 다른 유형 II 엔도뉴클레아제 도메인) 및 상응하는 점착성 말단에 의해 생성된 게놈에서의 표적화된 이중 가닥 파단은 NHEJ 공여자 DNA 설계 상에 있다. 점착성 말단 공여자 DNA는 미리 정의된 오버행을 갖는 선형 공여자 DNA로서 직접적으로 세포에 전달될 수 있다. 대안적 접근법은 숙주 표적 ZFN 및 표적 인식 부위와 동일한 적어도 하나의 ZFN 인식 부위를 함유하는 원형 DNA 공여자 분자를 공-전달함으로써 생체내 공여자 DNA 점착성 말단을 생성하는 것이다. 적어도 하나의 ZFN의 발현은 숙주 게놈 DNA (천연 또는 미리 조작된 것) 및 원형 공여자 DNA를 절단하여 숙주 NHEJ 복구 경로를 사용하여 분해되는 점착성 말단을 생산한다.
공여자 분자 상에 하나 이상의 ZFN 절단 부위를 갖는 것이 가능하다 (전체 공여자 분자를 선형화하기 위한 단일 ZFN 절단 부위, 보다 작은 공여자 DNA 단편을 방출하는 동일한 ZFN 부위 중 2개 또는 숙주 게놈 DNA로부터의 공여자로부터의 단편 및 상응하는 단편을 방출하기 위한 2개의 상이한 ZFN 부위 (DNA 대체)).
따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20100047805 및 20110207221을 참조한다. 특정 경우, 본 발명의 실시양태는 또한 선형 외인성 (공여자) 핵산(들), 이들 핵산을 포함하는 조성물 및 이들 선형 공여자 분자를 제조 및 사용하는 방법을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선형 공여자 분자는 그것이 도입된 세포를 안정하게 지속한다. 다른 실시양태에서, 선형 공여자 분자는, 예를 들어 공여자 분자의 말단 상에 하나 이상의 염기 쌍 사이의 하나 이상의 포스포로티오에이트 포스포디에스테르 결합을 두는 것으로써 엑소뉴클레아제 절단에 저항하기 위해 변형된다. 선형 외인성 핵산은 또한 단일 가닥 특이적 DNA를 포함할 수 있다.
III. FAD2 성능 유전자좌
FAD2 (지방산 데새투라제 2)으로 지정된 유전자좌는 식물 중 지방산 함량의 복합적 다유전자성 형질의 유전에 관련된 QTL에 포함된다. FAD2는 올레산 (18:1)의 리놀레산 (C18:2)으로의 탈포화를 일으키는 효소를 코딩한다 (Tanhuanpaa et al. (1998) Mol. Breed. 4:543-50; Schierholt et al. (2001) Crop Sci. 41:1444-9).
식물 오일 생합성 경로 내에서 지방산 데새투라제 (FAD)는 지방산 조성물에 유의하게 영향을 미치는 식물 지질 생합성 및 그의 활성에서 주요 역할을 한다. FAD는 식물에서 풍부하고, 발현 분석은 FAD mRNA가 과잉 생산됨을 시사한다. 또한, FAD 유전자는 다양한 조직 및 세포 유형, 뿐만 아니라 색소체 및 세포질 세망을 비롯한 세포하 구획에서 발현된다.
식물의 지방산 조성, 및 다수의 적용으로 그로부터 생산된 오일의 성능은 주요 지방산 구성성분; 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산 (C18:3)의 상대 농도에 의해 결정된다. 이들 지방산의 농도는 효소 FAD2 및 FAD3의 기능에 의해 주로 조절된다. 올레산은 하기 반응식에 따라 식물에서 리놀레산 및 리놀렌산으로 전환된다.
Figure 112015032527201-pct00001
FAD2 유전자는 옥수수, 대두, 목화, 아라비돕시스, 밀, 화본과 사료작물, 벼, 해바라기 및 브라시카(Brassica)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 주요 식물 및 조류 종에서 확인되었고, 이러한 유기체에서 FAD2 발현의 변형은 변경된 지방산 프로파일을 유도한다. 또한, 변형된 FAD2 유전자를 포함하는 식물은 상업화되었고, FAD2 유전자의 분열은 숙주 식물에 농경학적 페널티 없이 숙주 식물에 의해 생산된 오일의 영양적 및 기능적 특성을 개선할 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, 넥세라(Nexera)® 상표 (다우 아그로사이언시스, 엘엘씨(Dow AgroSciences, LLC)) 하에 시판된 카놀라 및 해바라기 품종은 야생형 카놀라 및 해바라기 프로파일과 비교할 때 더 고급 올레산, 더 저급 리놀레산 및 더 저급 리놀렌산 (및 더 저급 포화 지방산) 조성물을 특징으로 한다.
본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chi, X., et al., ((2011) Genome-wide analysis of fatty acid desaturases in soybean (Glycine max). Plant Molecular Biology Reports 29, 769-783)]에 기재된 바와 같이; 대두에서 FAD2의 공지된 기능적 유전자 카피는 아라비돕시스 대응부, FAB2, FAD2, FAD3, FAD5, FAD6, FAD7, FAD8, SLD1 및 DES1을 갖는 9개의 서브패밀리 내에 계통발생학적으로 위치하였다. 29개의 데새투라제 유전자가 20개의 대두 염색체 중 적어도 15개에 분포되는 것을 발견하였다. 유전자 구조 및 모티프 조성은 서브패밀리 중에 상당하게 보존되었다. 데새투라제 유전자의 대부분은 마이크로어레이 데이터 분석에 기초하여 다양한 조직 및 발육 단계에 걸쳐 특정한 시간적 및 공간적인 발현 패턴을 나타내었다.
FAD2 유전자좌는 식물의 가치에 유해한 영향을 미치지 않고, 다수의 목적을 위해 그의 가치를 실제로 증가시키면서 FAD2 발현의 변경, 오일 함량/비의 변경 및/또는 목적한 트랜스진의 통합 및 발현을 비롯하여, 식물에서 변형 및/또는 분열될 수 있다. 또한, 식물의 FAD 유전자좌의 보편적인 특성에 따라, FAD2 유전자좌는 다수의 종에서, 예를 들어 제한 없이 카놀라; 대두; 옥수수; 밀; 화본과 사료작물; 브라시카 종; 벼, 토마토, 보리; 귀리; 소르굼; 목화 및 해바라기, 뿐만 아니라 진균 및 조류에서 적어도 일부 목적을 위해 유해함 없이 변형 및/또는 분열될 수 있다. 본 발명의 실시양태는 외인성 핵산의 통합을 위한 FAD2 유전자좌, 및 성능 유전자좌로서의 그의 용도를 포함한다. 예에서, FAD2 유전자좌는 성능 유전자좌로서의 그의 용도의 문맥 내에서 바람직한 것으로 발견된 여러 특성, 예컨대 예를 들어 제한 없이 숙주 유기체의 생활 주기 동안 대략 일정한 발현 수준이 존재하고, 놀랍게도, FAD2 유전자좌에서의 공여자 DNA의 삽입은 숙주 상에 품질 또는 적합성 페널티를 유도하지 않는 것 중 적어도 하나를 나타낸다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 (예를 들어, FAD2 2.3 유전자좌 및 FAD2 2.6 유전자좌)는 외인성 핵산 (예를 들어, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)의 부위-특이적 통합에 대한 표적 부위로서 사용된다. 특정한 실시양태에서, 외인성 핵산의 통합은 변형된 유전자좌를 생성한다. 예를 들어, 외인성 핵산의 통합은 분열된 (즉, 불활성화된) FAD2 유전자를 생성하도록 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌는 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 보체에 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, FAD2 유전자좌는 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌는 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌는 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FAD2 상동체 (예를 들어, 오르토로그 또는 파라로그)이다. FAD2 상동체는 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과, 예를 들어 제한 없이 적어도 80%; 적어도 85%; 적어도 약 90%; 적어도 약 91%; 적어도 약 92%; 적어도 약 93%; 적어도 약 94%; 적어도 약 95%; 적어도 약 96%; 적어도 약 97%; 적어도 약 98%; 적어도 약 99%; 적어도 약 99.5%; 99.6%, 99.7%, 99.8% 및/또는 적어도 약 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 FAD2 상동체는 다양한 유기체에 대해 관련 기술분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 이용가능한 임의의 완전한 또는 부분 게놈으로부터 용이하게 확인되고 단리될 수 있다.
IV. FAD2 유전자좌에서의 핵산의 표적화 통합
FAD2 유전자좌에서의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌에서의 외인성 핵산의 통합은 세포 (예를 들어, 조직 또는 유기체의 단리된 세포 또는 세포)를 외인성 핵산을 포함하는 핵산 분자에 접촉시키는 것을 포함한다. 예에서, 이러한 핵산 분자는 핵산 분자와 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 사이의 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열은 FAD2 유전자좌의 내인성 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. 특정한 예에서, 상동 재조합을 용이하게 하는 외인성 핵산에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열은 이전에 통합된 외인성 뉴클레오티드에 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 외인성 핵산은 하나의 FAD2 유전자좌에서, 예컨대 유전자 스택킹으로 통합될 수 있다.
일부 실시양태에서 FAD2 유전자좌에서의 핵산의 통합은 숙주 세포의 내인성 세포 기구, 예컨대 예를 들어 제한 없이 내인성 DNA 및 내인성 레콤비나제 효소에 의해 용이할 수 있다 (예를 들어, 촉매작용함). 일부 실시양태에서, FAD2 유전자좌에서의 핵산의 통합은 숙주 세포에 제공된 하나 이상의 인자 (예를 들어, 폴리펩티드)에 의해 용이해질 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제(들), 레콤비나제(들) 및/또는 리가제 폴리펩티드는 폴리펩티드를 숙주 세포와 접촉시킴으로써, 또는 숙주 세포 내에서 폴리펩티드를 발현시킴으로써 (독립적으로 또는 키메라 폴리펩티드의 일부로서) 제공될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 적어도 하나의 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 FAD2 유전자좌에 부위-특이적 통합되는 핵산을 공동으로 또는 순차적으로 숙주 세포 내로 도입할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드는 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
A. DNA-결합 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 부위-특이적 통합은, 예를 들어 숙주 유기체의 게놈에서 특정한 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합될 수 있는 인자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 다수의 단백질은 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 포함한다. DNA 결합 폴리펩티드에 의해 인식된 DNA 서열은 "표적" 서열로서 언급될 수 있다. 도메인이 원래 그로부터 단리되어진 단백질이 아닌 폴리펩티드에서 발현될 때도, 부위-특이적 방식으로 DNA를 인식하고 이에 결합될 수 있는 폴리펩티드 도메인은 일반적으로 정확하게 접히고, 독립적으로 기능하여 부위-특이적 방식으로 DNA에 결합된다. 유사하게, 심지어 큰 DNA 구조 (예를 들어, 염색체)로 존재하는 경우에도, 특히 표적 서열이 위치한 부위가 가용성 세포성 단백질 (예를 들어, 유전자)에 접근가능한 것으로 공지된 것일 때, DNA-결합 폴리펩티드에 의한 인식 및 결합에 대한 표적 서열은 일반적으로 이러한 폴리펩티드에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다.
자연에 존재하는 단백질로부터 확인된 DNA-결합 폴리펩티드가 전형적으로 별개의 뉴클레오티드 서열 또는 모티프 (예를 들어, 컨센서스 인식 서열)에 결합하는 반면, 이러한 다수의 DNA-결합 폴리펩티드를 변형하여 다양한 뉴클레오티드 서열 또는 모티프를 인식하도록 하는 방법이 존재하고, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다. DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들어 제한 없이 아연 핑거 DNA-결합 도메인; 류신 지퍼; UPA DNA-결합 도메인; GAL4; TAL; LexA; Tet 리프레서; LacR; 및 스테로이드 호르몬 수용체를 포함한다.
일부 예에서, DNA-결합 폴리펩티드는 아연 핑거이다. 개별적인 아연 핑거 모티프는 광범위한 DNA 부위 중 임의의 부위를 특이적으로 표적화하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 정규 Cys2His2 (뿐만 아니라 비-정규 Cys3His) 아연 핑거 폴리펩티드도 표적 DNA 이중 나선의 주요 홈에 α-나선을 삽입하는 것에 의해 DNA에 결합한다. 아연 핑거에 의한 DNA의 인식은 모듈식이어서; 각 핑거가 일차적으로 표적의 3개 연속 염기 쌍에 접촉하고, 폴리펩티드의 소수의 핵심 잔기들이 인식을 매개한다. 표적화 엔도뉴클레아제에 다수의 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함시키는 것에 의해, 표적화 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 추가로 증가될 수 있다 (및 이에 따라 그에 의해 부여되는 임의의 유전자 조절 효과의 특이성 또한 증가될 수 있음). 예를 들어, 문헌 [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51]을 참조한다. 따라서, 숙주 세포 내로 도입된 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포의 게놈 내의 특유한 DNA 서열과 상호작용하도록, 하나 이상의 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩티드가 조작되고 이용될 수 있다.
바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연 발생된 것이다. 예를 들어, 그 전문이 모두 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조한다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인에는 자연 발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성이 있을 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은, 예를 들어 공동 소유의 WO 02/077227에 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축을 위한 방법은 통상의 기술자에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세하게 설명되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중 핑거의 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, DNA-결합 폴리펩티드는 GAL4로부터의 DNA-결합 도메인이다. GAL4는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 모듈화된 전사활성인자이지만, 이것은 또한 다수의 다른 유기체에서 전사활성인자로서 작동한다. 예를 들어, 문헌 [Sadowski et al. (1988) Nature 335:563-4]을 참조한다. 이와 같은 조절 시스템에서, 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)에서의 갈락토스 대사 경로의 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 이용가능한 탄소원에 의해 엄격하게 조절된다 (Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76). 이들 대사 효소의 전사 조절은 양성 조절 단백질 GAL4, 및 GAL4가 특이적으로 결합하는 17 bp 대칭형 DNA 서열 (UAS) 사이의 상호작용에 의해 매개된다.
천연 GAL4는 99 kDa의 분자량을 갖는 881개의 아미노산 잔기로 이루어진다. GAL4는 기능적으로 자율성인 도메인을 포함하며, 이의 조합된 활성이 생체 내에서의 GAL4의 활성을 담당한다 (Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36). GAL4의 N-말단 65개 아미노산은 GAL4 DNA-결합 도메인을 포함한다 (Keegan et al. (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5). 서열-특이적 결합은 DNA 결합 도메인에 존재하는 6개의 Cys 잔기에 의해 배위되는 2가 양이온의 존재를 필요로 한다. 배위된 양이온-함유 도메인은 DNA 나선의 주요 홈과의 직접적인 접촉을 통하여 17 bp UAS 각 말단의 보존되어 있는 CCG 삼중체와 상호작용하여 그것을 인식한다 (Marmorstein et al. (1992) Nature 356:408-14). 단백질의 DNA-결합 기능은 활성화 도메인이 전사를 유도할 수 있도록 프로모터의 근처에 C-말단 전사 활성화 도메인을 위치시킨다.
특정 실시양태에서, 이용할 수 있는 추가의 DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들어 제한 없이 AVRBS3-유도성 유전자로부터의 결합 서열; AVRBS3-유도성 유전자로부터의 컨센서스 결합 서열 또는 그로부터 조작된 합성 결합 서열 (예를 들어, UPA DNA-결합 도메인); TAL; LexA (예를 들어, 상기 문헌 [Brent & Ptashne (1985)] 참조); LacR (예를 들어, 문헌 [Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6)] 참조); 스테로이드 호르몬 수용체 (Ellliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:11517-121); 테트라시클린 (Tc)의 존재 하에는 tet 오퍼레이터 서열에 결합하나 부재시에는 그렇지 않은 Tet 리프레서 (미국 특허 6,271,341) 및 돌연변이된 Tet 리프레서; NF-κB의 DNA-결합 도메인; 및 GAL4, 호르몬 수용체 및 VP16의 융합을 이용하는, 문헌 [Wang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4]에 기재된 조절 시스템의 성분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20110301073을 참조한다. 속 크산토모나스(Xanthomonas)의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 병해를 야기하는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은 25개 초과의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 좌우된다. 상기 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성제-유사 (TAL) 이펙터가 존재한다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 대부분의 잘 특성화된 TAL-이펙터 중의 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 피브이. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복체의 중앙 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복체는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum) 생태형 1 균주 GMI1000 및 생태형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 유전자 산물 둘 다는 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,420,782 및 8,440,431 및 미국 특허 공개공보 번호 20110301073을 참조한다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (군집성의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복체) 유전자좌, 및 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR-연관) 유전자좌 (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60)는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주 내의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-연관 (Cas) 유전자의 조합 뿐만 아니라 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소를 함유한다.
유형 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중의 하나이고, 4개의 순차적 단계에서 표적화된 DNA 이중-가닥 파단을 수행한다. 먼저, 2개의 비-코딩 RNA인 프리-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 이어서, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고, 프리-crRNA의 개별적인 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로의 프로세싱을 매개한다. 세번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA 상의 스페이서와, 표적 인식을 위한 추가의 요건인 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 옆에 존재하는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Wastson-Crick) 염기-쌍형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 프로토스페이서 내의 이중 가닥 파단을 생성하기 위해 표적 DNA의 절단을 매개한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3 단계: (i) 이후의 공격을 방지하기 위해 '순응'으로 불리는 방법으로 CRISPR 어레이 내로의 외래 DNA 서열의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱 후, (iii) 외래 핵산을 사용한 RNA-매개 간섭을 포함한다. 따라서, 박테리아 세포에서, 소위 'Cas' 단백질 중 몇몇은 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능과 연관되고, 외래 DNA 등의 삽입과 같은 기능에서 역할을 한다.
특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 특성을 갖는다면, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드의 유도체 및 그의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체 둘 다, 공유 변형, 및 그의 융합체를 포함한다. Cas 폴리펩티드의 적합한 유도체 또는 그의 단편은 Cas 단백질의 돌연변이체, 융합체, 공유 변형 또는 그의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻거나 또는 화학적으로 합성되거나 또는 이들 2가지 절차의 조합에 의해 얻을 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 보다 높은 발현 수준으로 생산하거나 또는 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 코딩하는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 Cas 단백질을 천연적으로 생산하지 않고, Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
특정한 실시양태에서, DNA-결합 폴리펩티드는 숙주 유기체의 게놈 핵산 내에 포함되는 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합한다. 별개의 경우의 표적 뉴클레오티드 서열 중 임의의 수가 일부 예에서 숙주 게놈에서 발견될 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에서 드물게 있을 수 있다 (예를 들어, 표적 서열의 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2 또는 약 1 카피(들) 미만이 게놈 중에 존재할 수 있다). 예를 들어, 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에 특유한 부위에 위치할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 제한 없이 서로에 대한 게놈 전반에 무작위로 분산될 수 있고; 게놈의 다양한 연결 기에 위치할 수 있고; 동일한 연결 기에 위치할 수 있고; 다양한 염색체 상에 위치할 수 있고; 동일한 염색체 상에 위치할 수 있고; 유기체에서 유사한 조건 하에 (예를 들어, 동일한 또는 기능적으로 실질적으로 동일한 조절 인자의 제어 하에) 발현된 부위에서 게놈에 위치할 수 있고; 게놈에서 서로에 근접하게 위치할 수 있다 (예를 들어, 표적 서열은 게놈 유전자좌에 콘카테머로서 통합된 핵산 내에 포함될 수 있음).
B. 표적화 엔도뉴클레아제
특정한 실시양태에서, 특히 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드 내에 포함되어 키메라 폴리펩티드 상의 표적 서열에 특이적 결합을 부여할 수 있다. 예에서, 이러한 키메라 폴리펩티드는 이들 폴리펩티드가 상기에 기재된 바와 같이, 예를 들어 제한 없이 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함할 수 있다. DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제, 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 다른 기능적 폴리펩티드 모티프 및/또는 도메인, 예컨대 예를 들어 제한 없이 키메라 단백질에서 기능적 폴리펩티드 사이에 위치한 스페이서 서열; 리더 펩티드; 융합 단백질을 소기관 (예를 들어, 핵)에 표적화하는 펩티드; 세포 효소에 의해 절단되는 폴리펩티드; 펩티드 태그 (예를 들어, Myc, His 등); 및 키메라 폴리펩티드의 기능을 간섭하지 않는 다른 아미노산 서열을 또한 포함할 수 있다.
키메라 폴리펩티드에서의 기능적 폴리펩티드 (예를 들어, DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)는 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드의 기능적 폴리펩티드는 인-프레임 내에서 서로 라이게이션된 기능적 폴리펩티드를 적어도 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로부터 그의 발현에 의해 작동적으로 연결되어 키메라 단백질을 코딩하는 키메라 유전자를 생성할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드의 기능적 폴리펩티드는 다른 수단, 예컨대 독립적으로 발현된 폴리펩티드의 교차-연결에 의해 작동적으로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드는 단리된 천연 단백질 (또는 그의 돌연변이체) 내에 포함될 수 있고, 여기서 단리된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이체는 또한 뉴클레아제 폴리펩티드 (및 레콤비나제 및/또는 리가제 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있음)를 포함한다. 이러한 단리된 단백질의 예는 TALEN, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, Tre 및 FLP 레콤비나제), RNA-유도 CRISPR-Cas9 및 메가뉴클레아제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적화 엔도뉴클레아제"는 DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 단리된 천연 또는 조작된 단백질 및 그의 돌연변이체, 뿐만 아니라 DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. FAD2 유전자좌 내에 포함된 (예를 들어, 표적 서열이 유전자좌에서 천연 서열 내에 포함되기 때문에, 또는 표적 서열이 유전자좌 내로, 예를 들어 재조합에 의해 도입되었기 때문에) 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 임의의 표적화 엔도뉴클레아제는 특정 실시양태에서 이용될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서 유용할 수 있는 키메라 폴리펩티드의 일부 예는 제한 없이 하기 폴리펩티드의 조합을 포함한다: 아연 핑거 DNA-결합 폴리펩티드; FokI 뉴클레아제 폴리펩티드; TALE 도메인; 류신 지퍼; 전사 인자 DNA-결합 모티프; 및 예를 들어 제한 없이 TALEN, 레콤비나제 (예를 들어, Cre, Hin, RecA, Tre 및 FLP 레콤비나제), RNA-유도 CRISPR-Cas9, 메가뉴클레아제로부터 단리된 DNA 인식 및/또는 절단 도메인; 및 관련 기술분야에 공지된 다른 것. 특정한 예는 부위-특이적 DNA 결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 키메라 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드 내에 포함된 DNA-결합 폴리펩티드의 인식 서열을 변경하여 특정한 관심 뉴클레오티드 서열을 키메라 폴리펩티드에 표적화하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거, TAL-이펙터 도메인 등) 및 뉴클레아제 (절단) 도메인을 포함한다. 절단 도메인은 DNA-결합 도메인에 이종일 수 있으며, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인임. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미크로코쿠스(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)]을 참조한다). 이들 효소 (또는 그의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는, 상기 제시된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우에 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하는 것이 절단 절반-도메인이 기능성 절단 도메인을 형성 (예를 들어, 이량체화에 의해 형성)하는 것이 가능하도록 절단 절반-도메인을 서로에 대해 공간적으로 배향시키도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들이 서로 관련되어 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위의 가까운 경계는 뉴클레오티드 5-8개 또는 뉴클레오티드 15-18개에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개입할 수 있다 (예를 들어, 2 내지 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 쌍). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에 존재하고, 예를 들어 하나 이상의 외인성 서열 (공여자/트랜스진)이 결합 (표적) 부위에 또는 그 근처에서 통합되도록, DNA에 (인식 부위에서) 서열-특이적으로 결합하여, 결합의 부위에 또는 그 근처에서 DNA를 절단하는 것이 가능하다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위에서 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 Fok I은 한쪽 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매작용한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 또는 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 상기 특정한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok I 효소의 일부는 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화된 교체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적 활성 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20070134796에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소가 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 또한 함유하고, 이것은 본 개시내용에서 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 그 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 20050064474; 20060188987 및 20080131962에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로도 언급됨)을 포함한다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 FokI의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 대체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 대체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490 (E->K) 및 538 (I->K)을 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486 (Q->E) 및 499 (I->L)를 돌연변이시킴으로써 제조하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 또는 제거된 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 그 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개공보 번호 2008/0131962를 참조한다.
특정 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로, 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 대체한 돌연변이 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 언급됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체한 돌연변이 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 언급됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전자 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 번호 매김)의 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 언급됨)로 대체한 돌연변이를 포함한다 (미국 특허 공개공보 번호 20110201055 참조). 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 공개공보 번호 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인 (FokI)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내에서 어셈블리될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이, 예를 들어 자가-절단성 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
C. 아연 핑거 뉴클레아제
구체적 실시양태에서, 키메라 폴리펩티드는, 표적 부위-특이적 이중-가닥 DNA 파단을 전달하여 외인성 핵산, 또는 공여자 DNA가 통합될 수 있도록 설계될 수 있는 주문-설계된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)이다 (본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 공개 20100257638 참조). ZFN은 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터의 비-특이적 절단 도메인 및 아연 핑거 DNA-결합 도메인 폴리펩티드를 함유하는 키메라 폴리펩티드이다. 예를 들어, 문헌 [Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9; Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81]을 참조한다. 일부 실시양태에서, ZFN는 비-정규 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 포함한다 (본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 공개 20080182332 참조). FokI 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하고 이중-가닥 파단을 도입하기 위해 뉴클레아제 도메인을 통해 2량체화되어야 한다. 결과적으로, 이러한 엔도뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN는 또한 표적 DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이량체화가 요구된다 (Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9). ZFN의 이량체화는 반대로 배향된 2개의 인접한 DNA-결합 부위에 의해 용이해질 수 있다. 상기 동일 문헌을 참조한다.
ZFN 시스템의 유연성 및 특이성은 공지된 레콤비나제-매개 유전자 편집 전략에 의해 이전에는 달성될 수 없었던 제어 수준을 제공한다. 한 예로서, ZFN는, 예를 들어 특이적 핵산 서열을 인식하기 위해 용이하게 조작될 수 있다 (Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 20090205083, 20110189775, 20110167521 및 20100199389 참조)). 아연 핑거 인식 잔기에 대한 코돈의 무작위화는 임의로 선택된 DNA 서열에 대해 높은 친화도를 갖는 새로운 핑거의 선택을 허용한다. 또한, 아연 핑거는 천연 DNA-결합 분자이고, 조작된 아연 핑거는 살아있는 세포 내에서 그의 설계된 표적에 대해 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 아연 핑거를 기초로 한 뉴클레아제는 특이적인 그러나 임의의 인식 부위에 대한 표적화가 가능하다.
특정한 예에서, 숙주의 적어도 하나의 FAD2 성능 유전자좌로의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합 방법은 ZFN을 숙주의 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 ZFN은 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합하며, 여기서 표적 뉴클레오티드 서열은 숙주의 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 내에 포함된다. 특정 예에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 이외의 임의의 위치에서는 숙주의 게놈 내에 포함되지 않는다. 예를 들어, ZFN의 DNA-결합 폴리펩티드는 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 내에 확인된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, FAD2 유전자좌를 서열분석함으로써). ZFN을 숙주의 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 숙주의 적어도 하나의 FAD2 성능 유전자좌로의 외인성 핵산의 부위-특이적 통합 방법은 또한 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 FAD2 유전자좌를 포함하는 숙주의 핵산 내로의 외인성 핵산의 재조합은 표적 서열에 대한 부위-특이적 인식 및 ZFN의 결합 (및 FAD2 유전자좌를 포함하는 핵산의 후속적인 절단)에 의해 용이해진다.
V. FAD2 유전자좌에서의 통합을 위한 외인성 핵산
본 발명의 실시양태는 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에서 부위-특이적 통합을 위한 외인성 핵산, 예를 들어 제한 없이 PTU, ELP, ETIP 또는 ORF; 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 상기 중 어느 하나 또는 둘 다 중 적어도 하나를 포함하는 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에 사용하기 위한 특정한 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 구조적 뉴클레오티드 서열 및/또는 DNA-결합 폴리펩티드 인식 및 결합 부위를 포함한다.
A. 부위-특이적 통합을 위한 외인성 핵산 분자
상기에 기재된 바와 같이, 외인성 서열 (또한 "공여자 서열" 또는 "공여자" 또는 "트랜스진"으로도 불림)의 삽입은, 예를 들어 폴리펩티드의 발현, 돌연변이체 유전자의 수정 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위해 제공된다. 공여자 서열은 전형적으로 이것이 위치한 게놈 서열과 동일하지 않음이 용이하게 명백할 것이다. 공여자 서열은 상동성인 2개의 영역에 의해 플랭킹된 비-상동 서열을 함유하여 관심 위치에서 효율적 HDR을 가능하게 할 수 있다. 추가로, 공여자 서열은 세포 염색질에서의 관심 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자 포함할 수 있다. 공여자 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보통 관심 영역에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열이 공여자 핵산 분자에 존재할 수 있고, 관심 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역에 의해 상기 서열이 플랭킹될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 20100047805, 20110281361, 20110207221 및 미국 출원 번호 13/889,162를 참조한다. 선형 형태로 도입되면, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 공여자 서열의 말단이 보호될 수 있다 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/되거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌 [Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가의 방법은 말단 아미노 기(들)의 부가, 및 변형된 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여자 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결핍 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여자는 통합 부위에서의 내인성 프로모터, 즉 공여자가 통합된 내인성 유전자 (예를 들어, FAD2)의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 그의 발현을 유도하도록 일반적으로 통합된다. 그러나, 공여자가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 명백할 것이다.
또한, 발현을 위해 요구되지 않지만, 외인성 서열은 또한, 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화화 신호를 포함할 수 있다.
실시양태에서 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 내로 부위-특이적 방식으로 통합되어 FAD2 유전자좌를 변형시킬 수 있는 외인성 핵산은, 예를 들어 제한 없이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산; 농경학적 유전자를 포함하는 핵산; RNAi 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 또는 FAD2 유전자를 분열시키는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 FAD2 유전자좌에서 통합되어 FAD2 유전자좌를 변형시키고, 여기서 핵산은 농경학적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열이 숙주에서 FAD2 유전자좌로부터의 발현되도록, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 외래 단백질)은 산업량으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다. 이러한 예에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포, 조직 또는 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주는 식물이고, 관심 폴리펩티드의 상업적 생산을 위해 제공된 식물 물질은 식물, 식물 일부, 식물 조직 또는 식물 세포일 수 있다. 일부 예에서, 식물 일부는 식물 종자일 수 있다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은, 예를 들어 문헌 [Heney and Orr (1981) Anal. Biochem. 114:92-6]에 논의된 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
마찬가지로, 농경학적 유전자는 형질전환된 식물 세포, 식물 및/또는 그의 자손에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 식물은 적어도 하나의 FAD2 유전자좌로부터의 다양한 농경학적 관심 표현형을 발현하는 특정한 실시양태의 방법을 통해 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은, 예를 들어 제한 없이 해충 또는 병해에 대한 저항성을 부여하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Jones et al. (1994) Science 266:789] (클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성에 대한 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); 문헌 [Martin et al. (1993) Science 262:1432]; 문헌 [Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089] (슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)에 대한 저항성을 위한 RSP2 유전자); PCT 국제 특허 공개 번호 WO 96/30517 (대두 낭 선충병에 대한 저항성); PCT 국제 특허 공개 번호 WO 93/19181; 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 그에 대해 모델링된 합성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Geiser et al. (1986) Gene 48:109] (Bt δ-내독소 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열; 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 버지니아주 마나사스)으로부터 예를 들어, ATCC 등록 번호 40098; 67136; 31995 및 31998 하에 구입할 수 있음) 참조); 렉틴을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25] (몇몇 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열) 참조); 비타민-결합 단백질, 예를 들어 아비딘을 코딩하는 유전자 (PCT 국제 특허 공개 번호 US93/06487 (곤충 해충에 대한 유충구충제로서 아비딘 및 아비딘 상동체의 사용) 참조); 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제, 프로테이나제 억제제 또는 아밀라제 억제제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Abe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16793] (벼 시스테인 프로테이나제 억제제의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985] (담배 프로테이나제 억제제 I을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Sumitani et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243] (스트렙토미세스 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) 알파-아밀라제 억제제의 뉴클레오티드 서열) 및 미국 특허 5,494,813 참조); 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예를 들어 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 그의 변이체, 그에 대한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Hammock et al. (1990) Nature 344:458] (클로닝된 유충 호르몬 에스테라제 (유충 호르몬의 불활성화제)의 바큘로바이러스 발현) 참조); 발현시 이환된 해충을 생리학상 분열시키는, 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9] (발현 클로닝은 곤충 이뇨 호르몬 수용체를 코딩하는 DNA를 생성함); 문헌 [Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243] (디플로프테라 푼타타(Diploptera puntata) 내의 알로스타틴); 및 미국 특허 5,266,317 (곤충-특이적, 마비성 신경독소를 코딩하는 유전자) 참조); 자연에서 뱀, 말벌 또는 다른 유기체에 의해 생산되는 곤충-특이적 독을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Pang et al. (1992) Gene 116:165] (전갈 곤충독성 펩티드를 코딩하는 유전자의 식물 내 이종성 발현) 참조); 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 다른 분자의 과축적을 담당하는 효소를 코딩하는 유전자; 생물학적 활성 분자의 번역후 변형을 비롯한 변형에 관여하는 효소, 예를 들어 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 또는 글루카나제 (천연이든 합성이든)를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PCT 국제 특허 공개 번호 WO 93/02197 (칼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 또한, 키티나제-코딩 서열을 함유하는 DNA 분자는, 예를 들어 ATCC로부터 등록 번호 39637 및 67152 하에 얻을 수 있음); 문헌 [Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691] (담배 박각시나방 키티나제를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열); 및 문헌 [Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673] (파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자의 뉴클레오티드 서열) 참조); 신호 전달을 자극하는 분자를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757] (녹두 칼모둘린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열); 및 문헌 [Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467] (옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열) 참조); 소수성 모멘트 펩티드를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PCT 국제 특허 공개 번호 WO 95/16776 (진균 식물 병원체를 억제하는 태키플레신 (Tachyplesin)의 펩티드 유도체); 및 PCT 국제 특허 공개 번호 WO 95/18855 (병해 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드) 참조); 막 퍼미아제(permease), 채널 형성제, 또는 채널 차단제를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43] (트랜스제닉 담배 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성으로 만드는 세크로핀-β 라이틱 펩티드 유사체의 이종성 발현) 참조); 바이러스-침습 단백질 또는 그로부터 유래하는 복합 독소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451] 참조); 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래하는 면역독소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interations (Edinburgh, Scotland) (1994)] (단일쇄 항체 단편의 생산을 통해 트랜스제닉 담배 내에서 효소에 의한 불활성화) 참조); 바이러스-특이적 항체를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469] (재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 바이러스 공격으로부터 보호됨) 참조); 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산되는 발달 억제성 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436] (진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락토우로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락토우로나제를 가용화함으로써 진균 콜리니화 및 식물 영양분 방출을 촉진함); 문헌 [Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367] (콩 엔도폴리갈락토우로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화) 참조); 식물에 의해 자연에서 생산되는 발달-억제성 단백질을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305] (보리 리보솜-불활성화 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물은 진균 질환에 대한 증가된 저항성을 가짐) 참조)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한 및/또는 대안적으로, 예를 들어 제한 없이 성장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제와 같은 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 저항성을 부여하는 유전자 (본 카테고리에서 예시적인 유전자는, 예를 들어 문헌 [Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241, 및 Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449]에 각각 설명된 바와 같은 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩함); 예를 들어, 돌연변이체 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자에 의해 부여된 바와 같은 글리포세이트 저항성 (재조합 핵산 및/또는 다양한 형태의 천연 EPSP 유전자 (비제한적으로 CP4, DMMG 및 DGT-28 포함)의 생체내 돌연변이 유발의 도입을 통해; 각각 aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자); 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함하는 스트렙토미세스 종으로부터 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자); 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,940,835 및 6,248,876 (식물에 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열)을 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 39256 하에 얻을 수 있다. 또한, 미국 특허 4,769,061 (돌연변이체 aroA 유전자의 뉴클레오티드 서열)을 참조한다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에서는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여할 수 있는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있다. 예시적인 PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 번호 0 242 246, 및 문헌 [DeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61] (PAT 활성을 코딩하는 키메라 바(bar) 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산)에 제공되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예는 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 바와 같은 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자를 포함한다. 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 GAT 유전자는, 예를 들어 WO 2005012515에 기재되어 있다. 2,4-D, 페녹시프로프리온산 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자는, 예를 들어 WO 2005107437 및 WO 2007053482에 기재되어 있다.
관심 폴리펩티드를 코딩하는 농경학적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한, 예를 들어 제한 없이 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169] (돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환)을 참조한다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 53435; 67441; 및 67442 하에 이용가능하다. 또한, 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173] (글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 농경학적 유전자 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 또한 및/또는 대안적으로 가치-부가 형질, 예를 들어 제한 없이, 예를 들어 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위한 스테아릴-ACP 데새투라제의 안티센스 유전자를 갖는 식물의 형질전환에 의해 변형된 지방산 대사를 부여하거나 또는 이에 기여하는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624] 참조); 감소된 파이테이트(phytate) 함량 (예를 들어, 피타제-코딩 유전자의 도입은 파이테이트의 분해를 증진하여, 더 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 첨가함) (예를 들어, 문헌 [Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87] (아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 기인할 수 있는 단일 대립유전자에 연관된 DNA의 클로닝에 이어서 이를 재도입시킴으로써 달성될 수 있는, 옥수수에서 파이테이트 함량을 감소시키기 위해 도입될 수 있는 유전자 (예를 들어, 문헌 [Raboy et al. (1990) Maydica 35:383] 참조); 및 예를 들어 식물을 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 달성되는 변형된 탄수화물 조성 (예를 들어, 문헌 [Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810] (스트렙토코쿠스 돌연변이체 프룩토실트랜스페라제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220] (레반수크라제 유전자); 문헌 [Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292] (α-아밀라제); 문헌 [Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515] (토마토 인버타제 유전자의 뉴클레오티드 서열); 문헌 [Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480] (보리 α-아밀라제 유전자); 및 문헌 [Fisher et　al. (1993) Plant Physiol. 102:1045] (옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II) 참조)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 FAD2 유전자좌를 변형시키기 위해 FAD2 유전자좌에 통합되고, 여기서 핵산은, 예를 들어 PTU 또는 ELP의 부위에서의 제2 외인성 핵산의 후속적인 부위-특이적 통합이 용이해지도록 PTU 또는 ELP를 포함한다. 또한, 미국 출원 번호 13/889,162를 참조한다.
표적화 통합을 통해 식물 게놈 내로의 관심 핵산 분자의 표적화 엔도뉴클레아제-매개 통합은 표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 핵산 분자의 전달 후, 숙주에서의 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현을 필요로 한다. 외인성 핵산은, 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질이 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에서의 표적 부위(들)에서 이중-가닥 파단을 유도한 다음, 예를 들어 유전자좌 내로의 외인성 핵산의 상동성-유도 통합을 통해 복구되도록, 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포 내로 전달되거나 또는 발현되는 것와 동시에 숙주 세포에 내에 존재하는 것이 바람직하다. 통상의 기술자는 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현이 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 구축물의 유전자도입, 및 표적화 엔도뉴클레아제-코딩 구축물의 일시 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 방법에 의해 달성될 수 있음을 알 수 있다. 이들 둘 다의 경우에서, 기능적 표적화 엔도뉴클레아제 단백질의 발현 및 숙주 세포 내로 외인성 핵산의 전달은 FAD2 유전자좌에서 표적화 통합을 유도하기 위해 동시에 달성될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제로서 ZFN을 이용하는 실시양태에서 획득된 특정한 이점은 키메라 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인의 이량체화에 대한 요건이 서열의 높은 수준을 제공하고, 따라서 절단, 특이성의 높은 수준을 제공한다는 것이다. 3개 핑거의 각각의 세트는 9개의 연속적인 염기 쌍에 결합하기 때문에, 2개의 키메라 뉴클레아제는 각각의 아연 핑거 도메인이 완전한 특이성을 갖는다면 18개 bp 표적을 효과적으로 처리한다. 상기 길이의 임의의 주어진 서열은 단일 게놈 (대략 109 bp 가정) 내에서 특유할 것으로 예측된다 (상기 문헌 [Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97; Wu et al. (2007)]). 또한, 추가의 핑거는 증진된 특이성을 제공할 수 있으며 (Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14628-33; Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-30), 따라서 각각의 DNA-결합 도메인 내의 아연 핑거의 수는 추가의 특이성을 제공하기 위해 증가될 수 있다. 예를 들어, 특이성은 24개 bp 서열을 인식하는 한 쌍의 4-, 5-, 6- 또는 그 초과의 핑거 ZFN을 사용함으로써 추가로 증가될 수 있다 (Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51). 따라서, ZFN은 숙주 식물 게놈 내로 도입된 인식 서열이 게놈 내에서 특유하도록 사용될 수 있다.
B. 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자
일부 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표적화 엔도뉴클레아제 내에 포함된 폴리펩티드를 코딩하는 본래 뉴클레오티드 서열의 조작 (예를 들어, 라이게이션)에 의해 조작될 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 검사하여, DNA-결합 폴리펩티드에 상응하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하고 그 뉴클레오티드 서열을, DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 요소로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 표적화 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 유전자 코드의 축중성에 따라 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추론할 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산 분자에서, 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈은 임의 수의 뉴클레오티드 트리플릿에 의해, 예를 들어 인트론 또는 "정지"를 위한 코딩 없이 분리될 수 있다. 마찬가지로, DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈이 임의 수의 뉴클레오티드 트리플릿에 의해 분리될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 DNA-결합 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 (즉, 핵산 서열의 가장끝 3')의 마지막 코돈은 거기에 바로 연속되거나, 또는 합성 뉴클레오티드 링커 (예를 들어, 융합을 달성하는데 사용되었을 수 있는 뉴클레오티드 링커)에 의해 코딩되는 것과 같이 짧은 펩티드 서열로만 그로부터 분리된 서열을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드의 첫번째 코돈과 위상-일치 (phase-register)로 융합될 수 있다. 이러한 추가의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는, 예를 들어 제한 없이 태그, 표적화 펩티드 및 효소적 절단 부위를 포함한다. 마찬가지로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 가장끝 5' (핵산 서열에서)의 첫번째 코돈은 거기에 바로 연속되거나, 또는 짧은 펩티드 서열로만 그로부터 분리된 서열을 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드의 마지막 코돈과 위상-일치로 융합될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제 (예를 들어, DNA 결합-폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)에서 기능적 폴리펩티드를 코딩하는 서열 분리 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 코딩된 아미노산 서열이 표적화 엔도뉴클레아제의 번역을 유의하게 변경할 가능성이 없도록 하는 임의의 서열로 이루어질 수 있다. 공지된 뉴클레아제 폴리펩티드 및 공지된 DNA-결합 폴리펩티드의 자율 특성으로 인해, 개재 서열은 예에서 이들 구조의 각각 기능을 간섭하지 않을 것이다.
C. 벡터 및 발현 구축물
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드 및/또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자(들)는 세포, 조직 또는 유기체 내로 그 내부에서의 발현을 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 내에 포함된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 표적화 엔도뉴클레아제의 발현을 위해 세포 내로 도입될 수 있고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이, 예를 들어 발현된 표적화 엔도뉴클레아제에 의한 유전자좌에서의 이중 가닥 파단의 도입 후 상동 재조합에 의해, 적어도 하나의 FAD2 유전자좌 내로 통합되도록 세포 내로 도입될 수 있고, 관심 폴리펩티드는 통합된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 상기 중 하나와 같은 핵산 분자는, 예를 들어 벡터 시스템, 예컨대 예를 들어 제한 없이 선형 플라스미드 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다. 특정한 예에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 특정한 실시양태에 따른 핵산 서열은, 예를 들어 핵산 서열이 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 벡터에 삽입될 수 있다. 다수의 벡터들이 이와 같은 목적으로 이용가능한데, 구체적인 벡터의 선택은, 예를 들어 벡터에 삽입될 핵산의 크기, 벡터를 사용하여 형질전환될 특정한 숙주 세포, 및/또는 발현되기를 원하는 코딩된 폴리펩티드의 양에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 전형적으로 다양한 성분을 함유하며, 그의 동일성은 벡터의 기능 (예를 들어, DNA 증폭 및 DNA 발현), 및 적합한 벡터를 갖는 특정한 숙주 세포(들)에 따라 달라진다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 코딩 서열(들)에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포, 조류 세포, 진균 세포 또는 식물 세포에서 기능하는 프로모터 서열일 수 있고, 여기서 핵산 분자는 증폭되거나 또는 발현되는 것이다. 일부 실시양태는 관심 폴리펩티드 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드(들)에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)은 관심 폴리펩티드 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 식물 세포, 조직 또는 유기체에서, 조절 서열(들)의 제어 하에 발현될 수 있다.
일부 실시양태에 따른 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터는 유도성인 것, 조직-특이성인 것, 바이러스인 것, 합성인 것 또는 구성적인 것을 포함하며, 모두 관련 기술분야에 익히 공지되어 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 프로모터의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196 (35S 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (빛-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 5,447,858 (대두 열 쇼크 프로모터); 및 미국 특허 출원 일련 번호 09/757,089 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 의해 제공되어 있다.
추가의 예시적 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens))의 종양-유도 플라스미드 상에서 운반되는 것); 카울리모바이러스 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 번호 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 번호 6,051,753 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크(GenBank) 등록 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 핵산 분자는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 유기체의 다른 조직과 비교하여, 프로모터가 특이적인 조직에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 더 높은 수준으로 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 조직-특이적 프로모터의 예는 제한 없이 융단조직-특이적 프로모터; 수술-특이적 프로모터; 화분-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,141,424 및 국제 PCT 공개 번호 WO 99/042587 참조); 배주-특이적 프로모터; (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2001/047525 A1 참조); 과실-특이 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,943,674 및 5,753,475 참조); 및 종자-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,420,034 및 5,608,152 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발달 단계-특이적 프로모터 (예를 들어, 후기 발달 단계에 활성을 보이는 프로모터)가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 번역 리더 서열로서의 기능을 하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전하게 프로세싱된 mRNA에 존재하고, 이는 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5' UTR의 비-제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 번호 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 번호 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크 등록 번호 V00087; 및 상기 문헌 [Bevan et al. (1983)])에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열은 또한 3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 유전 요소이며, 이는 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가하는 기능을 한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 3' 전사 종료 영역의 비제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 다양한 3' 비번역 영역의 사용의 예가 문헌 [Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (진뱅크 등록 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.
구체적인 실시양태들에서 유용할 수 있는 조절 서열에 관한 추가의 정보는, 예를 들어 문헌 [Goeddel (1990) "Gene Expression Technology," Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다.
재조합 핵산 분자 또는 벡터는 형질전환된 세포, 예컨대 식물 세포에 선택가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 또한 선택 마터를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 유기체를 선택하는데 사용될 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 게네티신 (G418), 블레오마이신 및 히그로마이신), 또는 제초제 저항성 (예를 들어, 글리포세이트)을 코딩할 수 있다. 선택 마커의 예는 카나마이신 저항성을 부여하며, 예를 들어 카나마이신 및 G418을 사용하여 선택될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 부여하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 부여하는 돌연변이 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트-내성 DHFR 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 제한 없이 암피실린; 블레오마이신; 클로람페니콜; 겐타마이신; 히그로마이신; 카나마이신; 린코마이신; 메토트렉세이트; 포스피노트리신; 퓨로마이신; 스펙티노마이신; 리팜피신; 스트렙토마이신 및 테트라시클린을 포함하여, 화학적 작용제에 대한 저항성을 부여하는 다수의 선택 마커들이 이용가능하다. 상기 선택 마커의 예는, 예를 들어 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 및 6,118,047에 예시되어 있다.
핵산 분자 또는 벡터는 또한 또는 대안적으로 스크리닝가능 마커를 포함할 수 있다. 스크린가능한 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝가능 마커는, 그에 대한 각종 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색) 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds., Plenum, NY (pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 그에 대한 각종 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, PADAC, 발색성 세팔로스포린); 루시퍼라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); 티로신을 도파 및 도파퀴논으로 산화시킴에 따라 멜라닌을 축합시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
예를 들어, 특정한 관심 폴리펩티드 또는 특정한 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열은 통상의 기술자에 의해 즉시 인식가능할 것이다. 유전자 코드의 축중성은 특정한 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. 본 발명의 실시양태에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 특정한 서열의 선택은 실시자의 판단에 속한다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 특정한 숙주의 핵산 내에 포함되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증진시키기 위해, 핵산의 뉴클레오티드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 유전자 코드는 64개의 가능한 코돈으로 중복되지만, 대부분의 유기체는 우선적으로 이들 코돈의 하위세트를 사용한다. 종에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈은 최적 코돈이라 불리며, 가장 빈번하게 사용되지 않는 것들은 희귀 또는 저-사용 코돈으로 분류된다 (Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72). 코돈은 때때로 "코돈 최적화"로서 지칭되는 과정에서 특정한 숙주의 바람직한 코돈 사용을 반영하기 위해 대체될 수 있다. 특정한 원핵 또는 진핵 숙주가 선호하는 코돈을 함유하는 최적화된 코딩 서열은, 예를 들어 번역률을 증가시키거나, 목적하는 특성 (예를 들어, 비-최적화된 서열로부터 제조된 전사체와 비교하여 보다 장기간의 반감기)을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생산함으로써 제조할 수 있다.
핵산은 통상의 기술자로 공지된 임의의 방법, 예컨대 예를 들어 제한 없이 원형질체의 형질전환에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184); 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의한 것 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8]); 전기천공에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253); 탄화규소 섬유를 사용한 교반에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765); 아그로박테리움-매개 형질전환에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,563,055, 5,591,616, 5,693,512, 5,824,877, 5,981,840, 및 6,384,301); 및 DNA-코팅 입자의 가속에 의한 것 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865)에 의해 본 발명의 실시양태에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종의 경우에, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체 내로 재생될 수 있다. 임의의 이들 기술은, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈에 본 발명의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터를 식물에 도입하는데 가장 광범위하게 이용되는 방법은 아그로박테리움의 자연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전자 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전 형질전환을 담당하는 유전자를 운반한다. Ti (종양-유도)-플라스미드는 형질전환된 식물로 전달되는 T-DNA로 공지된 큰 절편을 함유한다. Ti 플라스미드의 또 다른 절편인 vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역에는 각각 말단 반복 뉴클레오티드 서열로 이루어진 좌측 및 우측 경계가 접한다. 몇몇의 변형된 이원성 벡터에서, 종양-유도 유전자가 결실되었고, vir 영역의 기능은 T-DNA 경계 서열이 접하는 외래 DNA를 전달하기 위해 이용된다. T-영역은 또한, 예를 들어 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선택 마커, 및 전달을 위한 삽입 서열, 예컨대 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 다중 클로닝 부위를 함유할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 에이. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 (예를 들어, 미국 특허 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, 및 5,501,967; 및 유럽 특허 EP 0 122 791 참조) 또는 에이. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래된다. 추가의 식물 형질전환 벡터는, 예를 들어 제한 없이 문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13]; 상기 문헌 [Bevan et al. (1983)]; 문헌 [Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42]; 및 유럽 특허 EP 0 120 516에 기재된 것, 및 상기 중 임의의 것으로부터 유래되는 것을 포함한다. 자연상에서 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예컨대 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium) 및 메소리조비움(Mesorhizobium)이 수많은 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개하도록 변형될 수 있다. 이들 식물-연관 공생 박테리아는 무력화된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원성 벡터 둘 다의 획득에 의해 유전자 전달에 대해 적격으로 만들 수 있다.
외인성 DNA를 수용자 세포에 제공한 후, 일반적으로는 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 형질전환된 세포를 확인한다. 형질전환된 세포를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해서는 형질전환체를 생성하는데 사용되는 벡터와 함께, 이전에 제시된 바와 같은 선택 또는 스크리닝가능 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선택 마커가 사용되는 경우, 형질전환된 세포는 세포를 선택제 또는 선택제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 확인된다. 스크리닝가능 마커가 사용되는 경우, 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택제에의 노출에서 살아남은 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성인 것으로 평가된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함함으로써 변형될 수 있다. 조직은 식물 재생의 노력을 개시하는데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동식 선택 라운드를 반복한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 형태가 될 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킨 다음, 신초 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 충분한 신초 형성이 일어날 때까지 주기적으로 배양물을 옮겨 놓는다. 일단 신초가 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가 성장 및 성숙화를 위해 식물을 토양으로 옮겨 놓을 수 있다.
재생 식물에서의 관심 핵산 분자 (예를 들어, 적어도 하나의 본 발명 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR 및 핵산 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해, 또는 효소 작용에 의해 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
통합 사례는, 예를 들어 관심 뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 분석될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 수행하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법에 대해서는 잘 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래하는 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 단일 내지 다중 카피의 재조합 DNA를 함유한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 사례" 또는 "통합 사례"로 지칭된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 삽입된 DNA 서열에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진과 관련하여 동형접합성인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 함유하는 독립 분리개체 트랜스제닉 식물을 그 자신, 예를 들어 F0 식물과 유성적으로 교배시켜 (자가 수정시켜) F1 종자를 생성함으로써 획득할 수 있다. 생성된 F1 종자 중 1/4은 트랜스진과 관련하여 동형접합성일 것이다. F1 종자를 발아시킴으로써, 전형적으로 SNP 검정, 또는 이형접합체와 동형접합체가 구별될 수 있게 하는 열 증폭 검정 (즉, 접합성 검정)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 생성한다.
일부 실시양태에서 핵산 분자를 사용한 식물 또는 식물 세포의 직접적인 형질전환 이외에도, 적어도 하나의 트랜스제닉 사례를 갖는 제1 식물을 이러한 사례가 결핍되어 있는 제2 식물과 교배시키는 것에 의해 트랜스제닉 식물이 특정한 실시양태에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산이 부위-특이적 방식으로 통합된 것인 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌를 포함하는 핵산은 트랜스제닉 식물을 생성하기 위한 형질전환에 순응하는 제1 식물 라인 내로 도입될 수 있으며, 여기서 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌를 제2 식물 라인 내로 유전자이입시키기 위해 (따라서, 외인성 핵산이 제2 식물 라인 내로 들어감) 제2 식물 라인과 교배될 수 있다.
재생 식물에서 관심 핵산 분자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 효소적 기능에 의한 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
표적화된 통합 사례는, 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한, 예를 들어 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 잘 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 세포 배양물을 비롯한 임의의 식물 종 또는 조직 종류로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 둘 다에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나 또는 멀티플렉스화될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 둘의 조합에 어닐링하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 결정 전략은 식물 게놈 내의 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 다중 특이적 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 비-특이적 서열의 증폭, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다 (이에 제한되지는 않음). 통상의 기술자는 게놈에 대해 정보를 얻기 위한 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트가 설계될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 예를 들어 관심 핵산 분자 내의 코딩 영역, 또는 관심 핵산 분자의 다른 부분에 상응하는 서열에서, 도입된 관심 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 이들 프라이머는 상기 기재된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 목적하는 서열에 따라 합성될 수 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.) 아이오와주 코랄빌)로부터). 증폭 후에, 증폭 생성물의 클로닝 및 서열 결정, 또는 직접적인 서열 분석이 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 PCR 유전자형 결정 동안 생성된 증폭 생성물의 분석을 위한 대안적인 방법을 구상할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
VI. FAD2 성능 유전자좌에 통합된 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물 및 식물 물질
일부 실시양태에서, 식물이 적어도 하나의 변형된 (예를 들어, 분열되고/거나 외인성 서열의 표적화 통합된) FAD2 유전자좌 (예를 들어, 대두 FAD2 2.3 유전자좌 및/또는 FAD2 2.6 유전자좌)를 포함하는 식물 세포를 포함하는, 트랜스제닉 식물이 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 식물은 식물 조직 또는 식물 세포의 형질전환, 및 전체 식물의 재생에 의해 생성될 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 식물은 부위-특이적 방식으로 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에서의 외인성 핵산의 도입을 통해 또는 변형된 FAD2 유전자좌의 생식질로의 유전자이입을 통해 획득될 수 있다. 이러한 식물 세포를 포함하는 식물 물질이 또한 제공된다. 이러한 식물 물질은 식물 세포를 포함하는 식물로부터 획득될 수 있다.
적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 물질은 일부 실시양태에서 하기 특징: 식물 세포에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 발현; 식물 세포에서의 (또는 그 내부의 색소체에서의) 관심 폴리펩티드의 발현; 식물 세포의 핵에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 발현; 식물 세포에서의 표적화 엔도뉴클레아제의 국재화; 식물 세포의 게놈에서 FAD2 유전자좌에서의 통합; 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 농경학상 유전자의 식물 세포의 게놈에서 FAD2 유전자좌에서의 통합; 및/또는 식물 세포의 게놈에서 FAD2 유전자좌에서 통합된 코딩 서열에 상응하는 RNA 전사체의 존재 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 이러한 식물은 추가로, 예를 들어 제한 없이 내인성 또는 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열의 발현, 식물 세포의 게놈에서 FAD2 유전자좌에서 통합된 관심 폴리펩티드 또는 농경학상 유전자에 의해 조절되는 발현; 곤충, 다른 해충, 및 병해 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 보관-수명 증진; 환경상의 내성; 약제 생산; 산업 제품 생산; 및 영양상 증진으로 인한 것을 비롯한 하나 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 본원에 기재된 방법에 따라 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에 후속적으로 통합되는 핵산으로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용가능한 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 아라비돕시스, 알팔파, 콩, 브로콜리, 양배추, 카놀라, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 상추, 멜론, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지씨, 시금치, 대두, 스쿼시, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토 및 수박을 포함한다. 본 방법에 사용가능한 단자엽 식물은 비제한적인 예는 옥수수, 보리, 양파, 벼, 소르굼, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 트리티케일, 스위치그래스 및 잔디를 포함한다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물이 사용될 수 있거나, 또는 이는 임의의 방식으로 재배될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 본 발명의 트랜스제닉 식물로부터 생산되는 일상용품을 제공한다. 일상용품은, 예를 들어 제한 없이 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에 통합되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식품 제품, 음식, 오일 또는 식물의 분쇄 곡물 또는 통곡물 또는 종자를 포함한다. 하나 이상의 상품 또는 일상용품에서의 하나 이상의 이러한 뉴클레오티드 서열의 검출은 상품 또는 일상용품이 적어도 일부가 본 발명의 실시양태에 따라 생산된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 사실상의 증거이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 그의 게놈에서의 적어도 하나의 다른 트랜스제닉 사례, 예컨대 제한 없이 RNAi 분자가 전사되는 트랜스제닉 사례; 살곤충 단백질 (예를 들어, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 살곤충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 목적하는 표현형 (예를 들어, 증가된 수율, 변경된 지방산 대사물질, 또는 세포질 남성 불임의 회복)에 기여하는 유전자를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌를 포함하는 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물은 하나 이상의 목적하는 형질을 가질 수 있다. 이러한 형질은, 예를 들어 곤충, 다른 해충, 및 병해 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 보관-수명 증진; 환경상의 내성; 제약 생산; 산업 제품 생산; 및 영양상 증진을 포함할 수 있다. 바람직한 형질은 바람직한 형질을 나타내는 식물에서 발현되는 FAD2 유전자좌에서의 표적화된 재조합에 의해 통합된 하나 이상의 핵산 분자에 의해 부여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 목적하는 형질은 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌의 부위에서의 식물의 게놈 내로 도입된 트랜스진(들)의 식물 내 존재에 의한 것일 수 있다. 추가 실시양태에서, 목적하는 형질은 형질이 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌에서 표적화된 재조합에 의해 통합된 하나 이상의 핵산 분자에 의해 부여될 수 있는 통상적인 육종을 통해 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 임의의 방식으로 사용되거나 또는 배양될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 변형된 FAD2 유전자좌의 존재는 바람직한 것이다. 따라서, 식물은, 특히 본 발명에 따른 적어도 하나의 FAD2 유전자좌에서 부위-특이적 방식으로 후속적으로 통합되는 핵산 분자로 형질전환되고, 관련 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 경작 및 배양됨으로써 하나 이상의 목적하는 형질을 갖도록 조작될 수 있다.
VII. FAD2 성능 유전자좌에 통합된 핵산을 포함하는 트랜스제닉 식물의 마커-지원 육종
글리신 맥스에서 fad2에 연관된 (예를 들어, 긴밀하게-연관된) 분자 마커가 제공된다. 예를 들어, HO 형질에 관련된 서열 (fad2)을 함유하는 DNA 절편이 확인된다. 이들 절편은 게놈 연결 기의 돌연변이체 대립유전자에 연관된 (예를 들어, 긴밀하게-연관된) 마커 주위에 및 이들 사이에 위치한다. 따라서, 불활성화 돌연변이를 갖는 돌연변이체 FAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 부분적으로, 확인된 절편 및 그의 마커는 글리신 맥스 게놈에서의 연결 기에서 그의 위치에 의해 본 발명의 대상에 포함된다.
본원에 인용된 공개공보, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명백한 상세한 설명과 불일치하지 않는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 각 참고문헌이 참고문헌으로써 개별적으로 및 구체적으로 나타나고 그 전문이 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 포함된다. 본원에서 논의된 참고 문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공하는 것이다. 본 발명자들이 선행 발명으로 인해 이러한 개시내용에 대해 선행하는 권리가 없음을 용인하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 하기 실시예는 특정 특별한 특징 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 예시되어 있는 구체적인 특징 또는 실시양태로 본 개시내용을 제한하는 것으로 간주되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 5개의 대두 재배품종으로부터의 FAD2 표적 서열의 서열분석
서열분석 반응
게놈 DNA를 대두 조직으로부터 단리시켰다. 게놈 DNA를 재배품종 X5 및 웨스태그에 대한 동결건조된 배아 현탁액 세포로부터 및 재배품종 잭, 윌리암스 82 및 매버릭에 대한 어린 잎으로부터 단리시키고 정제하였다. 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 DNeasy 플랜트 미니 키트(DNeasy Plant Mini Kit)™ (퀴아젠(Qiagen); 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 추출하였다.
FAD2 2.3 및 2.6 유전자
FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 게놈 DNA 서열을 프라이머 MA49 (서열 1 caagggttccaaacacaaagcc) 및 MA51 (서열 2 catcaatacttgttcctgtacc) 또는 MA50 (서열 3 gaagaagcctctctcaagggttc) 및 MA51을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 게놈 DNA 서열을 1140 bp 유전자의 대략 염기 40 내지 1140의 단편에 대해 획득하였다. PCR 반응 조건은 초기 변성을 위해 98℃에서 1분, 이어서 98℃에서 30초, 60℃에서 15초, 72℃에서 3분의 35 사이클 및 72℃에서 5분 동안의 최종 연장이었다.
생성된 PCR 앰플리콘을 TE 완충제 (TE 완충제 중 1 μg) 중에 현탁시키고, 최대 순간 출력 140, 듀티 팩터 10%, 버스트당 200 사이클, 및 430초의 처리 시간의 세팅을 사용하여 코바리스 E220 시스템™ 소니케이터(Covaris E220 System™ sonicator) (코바리스(Covaris); 매사추세츠주 워번)를 사용하여 약 300 bp의 단편으로 전단시켰다. 일루미나(Illumina)™ (캘리포니아주 샌디에고) 쌍형성된-말단 서열분석 라이브러리를 제조업체의 추천 프로토콜에 따라 아폴로 324TM 오토메이션 시스템(Apollo 324TM Automation System)™ (인테겐엑스(IntegenX)) 상에서 PrepX DNA 라이브러리 키트™ (인테겐엑스; 캘리포니아주 플레젠튼)를 사용하여 제조하였다. 간략하게, 5' 또는 3' 오버행을 갖는 전단된 DNA 단편을 5' 인산화 평활 말단 DNA로 전환시켰다. 단일 아데닌 (A) 연장을 말단-복구된 DNA 단편의 3' 말단에 부가한 후, 인덱스된 일루미나™ 쌍형성된-말단 (PE) 어댑터에 라이게이션하였다. 마지막으로, 어댑터-라이게이션된 라이브러리 생성물을 로봇으로 검색하였고, 초기 변성을 위해 98℃에서 30초, 이어서 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 10 사이클 및 72℃에서 5분 동안의 최종 연장의 열순환 조건 하에 일루미나 TruSeq PCR™ 시약을 사용하여 PCR로 풍부화시켰다. 풍부화된 라이브러리를 2 nM으로 정규화시키고 풀링시켰다. 이어서 풀링시킨 라이브러리를 수산화나트륨으로 변성시키고, 미세크 플로우 셀(Miseq flow cell)™ (일루미나; 캘리포니아주 샌디에고) 상에 로딩하기 위해 혼성화 완충제 중에 6 pM으로 희석하였다. 6개의 인덱스 사이클을 사용하는 2x150 사이클 시행을 일루미나의 추천 프로토콜에 따라 미세크™ 상에서 수행하였다.
일루미나 미세크™ 기기로부터의 쌍형성된-말단 판독물을 생성하는 생성된 서열 반응물을 TruSeq 어댑터 시퀀스(TruSeq adapter sequences)™ (일루미나)에 대해 트리밍하였다. 트리밍 후, 판독물을 버로우스 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner) (BWA)를 사용하여 재배품종 윌리암스 82의 대두 참조 스캐폴드에 대해 맵핑하였다 (Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60).
각각의 대두 재배품종을 개별 샘플로서 처리하여, 각각의 재배품종의 서열분석 판독물을 개별적으로 맵핑하였다. 맵핑된 서열분석 판독물의 깊이가 0보다 큰 스캐폴드 상의 영역을 검사하였다. 이들이 앰플리콘으로부터의 서열분석 판독물이므로, 스캐폴드 상의 특정 영역만이 그들에 맵핑된 판독물을 갖는 것으로 예상되었다. 서열분석 판독물을 다양한 샘플에 걸쳐 대두 염색체 10 및 20에 대해 맵핑하였다. 각각의 샘플에 대해, 컨센서스 서열을 엠파일업(Mpileup) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 획득하였다. 이들 결과는 2개의 파라로그 추정 FAD 유전자에 대해 맵핑된 서열분석 판독물을 나타내었다. 생성된 서열 판독물을 정렬하여 재배품종 X5, 웨스태그, 잭, 윌리암스 82 및 매버릭으로부터 획득한 파라로그 추정 유전자 서열 사이의 SNP/변이를 확인하였다.
서열 정렬을 벡터 NTI 어드밴스 11.0 컴퓨터 프로그램 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스배드)으로부터의 얼라인X® 프로그램을 통해 만들고, 도 1 및 도 2에 제시하였다. 얼라인X®는 변형된 클러스탈 W 알고리즘을 이용하여 유사성 비교 및 주석달기를 위한 단백질 또는 핵산 서열의 다중 서열 정렬을 생성한다. 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 단리된 서열의 분석은 각각 FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 서열이 높은 수준의 서열 유사성을 공유하는 것을 나타냈다.
FAD2 2.3 유전자는 윌리암스 82 참조 게놈 서열 (서열 4)의 염색체 10 상의 염기 49,417,070 내지 49,418,219에 상응한다. 5종의 재배품종 (윌리암스 82, 잭, 매버릭, X5 및 웨스태그)으로부터의 유전자의 서열은 염기 41-1140 (사용한 프라이로 획득한 적용범위)과 동일하였다. FAD2 2.6 유전자는 윌리암스 82 참조 게놈 서열 (서열 9)의 염색체 20 상의 염기 34,178,330 내지 34,179,475에 상응한다. 서열 차이는 윌리암스 82 참조 서열에 대한 X5 서열에서 위치 233 (C>T), 352 (A>G), 633 (C>T), 645 (T>C), 658 (T>C), 894 (A>G)에서 확인하였다. 매버릭은 위치 352 및 894에서 X5와 동일한 염기를 변화를 가지고 있었다.
실시예 2: FAD2 유전자에 특이적인 아연 핑거 결합 도메인의 설계
FAD2 유전자 유전자좌의 다양한 기능적 서열을 코딩하는 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 이전에 기재된 바와 같이 설계하였다. 예를 들어, 문헌 [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651]을 참조한다. 예시적인 표적 서열 및 인식 나선은 표 1 (표적 부위) 및 표 2 (인식 나선 영역 설계)에 제시된다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 표적 부위는 FAD2의 표적 부위에 결합하도록 설계하였다. FAD2 아연 핑거 설계를, CCHC 구조의 핑거를 적어도 하나 갖는 단백질을 코딩하는 아연 핑거 발현 벡터에 도입하였다. 미국 특허 공보 번호 2008/0182332를 참조한다. 특히, 각 단백질에서 마지막 핑거는 인식 나선에 대해 CCHC 백본을 갖는다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을 4개의 아미노산 ZC 링커 및 제아 메이스(Zea mays)로부터 유래된 opaque-2 핵 국재화 신호를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합시켜 FAD2 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하였다. 야생형 FokI 및 eHF-FokI 도메인 (미국 특허 공개공보 번호 20110201055 참조) 둘 다로 ZFN 1내지 3을 구축한 반면, 단독의 eHF-FokI 도메인은 ZFN 4 내지 7에서 사용하였다.
FAD2 2.3 및 2.6 설계된 ZFN의 활성을, 가장 높은 활성을 갖는 ZFN을 확인하기 위해 DLSSA 검정 (미국 특허 출원 공개 번호 20110301073 참조)에서 시험하였다. ZFN에 의해 포유동물 세포 내로 클로닝된 관련된 FAD2 2.3 및 2.6 서열의 절단을 평가하였다 (도 3). 활성을 고도의 활성인 참조 ZFN과 비교하였고 (8266:8196); 기저 활성을 나타내었다.
표 1: FAD2 아연 핑거의 표적 부위
Figure 112015032527201-pct00002
표 2: ZFN 결합 부위에 대한 ZFN 단량체의 FAD2 아연 핑거 설계
Figure 112015032527201-pct00003
실시예 3: 아연 핑거 뉴클레아제 및 공여자 구축물
ZFN 구축물
실시예 2에 기재된 바와 같이, 검정을 이용하여 확인된, 예시적인 아연 핑거 뉴클레아제의 ZFN 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터를 설계하고 완성하였다.
각각의 아연 핑거-코딩 서열을 아연 핑거 뉴클레아제의 상류에 위치한, opaque-2 핵 국재화 신호를 코딩하는 서열에 융합시켰다 (Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532). 이어서, opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열과 상보적 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열의 쌍을 형성하였다. 이에 따라, 각 구축물은 토세아 아시그나 바이러스로부터의 2A 서열에 의해 분리된 2개의 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열을 포함하는 단일 오픈 리딩 프레임으로 이루어졌다 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127). 융합 단백질의 발현은 상대적으로 강한 구성적 프로모터, 예컨대 카사바 베인 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터로부터 유래되고 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR)에 의해 플랭킹된 프로모터에 의해 구동된다.
벡터를 인-퓨전(In-FUSION)™ 어드밴티지 테크놀로지(Advantage Technology) (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 어셈블리하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) (NEB; 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하고, T4 DNA 리가제 (인비트로젠)를 DNA 라이게이션에 사용하였다. 플라스미드 제조는 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (마슈레-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.), 펜실베니아주 베들레헴) 또는 플라스미드 미디 키트 (퀴아젠)를 공급업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. DNA 단편을 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. 모두 어셈블리된 플라스미드의 콜로니를 처음에 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적인 서열분석 공급원 (유로핀스 MWG 오페론(Eurofins MWG Operon), 알라배마주 헌츠빌)에서 서열분석하였다. 서열 데이터를 어셈블리하고, 시퀀셔™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corp.), 미시간주 앤 아버)를 이용하여 분석하였다.
글리신 맥스 원형질체로 전달하기 전에, 플라스미드 DNA를 이. 콜라이의 배양물로부터 퓨어 일드(Pure Yield) 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시 키트® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 공급업체의 지침에 따라 사용하여 제조하였다.
생성된 11개의 플라스미드 구축물; pDAB115603 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37354 및 ZFN37355 구축물), pDAB115600 (야생형 FokI을 갖는 ZFN37354 및 ZFN37355 구축물), pDAB115605 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37370 및 ZFN37371 구축물), pDAB115601 (야생형 FokI을 갖는 ZFN37370 및 ZFN37371 구축물), pDAB115606 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37374 및 ZFN37375 구축물), pDAB115604 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37366 및 ZFN37367 구축물), pDAB115607 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37384 및 ZFN37385 구축물), pDAB115602 (야생형 FokI을 갖는 ZFN37384 및 ZFN37385 구축물), pDAB115609 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37398 및 ZFN37399 구축물), 및 pDAB115608 (eHF-FokI을 갖는 ZFN37392 및 ZFN37393 구축물)을 제한 효소 소화를 통해 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
공여자 구축물
FAD2 공여자 벡터를 높은 카피 플라스미드 벡터 내에서 합성된 신생 선형 조각과 조합시킴으로써 구축하였다. pDAB115620 (도 4) 및 pDAB115622 (도 5)를 대두 게놈의 FAD2 유전자좌 내에서 공여자 통합에 사용하였다. 공여자 벡터 둘 다를 아연 핑거 뉴클레아제 결합 도메인을 함유하도록 합성하였다. pDAB115620 ("공여자 1")은 37354:37355 ZFN 결합 도메인, 37366:37367 ZFN 결합 도메인, 37370:37371 ZFN 결합 도메인 및 37374:37375 ZFN 결합 도메인을 포함한다. pDAB115622 ("공여자 2")는 37384:37385 ZFN 결합 도메인, 37392:37393 ZFN 결합 도메인 및 37398:37399 ZFN 결합 도메인을 포함한다. ZFN 결합 도메인은 상응하는 발현된 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되고, 공여자 벡터 및 아연 핑거 뉴클레아제 벡터를 갖는 식물 세포에서의 공-형질전환 동안 절단된다.
실시예 4: 대두 원형질체의 형질전환
대두 (예를 들어, 글리신 맥스 c.v. 매버릭) 원형질체-기반 형질전환 방법을 개발하였다. 원형질체를 잎 체외이식편으로부터 생성된 캘러스로부터 유래하는 매버릭 현탁액 배양물로부터 단리시켰다. 하기 기재된 기술은 방법을 기재한다.
배양 유지
대두 세포 현탁액을 3% (w/v) 수크로스, 0.5 mg/L 2,4-D 및 박토아가(bactoagar) 7 g, pH 5.7을 함유하는 새로운 LS 배지 (Linsmaier and Skoog 1965)의 1:5 희석액에 의해 7일마다 계대배양하였다. 모든 실험은 하기 기재된 프로토콜에 기반하여 계대배양 7일 후에 시작하여 수행하였다.
원형질체 단리
계대배양 7일 후의 매버릭 현탁액 배양물 30 밀리리터를 50 ml 원추형 원심분리 튜브로 이동시키고, 200g로 3분 동안 원심분리시켜 튜브당 침강된 세포 부피 (SCV) 약 10 ml를 수득하였다. 상청액을 세포 펠릿을 분열시킴 없이 제거하였다. MMG 용액 (4 mM MES, 0.6 M 만니톨, 15 mM MgCl2, pH 6.0) 중 효소 용액 (0.3% 펙톨리아제 (320952; MP 바이오메디칼스), 3% 셀룰라제 ("오노즈카(Onozuka)" R10™; 야쿠르트 파마슈티칼스(Yakult Pharmaceuticals), 일본) 20 밀리리터를 현탁 세포의 4 SCV마다 첨가하였고, 튜브를 파라필름™으로 포장하였다. 튜브를 밤새 플랫폼 로커에 위치시켰다 (약 16-18시간). 다음날 아침, 소화된 세포의 분취액을 현미경으로 관찰하여 세포벽의 소화가 충분하게 되었음을 확인하였다.
원형질체 정제
세포/효소 용액을 100 μM 세포 스트레이너를 통해 천천히 여과시켰다. 세포 스트레이너를 W5+ 배지 (1.82 mM MES, 192 mM NaCl, 154 mM CaCl2, 4.7 mM KCl, pH 6.0) 10 ml로 헹구었다. 여과 단계를 70 μM 스크린을 사용하여 반복하였다. 최종 부피를 W5+ 배지 10 ml를 첨가함으로써 40 ml로 만들었다. 튜브를 역전시킴으로써 세포를 혼합하였다. 원형질체는 세포를 함유하는 50 ml 원추형 원심분리 튜브의 하부에 쿠션 용액을 첨가함으로써 수크로스 쿠션 용액 (500 mM 수크로스, 1 mM CaCl2, 5 mM MES-KOH, pH 6.0) 8 ml 상에 천천히 층상화되었다. 튜브를 흔들리는 버킷 로터에서 15분 동안 350 g로 원심분리하였다. 5 ml 피펫 팁을 사용하여 원형질체 밴드 (약 7-8 ml)를 천천히 제거하였다. 이어서, 원형질체를 50 ml 원추형 튜브로 이동시키고, W5+세척액 25 ml를 첨가하였다. 튜브를 천천히 역전시키고, 200 g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, MMG 용액 10 ml를 첨가하고, 튜브를 천천히 역전시켜 원형질체를 재현탁시켰다. 원형질체 밀도를 혈구 계수법 또는 유동 세포측정기를 사용하여 결정하였다. 전형적으로, 세포 현탁액 4 PCV로 약 2백만개 원형질체를 수득하였다.
PEG를 사용한 원형질체의 형질전환
원형질체 농도를 MMG를 사용하여 1.6백만개/ml로 조절하였다. 300 μl의 원형질체 분취액 (약 500,000개의 원형질체)을 2 ml 멸균 튜브 내로 이동시켰다. 원형질체 현탁액을 튜브 내로 원형질체를 이동시키는 동안 정기적으로 혼합하였다. 플라스미드 DNA를 실험 설계에 따라 원형질체 분취액에 첨가하였다. 원형질체의 튜브를 함유하는 랙을 DNA 및 원형질체를 혼합하기 위해 각 1분 동안 3 회 천천히 역전시켰다. 원형질체를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 4000) 용액 300 마이크로리터 (40% 에틸렌 글리콜 (81240-시그마 알드리치), 0.3 M 만니톨, 0.4 M CaCl2)를 원형질체에 첨가하고, 튜브의 랙을 1분 동안 혼합하고, 인큐베이션 동안 2회 부드럽게 역전시키면서 5분 동안 인큐베이션하였다. W5+ 1 밀리리터를 천천히 튜브에 첨가하고, 튜브의 랙을 15-20회 역전시켰다. 이어서, 튜브를 5분 동안 350 g로 원심분리하고, 상청액을 펠릿의 분해 없이 제거하였다. WI 배지 (4 mM MES 0.6 M 만니톨, 20 mM KCl, pH 6.0) 1 밀리리터를 각각 튜브에 첨가하고, 랙을 부드럽게 역전시켜 펠릿을 재현탁시켰다. 랙을 알루미늄 호일로 덮고, 기울여놓고 23℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
형질전환 빈도 측정 및 원형질체 수확
원형질체 및 형질전환 효율의 정량화는 양자 유동 세포측정기™ (베크만-쿨터 인크(Beckman-Coulter Inc))를 사용하여 측정하였다. 형질전환 대략 16-18시간 후, 각각의 반복으로부터 100 μl를 샘플링하고, 96 웰 플레이트에 놓고, WI 용액을 사용하여 1:1로 희석시켰다. 반복한 것을 3회 재현탁시키고, 100 μl를 유동 세포측정법을 사용하여 정량화하였다. 분석을 위한 샘플을 제공하기 전에, 샘플을 5분 동안 200 g로 원심분리시키고, 상청액을 제거하고, 샘플을 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 이어서, 샘플을 분자 분석을 위해 처리할 때까지, -80℃ 동결기에 두었다.
실시예 5: 아연 핑거 뉴클레아제 절단 및 공여자 통합
설계된 ZFN을 상기 기재된 형질전환 방법론을 사용하여 대두 원형질체로 형질전환시켰다. FAD2 유전자좌에 대한 절단 효율을 미국 가특허 출원 번호 61/736,856에 기재된 바와 같이 유전자좌 분열 검정을 통해 다양한 ZFN에 대해 평가하였다. 또한, FAD2 유전자좌 내의 공여자 서열의 아연 핑거 뉴클레아제-매개 통합을 인-아웃 PCR 검정을 통해 평가하였고, 생성된 PCR 앰플리콘을 서열분석하여 대두 게놈 내로의 공여자 통합을 특성화하였다.
공여자 벡터 단독, ZFN 벡터 단독 또는 조합된 ZFN 및 공여자 벡터를 함유하는 처리군으로 실험을 구성하였다 (표 3). 또한, 실험은 비형질전환된 세포 또는 CsVMV 프로모터에 의해 수행되고, 높은 카피수 플라스미드 내의 AtuORF24 3'-UTR에 의해 플랭킹된 GFP 발현 카세트를 포함하는 대조군 벡터 pDAB7221 (도 6)로 형질전환된 세포의 음성 대조 처리군을 포함하였다. 형질전환된 샘플을 형질감염 대략 18-24시간 후에 수확하였다. 실험 데이터는 ZFN 플라스미드 pDAB115601의 높은 활성을 입증하였고, 상기 ZFN 플라스미드를 모든 하위서열 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
표 3에 상세히 설명된 바와 같이, 형질전환 실험은 DNA의 총 농도를 80 μg으로 만들기 위해 필요한 대로 첨가되는 플라스미드 pDAB7221과 함께 DNA 총 80 μg을 함유하였다. 공여자 벡터 대 ZFN-발현 플라스미드의 비는 대략 10:1이었다. 각각의 실험 또는 처리는 독립적으로 처리되고 분석되는 6번의 실험 반복으로 이루어졌다. ZFN을 평가하는 실험을 양성 대조군으로서 모든 최종 실험에서 사용한 ZFN 플라스미드 pDAB115601을 사용하여 2개의 실험 세트로 수행하였다.
표 3: 실험 설계. ZFN 플라스미드를 2개의 세트 (F2 ZFN 1-3 및 F2 ZFN 4-7)에서 평가하였다. ZFN 플라스미드에 적절한 공여자 벡터를 시험하였고, 표적화 실험에 사용하였다. 각각 처리를 위해 6회 반복을 수행하였다.
Figure 112015032527201-pct00004
Figure 112015032527201-pct00005
표적화의 분석
표적화 실험으로부터의 DNA 샘플을 유전자좌 분열 검정을 사용하여 분석하여 FAD2 ZFN 절단 부위에서의 변형을 측정하거나 또는 NHEJ에 의한 표적화를 평가하였다. FAD2 표적에서 무손상 ZFN 결합 부위를 측정하기 위해 qPCR 검정을 설계하였다. ZFN 매개된 공여자 삽입 또는 절단 후 NHEJ 복구는 ZFN 결합 부위의 손실 및 검출가능한 qPCR 신호에서의 후속적인 감소를 유발한다. 유의한 절단 활성을 보유하는 ZFN은 공여자 단독 처리와 비교하여 감소된 신호를 갖는 앰플리콘의 생산을 유발한다. 유전자좌 분열 검정에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 4에 제공되고, FAD2 유전자좌 상의 그의 관련된 위치는 도 7에 나타낸다.
결과를 비처리 대두 세포에서의 무손상 FAD2 유전자좌로부터 획득된 신호와 비교하였다. 적절한 공여자 벡터의 존재 하에 FAD2 2.3 ZFN2_WT ZFN (실험 둘 다) 및 FAD2 2.6 ZFNs ZFN4_HF (하나의 실험) 및 F2 ZFN5_HF (실험 둘 다)를 사용한 원형질체의 처리는 무손상 서열 (공여자 단독)로부터 획득한 것과 비교하여 통계적으로 유의하게 더 낮은 신호를 유도하였다.
표 4: 분열 PCR에 대한 프라이머 및 프로브
Figure 112015032527201-pct00006
Figure 112015032527201-pct00007
유전자좌 특이적 인 -아웃 PCR
표적화 공여자 삽입을 확인하기 위해, 모든 처리로부터의 DNA를 유전자좌-특이적 인-아웃 PCR 검정에 적용하였다. 실험에서 공여자 벡터를 FAD2 유전자좌 내에서의 표적화 통합에 대해 시험되는 모든 ZFN에 대한 결합 부위를 함유하도록 설계하였다. 대두 세포 내로의 ZFN 및 공여자의 공-전달은 표적 및 공여자 벡터에서의 ZFN 결합 부위의 절단 및 비-상동 말단-연결 메카니즘을 통해 절단된 FAD2 유전자좌 내로의 후속적인 공여자의 통합을 유도하였다. ZFN 절단에 의해 생성된 FAD2 염색체 부위의 말단 및 선형화 공여자 벡터는 FAD2 유전자좌 내로의 통합 전에 프로세싱을 겪고, 불완전한 말단 연결 생성물을 생성할 수 있다. 표적에서의 표적화된 통합의 확인을 "아웃(Out)" 프라이머가 고유 게놈 유전자좌에서의 서열을 인식하고, "인(In)" 프라이머가 공여자 DNA 내의 서열에 결합하는 "인-아웃" PCR 전략에 기초하여 수행하였다. 인-아웃 PCR 검정을 삽입 접합부의 5'- 및 3'-말단 양쪽 상에서 수행하였다.
시험된 모든 ZFN은 공여자 및 ZFN 샘플에서 PCR 생성물에 의해 결정된 바와 같이 적어도 한 실험에서의 FAD2 대두 유전자좌 내로의 공여자 단편의 표적화 및 통합의 일부 증거를 나타내었다. 다음 ZFN; F2 ZFN2_WT, F2 ZFN2_HF 및 F2 ZFN4_HF를 사용하여 표적화하는 통합된 공여자의 결과는 5'- 및 3'-말단 양쪽에서 6번의 실험 반복 중 적어도 2번에서 생산된 PCR 생성물로서 재생산가능하였다 (표 5).
표 5: 대두 원형질체에서 FAD2 유전자좌에서의 NHEJ 표적화의 개요. 독립적인 표적화 실험에서 인-아웃 PCR에 대해 양성인 반복 횟수를 실험 또는 처리에 대해 나타내었다.
Figure 112015032527201-pct00008
인-아웃 PCR 생성물의 서열분석
pDAB1115620 및 F2 ZFN2_WT 또는 pDAB1115620 및 F2 ZFN2_HF로 완료된 각각의 인-아웃 PCR 표적화 실험으로부터의 앰플리콘 중 2개 (예상한 크기의)를 플라스미드 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 생어 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하였다. FokI 절단으로부터 생성되는 것으로 예측되는 단일-가닥 4 bp 말단이 말단의 모든 가능한 조합을 나타내도록 반복한 서열을 참조 서열로 정렬시켰다. 10개의 특유의 서열 패턴을 획득한 23개의 클로닝된 서열로부터 발견하였다 (도 8). 모든 서열 패턴은 ZFN 결합 부위 (GAAATTTC) 사이에 위치한 FAD2 게놈 참조 서열의 일부를 유지하였지만, 서열 패턴은 또한 FAD2 게놈 참조 서열과 비교하여 결실을 보유하였다. 서열 4WT1 및 4WT4는 GAAATTTC 서열의 3' 말단 상의 ZFN 결합 부위 내로 연장된 결실을 함유하였다. 2개의 서열 1HF4 및 6HF4는 단일-염기 삽입을 가지고 있었다. 관찰된 DNA 서열 패턴은 대두 FAD2 유전자좌 내로 공여자 DNA의 표적화가 발생하는 것을 입증한다.
특정의 예시적인 실시양태가 본원에 기재되어 있으며, 통상의 기술자는 예시적 실시양태에 대한 다수의 추가, 제거 및 변형이 하기 청구범위의 범주에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 인식하고 이해할 것이다. 또한, 한 실시양태로부터의 특징은 또 다른 실시양태의 특징과 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DOW AGROSCIENCES LLC <120> FAD2 PERFORMANCE LOCI AND CORRESPONDING TARGET SITE SPECIFIC BINDING PROTEINS CAPABLE OF INDUCING TARGETED BREAKS <130> 8326-4012.40 <140> PCT/US2013/058299 <141> 2013-09-05 <150> 61/697,886 <151> 2012-09-07 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 caagggttcc aaacacaaag cc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 catcaatact tgttcctgta cc 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 gaagaagcct ctctcaaggg ttc 23 <210> 4 <211> 1100 <212> DNA <213> Glycine max <400> 4 ggaagaagcc tctctcaagg gttccaaaca caaagccacc attcactgtt ggccaactca 60 agaaagcaat tccaccacac tgctttcagc gctccctcct cacttcattc tcctatgttg 120 tttatgacct ttcatttgcc ttcattttct acattgccac 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ctga 34 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 tgagtgtgat gagaagagaa gcagcc 26 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 87 agcaagtacc catgggttga tgatgttatg 30 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 ttggtttggc tgctatgtgt ttatgg 26 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 tgtggcattg tagagaagag atggtgag 28 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 90 agggagcttt ggcaactatg gacagagatt at 32 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 agccttcaat gtctctggca gaccct 26 <210> 92 <211> 26 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Synthetic oligonucleotide <400> 119 ttactctctc taccgtgttg caaccctgaa atttcagggt tgcaacacgg tagagagagt 60 aa 62 <210> 120 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 ttactctctc taccgtgttg caaccctgat cagggttgca acacggtaga gagagtaa 58 <210> 121 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 ttactctctc taccgtgttg caaccctgaa agggttgcaa cacggtagag agagtaa 57 <210> 122 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 ttactctctc taccgtgttg caaccctgag gttgcaacac ggtagagaga gtaa 54 <210> 123 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 ttactctctc taccgtgttg caaccctgaa 30 <210> 124 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 ttactctctc taccgtgttg caaccctgat ttcagggttg caacacggta gagagagtaa 60 <210> 125 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 ttactctctc taccgtgttg caaccctgat tcagggttgc aacacggtag agagagtaa 59 <210> 126 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 ttactctctc taccgtgttg caaccctatt cagggttgca acacggtaga gagagtaa 58 <210> 127 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 ttactctctc taccgtgttg caaccctgat tcagggttgc aacacggtag agagagtaa 59 <210> 128 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 ttactctctc taccgtgttg caaccctgaa tcagggttgc aacacggtag agagagtaa 59 <210> 129 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Claims (18)

  1. 외인성 서열을 대두 세포 내 지방산 데새투라제 2(FAD2) 유전자로 통합시키는 방법으로서, 상기 방법은 FAD2 유전자 내 서열 14-20 중 어느 하나로 나타내어지는 표적 부위에 결합하는 뉴클레아제를 사용하여, 대두 세포 내 FAD2 유전자를 절단함에 따라 FAD2 유전자에 파단을 생성하는 것을 포함하고, 여기서 FAD2 유전자는 서열 4로 나타내어지는 FAD2 2.3 유전자 또는 서열 9로 나타내어지는 FAD2 2.6 유전자 또는 둘 다를 포함하고, 여기서 외인성 서열은 FAD2 유전자 내의 파단에 통합되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, FAD2 유전자가 FAD2 2.3, FAD2 2.6 유전자, 또는 둘 다인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 뉴클레아제가 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함하고, 여기서 DNA-결합 도메인은 표적 부위에 특이적으로 결합하고, 표적 부위 내를 절단함으로써 파단을 생성하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, DNA-결합 도메인이 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 류신 지퍼 DNA-결합 도메인, 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) DNA-결합 도메인, CRISPR-Cas9 뉴클레아제 시스템의 단일 가이드 RNA, 레콤비나제, 아연 핑거 단백질 DNA-결합 도메인 및 상기 DNA-결합 도메인의 키메라 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인이 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인, FokI 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인, StsI 엔도뉴클레아제로부터의 절단 절반-도메인, Cas 단백질 및 귀소성 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제인 방법으로서, 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 단백질이 하기 표의 단일 열로 정리하여 나타낸 인식 나선 영역을 포함하는 것인 방법.
    Figure 112019086466330-pct00021
  7. 제1항에 있어서, 서열 4로 나타내어지는 FAD2 2.3 및 서열 9로 나타내어지는 FAD2 2.6의 모든 카피가 아닌 일부 카피가 절단되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 관심 핵산 서열이 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 도메인, 하나 이상의 살곤충 저항성 유전자, 하나 이상의 제초제 내성 유전자, 하나 이상의 질소 이용 효율 유전자, 하나 이상의 물 이용 효율 유전자, 하나 이상의 영양 품질 유전자, 하나 이상의 DNA 결합 유전자, 하나 이상의 선택 마커 유전자 및 그의 조합을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 대두 세포가 FAD2 2.3 및 FAD2 2.6 유전자 중 적어도 하나의 하나 이상의 카피 내로 통합된 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있도록, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 방법에 따라 변형된 대두 세포를 포함하는 대두 식물로서, FAD2 2.3 유전자는 서열 4 또는 그의 동조체 또는 파라로그로 나타내어지고, FAD2 2.6 유전자는 서열 9 또는 그의 동조체 또는 파라로그로 나타내어지는 것인 식물.
  10. 제9항에 있어서, 핵산 서열이 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 부위 내로 통합되는 것인 식물.
  11. 서열 14 내지 서열 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 표적 부위에 결합하는, 대두 세포 내 FAD2 유전자를 변형시키는데 사용하기 위한 부위 특이적 아연 핑거 뉴클레아제로서, FAD2 유전자는 서열 4로 나타내어지는 FAD2 2.3 유전자 또는 서열 9로 나타내어지는 FAD2 2.6 유전자 또는 둘 다이고, 여기서 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개의 아연 핑거 도메인을 포함하고, 각각의 아연 핑거 도메인은 인식 나선 영역을 포함하며, 여기서 아연 핑거 단백질은 하기 표의 단일 열로 정리하여 나타낸 인식 나선 영역을 포함하는 것인 아연 핑거 뉴클레아제.
    Figure 112019086466330-pct00022
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KR1020157008551A 2012-09-07 2013-09-05 Fad2 성능 유전자좌 및 표적화 파단을 유도할 수 있는 상응하는 표적 부위 특이적 결합 단백질 KR102147006B1 (ko)

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