JP2015527082A - Ｆａｄ２性能座および標的化切断を誘導することができる対応する標的部位特異的結合タンパク質 - Google Patents

Ｆａｄ２性能座および標的化切断を誘導することができる対応する標的部位特異的結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の位置を切断して、ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こし、次いで場合により対象となる核酸分子を破壊に組み込むことによる、ＦＡＤ２座中の遺伝子破壊、遺伝子編集または遺伝子スタッキングのための方法および組成物が開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、これによりその開示の全体が参照により組み込まれる、２０１２年９月７日出願の米国仮特許出願第６１／６９７，８８６号の利益に対する優先権を主張するものである。
本開示は、概して組換え植物技術に使用するため（例えば、トランスジェニック植物を産生するため）の組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、対象となる任意の核酸の部位特異的導入に使用され得るゲノム中の座を含む植物細胞および植物に関する。
多くの植物が、例えば、農業的価値を改善するために、望ましい形質を導入するために外因性核酸（例えば、導入遺伝子）で遺伝的に形質転換されている。遺伝子形質転換を通して達成され得る農業的価値の改善の例は、改善した栄養価、増加した収量、有害生物または病気耐性、乾燥およびストレス耐性、改善した園芸品質（例えば、改善した色素沈着および／または成長）、除草剤耐性、植物からの産業上有用な化合物および／または材料の製造、ならびに／或いは医薬品の製造を含む。クローニング遺伝子の植物細胞への導入および安定な繁殖可能なトランスジェニック植物の回収が、植物の遺伝子修飾を複数世代を通して安定にし、それによって作物植物の遺伝子操作を可能にするために使用され得る。
遺伝子形質転換およびトランスジェニック植物産生のための方法では、外因性ＤＮＡが真核植物細胞の核またはプラスミドＤＮＡに典型的にはランダムに導入され、引き続いて組み込まれた外因性ＤＮＡを含む細胞が単離され、その後安定に形質転換した植物が再生される。トランスジェニック植物は、典型的にはアグロバクテリウム媒介形質転換技術によって産生された。これらの技術での成功が、対象となる核酸分子を植物のゲノムに導入するための他の方法、例えば、プロトプラストへのＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、微粒子銃およびケイ素ウィスカー媒介形質転換の開発を刺激した。
しかしながら、これらの植物形質転換法の全てにおいて、植物ゲノムに組み込まれる外因性核酸は、植物細胞のゲノムにランダムに、かつ予測不可能なコピー数で組み込まれる。Terada et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnology J.6(1):93。 例えば、導入遺伝子はしばしば、導入遺伝子全体またはその一部の配列反復の形態で組み込まれる。このような複雑な組込みパターンは、一般的に（例えば、転写後遺伝子サイレンシング機構を通した転写ＲＮＡの破壊により、または組み込まれたＤＮＡのメチル化の誘導により）組み込まれた核酸の発現レベルに悪影響を及ぼす。また、組込み部位の位置が一般的に組み込まれた核酸の発現レベルに影響を及ぼす。さらに、外因性ＤＮＡの組込みは、組込みが起こるゲノムの領域に破壊的効果をもたらし、それによって標的領域の正常な機能に影響を及ぼすまたはこれを妨害して望ましくない副作用をもたらし得る。前記を含む因子の組み合わせは、同じ方法によって作成されたものでさえ、異なるトランスジェニック植物細胞と植物系統との間で導入遺伝子または外因性ＤＮＡの発現レベル（および農学的品質全体）における広い変動をもたらす。組込みがランダムであるために、これらの効果は専門家によって制御され得ないが、専門家は望ましい特性を有する新規な植物を産生しようと試みている。
前記の考慮は、特定の外因性核酸を植物に導入することの効果が調査される場合はいつでも、有意な結果を得るために、多数のトランスジェニック植物系統が産生および分析されなければならないことを要する。同様に、所望の表現型を有するトランスジェニック植物を提供するための特定の組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物の産生においては、核酸の最適な発現を有する、ならびにトランスジェニック植物の表現型および性能全体への副作用が最小であるまたは無い植物系統の選択を可能にするために、大集団の独立に作成されたトランスジェニック植物系統が作成されなければならない。これらの実際的な考慮は、複数の外因性核酸を挿入することによって（例えば、遺伝子スタッキング）作成されるトランスジェニック植物においてさらなる重要性を帯びる。このような植物では、現象、例えば、転写後遺伝子サイレンシングが増幅され得る。
植物への導入遺伝子挿入を制御しようとしていくつかの方法が開発されてきた。例えば、Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9を参照されたい。これらの方法は、原核生物と下等真核生物の両方でうまく適用されてきた相同組換えに基づく導入遺伝子組込みに頼るものである。Paszkowski et al.(1988) EMBO J.7:4021-6。しかしながら、植物では近年まで、導入遺伝子組込みのための支配的機構は、組換えＤＮＡ鎖間の相同性をほとんど伴わない非正統的組換えに基づいてきた。そのため、この分野での主な課題は、非正統的組換えを介したずっと効率的な組込みイベントによって隠されている、まれな相同組換えイベントの検出および選択的産生である。さらに、標的化された相同組換えイベントの選択的産生および検出が達成されたとしても、この戦略の最大の利益を実現するために、このイベントが宿主ゲノム中の望ましい位置に標的化されなければならない。
例えば、標的化された遺伝子形質転換の想定される利益は、ランダムな組込みから得られる形質転換イベントと比べた、導入遺伝子発現のイベント間変動性の減少である。さらなる想定される利益は、導入された核酸をスクリーニングし、形質転換構築物をソートし、得られたトランスジェニック植物の望ましい特徴全体に寄与するイベントをもたらすために要求されるイベントの数の有意な減少である。これらの利益を実現するために要求される重要な因子は、導入遺伝子性能が一貫しており、可能であれば宿主植物に対する有害効果が排除または最小化されるゲノム中の特異的位置の同定である。
近年、ゲノムＤＮＡの標的化切断のための方法および組成物が記載されている。例えば、標的化突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、かつ所定の染色体座において標的化組換えおよび組込みを促進するために、このような標的化切断イベントが使用され得る。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が参照により組み込まれる、Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；第２００５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明細書；第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２００９０２６３９００号明細書；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７８０５号明細書；第２０１１０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細書；第２０１１０８９７７５号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１０１４５９４０号明細書；および国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットを参照されたい。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化物質様作動因子ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用、または特異的切断を導くために操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を通して起こり得る。米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書は、植物ゲノムの標的化修飾のための非標準ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載しており；米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書は、植物ＥＰＳＰＳ座のＺＦＮ媒介標的化修飾を記載しており；米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書は、植物Ｚｐ１５座の標的化修飾を記載しており、米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書は、脂肪酸生合成に関与する植物遺伝子の標的化修飾を記載している。さらに、Moehle et al.(2007) Proc.Natl.Acad, Sci.USA 104(9):3055-3060は、特定の座における標的化遺伝子付加のための設計されたＺＦＮの使用を記載している。米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号明細書は、ホモ接合型二倍体生物を作成する方法を記載している。
しかしながら、ＦＡＤ２座において所望の導入遺伝子が標的化挿入された植物の産生を含む、植物のＦＡＤ２遺伝子の発現を修飾および／または調節するための組成物および方法が依然として必要とされている。
米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書 米国特許出願公開第２００９０２６３９００号明細書 米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号明細書 米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号明細書 米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書 米国特許出願公開第２０１１０８９７７５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号明細書 国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレット 米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書 米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書 米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書 米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書 米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号明細書
Terada et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1030 Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846 D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnology J.6(1):93 Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9 Paszkowski et al.(1988) EMBO J.7:4021-6 Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51 Moehle et al.(2007) Proc.Natl.Acad, Sci.USA 104(9):3055-3060
本開示は、（例えば、植物、藻類および真菌類において）ＦＡＤ２遺伝子の発現を調節するための組成物および方法、ならびに対象となる核酸配列（例えば、外因性核酸配列）の宿主細胞への標的化組込みのための部位としてのこれらの座の使用を記載する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、そのいずれかまたは全てが選択的に修飾および／または破壊され得る１つまたはそれ以上のＦＡＤ２配列（例えば、ホモログまたはパラログ）を含む１つまたはそれ以上のゲノムを含み得る。具体的な例では、本開示が、ダイズ（Glycine max）（例えば、ダイズ栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２、Ｘ５、ＷｅｓｔａｇおよびＭａｖｅｒｉｃｋ）のＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６遺伝子、ならびに対応するホモログまたはパラログ、ならびに対象となる核酸配列の標的化組込みのための座としてのその使用を記載する。本明細書に記載されるように、ＦＡＤ２遺伝子は宿主の脂肪酸生合成に関与しているが、（例えば、ＦＡＤ２コード配列への外因性核酸の組込みによる）修飾または破壊は、結果として生じる宿主生物に予想外に全く有害効果をもたらさないまたは最小の有害効果しかもたらし得ない。
また、本明細書においては、ＦＡＤ２座において特異的核酸配列の切断および／または組込みを行うことができるポリペプチドと協力した１つまたはそれ以上の特定のＦＡＤ２座の使用も記載される。ＦＡＤ２座の切断および／または組込みを行うことができるポリペプチドと協力したＦＡＤ２座の使用の例は、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ロイシンジッパー、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓおよび当業者に公知のその他のものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。特定の例は、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインポリペプチドおよび切断ドメインポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）を含むキメラ（「融合」）タンパク質、例えば、ジンクフィンガーポリペプチドおよびＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチドを含むＺＦＮタンパク質を含む。例えば、本明細書においては、対応するホモログまたはパラログを切断することなく、ＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６遺伝子ならびにこれらの組み合わせにおける二本鎖切断を結合および誘導するよう設計された特定のＺＦＮのインビトロおよびインビボでの有効性および特異性の証明が記載される。いくつかの実施形態では、宿主の農学的性能に及ぼす有害な影響が最小限でありながら、その後宿主中で発現される対象となる核酸の部位特異的組込みを行うために、特定のＦＡＤ２座が前記ポリペプチドのいずれかと共に使用され得る。
特定の態様では、本明細書において、ＦＡＤ２遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが記載される。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドが、標的化二本鎖切断を誘導し得る、および／または切断部位での対象となる核酸の組換えを促進し得るように、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたはハーフドメイン（例えば、ＺＦＮ、リコンビナーゼ、トランスポサーゼ、または修飾ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含むホーミングエンドヌクレアーゼを含むホーミングエンドヌクレアーゼ）、ならびに／或いはリガーゼドメインを含んでもよい。特定の実施形態では、ＦＡＤ２座を標的化するＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ切断機能ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、外因性核酸を、１つまたはそれ以上のＦＡＤ２座で宿主生物（例えば、植物または動物種）のゲノムに導入するために前記ポリペプチドが使用され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、１つまたはそれ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくはそれ以上のジンクフィンガー）を含み、ＦＡＤ２遺伝子中の任意の配列に結合するよう操作され得る（自然には起こらない）ジンクフィンガータンパク質を含む。本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、標的遺伝子のコード配列中または隣接配列（例えば、プロモーターもしくは他の発現要素）中の標的部位に結合し得る。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質が、例えば、表１に示されるように、ＦＡＤ２遺伝子中の標的部位に結合する。代表的なＦＡＤ２結合ジンクフィンガーの認識ヘリックス領域が表２に示される。ジンクフィンガータンパク質の構成ジンクフィンガー結合ドメインの１つまたはそれ以上は、標準（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーまたは非標準（例えば、Ｃ３Ｈ）ジンクフィンガー（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端ジンクフィンガーが非標準フィンガーであり得る）であり得る。
また、本明細書においては、ＦＡＤ２遺伝子を破壊または編集する方法も記載される。さらに、本明細書においては、本発明の実施形態による方法によって産生された遺伝子組換え宿主生物（例えば、トランスジェニック植物）が記載される。特定の例では、本発明の実施形態による方法によって産生されたトランスジェニック生物が、限定されないが、藻類、真菌類、単子葉植物、双子葉植物等であり得る。いくつかの特定の実施形態では、双子葉植物が大豆（ダイズ）植物であり得る。
本明細書に開示されるＦＡＤ２遺伝子は、１つまたはそれ以上のＦＡＤ２遺伝子を有する任意の植物、藻類または真菌類に見られるものを含み得る。
前記および他の特徴は、添付の図面を参照して進むいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２ ２．３コード配列のアラインメントを示す。 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２ ２．３コード配列のアラインメントを示す。 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号４）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号５）、Ｘ５（配列番号６）、Ｊａｃｋ（配列番号７）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号８）からのＦＡＤ２ ２．３コード配列のアラインメントを示す。 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２ ２．６コード配列のアラインメントを示す。 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２ ２．６コード配列のアラインメントを示す。 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２（配列番号９）、Ｗｅｓｔａｇ（配列番号１０）、Ｘ５（配列番号１１）、Ｊａｃｋ（配列番号１２）およびＭａｖｅｒｉｃｋ（配列番号１３）からのＦＡＤ２ ２．６コード配列のアラインメントを示す。 ＤＬＳＳＡアッセイにおけるＦＡＤ２ ２．３および２．６遺伝子設計ＺＦＮの活性を示す。 ＦＡＤ２ ２．３および２．６座に向けて設計されたＺＦＮが、レポーターとして哺乳動物細胞にクローニングされたＦＡＤ２ ２．３および２．６配列の切断活性について評価された。 ｐＤＡＢ１１５６２０のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＢ１１５６２２のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＢ７２２１のプラスミドマップを示す。 座破壊アッセイのためのプローブ／プライマーを示す概略図である。 ＦＡＤ２ ２．３および２．６遺伝子のＦ２ ＺＦＮ結合部位ならびに破壊アッセイに使用されるプライマーが示されている。 ＦＡＤ２ ２．３座におけるＦ２ ＺＦＮ２ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたドナー配列のＮＨＥＪ標的化から得られたイン−アウトＰＣＲ産物の配列を示す。基準配列（図の上部）は、逆方向配向でのドナーベクターの標的化挿入の構成を表している。基準配列を作成するためにＦｏｋＩ消化から生じたＤＮＡの一本鎖末端が挿入された。Ｓａｎｇｅｒ配列が示されている。 Ｆ２ ＺＦＮ２ ＺＦＮ結合配列は下線を引かれている。指定された配列と類似の配列を有するプラスミドクローンが右に列挙されている。
配列
核酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されるヌクレオチド塩基についての標準的な文字略語を用いて示される。１本鎖のみの各核酸配列が示されるが、示される鎖への任意の言及により、相補鎖が含まれると理解される。
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本発明の実施形態は、組み込まれた核酸によって影響を及ぼされるものを超えて宿主の他の表現型に大いに悪影響を及ぼすことのない、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）の宿主ゲノムへの標的化組込みのための手法を確立する。単一の宿主ゲノム中の複数の核酸を「スタッキングする」ために、いくつかの実施形態が使用され得る。このような手法は、４つの相互接続技術の開発および配置を要する：特異的ゲノムＤＮＡ位置への二本鎖切断の導入を可能にする標的化技術（例えば、Puchta et al.(1993) Nucleic Acids Res.21:5034-40；Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31；D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnol.J.6(1):93-102；Cai et al.(2009) Plant Mol.Biol.69(6):699-709；Shukla et al.(2009) Nature 459(7245):437-41)；Shan et al.(2103) Nature Biotechnol.31:686-680；Le et al.(2013) Nature Biotechnol 31: 688-691；Nekrasov et al.(2013) Nature Biotechnol.31:691-693、Ainely et al.(2013) Plant Biotechnol.J.(On Line 19 Aug)参照）；最適化外因性（ドナー）核酸の送達を可能にする送達技術（Bibikova et al.(2003) Science 300(5620):764）；標的化ドナーＤＮＡ挿入のためにＨＤＲまたはＮＨＥＪ頻度を増加させるための、（相同組換えまたはＮＨＥＪ経路のいずれかに位置する）宿主遺伝子の修飾を伴う組込み技術；標的化組込みイベントを富化し特徴付けるための分析ツール；および遺伝的に十分定義されかつ形質転換された宿主生物に大いに悪影響を及ぼすことなく世代にわたる安定な遺伝子発現を支持する特異的な所望の宿主ゲノム位置（「性能座」）。また、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；第２００５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明細書；第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２００９０２６３９００号明細書；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７８０５号明細書；第２０１１０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細書；第２０１１０８９７７５号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１０１４５９４０号明細書；第２００８０１８２３３２号明細書；第２００９０２０５０８３号明細書；第２０１００１９９３８９号明細書；第２０１１０１６７５２１号明細書も参照されたい。例えば、植物では、性能座は、座で導入遺伝子が挿入されたトランスジェニック植物の農学的または品質特性に対する負の影響が無視できるまたは存在しない座である。
本明細書に記載される実施形態は、植物ＦＡＤ２遺伝子が外因性核酸（例えば、遺伝子；非コードＤＮＡ配列、例えば、操作されたランディングパッド（ＥＬＰ）（米国特許出願第１２／０１１，７３５号明細書）および操作された導入遺伝子挿入プラットホーム（ＥＴＩＰ）（係属中の米国特許出願第６１／６９７８８２号明細書）；および植物形質転換ユニット）の標的化挿入のための性能座であるという予期しない知見を利用する。植物におけるＦＡＤ２座の遍在性の性質、ならびにアブラナ、トウモロコシ、ヒマワリ、コムギ、ワタおよび大豆におけるＦＡＤ２の変化またはノックアウトが農学的または品質の不利益を有さないという証拠は、ＦＡＤ２座を商業的に関連する植物種にわたる広範なクラスの性能座と証明する。
いくつかの実施形態は、例えば、標的部位特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質の送達および発現から生じる、ＦＡＤ２座における部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を利用する。具体的な例では、このようなＦＡＤ２特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質が、例えば、限定されないが、ＺＦＮ；ＴＡＬＥＮ；ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）；メガヌクレアーゼ、および前記のいずれかまたはその同等物に由来する操作タンパク質であり得る。切断は、特異的切断を導くよう操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いても行われ得る。いくつかの実施形態では、このような二本鎖切断が、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、ＦＡＤ２性能座中の切断部位でのドナー核酸の組込みを介して修復され得る。
本開示は、例えば、大豆（ダイズ）のＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６座、ならびにＦＡＤ２ ２．３および／またはＦＡＤ２ ２．６座において外因性核酸を組み込むために利用され得る対応するＦＡＤ２特異的ＺＦＮを記載することによって、性能座としてのＦＡＤ２座の有用性を示す。
本発明の実施形態は、当分野における多くの未解決の課題に対処する。例えば、本明細書に記載される標的化組込み手法の選択性は、不必要な遺伝子導入イベントの排除に要求される度重なる野外試験の必要性を低減または排除することができる（この試験は関与する資源およびこの区域における負担となる規制要求のために高価である）。さらに、本明細書に記載される標的化ＤＮＡ挿入手法は、導入遺伝子スタッキングのプロセスにおいて特に有益となり得る。
いくつかの実施形態では、対象となる核酸を直接標的化するために内因性ＦＡＤ２座における野生のヌクレオチド配列が使用され得るが、対象となるさらなる核酸分子の宿主への組込みが促進されるように、核酸が最初に宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２座に標的化され得る。他の例では、ＤＮＡ認識部位（例えば、ジンクフィンガー認識部位）に隣接する宿主生物の野生の配列（例えば、本質的にランダムに産生された核酸配列）と相同でないヌクレオチド配列が利用され得る。
ＩＩ．用語
特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数および単数形の用語は、別段の明確な指示がない限り、複数指示対象を含む。したがって、例えば、「植物（plant）」、「植物（the plant）」または「植物（a plant）」への言及は、複数の植物も指す。さらに、文脈に応じて、「植物（plant）」という用語の使用は、その植物の遺伝的に類似または同一の子孫も指し得る。同様に、「核酸」という用語は、核酸分子の多くのコピーを指し得る。同様に、「プローブ」という用語は、多くの類似または同一のプローブ分子を指し得る。
数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、定義される範囲内の各整数および非整数分数を明示的に含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本開示に記載される種々の実施形態の概観を容易にするために、具体的な用語の以下の説明が提供される：
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、該成分の化学的または機能的変化をもたらしながら（例えば、核酸は、染色体で核酸と残りのＤＮＡを結合している化学結合を破壊することによって染色体から単離され得る）、該成分が自然に生じる生物の細胞中の他の生物学的成分（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびタンパク質）から実質的に分離されている、別に産生されている、または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも包含する。
交雑：植物に関して本明細書で使用される場合、「交雑する」または「交雑した」という用語は、子孫（例えば、細胞、種子および植物）を産生するための受粉を介した配偶子の融合を指す。この用語は、性的交雑（すなわち、ある植物の別の植物による受粉）と自殖（すなわち、例えば、同じ植物からの花粉および胚珠を用いた自家受粉）の両方を包含する。
戻し交雑：核酸配列を植物に導入するために戻し交雑法が使用され得る。この技術は、新しい形質を植物に導入するために数十年間広く使用されてきた。Jensen, N., Ed.Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交雑プロトコルでは、対象となる元の品種（反復親）が、移植するための対象となる核酸配列を保有する第２の品種（非反復親）と交雑される。次いで、この交雑から得られた子孫が反復親と再度交雑され、非反復親から移植された核酸配列に加えて、反復植物の所望の形態学的および生理学的特性の本質的に全てが変換植物で取り戻された植物が得られるまでこのプロセスが繰り返される。
遺伝子移入：本明細書で使用される場合、「遺伝子移入」という用語は、特定の座における対立遺伝子（または外因性核酸を含む修飾対立遺伝子）の遺伝的背景への伝達を指す。いくつかの実施形態では、座における特異的対立遺伝子の遺伝子移入が、同じ種の２つの親（親の少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での性的交雑を介して対立遺伝子を少なくとも１つの子孫に伝達することによって起こり得る。特異的対立遺伝子を含む子孫が、所望の遺伝的背景を有する系統と繰り返し戻し交雑され得る。特異的対立遺伝子型が遺伝的背景で固定された新しい品種を産生するために、戻し交雑子孫が特異的対立遺伝子型について選択され得る。いくつかの実施形態では、特異的対立遺伝子の遺伝子移入が、２つのドナーゲノム（例えば、融合プロトプラスト）（ドナーゲノムの少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での組換えによって起こり得る。遺伝子移入は、例えば、限定されないが、破壊または修飾対立遺伝子；導入遺伝子；ＰＴＵ；およびＥＬＰであり得る特異的対立遺伝子型の伝達を伴い得る。
生殖質：本明細書で使用される場合、「生殖質」という用語は、個々の植物、植物のグループ（例えば、植物系統、品種および科）、および植物または植物のグループに由来するクローンのまたはこれらから得られる遺伝物質を指す。生殖質は生物もしくは細胞の一部であり得る、またはこれは生物もしくは細胞とは別（例えば、単離されている）であり得る。一般に、生殖質は、植物の遺伝的質の基礎である特定の分子構造を有する遺伝物質を提供する。本明細書で使用される場合、「生殖質」は、特定の植物の細胞；種子；特定の植物の組織（例えば、そこから新しい植物が栽培され得る組織）；および特定の植物の種子以外の部分（例えば、葉、茎、花粉および細胞）を指す。本明細書で使用される場合、「生殖質」という用語は「遺伝物質」と同義であり、そこから植物が繁殖され得る種子（または他の植物材料）を指すために使用され得る。「生殖質バンク」は、そこから公知の栽培品種が栽培され得る、およびそこから新しい栽培品種が産生され得る、異なる種子または他の遺伝物質（各遺伝子型が独自に同定されている）の組織的収集物を指し得る。
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」（または「遺伝要素」）という用語は、機能的重要性を有する遺伝的ゲノムＤＮＡ配列を指し得る。遺伝子は野生の核酸であっても、ゲノムに組み込まれた核酸であってもよい。「遺伝子」という用語は、例えば、限定されないが、遺伝的ゲノムＤＮＡ配列によってコードされているｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを指すためにも使用され得る。
核酸分子：本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび／または前記のいずれかの修飾型）のポリマー型を指し得る。本明細書で使用される「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。この用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにこれらの合成型および混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。この用語は、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、円形および南京錠構造を含む任意の形態的構造を含む。核酸分子は、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことができる。このようなヌクレオチドは、天然および／または非天然ヌクレオチド結合によって結合され得る。
核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾は、例えば、限定されないが、ラベル；メチル化；類似体による天然ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の置換；およびヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷結合、例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデートおよびカルバメート；荷電結合、例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート；ペンダント部分、例えば、ペプチド；インターカレーター、例えば、アクリジンおよびソラレン；キレート剤；アルキル化剤；および修飾結合、例えば、αアノマー核酸）を含む。
外因性：「外因性」分子は、ポリヌクレオチドについてはヌクレオチド配列および／またはゲノム位置（すなわち、座）に関して（およびポリペプチドについてはアミノ酸配列および／または細胞局在に関して）、特定の系（例えば、生殖質、品種、エリート品種および／または植物）に生まれつき備わっていない分子である。実施形態では、外因性または異種性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生物系（例えば、植物細胞、植物遺伝子、特定の植物種もしくは品種、および／または植物染色体）に人工的に供給されており、かつ特定の生物系に生まれつき備わっていない分子であり得る。したがって、「外因性」としての核酸の指定は、その核酸が天然源以外の源に由来することを示す、またはその核酸が非天然構造、遺伝子位置もしくは要素の配列を有することを示し得る。
対照的に、例えば、「野生の」または「内因性」核酸は、染色体またはその核酸が天然で通常見られる他の遺伝物質中に通常存在するもの以外の核酸要素を含まない核酸（例えば、遺伝子）である。内因性遺伝子転写産物は、その天然の染色体座でヌクレオチド配列によってコードされ、細胞に人工的に供給されていない。
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結されている。組換え的に産生されると、作動可能に連結された核酸配列は一般的に隣接しており、必要な場合には同じリーディングフレーム中の２つのタンパク質コード領域を連結する。しかしながら、要素は作動可能に連結されるために隣接している必要はない。
プロモーター：プロモーターは、一般的に核酸の転写を増強する核酸の（５’領域に向かって）上流に位置するＤＮＡの領域である。プロモーターは、作動可能に連結されている核酸の適当な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含む。これらの因子がプロモーターＤＮＡ配列に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわち核酸のコード領域からＲＮＡを合成する酵素の動員をもたらす。形質転換された：ベクターが核酸分子を細胞中に移す場合、ベクターは細胞を「形質転換する」または「形質導入する」。核酸分子が、核酸分子の細胞ゲノムへの組込みまたはエピソーム複製によって、細胞により安定的に複製されるようになると、細胞は核酸分子により「形質転換されている」。本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、核酸分子が細胞に導入され得る全ての技術を包含する。例は、限定されないが、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al.(1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al.(1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム媒介移入（Fraley et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取り込み；および微粒子銃（Klein et al.(1987) Nature 327:70）を含む。
導入された：本明細書で使用される場合、「導入された」という用語は、外因性核酸の細胞への転位に言及する場合には、当分野で利用可能な任意の方法論を用いた核酸の細胞への組込みを指す。この用語は、例えば、限定されないが、トランスフェクション；形質転換；および形質導入を含む核酸導入法を包含する。
導入遺伝子：本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、対象となる外因性核酸コード配列を指す。例えば、導入遺伝子は産業的もしくは薬学的に有用な化合物、または望ましい農業的形質（例えば、除草剤耐性もしくは有害生物耐性）に寄与する発現産物をコードし得る。さらなる例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸であってもよく、アンチセンス核酸の発現は標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子と作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座において部位特異的標的化によって導入される対象となる核酸分子が導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態では、対象となる核酸分子がＰＴＵ、ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたは内因性核酸配列（例えば、内因性核酸配列の追加の外因性ゲノムコピーが望まれる場合）であり得る。
要素は、構造ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡも含むことができる。このようなＲＮＡは、限定されないが、ポスティングに影響を及ぼすまたは除草剤耐性を与えることを含む外因性または内因性遺伝子を修飾することができる。
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、ヒトの介入によって変えられた材料（例えば、核酸、遺伝子、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を指す。例えば、組換え分子の一部または要素の配列は野生の配列でなくてもよく、および／または組換え分子の一次配列は、例えば、その発現および／または活性を最適化するためにその野生の配列から変更されていてもよい。自然の環境または状態で組換え材料を産生するまたはそこから取り出すために材料が変化され得る。一例として、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列がその自然の状況から取り出され、人工核酸分子（例えば、ベクター）にクローニングされた場合、核酸のオープンリーディングフレームは組換えである。組換え分子（例えば、組換え核酸）を産生するためのプロトコルおよび試薬は、当分野で一般的であり、その使用は日常的である。「組換え」という用語はまた、本明細書において、組換え材料を含む細胞または生物（例えば、組換え核酸を含む植物および／または植物細胞）も指し得る。いくつかの例では、組換え生物がトランスジェニック生物である。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、少なくとも１つの核酸セグメントを細胞に移入することができるポリヌクレオチドまたは他の分子を指す。ベクターは場合により、ベクター維持を媒介するおよび／またはその意図した使用を可能にする成分／要素（例えば、複製に必要な配列、薬剤もしくは抗生物質耐性を与える遺伝子、マルチクローニングサイト、および／またはクローニングされた遺伝子の発現を可能にする作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサー要素）を含んでもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物ウイルスに由来し得る。「クローニングベクター」、「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、一般的にクローニングまたはサブクローニング工程を促進するための作動可能に連結された要素を含む（例えば、マルチクローニングサイトは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）。
発現ベクター：本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物においてコード配列の発現を促進することができる作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを指す。例えば、細菌発現ベクターは、細菌においてコード配列の発現を促進することができる。同様に、植物発現ベクターは、植物細胞においてコード配列の発現を促進することができる。原核生物において発現を促進するポリヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、プロモーター；オペレーター；およびリボソーム結合部位を含み得る。真核生物発現ベクター（例えば、植物発現ベクター）は、例えば、原核生物発現ベクターで使用されるものとは一般的に異なるプロモーター；エンハンサー；終止シグナル；およびポリアデニル化シグナル（および他の配列）を含み得る。
配列同一性：２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較窓にわたって最大の対応で整列された場合に、同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の値は、比較窓にわたって２つの最適整列配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することによって決定され得、比較窓中の配列の一部は２つの配列の最適整列のための（付加も欠失も含まない）基準配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。配列同一性は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって百分率として計算される。
比較のために配列を整列させる方法は当分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992) Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994) Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999) FEMS Microbiol.Lett.174:247-50に記載されている。配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討は、Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10に見出され得る。
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）； Altschul et al.(1990)）が配列を整列させるために使用され得、これはいくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。どのようにこのプログラムを用いて配列同一性を決定するかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」の項目でインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能が使用され得る。基準配列との類似性が大きい核酸配列は、この方法で評価されると、同一性百分率の増加を示すだろう。
本明細書で使用される場合、「実質的に同一の」という用語は、８０％超同一であるヌクレオチド配列を指し得る。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、基準配列と少なくとも８５％；少なくとも８６％；少なくとも８７％；少なくとも８８％；少なくとも８９％；少なくとも９０％；少なくとも９１％；少なくとも９２％；少なくとも９３％；少なくとも９４％；少なくとも９５％；少なくとも９６％；少なくとも９７％；少なくとも９８％；少なくとも９９％；または少なくとも９９．５％同一であり得る。
座：本明細書で使用される場合、「座」という用語は、測定可能な特性（例えば、形質）に対応するゲノム上の位置を指す。いくつかの実施形態では、特に対象となる座がＦＡＤ２遺伝子のゲノム位置であり、この遺伝子の破壊は野生型遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現を減少させるまたは排除する。座は、サザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ中に座中に含まれる特有のヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブによって定義され得る。
マーカー：本明細書で使用される場合、「マーカー」は特定の対立遺伝子を有するおよび／または特定の形質もしくは表現型を示すと見られる植物を同定するために使用され得る遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。マーカーは、所与のゲノム座で変異として記載され得る。遺伝子マーカーは、短ＤＮＡ配列、例えば、単一塩基対変化（一塩基多型、すなわち「ＳＮＰ」）を囲む配列、または長配列、例えば、ミニサテライト／単純反復配列（「ＳＳＲ」）であり得る。「マーカー対立遺伝子」は、特定の植物中に存在するマーカーのバージョンを指す。本明細書で使用されるマーカーという用語は、植物染色体ＤＮＡのクローン化セグメント（例えば、ＦＡＤ２座、或いは修飾および／または破壊ＦＡＤ２座を含むセグメント）を指し得、同様にまたは或いは、植物染色体ＤＮＡのクローン化セグメントに相補的なＤＮＡ分子を指し得る。当業者によって認識されるように、マーカーに包含するための追加の隣接ヌクレオチド配列を得る工程がほとんど無限に反復され（染色体の長さによってのみ限定される）、それによって染色体に沿って追加のマーカーが同定され得る。上記の多様なマーカーのいずれかおよび全てが本発明のいくつかの実施形態で使用され得る。
いくつかの実施形態では、生殖質中の（「標的」配列によって特徴付けられる）導入遺伝子またはマーカーの存在は、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチドの使用を通して検出され得る。プローブはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。オリゴヌクレオチドプローブは、合成的にまたはクローニングによって調製され得る。適当なクローニングベクターは当業者に周知である。ＲＮＡプローブは当分野で公知の手段によって、例えば、ＤＮＡ分子テンプレートを用いて合成され得る。
オリゴヌクレオチドプローブは標識されていても非標識であってもよい。例えば、限定されないが、ニックトランスレーションによる放射標識；ランダムプライミング；および末端デオキシトランスフェラーゼによるテーリング（使用されるヌクレオチドが、例えば、放射性３２Ｐで標識される）を含む、核酸分子を標識するための多種多様な技術が存在する。使用され得る他の標識は、例えば、限定されないが、発蛍光団；酵素；酵素基質；酵素補因子；および酵素阻害剤を含む。あるいは、単独でまたは他の反応性薬剤と併せて、検出可能なシグナルを提供する標識の使用は、受容体が結合するリガンドによって置き換えられ得、ここでは受容体が（例えば、上に示される標識によって）標識されて、単独でまたは他の試薬と併せて、検出可能なシグナルを提供する。例えば、Leary et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9を参照されたい。
プローブは、検出される導入遺伝子またはマーカーの正確なコピーであり得る。プローブはまた、検出される導入遺伝子またはマーカーを含む染色体ＤＮＡのクローン化セグメントと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる核酸分子であり得る。プローブは、追加の核酸配列、例えば、プロモーター；転写シグナル；および／またはベクター配列をさらに含んでもよい。
プローブは、ゲノムからの標的ヌクレオチド配列および追加の隣接ヌクレオチド配列の全部または一部を含んでもよい。これは本明細書において「隣接プローブ」と呼ばれる。追加の隣接ヌクレオチド配列は、染色体からの隣接ヌクレオチド配列が慣用的に理解されるように元のマーカーの５’または３’側にあるかどうかに応じて、元の標的の「上流」または「下流」と呼ばれる。プローブは元の標的のヌクレオチド配列と隣接しないヌクレオチド配列を含んでもよく、このプローブは本明細書において「非隣接プローブ」と呼ばれる。非隣接プローブの配列は、非隣接プローブが元のマーカーまたは導入遺伝子と連結するように、染色体上の元の標的の配列の十分近くに位置し得る。
いくつかの実施形態では、プローブが、検出される標的の正確なコピーに「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に相補的」である核酸分子である。「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」は、核酸分子と標的との間で安定かつ特異的な結合が起こるのに十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が望まれる条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸と非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能である。
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズしている核酸配列の組成および長さに応じて変化するだろう。一般的に、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼすが、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するだろう。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために要求されるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al.(ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11；およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および手引きは、例えば、Tijssen, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出され得る。
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間のミスマッチが２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」はさらなる特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用される場合、「中等度ストリンジェンシー」条件は、２５％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり；「中程度ストリンジェンシー」の条件は、１５％超のミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり；また「高ストリンジェンシー」の条件は、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「極めて高ストリンジェンシー」の条件は、６％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６ｘ生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファ、５ｘデンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ断片化サケ精巣ＤＮＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて２ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ、引き続いて１ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ、そして最後に０．２ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃での１５〜３０分の連続的洗浄である。
連鎖（不）平衡：本明細書で使用される場合、「連鎖平衡」という用語は、マーカーおよび第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）が独立に分離する、すなわち、マーカーおよび第２の核酸が子孫間でランダムにソートする状態を指す。連鎖平衡を示す核酸は（それらが同じ染色体上にあろうとなかろうと）連結していないとみなされる。本明細書で使用される場合、「連鎖不平衡」は、マーカーおよび第２の核酸がランダムでない様式で分離する；すなわち、核酸が５０％未満の組換え頻度を有する（したがって、定義によると、同じ連鎖群上で５０ｃＭ未満離れている）状態を指す。いくつかの例では、連鎖不平衡を示す核酸は連結しているとみなされる。
連結した、密に連結した、および極めて密に連結した：本明細書で使用される場合、マーカーと第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）との間の連鎖は、染色体上の核酸が次の世代の個体に一緒に伝えられる測定可能な確率を示す現象を指し得る。したがって、あるマーカーと第２の核酸の連鎖は、組換え頻度として測定および／または表現され得る。２つの核酸が互いに近いほど、この確率が「１」に近くなる。したがって、「連結した」という用語は、０．５より大きい確率（マーカー／遺伝子が異なる染色体上に位置する場合、独立組み合わせから予測される）で、第２の核酸と一緒に伝えられる１つまたはそれ以上の遺伝子またはマーカーを指し得る。遺伝子（例えば、導入遺伝子）の存在が個体の表現型に寄与する場合、遺伝子に連結したマーカーは表現型に連結していると言われ得る。したがって、「連結している」という用語は、マーカーと遺伝子との間、またはマーカーと表現型との間の関係を指し得る。
相対的遺伝的距離（交差度数によって決定され、センチモルガン（ｃＭ）で測定される）は、一般的に２つの連結したマーカーまたは遺伝子が染色体上で互いに離れている物理的距離（塩基対で測定される）に比例する。１センチモルガンは、１％組換え頻度を示す（すなわち、２つのマーカーの間で交差イベントが１００回の細胞分裂毎に１回起こる）２つの遺伝子マーカーの間の距離として定義される。一般に、あるマーカーが別のマーカーまたは遺伝子と近いほど（これらの間の距離が遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、これらがより密に連結している。染色体距離は形質間の組換えイベントの頻度にほぼ比例するので、組換え頻度と相関するおおよその物理的距離が存在する。この相関は、主要な作物植物（Helentjaris and Burr (eds.) (1989) Development and Application of Molecular Markers to Problems in Plant Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；Gresshoff (ed.) (1994) Plant Genome Analysis. CRC Press, Boca Raton, FL；Lander et al.(1987) Genomics 1:174-81；Tanksley et al.(1988) 「Molecular mapping of plant chromosomes」 In Chromosome Structure and Function. Gustafson and Appels (eds.) Plenum Press, NY, pp.157-73）および多くの他の生物にわたって一般的に知られているまたは容易に決定可能である。例えば、１ｃＭは酵母では約２．５〜３．０ｋｂ、シロイヌナズナでは約１４０ｋｂ、ヒマワリでは約４００ｋｂおよびユーカリでは約３５０ｋｂに相当する。
「連結している」という用語は、本明細書においては５０％未満（すなわち、５０ｃＭ未満）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「連結している」核酸は、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、および約１０％以下の頻度で再結合し得る。前記組換え頻度に対応する同じ染色体上の（異なる染色体上の核酸は連鎖平衡であると予想される）このような核酸間の物理的距離は宿主ゲノムに依存し、上に示されているように容易に計算され得る。
本明細書で使用される場合、「密に連結している」という用語は、約２０％以下（すなわち、約２０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「密に連結している」核酸は、２２％以下、約１８％以下、約１６％以下、約１４％以下、約１２％以下、約１０％以下、約８％以下、約６％以下、約４％以下、および約２％以下の頻度で再結合し得る。
本明細書で使用される場合、「極めて密に連結している」という用語は、約１０％以下（すなわち、約１０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「極めて密に連結している」核酸は、１１％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、および約１％以下の頻度で再結合し得る。
特定の核酸が特定の表現型に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子に近いほど（遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸は表現型とより密に連結している。前記を考慮して、特定の遺伝子または表現型と連結している核酸は、遺伝子または表現型と密に連結している核酸、および極めて密に連結している核酸を含むと認識されるだろう。いくつかの実施形態では、特定の核酸がＦＡＤ２座（例えば、修飾または破壊ＦＡＤ２座）に近いほど（遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸はＦＡＤ２座において組み込まれている外因性核酸によって与えられる任意の形質／表現型と（または非修飾座の場合、野生型ＦＡＤ２表現型と）より密に連結している。したがって、組み込まれた外因性核酸を含むＦＡＤ２座と連結している、密に連結しているおよび／または極めて密に連結している遺伝子マーカーは、組み込まれた核酸を含む生物（例えば、植物および植物品種）を同定する、組み込まれた核酸によって与えられる表現型を含む生物を同定する、ならびにこのような組み込まれた核酸および／または組み込まれた核酸によって与えられる表現型を他の適合性生物中で繁殖させるためのＭＡＳプログラムで有用となり得る。
マーカー利用育種：本明細書で使用される場合、「マーカー利用育種」という用語は、１つまたはそれ以上の形質（例えば、ポリジーン形質）のために直接植物を育種する手法を指し得る。現在の実際問題として、植物育種家は、容易に検出可能な形質、例えば、花の色、種皮の外観、または農業経済学的に望ましい形質に関連するアイソザイム変異形を同定しようと試みている。その結果、植物育種家は、容易に検出可能な形質の分離に従うことによって、分離している育種集団の農学的形質に従う。しかしながら、対象となる形質と、植物育種に使用するために利用可能な容易に検出可能な形質との間のこれらの連鎖関係はほとんど存在しない。本発明のいくつかの実施形態では、マーカー利用育種が、対象となる形質に寄与する外因性核酸が組み込まれたＦＡＤ２座に連結した１つまたはそれ以上の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ、アイソザイムおよび／またはＳＳＲマーカー）を同定する工程と、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの分離に従うことによって分離している育種集団の対象となる形質に従う工程とを含む。いくつかの例では、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの分離が、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの存在について子孫植物からの遺伝子サンプルをアッセイすることによって、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーのためのプローブを利用して決定され得る。マーカー利用育種は、植物品種の改善のための時間および費用効率的なプロセスを提供する。
形質または表現型：「形質」および「表現型」という用語は本明細書において互換的に使用される。本開示の目的のために、特に対象となる形質は、例えば、作物植物において発現され得るような農業経済学的に重要な形質、および標的化組込みイベントからの導入遺伝子発現産物の産生を含む。「分子表現型」という用語は、（１つまたはそれ以上の）分子の集団のレベルで検出可能な表現型を指し得る。いくつかの例では、分子表現型は、分子レベルでのみ検出可能であり得る。表現型の検出可能な分子は核酸（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ）；タンパク質；および／または代謝産物であり得る。例えば、分子表現型は、（例えば、植物発育の特定の段階における、または環境条件もしくはストレスに応じた）１つまたはそれ以上の遺伝子産物についての発現プロファイルであり得る。
量的形質座位：遺伝子（相加、優先および上位）および環境の影響により絶えず変化する形質は一般的に「量的形質」と呼ばれる。量的形質は、表現型の連続分布をもたらす遺伝子発現への環境的影響、および多遺伝子遺伝によってもたらされる複雑な分離パターンの２つの因子に基づいて「質的」または「離散」形質から識別され得る。量的形質の発現に関連するゲノムの１つまたはそれ以上の領域の同定が、このような領域を「量的形質座位（「ＱＴＬ」）と定義する。
植物：本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、全植物、植物に由来する細胞もしくは組織培養物、および／または前記のいずれかの任意の部分を指し得る。したがって、「植物」という用語は、例えば、限定されないが、全植物；植物成分および／または器官（例えば、葉、茎および根）；植物組織；種子；ならびに植物細胞を包含する。植物細胞は、例えば、限定されないが、植物中および／または植物の細胞、植物から単離された細胞、ならびに植物から単離された細胞の培養を通して得られた細胞であり得る。
「トランスジェニック植物」は、その細胞の少なくとも１つの中に外因性ポリヌクレオチドを含む植物である。「トランスジェニック」という用語は、本明細書において、その遺伝子型が外因性核酸の存在によって変えられた任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物部位、または植物を指すために使用される。したがって、この用語は、外因性ポリヌクレオチドを含むように最初に変えられたトランスジェニック生物および細胞、ならびに最初のトランスジェニック生物または細胞の交雑または無性繁殖によって作成された生物および細胞を包含する。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法（例えば、非トランスジェニック生物のみの交雑）または天然のイベント（例えば、ランダム多家受粉、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位および自然突然変異）によって導入されたゲノム（染色体または染色体外）変化を包含しない。
植物「系統」、「品種」または「株」は、同じ血統を有する個々の植物の群である。ある系統の植物は、一般的にある程度近交系であり、一般的にほとんどの遺伝子座（例えば、ＦＡＤ２座）でホモ接合性および同種である。「亜系統」は、同じ祖先に由来する他の類似の近交系サブセットとは遺伝的に異なる共通の祖先からの子孫の近交系サブセットを指し得る。いくつかの実施形態では、「亜系統」は、残りの分離座がほとんどまたは全ての座にわたってホモ接合性となるまで、Ｆ３〜Ｆ５世代で選択される個々のトランスジェニック植物からの種子を近親交配することによって産生され得る。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは（ホモダイマー、ホモトリマー等を形成するために）自身に結合することができる、および／または異なるタンパク質の１つまたはそれ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の型の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質または大型タンパク質中のドメインであり、ジンクフィンガーはその構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される結合ドメイン中のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は通常、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥとその同族の標的ＤＮＡ配列の結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、典型的には長さ３３〜３５個のアミノ酸であり、天然のＴＡＬＥタンパク質中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたはそれ以上のアミノ酸を変化させる）を通して、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作」され得る。そのため、操作ＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作する方法の非限定的例は、設計および選択である。設計ＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が原則として合理的な基準から生じる、天然で生じないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、置換ルールならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報を記憶するデータベース中の情報を処理するための計算機化アルゴリズムの適用、ならびにデータの結合を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；および第６，５３４，２６１号明細書；を参照されたい；また国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が経験的プロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択から主に生じる、天然で見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、それだけに限らないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断イベントの結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが標的化二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と併せて、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」および「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する対の切断ハーフドメインを指すために互換的に使用される。
「操作切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作切断ハーフドメイン）と共に絶対ヘテロダイマーを形成するよう修飾された切断ハーフドメインである。全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書、第２００７０２１８５２８号明細書、第２００８／０１３１９６２号明細書および第２０１１／０２０１０５５号明細書も参照されたい。
二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段」という用語は、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両鎖を切断することができる分子構造を指す。このような構造は、多くの公知のヌクレアーゼタンパク質、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに含まれるポリペプチドドメインを含み、触媒ドメインはタンパク質Ｍｍｅｌ、コリシンＥ７（ＣＥＡ７＿ＥＣＯＬＸ）、コリシンＥ９、ＡＰＦＬ、ＥｎｄＡ、エンドＩ（ＥＮＤ１＿ＥＣ０ＬＩ）、ヒトエンドＧ（ＮＵＣＧ＿ＨＵＭＡＮ）、ウシエンドＧ（ＮＵＣＧ＿ＢＯＶＩＮ）、Ｒ．ＨｉｎＰｌｌ、ｌ−Ｂａｓｌ、ｌ−Ｂｍｏｌ、ｌ−Ｈｍｕｌ、ｌ−Ｔｅｖｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌｌ、ｌ−Ｔｗｏｌ、Ｒ．Ｍｓｐｌ、Ｒ．Ｍｖａｌ、ＮｕｃＡ、ＮｕｃＭ、Ｖｖｎ、Ｖｖｎ＿ＣＬＳ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＴＡＡＵ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＴＡＨＹ）、小球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＨＩＦＬ）、エンドヌクレアーゼｙｎｃＢ、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＥＮＲＮ＿ＢＰＴ７）、Ｍｅｔｎａｓｅ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ Ａ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．ＢｓｐＤ６ｌ大型サブユニット）、ｓｓ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．ＢｓｐＤ６ｌ小型サブユニット）、Ｒ．ＰＩｅｌ、Ｍｌｙｌ、Ａｌｗｌ、Ｍｖａｌ２６９ｌ、Ｂｓｒｌ、Ｂｓｍｌ、Ｎｂ．ＢｔｓＣＩ、Ｎｔ．ＢｔｓＣＩ、Ｒｌ．Ｂｔｓｌ、Ｒ２．Ｂｔｓｌ、ＢｂｖＣＩサブユニット１、ＢｂｖＣＩサブユニット２、ＢｐｕｌＯＩαサブユニット、ＢｐｕｌＯＩβサブユニット、Ｂｍｒｌ、Ｂｆｉｌ、ｌ−Ｃｒｅｌ、ｈＥｘｏｌ（ＥＸ０１ＪＨＵＭＡＮ）、酵母Ｅｘｏｌ（ＥＸ０１＿ＹＥＡＳＴ）、大腸菌Ｅｘｏｌ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択される。
二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段」という用語も、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段」は、例えば、単一の二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって産生される末端を連結する、または単一の二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって産生される一端と外因性二本鎖ＤＮＡ分子の末端を連結することによって、二本鎖ＤＮＡ分子の末端の連結を促進／触媒することができる分子構造を指す。このような構造は、多くの公知のリガーゼタンパク質、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに含まれるポリペプチドドメインを含む。いくつかの例では、同じ分子構造が、二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段と、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段の両方として作用することができ、ここでは同じ構造が二本鎖ＤＮＡ分子の切断と修復の両方を促進する（例えば、Ｈｉｎリコンビナーゼ）。
ゲノム中の部位特異的二本鎖切断の誘導は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を通して二本鎖切断を回復させる宿主植物細胞ＤＮＡ修復経路を誘導する。植物では、科学文献が、野生のゲノムまたは予備操作位置への正確な遺伝子またはドナーＤＮＡ組込みが、標的化二本鎖切断に隣接する配列との種々の量の配列相同性を含む入来ドナーＤＮＡ構築物を伴っていることを報告している。このようなドナーの特定の標的座への組込みは、おそらくＨＤＲ経路に頼っている。植物における遺伝子標的化のためにＨＤＲアプローチにもっぱら頼ることは、ＨＤＲ修復経路が、ＮＨＥＪと比べると支配的ＤＮＡ修復経路ではないという報告のために、制限を有し得る。 標的特異的ＤＮＡ切断（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓまたは操作メガヌクレアーゼ等）を利用する公開されている植物科学文献では、ＮＨＥＪ経路が特異的点突然変異（挿入または欠失）をゲノムに導入する方法として報告されている。ここでは、本発明者らは、０〜１０ｂｐ未満の相同性領域を有する種々のドナーＤＮＡ設計の存在下で、（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓ等によって誘導される）部位特異的二本鎖切断が、植物におけるＮＨＥＪ修復経路を介して標的化切断において特異的に挿入され得ることを報告する。 線状から環状の一本鎖から二本鎖に及ぶ小型の１〜１０ｂｐとの相同性が０の種々の異なるＤＮＡドナー設計が、ＮＨＥＪ経路を用いて特異的位置に標的化され得る。ＮＨＥＪベースのドナーＤＮＡ植物ゲノム標的化は、「付着末端捕捉」に基づくことができ、ここではＦｏｋ１（または他のＩＩ型エンドヌクレアーゼドメイン）によって産生されたゲノム中の標的化二本鎖切断および対応する付着末端がＮＨＥＪドナーＤＮＡ設計となる。付着末端ドナーＤＮＡは、予め定義されたオーバーハングを有する線状ドナーＤＮＡとして細胞に直接送達され得る。代替手法は、宿主標的ＺＦＮおよび標的認識部位と同一の少なくとも１つのＺＦＮ認識部位を含む環状ＤＮＡドナー分子を同時送達することによってインビボでドナーＤＮＡ付着末端を産生することである。少なくとも１つのＺＦＮの発現が、宿主ゲノムＤＮＡ（野生のまたは予備操作された）および環状ドナーＤＮＡを切断して、宿主ＮＨＥＪ修復経路を用いて回復される付着末端を産生する。
ドナー分子上に１つまたはそれ以上のＺＦＮ切断部位を有することが可能である（ドナー分子全体を直線化するための単一ＺＦＮ切断部位、小型ドナーＤＮＡ断片を放出するための２つの同じＺＦＮ部位、またはドナーから断片および宿主ゲノムＤＮＡから対応する断片（ＤＮＡ置換）を放出するための２つの異なるＺＦＮ部位）。
したがって、ドナーポリヌクレオチドは一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書および第２０１１０２０７２２１号明細書を参照されたい。ある場合、本発明の実施形態は、線状外因性（ドナー）核酸、これらの核酸を含む組成物、ならびにこれらの線状ドナー分子を製造および使用する方法も含み得る。特定の実施形態では、線状ドナー分子が、導入される細胞中に安定的に持続する。他の実施形態では、線状ドナー分子が、例えば、ドナー分子の端部に１つまたはそれ以上の塩基対間の１つまたはそれ以上のホスホロチオエートホスホジエステル結合を配置することによって、エキソヌクレアーゼ切断に耐えるよう修飾される。線状外因性核酸は、一本鎖特異的ＤＮＡを含んでもよい。
ＩＩＩ．ＦＡＤ２性能座
ＦＡＤ２（脂肪酸デサチュラーゼ２）と命名される座は、植物中の脂肪酸含量の複雑な多遺伝子形質の遺伝に関与するＱＴＬに含まれる。ＦＡＤ２は、オレイン酸（１８：１）のリノール酸（Ｃ１８：２）への不飽和化を担う酵素をコードしている。Tanhuanpaa et al.(1998) Mol. Breed. 4:543-50; Schierholt et al.(2001) Crop Sci. 41:1444-9。
植物油生合成経路において、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）は植物脂質生合成において重要な役割を果たしており、その活性は脂肪酸組成に有意に影響を及ぼす。ＦＡＤは植物中に豊富にあり、発現解析が、ＦＡＤ ｍＲＮＡが過剰に産生されていることを示唆した。さらに、ＦＡＤ遺伝子は、種々の組織および細胞型、ならびにプラスチドおよび小胞体を含む細胞内区画で発現している。
植物の脂肪酸組成、および多くの用途におけるそこから産生される油の性能は、主要な脂肪酸構成成分であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸（Ｃ１８：３）の相対濃度によって決定される。これらの脂肪酸の濃度は、酵素ＦＡＤ２およびＦＡＤ３の機能によって主に調節される。オレイン酸は以下のスキームにしたがって、植物中でリノール酸およびリノレン酸に変換される：
Ｃ１８：０ → Ｃ１８：１ → Ｃ１８：２ → Ｃ１８：３
ＦＡＤ２ ＦＡＤ３
ＦＡＤ２遺伝子は、それだけに限らないが、トウモロコシ、大豆、ワタ、シロイヌナズナ、コムギ、イネ科牧草、イネ、ヒマワリおよびアブラナ属を含む主要な植物および藻類の種で同定されており、ＦＡＤ２発現の修飾は、このような生物における脂肪酸プロファイルの変化をもたらす。さらに、修飾ＦＡＤ２遺伝子を含む植物が商品化されており、ＦＡＤ２遺伝子の破壊は、宿主植物への農学的不利益なしに宿主植物によって産生される油の栄養的および機能的特性を改善することができることが示されている。例えば、Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）ブランド（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ）で商品化されているアブラナおよびヒマワリ品種は、野生型アブラナおよびヒマワリのプロファイルと比べると、高いオレイン酸、低いリノール酸および低いリノレン酸（および低い飽和脂肪酸）組成によって特徴付けられる。
参照による本明細書に組み込まれるChi, X等（(2011) Genome-wide analysis of fatty acid desaturases in soybean (Glycine max). Plant Molecular Biology Reports 29, 769-783）に記載されているように、大豆におけるＦＡＤ２の公知の機能遺伝子コピーが、シロイヌナズナカウンターパートの９つのサブファミリー、ＦＡＢ２、ＦＡＤ２、ＦＡＤ３、ＦＡＤ５、ＦＡＤ６、ＦＡＤ７、ＦＡＤ８、ＳＬＤ１およびＤＥＳ１に系統学的に位置していた。２９個デサチュラーゼ遺伝子が、２０本の大豆染色体の少なくとも１５本上に分布していることが分かった。遺伝子構造およびモチーフ組成は、サブファミリー間でかなり保存されていた。デサチュラーゼ遺伝子の大部分が、マイクロアレイデータ分析に基づいて、異なる組織および発達段階にわたって特異的な時間的および空間的発現パターンを示した。
ＦＡＤ２座は、植物の価値に悪影響を及ぼすことなく、かつ多くの目的のために、ＦＡＤ２発現の変化、油含量／比の変化ならびに／或いは所望の導入遺伝子の組込みおよび発現を含むその価値を実際に増加させて、植物中で修飾および／または破壊され得る。さらに、植物におけるＦＡＤ座の遍在的性質により、ＦＡＤ２座は、例えば、限定されないが、アブラナ；大豆；トウモロコシ；コムギ；イネ科牧草；アブラナ属の種；イネ；トマト；オオムギ；エンバク；ソルガム；ワタ；およびヒマワリ、ならびに真菌類および藻類を含む多くの種で少なくともいくつかの目的を損なうことなく修飾および／または破壊され得る。本発明の実施形態は、ＦＡＤ２座、および外因性核酸の組込みのための性能座としてのその使用を含む。例では、ＦＡＤ２座が、例えば、限定されないが、宿主生物の生活環中にほぼ一貫したレベルの発現があること；および驚くべきことに、ＦＡＤ２座におけるドナーＤＮＡの挿入が宿主に質または適合性の不利益を誘導しないことを含む、性能座としてのその使用の状況の中で望ましいことが分かっているいくつかの特徴の少なくとも１つを示す。
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＦＡＤ２座（例えば、ＦＡＤ２ ２．３座およびＦＡＤ２ ２．６座）が、外因性核酸（例えば、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）の部位特異的組込みのための標的部位として使用される。特定の実施形態では、外因性核酸の組込みが修飾された座をもたらす。例えば、外因性核酸の組込みは、破壊された（すなわち、不活性化された）ＦＡＤ２遺伝子を産生するように座を修飾し得る。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ＦＡＤ２座は、配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＦＡＤ２ホモログ（例えば、オルソログまたはパラログ）である。ＦＡＤ２ホモログは、例えば、限定されないが、配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％；少なくとも８５％；少なくとも約９０％；少なくとも約９１％；少なくとも約９２％；少なくとも約９３％；少なくとも約９４％；少なくとも約９５％；少なくとも約９６％；少なくとも約９７％；少なくとも約９８％；少なくとも約９９％；少なくとも約９９．５％；９９．６％、９９．７％、９９．８％および／または少なくとも約９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。このようなＦＡＤ２ホモログは、種々の生物について当業者に容易に利用可能な任意の完全または部分的ゲノムから容易に同定および単離され得る。
ＩＶ．ＦＡＤ２座における核酸の標的化組込み
ＦＡＤ２座における外因性核酸の部位特異的組込みは、当業者に公知の任意の技術によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座における外因性核酸の組込みが、細胞（例えば、単離細胞または組織もしくは生物中の細胞）を外因性核酸を含む核酸分子と接触させることを含む。例では、このような核酸分子が、核酸分子と少なくとも１つのＦＡＤ２座との間の相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列を含み得る。特定の例では、相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が、ＦＡＤ２座の外因性ヌクレオチドと相補的であり得る。特定の例では、相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が、予め組み込まれた外因性ヌクレオチドと相補的であり得る。いくつかの実施形態では、複数の外因性核酸が、１つのＦＡＤ２座において、例えば、遺伝子スタッキングで組み込まれ得る。
ＦＡＤ２座における核酸の組込みは、いくつかの実施形態では、宿主細胞の内因性細胞機構、例えば、限定されないが、内因性ＤＮＡおよび内因性リコンビナーゼ酵素によって促進（例えば、触媒）され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座における核酸の組込みが、宿主細胞に提供される１つまたはそれ以上の因子（例えば、ポリペプチド）によって促進され得る。例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドは、ポリペプチドを宿主細胞と接触させることによって、またはポリペプチドを宿主細胞中で発現させることによって、（独立にまたはキメラポリペプチドの一部として）提供され得る。したがって、いくつかの例では、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、ＦＡＤ２座において部位特異的に組み込まれる核酸と同時にまたは順次、宿主細胞に導入され得、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドが宿主細胞中のヌクレオチド配列から発現される。
Ａ．ＤＮＡ結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、部位特異的組込みが、例えば、宿主生物のゲノム中の特定のヌクレオチド配列を認識し、これに結合することができる因子を利用することによって達成され得る。例えば、多くのタンパク質が、部位特異的様式でＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識されるＤＮＡ配列は、「標的」配列と呼ばれ得る。部位特異的様式でＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインは、一般的にドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチド中で発現する場合でさえ、正確に折り畳み、独立に機能して部位特異的様式でＤＮＡに結合する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、一般的に大型ＤＮＡ構造（例えば、染色体）中に存在する場合でさえ、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質にアクセス可能であることが知られているもの（例えば、遺伝子）である場合に、このようなポリペプチドによって認識され、結合され得る。
天然に存在するタンパク質から同定されたＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には離散的ヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するように多くのこのようなＤＮＡ結合ポリペプチドを修飾する方法が存在し当分野で公知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；ロイシンジッパー；ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ；Ｔｅｔリプレッサー；ＬａｃＲ；およびステロイドホルモン受容体を含む。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがジンクフィンガーである。個々のジンクフィンガーモチーフは、大きい範囲のＤＮＡ部位のいずれかに特異的に標的化および結合するよう設計され得る。標準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（ならびに非標準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、αヘリックスを標的ＤＮＡ二重螺旋の主溝に挿入することによって、ＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュール式であり；各フィンガーが主に標的中の３つの連続した塩基対に接触し、ポリペプチド中の数個の重要な残基が認識を媒介する。標的化エンドヌクレアーゼに複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを包含させることによって、標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性がさらに増加され得る（したがって、それによって与えられる任意の遺伝子調節効果の特異性も増加され得る）。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51を参照されたい。したがって、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿主細胞に導入された標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞のゲノム中で特有のＤＮＡ配列と相互作用するように操作および利用され得る。
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するよう操作されているという点で非天然である。例えば、全て全体が参照により本明細書に組み込まれる、Beerli et al.(2002) Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001) Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001) Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001) Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000) Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；第６，５３４，２６１号明細書；第６，５９９，６９２号明細書；第６，５０３，７１７号明細書；第６，６８９，５５８号明細書；第７，０３０，２１５号明細書；第６，７９４，１３６号明細書；第７，０６７，３１７号明細書；第７，２６２，０５４号明細書；第７，０７０，９３４号明細書；第７，３６１，６３５号明細書；第７，２５３，２７３号明細書；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；第２００７／０２１８５２８号明細書；第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたい。
操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質と比べて新規な結合特異性を有することができる。操作法は、それだけに限らないが、合理的な設計および種々の型の選択を含む。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、ここでは各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許第６，４５３，２４２号明細書および第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的な選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９８８号明細書；第６，０１３，４５３号明細書；第６，４１０，２４８号明細書；第６，１４０，４６６号明細書；第６，２００，７５９号明細書；および第６，２４２，５６８号明細書ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレットおよび英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有されている国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（および同タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；第７８９，５３８号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；第６，５３４，２６１号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９８８号明細書；第６，０１３，４５３号明細書；第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットに詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のモジュラートランス活性化因子であるが、多くの他の生物のトランス活性化因子としても作用する。例えば、Sadowski et al.(1988) Nature 335:563-4を参照されたい。この調節システムでは、出芽酵母のガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現が利用可能な炭素源によってストリンジェントに調節される。Johnston (1987) Microbiol.Rev.51:458-76。これらの代謝酵素の転写制御は、正の調節タンパク質、ＧＡＬ４とＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐの対称ＤＮＡ配列（ＵＡＳ）との間の相互作用によって媒介される。
野生のＧＡＬ４は８８１個のアミノ酸残基からなり、９９ｋＤａの分子量を有する。ＧＡＬ４は、その組み合わせられた活性がインビボでＧＡＬ４の活性の原因となる機能的自律ドメインを含む。Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36。ＧＡＬ４のＮ末端の６５個のアミノ酸は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む。Keegan et al.(1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン中に存在する６個のＣｙｓ残基によって配位された二価カチオンの存在を要する。配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡヘリックスの主溝との直接接触を介して１７ｂｐのＵＡＳの各端で保存されたＣＣＧトリプレットと相互作用し、これを認識する。Marmorstein et al.(1992) Nature 356:408-14。タンパク質のＤＮＡ結合機能は、活性化ドメインが転写を指示することができるように、Ｃ末端転写活性化ドメインをプロモーターの近くに配置する。
特定の実施形態で利用され得るさらなるＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、限定されないが、ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からの結合配列；ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からのコンセンサス結合配列またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン）；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ（例えば、Brent & Ptashne (1985)、上記参照）；ＬａｃＲ（例えば、Labow et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:3343-56；Baim et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(12):5072-6参照）；ステロイドホルモン受容体（Ellliston et al.(1990) J.Biol.Chem.265:11517-121）；Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号明細書）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合するが、不在下では結合しない突然変異Ｔｅｔリプレッサー；ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合ドメイン；ならびにＧＡＬ４、ホルモン受容体およびＶＰ１６の融合を利用する、Wang et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17):8180-4に記載されている調節システムの成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物に使用されるヌクレアーゼの１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインが天然のまたは操作された（非天然の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの病気を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、２５種超の異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物転写活性化物質を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Kay et al (2007) Science 318:648-651参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含んでいる。最もよく特徴付けられているＴＡＬエフェクターの１つがキサントモナス・カムペストリス病原型ベスカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレット参照）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含んでおり、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含んでいる。さらに、ＴＡＬエフェクターは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含んでいる（概要については、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272参照）。さらに、植物病原性細菌である青枯病菌（Ralstonia solanacearum）では、青枯病菌次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および次亜種４菌株ＲＳ１０００においてキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同性のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が発見された（Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384参照）。これらの遺伝子は互いにヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，４２０，７８２号明細書および第８，４４０，４３１号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
他の実施形態では、ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）座（Jansen et al., 2002.Mol.Microbiol.43: 1565-1575；Makarova et al., 2002.Nucleic Acids Res.30: 482-496；Makarova et al., 2006.Biol.Direct 1: 7；Haft et al., 2005.PLoS Comput.Biol.1: e60）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素の組み合わせを含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの連続工程で標的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。最初に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、標的認識のためのさらなる要件であるｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー中に二本鎖切断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活動は３つの工程を含む：（ｉ）「適応」と呼ばれる工程で、外来ＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して将来の攻撃を防ぐ、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、引き続いて（ｉｉｉ）外来核酸によるＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然な機能と関係し、外来ＤＮＡの挿入等の機能において役割を果たす。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質が天然Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。野生の配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、野生の配列のポリペプチドと共通の質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それだけに限らないが、対応する野生の配列のポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、野生の配列の断片、ならびに野生の配列のポリペプチドおよびその断片の誘導体を含む。本明細書において考えられる生物学的活性は、機能的誘導体がＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異形、その共有結合修飾、および融合体のいずれも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適当な誘導体は、それだけに限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾を含む。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得られても、化学的に合成されても、これらの２つの手順の組み合わせによってもよい。細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するもしくは外因的に導入された核酸（この核酸は内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞であり得る。いくつかの場合、細胞はＣａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作される。
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドが、宿主生物のゲノム核酸に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合する。いくつかの例では、任意の数の個別の例の標的ヌクレオチド配列が宿主ゲノム中に見出され得る。標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中でまれであり得る（例えば、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１未満のコピーの標的配列がゲノム中に存在し得る）。例えば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中の特有の部位に位置し得る。標的ヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、互いに関してゲノムの全体にわたってランダムに分布していてもよいし；ゲノム中の異なる連鎖群に位置していてもよいし；同じ連鎖群に位置していてもよいし；異なる染色体上に位置していてもよいし；同じ染色体上に位置していてもよいし；生物において類似の条件下で（例えば、同じ、または実質的に機能的に同一の調節因子の制御下で）発現する部位においてゲノム中に位置していてもよいし；ゲノム中に互いに接近して位置していてもよい（例えば、標的配列がゲノム座においてコンカテマーとして組み込まれた核酸中に含まれていてもよい）。
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼ
特定の実施形態では、キメラポリペプチドに標的配列との特異的結合を与えるために、標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドが、キメラポリペプチドに含まれ得る。例では、これらのポリペプチドは上に記載されているので、このようなキメラポリペプチドは、例えば、限定されないが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含み得る。ＤＮＡ結合ポリペプチド、ならびにヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、他の機能的ポリペプチドモチーフおよび／またはドメイン、例えば、限定されないが、キメラタンパク質中の機能的ポリペプチド間に位置するスペーサー配列；リーダーペプチド；融合タンパク質を小器官（例えば、核）に標的化するペプチド；細胞酵素によって切断されるポリペプチド；ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ等）；およびキメラポリペプチドの機能に干渉しない他のアミノ酸配列を含んでもよい。
キメラポリペプチド中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）は作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成するために、少なくともインフレームの互いに連結した機能的ポリペプチドをコードする単一ポリヌクレオチドからの発現によって作動可能に連結され得る。代替実施形態では、キメラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、他の手段、例えば、独立に発現するポリペプチドの架橋によって作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドが、天然の単離タンパク質（またはその突然変異体）に含まれ、天然の単離タンパク質またはその突然変異体がヌクレアーゼポリペプチドも含む（また、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含んでもよい）。このような単離タンパク質の例は、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、およびメガヌクレアーゼを含む。
本明細書で使用される場合、「標的化エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然のまたは操作された単離タンパク質およびその突然変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼを含むキメラポリペプチドを指す。（例えば、標的配列は座において野生の配列に含まれるので、または標的配列は、例えば、組換えによって座に導入されているので）ＦＡＤ２座に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドを含む任意の標的化エンドヌクレアーゼが特定の実施形態で利用され得る。
本発明の特定の実施形態で有用となり得るキメラポリペプチドのいくつかの例は、限定されないが、以下のポリペプチドの組み合わせを含む：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；転写因子ＤＮＡ結合モチーフ；ならびに例えば、限定されないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識および／または切断ドメイン；ならびに当業者に公知のその他。特定の例は、部位特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質を含む。キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドを対象となる特定のヌクレオチド配列に標的化するために、キメラポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を変えるよう当業者に公知の方法によって操作され得る。
特定の実施形態では、キメラポリペプチドがＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクタードメイン等）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインと異種性であり得る。異種性切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが得られ得る代表的なエンドヌクレアーゼは、それだけに限らないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al.(eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つまたはそれ以上が切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用され得る。
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を要する、上に示される任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断に２つの融合タンパク質が要求される。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよいし、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに対して、２つの融合タンパク質とそれぞれの標的部位の結合が、切断ハーフドメインを、切断ハーフドメインが例えば、二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にする、互いに対する空間的配向に配置するように配置される。したがって、特定の実施形態では、標的部位の接近端が５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドによって分離されている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在することができる（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断の部位は標的部位の間にある。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、例えば、１つまたはそれ以上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位でまたはその近くに組み込まれるように、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位でまたはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位からの９個のヌクレオチドおよび他方の鎖上の認識部位からの１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号明細書；第５，４３６，１５０号明細書および第５，４８７，９９４号明細書；ならびにLi et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim et al.(1994b) J.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質が、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、１つまたはそれ以上の操作されていてもされていなくてもよいジンクフィンガー結合ドメインとを含む。
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な代表的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示の融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の一部が切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた細胞配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換のために、触媒活性切断ドメインを再構成するためにそれぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が使用され得る。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含む単一のポリペプチド分子も使用され得る。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
代表的なＩＩＳ型制限酵素は、全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７０１３４７９６号明細書に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインと切断ドメインとを含み、これらも本開示によって考慮される。例えば、Roberts et al.(2003) Nucleic Acids Res.31:418-420を参照されたい。
特定の実施形態では、切断ドメインが、例えば、その全ての開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書および第２００８０１３１９６２号明細書に記載されているように、１つまたはそれ以上のホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ操作切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの代表的な操作切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対を含む。
したがって、一実施形態では、４９０の突然変異が、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；５３８の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；４８６の突然変異がＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し；４９９の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と示される操作切断ハーフドメインを製造し、かつ別の切断ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と示される操作切断ハーフドメインを製造することによって調製された。本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化されたまたは消滅した絶対ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書を参照されたい。
特定の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に置換する突然変異および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書を参照されたい）。本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、任意の適当な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００８０１３１９６２号明細書；および第２０１１０２０１０５５号明細書に記載されているような野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号明細書参照）。このようなスプリット酵素の成分は別々の発現構築物で発現してもよいし、または個々の成分が例えば、自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離されている１つのオープンリーディングフレームで連結されていてもよい。成分は個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
Ｃ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
具体的な実施形態では、キメラポリペプチドが、外因性核酸またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る標的化部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断に送達されるよう設計され得るカスタム設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である（参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許出願公開第２０１００２５７６３８号明細書参照）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの非特異的切断ドメインと、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである。例えば、Huang et al.(1996) J.Protein Chem.15:481-9；Kim et al.(1997a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616-20；Kim et al.(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-60；Kim et al.(1994) Proc Natl.Acad.Sci.USA 91:883-7；Kim et al.(1997b) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12875-9；Kim et al.(1997c) Gene 203:43-9；Kim et al.(1998) Biol.Chem.379:489-95；Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res.26:1233-9；Smith et al.(1999) Nucleic Acids Res.27:674-81を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮが非標準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む（参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書参照）。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。結果として、このようなエンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮも、標的ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を要する。Mani et al.(2005) Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7; Smith et al.(2000) Nucleic Acids Res.28:3361-9。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する正反対に配向したＤＮＡ結合部位によって促進され得る。前記。
ＺＦＮ系の柔軟性および特異性は、公知のリコンビナーゼ媒介遺伝子編集戦略によって以前は達成することができなかった一定レベルの制御をもたらす。一例として、ＺＦＮは、例えば、特異的核酸配列を認識するように容易に操作され得る。Wu et al.(2007) Cell.Mol.Life Sci.64:2933-44（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書、第２０１１０１８９７７５号明細書、第２０１１０１６７５２１号明細書および第２０１００１９９３８９号明細書参照）。ジンクフィンガー認識残基に関するコドンのランダム化は、恣意的に選択されたＤＮＡ配列に対して高い親和性を有する新しいフィンガーの選択を可能にする。さらに、ジンクフィンガーは天然のＤＮＡ結合分子であり、操作されたジンクフィンガーは生細胞でその設計された標的に作用することが示されている。したがって、ジンクフィンガーに基づくヌクレアーゼは、特異的であるが、恣意的な認識部位を標的化可能である。
特定の例では、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２性能座に部位特異的に組み込む方法が、ＺＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含み、ＺＦＮが標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合し、標的ヌクレオチド配列が宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２座に含まれる。特定の例では、標的ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのＦＡＤ２座以外の位置において宿主のゲノムに含まれない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは、（例えば、ＦＡＤ２座をシーケンシングすることによって）少なくとも１つのＦＡＤ２座中の同定された標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合するよう操作され得る。ＺＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含む、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ２性能座に部位特異的に組み込む方法は、外因性核酸を細胞に導入する工程を含んでもよく、外因性核酸の少なくとも１つのＦＡＤ２座を含む宿主の核酸への組換えは、ＺＦＮの部位特異的認識および標的配列との結合（およびその後のＦＡＤ２座を含む核酸の切断）によって促進される。
Ｖ．ＦＡＤ２座における組込みのための外因性核酸
本発明の実施形態は、少なくとも１つのＦＡＤ２座への部位特異的組込みのための外因性核酸、例えば、限定されないが、ＰＴＵ、ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたはＯＲＦ；標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および前記のいずれかまたは両方の少なくとも１つを含むベクターからなる群から選択される１つまたはそれ以上の核酸を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態で使用するための特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造ヌクレオチド配列ならびに／或いはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
Ａ．部位特異的組込みのための外因性核酸分子
上記のように、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現増加のために、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）が挿入される。ドナー配列が典型的には配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかであるだろう。ドナー配列は、対象となる位置での効率的なＨＤＲを可能にするための相同性の２つの領域が隣接した非相同性配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン中の対象となる領域と相同性でない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの不連続領域を含むことができる。例えば、対象となる領域中に通常は存在しない配列の標的化挿入のために、前記配列がドナー核酸分子中に存在し、対象となる領域中の配列と相同性の領域が隣接していてもよい。
ドナーポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書、第２０１１０２８１３６１号明細書、第２０１１０２０７２２１号明細書および米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書を参照されたい。線状型で導入される場合、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端に連結される。例えば、Chang et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls et al.(1996) Science 272:886-889を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するさらなる方法は、限定されないが、末端アミノ基の付加および修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含む。
ポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、薬剤、例えば、リポソームもしくはポロキサマーと複合体化した核酸として導入され得る、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
ドナーは一般的に、その発現が組込み部位の内因性プロモーター、すなわち、ドナーが組み込まれる内因性遺伝子（例えば、ＦＡＤ２）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーがプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成型プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことが明らかであるだろう。
さらに、発現に要求されないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
実施形態において、ＦＡＤ２座を修飾するために、少なくとも１つのＦＡＤ２座に部位特異的様式で組み込まれ得る外因性核酸は、例えば、限定されないが、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；農学的遺伝子を含む核酸；ＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；またはＦＡＤ２遺伝子を破壊する核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座を修飾するために、外因性核酸がＦＡＤ２座において組み込まれ、農学的遺伝子またはヌクレオチド配列がＦＡＤ２座から宿主中で発現するように、核酸が農学的遺伝子または対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、対象となるポリペプチド（例えば、外来タンパク質）が、商業的な量で対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から発現する。このような例では、対象となるポリペプチドが、宿主細胞、組織またはバイオマスから抽出され得る。いくつかの実施形態では、宿主が植物であり、対象となるポリペプチドの商業的製造のために用意される植物材料が植物、植物部位、植物組織または植物細胞であり得る。いくつかの例では、植物部位が植物種子であり得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、Heney and Orr (1981) Anal.Biochem.114:92-6で論じられている公知の方法によって達成され得る。
同様に、農学的遺伝子は、形質転換植物細胞、植物および／またはその子孫で発現され得る。例えば、植物は、少なくとも１つのＦＡＤ２座から農学的対象となる種々の表現型を発現するように特定の実施形態の方法を介して遺伝的に操作され得る。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸が、例えば、限定されないが、有害生物または病気に対する耐性を与える遺伝子（例えば、Jones et al.(1994) Science 266:789（クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）に対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Martin et al.(1993) Science 262:1432; Mindrinos et al.(1994) Cell 78:1089（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する耐性のためのＲＳＰ２遺伝子）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９６／３０５１７号パンフレット（ダイズシストセンチュウに対する耐性）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９３／１９１８１号パンフレット）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体、またはその上にモデル化される合成ポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、Geiser et al.(1986) Gene 48:109（Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列；さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣ寄託番号４００９８；６７１３６；３１９９５；および３１９９８で、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入され得る））；レクチンをコードする遺伝子（例えば、Van Damme et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:25（いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列）参照）；ビタミン結合タンパク質、例えば、アビジンをコードする遺伝子（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＵＳ９３／０６４８７号パンフレット（害虫に対する殺幼虫剤としてのアビジンおよびアビジンホモログの使用）参照）；酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ、プロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤をコードする遺伝子（例えば、Abe et al.(1987) J.Biol.Chem.262:16793（イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；Huub et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:985（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；Sumitani et al.(1993) Biosci.Biotech.Biochem.57:1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）αアミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）および米国特許第５，４９４，８１３号明細書参照）；昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドもしくは幼若ホルモン、その変異形、それに基づく模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニストをコードする遺伝子（例えば、Hammock et al.(1990) Nature 344:458（クローニング幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活性化因子）参照）；発現すると、冒された有害生物の生理学を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチドをコードする遺伝子（例えば、Regan (1994) J.Biol.Chem.269:9（発現クローニングが昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡをもたらす）；Pratt et al.(1989) Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243（ディプロプテラ・パンタタ（Diploptera puntata）のアロスタチン）；および米国特許第５，２６６，３１７号明細書（昆虫特異的麻痺性神経毒をコードする遺伝子）参照）；ヘビ、スズメバチまたは他の生物によって天然に産生される昆虫特異的毒液をコードする遺伝子（例えば、Pang et al.(1992) Gene 116:165（サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現）参照）；モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する他の分子の高度蓄積を担う酵素をコードする遺伝子；生物学的活性分子の転写後修飾を含む修飾に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼまたはグルカナーゼ（天然または合成のいずれも）をコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第９３／０２１９７号パンフレット（カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；さらに、キチナーゼコード配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、寄託番号３９６３７および６７１５２で、ＡＴＣＣから得られ得る；Kramer et al.(1993) Insect Biochem.Molec.Biol.23:691（タバコスズメガキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；およびKawalleck et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:673（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）参照）；シグナル伝達を刺激する分子をコードする遺伝子（例えば、Botella et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:757（リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列）；およびGriess et al.(1994) Plant Physiol.104:1467（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列）参照）；疎水性モーメントペプチドをコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第９５／１６７７６号パンフレット（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体）；およびＰＣＴ国際特許出願公開第９５／１８８５５号パンフレット（耐病性を与える合成抗微生物ペプチド）参照）；膜パーミアーゼ、チャネルフォーマーまたはチャネルブロッカーをコードする遺伝子（例えば、Jaynes et al.(1993) Plant Sci 89:43（トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して耐性にするためのセクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現）参照）；ウイルス侵入タンパク質またはこれに由来する複合毒素をコードする遺伝子（例えば、Beachy et al.(1990) Ann.rev.Phytopathol.28:451参照）；昆虫特異抗体またはこれに由来する免疫毒素をコードする遺伝子（例えば、Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)（単鎖抗体断片の産生を介したトランスジェニックタバコにおける酵素不活性化）参照）；ウイルス特異抗体をコードする遺伝子（例えば、Tavladoraki et al.(1993) Nature 366:469（組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物はウイルス攻撃から保護される）参照）；病原体または寄生生物によって天然に産生される発育遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Lamb et al.(1992) Bio/Technology 10:1436（真菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌定着および植物栄養放出を促進する）；Toubart et al.(1992) Plant J.2:367（マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付け）参照）；植物によって天然に産生される発育遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Logemann et al.(1992) Bio/Technology 10:305（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現しているトランスジェニック植物は真菌病に対する増加した耐性を有する）参照）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチドを含む核酸が同様におよび／または代わりに、例えば、限定されないが、除草剤、例えば、成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する耐性を与える遺伝子（このカテゴリーの代表的な遺伝子は、例えば、それぞれLee et al.(1988) EMBO J.7:1241およびMiki et al.(1990) Theor.Appl.Genet.80:449に記載されているように突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする；例えば、（組換え核酸の導入および／または野生型ＥＰＳＰ遺伝子（それだけに限らないが、ＣＰ４、ＤＭＭＧおよびＤＧＴ−２８を含む）の種々の形態のインビボ突然変異誘発を介して）突然変異５−エノイルピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子；ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によってそれぞれ与えられるグリホサート耐性）；他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属の種からのグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子；ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）を含んでもよい。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号明細書および第６，２４８，８７６号明細書（植物にグリホサート耐性を与えることができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。突然変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ寄託番号３９２５６で得られ得る。米国特許第４，７６９，０６１号明細書（突然変異ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）も参照されたい。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書は、除草剤、例えば、Ｌ−ホスフィノトリシンに対する耐性を与えることができる、グルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。代表的なＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書およびDeGreef et al.(1989) Bio/Technology 7:61（ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の製造）に提供されている。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン、例えば、セトキシジムおよびハロキシホップに対する耐性を与える遺伝子の例は、Marshall et al.(1992) Theor.Appl.Genet.83:435に記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリホサート耐性を与えることができるＧＡＴ遺伝子は、例えば、国際公開第２００５０１２５１５号パンフレットに記載されている。２，４−Ｄ−フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性を与える遺伝子は、例えば、国際公開第２００５１０７４３７号パンフレットおよび国際公開第２００７０５３４８２号パンフレットに記載されている。
対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、限定されないが、光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を与える遺伝子を含んでもよい。例えば、Przibila et al.(1991) Plant Cell 3:169（突然変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属の形質転換）を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子はＡＴＣＣ寄託番号５３４３５；６７４４１；および６７４４２で入手可能である。Hayes et al.(1992) Biochem.J.285:173（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現）も参照されたい。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸が同様におよび／または代わりに、付加価値形質、例えば、限定されないが、例えば、植物のステアリン酸含量を増加させるためにステアリルＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝（例えば、Knultzon et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624参照）；例えば、フィターゼコード遺伝子の導入がフィターゼの破壊を強化し、より多くの遊離ホスフェートを形質転換植物に付与する（例えば、Van Hartingsveldt et al.(1993) Gene 127:87（クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列；トウモロコシ中のフィターゼ含量を低下させるための遺伝子が導入されてもよく、例えば、これは低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体の原因となり得る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングし、次いで再導入することによって達成され得る（Raboy et al.(1990) Maydica 35:383参照）参照）；および例えば、デンプンの分岐パターンを変える酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによってもたらされる修飾された炭水化物組成（例えば、Shiroza et al.(1988) J.Bacteol.170:810（ストレプトコッカス属突然変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Steinmetz et al.(1985) Mol.Gen.Genet.20:220（レバンスクラーゼ）；Pen et al.(1992) Bio/Technology 10:292（α−アミラーゼ）；Elliot et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:515（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Sogaard et al.(1993) J.Biol.Chem.268:22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；およびFisher et al.(1993) Plant Physiol.102:1045（トウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ）参照）を与えるまたはこれに寄与する遺伝子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ２座を修飾するために、外因性核酸がＦＡＤ２座において組み込まれ、例えば、その後のＰＴＵまたはＥＬＰの部位における第２の外因性核酸の部位特異的組込みが促進されるように、核酸がＰＴＵまたはＥＬＰを含む。米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書も参照されたい。
標的化組込みを介した対象となる核酸分子の植物ゲノムへの標的化エンドヌクレアーゼ媒介組込みは、標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼコード核酸分子の送達、引き続いて宿主中での機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を要する。機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質が少なくとも１つのＦＡＤ２座の標的部位において二本鎖切断を誘導し、次いでこれが例えば、外因性核酸の座への相同性駆動組込みを介して修復されるように、標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞に送達されるまたはそこで発現するのと同時に外因性核酸も好ましくは宿主細胞中に存在する。当業者であれば、機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現が、それだけに限らないが、標的化エンドヌクレアーゼコード構築物の遺伝子組換え、および標的化エンドヌクレアーゼコード構築物の一過性発現を含むいくつかの方法によって達成され得ることを認識し得る。これらの両ケースで、ＦＡＤ２座における標的化組込みを駆動するために、機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現および外因性核酸の宿主細胞への送達が同時に達成され得る。
標的化エンドヌクレアーゼとしてＺＦＮを利用する実施形態で得られる特定の利点は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインの二量体化の必要条件が高レベルの配列、したがって切断特異性を与えることである。３つのフィンガーの各セットが９個の連続塩基対に結合するので、各ジンクフィンガードメインが完全な特異性を有する場合、２つのキメラヌクレアーゼが１８ｂｐの標的を有効に要求する。この長さの任意の所与の配列は、単一ゲノム中で特有であると予想される（約１０９ｂｐと仮定）。上記Bibikova et al.(2001) Mol.Cell.Biol.21(1):289-97; Wu et al.(2007)。さらに、さらなるフィンガーが強化された特異性を提供することができる（Beerli et al.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14628-33；Kim and Pabo (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2812-7；Liu et al.(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525-30）ので、さらなる特異性を提供するために各ＤＮＡ結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が増加され得る。例えば、２４ｂｐ配列を認識する４−、５−、６−またはそれ以上のフィンガーＺＦＮ対を用いることによって、特異性がさらに増加され得る。Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51。したがって、宿主植物ゲノムに導入された認識配列がゲノム中で特有となるように、ＺＦＮが使用され得る。
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、標的化エンドヌクレアーゼ中に含まれるポリペプチドをコードする野生のヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）によって操作され得る。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が調査され得、このヌクレオチド配列がＤＮＡ結合ポリペプチドを含む標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の要素として使用され得る。あるいは、例えば、遺伝暗号の縮重にしたがって、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定するために、標的化エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列が使用され得る。
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む代表的な核酸分子では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンが、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく、任意の数のヌクレオチドトリプレットによって分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌクレアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンが、任意の数のヌクレオチドトリプレットによって分離され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最後の（すなわち、核酸配列のほぼ３’）の最後のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列、例えば、合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用されたかもしれないヌクレオチドリンカー）によってコードされるもの以下によってそこから分離されたさらなるポリヌクレオチドコード配列の最初のコドンと相レジスターで融合され得る。このようなさらなるポリヌクレオチド配列の例は、例えば、限定されないが、タグ、標的化ペプチド、および酵素切断部位を含む。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列のほぼ５’（核酸配列中）の最初のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列以下によってそこから分離されたさらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと相レジスターで融合され得る。
標的化エンドヌクレアーゼ中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を分離する配列は、例えば、コードされるアミノ酸配列が標的化エンドヌクレアーゼの翻訳を有意に変えにくいような任意の配列からなることができる。公知のヌクレアーゼポリペプチドおよび公知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自律的性質のために、例では介在配列はこれらの構造のそれぞれの機能に干渉しないだろう。
Ｃ．ベクターおよび発現構築物
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドおよび／または標的化エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、発現のために細胞、組織または生物に導入され得る。例えば、少なくとも１つのＦＡＤ２座中に含まれるヌクレオチド配列を特異的に認識する標的化エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が、標的化エンドヌクレアーゼの発現のために細胞に導入され得、また対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、例えば、発現した標的エンドヌクレアーゼによる座における二本鎖切断の導入後の相同組換えによって少なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込まれ、対象となるポリペプチドが組み込まれたポリヌクレオチド配列から発現するように、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、核酸分子、例えば、前記の１つが、例えば、限定されないが、直線状プラスミドまたは閉環状プラスミドを含むベクター系であってもよい。特定の例では、ベクターが発現ベクターであってもよい。特定の実施形態による核酸配列は、例えば、核酸配列が１つまたはそれ以上の調節配列と作動可能に連結されるように、ベクターに組み込まれ得る。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、特定のベクターの選択は、例えば、ベクターに挿入される核酸のサイズ、ベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞、および／または発現することが望まれる任意のコードされたポリペプチドの量に依存し得る。ベクターは、典型的には種々の成分を含み、その素性はベクターの機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）、およびベクターが適合性である特定の宿主細胞に依存する。
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のコード配列と作動可能に連結された調節配列が、核酸分子が増幅または発現される宿主細胞、例えば、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞または植物細胞中で機能するプロモーター配列であってもよい。いくつかの実施形態は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結された少なくとも１つの調節配列を含むヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含むことができ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼを産生するために、植物細胞、組織または生物中で調節配列の制御下で発現され得る。
いくつかの実施形態による核酸分子に使用するのに適したプロモーターは、その全てが当分野で周知である、誘導性、組織特異的、ウイルス、合成または構成型であるものを含む。本発明の実施形態に有用となり得るプロモーターの非限定的例は、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号明細書（構成型トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書（３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（双方向性プロモーター）；第６，６３５，８０６号明細書（γ−コイキシンプロモーター）；第５，４４７，８５８号明細書（大豆ヒートショックプロモーター）；ならびに米国特許出願第０９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシクロロプラストアルドラーゼプロモーター）によって提供される。
さらなる代表的なプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9）；オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発プラスミドに維持される）；カリモウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Lawton et al.(1987) Plant Mol.Biol.9:315-24）；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Odell et al.(1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al.(1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；ならびにＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ０００８７；Depicker et al.(1982) J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan et al.(1983) Nature 304:184-7）を含む。
特定の実施形態では、核酸分子が組織特異的プロモーターを含んでもよい。組織特異的プロモーターは、生物の他の組織に対してプロモーターが特異的である組織中の作動可能に連結されたヌクレオチド配列の高レベルの転写を指示するヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例は、限定されないが、タペータム特異的プロモーター；葯特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号明細書および国際ＰＣＴ公開第９９／０４２５８７号パンフレット参照）；胚珠特異的プロモーター（例えば、米国特許出願公開第２００１／０４７５２５ Ａ１号明細書参照）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号明細書および第５，７５３，４７５号明細書参照）；および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号明細書および第５，６０８，１５２号明細書参照）を含む。いくつかの実施形態では、発育段階特異的プロモーター（例えば、発育の後期で活性のプロモーター）が使用され得る。
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、翻訳リーダー配列として機能する、プロモーター配列とコード配列との間に位置する５’ＵＴＲを含む。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡ中に存在し、一次転写産物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は、トウモロコシおよびペチュニアヒートショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼリーダーなどを含む。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech.3(3):225-36を参照されたい。５’ＵＴＲの非限定的例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａｋ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J.Virol.64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al.(1983)、上記）によって提供される。
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらはヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝要素であり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物において、ポリアデニル酸ヌクレオチドのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加を引き起こすよう機能する。ポリアデニル化配列は、種々の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的例は、ノパリンシンターゼ３’領域である（ｎｏｓ３’；Fraley et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al.(1989) Plant Cell 1:671-80で提供される。ポリアデニル化シグナルの非限定的例は、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al.(1984) EMBO J.3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０１３１２）からのものを含む。
特定の実施形態で有用となり得る調節配列に関するさらなる情報は、例えば、Goeddel (1990)「Gene Expression Technology」, Methods Enzymol.185, Academic Press, San Diego, CAに記載されている。
組換え核酸分子またはベクターは、形質転換細胞、例えば、植物細胞に選択可能な表現型を与える選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを含む核酸分子を含む細胞または生物を選び出すためにも使用され得る。マーカーは、殺生物剤耐性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシンおよびハイグロマイシン）または除草剤耐性（例えば、グリホサート）をコードし得る。選択可能なマーカーの例は、それだけに限らないが、カナマイシン耐性を与え、例えば、カナマイシンおよびＧ４１８を使用して選び出され得るｎｅｏ遺伝子；ビアラホス耐性を与えるｂａｒ遺伝子；グリホサート耐性を与える突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含む。例えば、限定されないが、アンピシリン；ブレオマイシン；クロラムフェニコール；ゲンタマイシン；ハイグロマイシン；カナマイシン；リンコマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン；プロマイシン；スペクチノマイシン；リファンピシン；ストレプトマイシン；およびテトラサイクリンを含む化学薬剤に対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用可能である。このような選択可能なマーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書；第５，６３３，４３５号明細書；第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４７号明細書に示されている。
核酸分子またはベクターが、同様にまたは代わりにスクリーニング可能なマーカーを含んでもよい。発現を監視するためにスクリーニング可能なマーカーが使用され得る。代表的なスクリーニング可能なマーカーは、種々の発色基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al.(1987) Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405）；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ座遺伝子（Dellaporta et al.(1988) 「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.」In 18th Stadler Genetics Symposium, P.Gustafson and R.Appels, eds., Plenum, NY (pp.263-82)）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al.(1978) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41）；種々の発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al.(1986) Science 234:856-9）；発色性カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al.(1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al.(1990) Bio/Technol.8:241-2）；チロシンを、ＤＯＰＡおよび縮合してメラニンになるドーパキノンに酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al.(1983) J.Gen.Microbiol.129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼを含む。
例えば、対象となる特定のポリペプチドまたは特定の標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の全ては、当業者によって直ちに認識可能であるだろう。遺伝暗号の縮重が、特定のアミノ酸配列に有限数のコード配列を提供する。本発明の実施形態によるポリペプチドをコードする特定の配列の選択は専門家の裁量の範囲内にある。異なるコード配列は異なる用途に望ましくなり得る。
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主の核酸中に含まれるポリヌクレオチド配列の発現を強化するために、核酸のヌクレオチドを修飾することが望ましくなり得る。遺伝暗号は６４個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物はこれらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も一般的に利用されているコドンは最適コドンと呼ばれ、あまり一般的に利用されていないものはレアまたは低使用頻度コドンとして分類される。Zhang et al.(1991) Gene 105:61-72。コドンは、時々「コドン最適化」と呼ばれるプロセスで、特定の宿主の好ましいコドン使用を反映するよう置換され得る。特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化コード配列が、例えば、翻訳速度を増加させるまたは望ましい特性（例えば、非最適化配列から産生される転写産物と比べて長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写産物を産生するために調製され得る。
核酸は、本発明の実施形態において、例えば、限定されないが、プロトプラストの形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）；乾燥／阻害−媒介ＤＮＡ取り込み（例えば、Potrykus et al.(1985) Mol.Gen.Genet.199:183-8参照）；電気穿孔（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）；アグロバクテリウム媒介形質転換（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参照）；およびＤＮＡコーティング粒子の加速（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書参照）を含む当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞に導入され得る。これらのような技術の適用を通して、事実上いずれの種の細胞も安定的に形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞がトランスジェニック生物に再生され得る。例えば、トランスジェニック植物のゲノム中に本発明の１つまたはそれ以上の核酸配列を含むトランスジェニック植物を産生するために、これらの技術のいずれかが使用され得る。
発現ベクターを植物に導入するための最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換システムに基づくものである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉおよびＲｉプラスミドがそれぞれ植物の遺伝子形質転換を担う遺伝子を導入する。Ｔｉ（腫瘍誘発）−プラスミドは、形質転換植物に運ばれる、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大型セグメントを含む。Ｔｉプラスミドの別のセグメントであるｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ導入を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域は、それぞれ末端反復ヌクレオチド配列で構成された左手および右手境界に縁どられている。いくつかの修飾バイナリーベクターでは、腫瘍誘発性遺伝子が欠失しており、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列に縁どられている外来ＤＮＡを導入するためにｖｉｒ領域の機能が利用される。Ｔ−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞を効率的に回収するための選択可能なマーカー、ならびに導入するための挿入配列、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸のための複数のクローニングサイトを含んでもよい。
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，９６７号明細書；ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書）またはアグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する。さらなる植物形質転換ベクターは、例えば、限定されないが、Herrera-Estrella et al.(1983) Nature 303:209-13；Bevan et al.(1983)、上記；Klee et al.(1985) Bio/Technol.3:637-42；および欧州特許第０１２０５１６号明細書に記載されているもの、ならびに前記のいずれかに由来するものを含む。いくつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するために、植物と自然に相互作用する他の細菌、例えば、シノリゾビウム属、リゾビウム属およびメソリゾビウム属が修飾され得る。これらの植物関連共生細菌は、非武装Ｔｉプラスミドと適当なバイナリーベクターの両方の獲得によって遺伝子導入に適格性にされ得る。
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、形質転換体を産生するために使用されるベクターと共に、前記の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望まれ得る。選択可能なマーカーが使用される場合、形質転換細胞は、これらの細胞を１つまたはそれ以上の選択剤に暴露することによって、潜在的に形質転換された細胞集団中で同定される。スクリーニング可能なマーカーが使用される場合、細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングされ得る。
選択剤への暴露を生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化された細胞が、植物の再生を支持する培地中で培養され得る。いくつかの実施形態では、任意の適当な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）が、さらなる物質、例えば、成長調節物質を含めることによって修飾され得る。植物再生運動を開始するのに十分な組織が利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態が再生に適したものになるまで（例えば、少なくとも２週間）、組織が成長調節物質を含む基本培地に維持され、次いで、シュート形成を促す培地に移され得る。十分なシュート形成が起こるまで、培養物が定期的に移される。いったんシュートが形成されたら、これらは根形成を促す培地に移される。いったん十分な根が形成されたら、植物はさらなる成長および成熟のために土壌に移され得る。
再生植物中の対象となる核酸分子（例えば、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＰＣＲ、ならびに核酸シーケンシング；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット法）または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および全再生植物の表現型の分析を含む。
組込みイベントは、例えば、対象となるヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって分析され得る。ＰＣＲジェノタイピングは、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想される単離宿主植物組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いてＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解される。ＰＣＲジェノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002) Plant J.32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用され得る。
アグロバクテリウム依存型形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には単一から複数コピーの組換えＤＮＡを含む。単一組換えＤＮＡ配列は「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。このようなトランスジェニック植物は挿入されたＤＮＡ配列がヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物が、単一外因性遺伝子配列を含む独立分離トランスジェニック植物を自身、例えばＦ０植物と有性交配（自殖）してＦ１種子を産生することによって得られ得る。産生されたＦ１種子の４分の１が導入遺伝子に関してホモ接合性となる。Ｆ１種子の出芽が、典型的にはＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合体とホモ接合体との間の差異を認める熱増幅アッセイ（すなわち、接合生殖性アッセイ）を用いて、ヘテロ接合性について試験され得る植物をもたらす。
いくつかの実施形態における植物または植物細胞の核酸分子を用いた直接形質転換に加えて、特定の実施形態では、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をこのようなイベントを欠く第２の植物と交雑することによって、トランスジェニック植物が調製され得る。例えば、外因性核酸が部位特異的様式で組み込まれた少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む核酸が、形質転換に修正可能な第１の植物系統に導入されてトランスジェニック植物を産生し、このトランスジェニック植物が第２の植物系統と交雑されて少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座（およびそれゆえに外因性核酸）を第２の植物系統に遺伝子移入することができる。
再生植物中の対象となる核酸分子の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット法）または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および全再生植物の表現型の分析を含む。
標的化組込みイベントは、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングされ得る。ＰＣＲジェノタイピングは、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想される単離宿主植物カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いてＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解される。ＰＣＲジェノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002) Plant J.32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用され得る。標的化配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせがＰＣＲ増幅反応で連続的に使用され得るまたは多重化され得る。標的部位にアニールするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマー、導入された核酸配列、および／または２つの組み合わせが実行可能である。したがって、ＰＣＲジェノタイピング戦略は、（それだけに限らないが）植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、またはこれらの組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーと増幅反応のさらなる組み合わせを考案することができる。例えば、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列にアニールするよう設計され得る。
順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、対象となる核酸分子中のコード領域に相当する配列、または対象となる核酸分子の他の部分で、対象となる導入された核酸分子に特異的にアニールするよう設計され得る。これらのプライマーは、上記プライマーと併せて使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列にしたがって合成され得、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｅ、ＩＡから）商業的に入手可能である。増幅に、クローニングおよびシーケンシング、または増幅産物の直接配列解析が続き得る。当業者であれば、ＰＣＲジェノタイピング中に産生した増幅産物の解析のための代替法を認識するだろう。 一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲ増幅に使用される。
ＶＩ．ＦＡＤ２性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物および植物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾された（例えば、外因性配列の破壊および／または標的化組込み）ＦＡＤ２座（例えば、大豆ＦＡＤ２ ２．３座および／またはＦＡＤ２ ２．６座）を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物が提供される。特定の実施形態では、このような植物が、植物組織または植物細胞の形質転換、および全植物の再生によって産生され得る。さらなる実施形態では、このような植物が、部位特異的様式での少なくとも１つのＦＡＤ２座における外因性核酸の導入、または修飾ＦＡＤ２座の生殖質への遺伝子移入を通して得られ得る。このような植物細胞を含む植物材料も提供される。このような植物材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物または植物材料は、いくつかの実施形態では、以下の特性の１つまたはそれ以上を示し得る：植物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの発現；植物の細胞中（またはその中のプラスチド中）の対象となるポリペプチドの発現；植物の細胞の核中の標的化エンドヌクレアーゼの発現；植物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの局在化；植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座における組込み；植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座における対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または農学的遺伝子の組込み；ならびに／或いは植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座において組み込まれたコード配列に対応するＲＮＡ転写産物の存在。このような植物は、例えば、限定されないが、植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ２座において組み込まれた対象となるポリペプチドまたは農学的遺伝子によってその発現が調節される、内因性または導入遺伝子ヌクレオチド配列の発現から生じるもの；昆虫、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定性、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含む１つまたはそれ以上の望ましい形質をさらに有することができる。
本発明によるトランスジェニック植物は、その後本明細書に記載される方法によって少なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込まれる核酸を用いて形質転換され得る任意の植物であり得る。したがって、植物は双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。本方法に使用可能な双子葉植物の非限定的例は、シロイヌナズナ、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、大豆、スカッシュ、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびスイカを含む。本方法に使用可能な単子葉植物の非限定的例は、トウモロコシ、オオムギ、タマネギ、イネ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オートムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよび芝草を含む。本発明によるトランスジェニック植物は任意の様式で使用または栽培され得る。
いくつかの実施形態は、本発明のトランスジェニック植物から製造された商品産物も提供する。商品産物は、例えば、限定されないが、少なくとも１つのＦＡＤ２座に組み込まれた１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む植物の食品、粗粉、油または粉砕穀物もしくは全粒粉または種子を含む。１つまたはそれ以上の商品または商品産物中の１つまたはそれ以上のこのようなヌクレオチド配列の検出は、商品または商品産物が少なくとも一部は本発明の実施形態により産生されたトランスジェニック植物から製造されたという事実上の証拠である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物または種子が、限定されないが、ＲＮＡｉ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・チューリゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を提供する遺伝子）；およびトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子（例えば、増加した収量、変化した脂肪酸代謝または細胞質雄性不稔の修復）を含む、そのゲノム中の少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントを含んでもよい。
少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物は、１つまたはそれ以上の望ましい形質を有することができる。このような形質は、例えば、昆虫、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定性、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含むことができる。望ましい形質は、望ましい形質を示す植物中で発現されるＦＡＤ２座における標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ以上の核酸分子によって与えられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、所望の形質が、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座の部位において植物のゲノム中に導入された、植物中の導入遺伝子の存在により得る。さらなる実施形態では、望ましい形質が、従来の育種を通して得られ、この形質は少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座における標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ以上の核酸分子によって与えられ得る。
本発明によるトランスジェニック植物は、少なくとも１つの修飾ＦＡＤ２座の存在が望ましい任意の様式で使用または栽培され得る。したがって、植物は、特に、その後本発明による少なくとも１つのＦＡＤ２座に部位特異的様式で組み込まれる核酸分子を用いて形質転換されることによって、１つまたはそれ以上の所望の形質を有するように操作され、当業者に公知の任意の方法によって収穫および栽培され得る。
ＶＩＩ．ＦＡＤ２性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物のマーカー利用育種
ダイズにおいてｆａｄ２と連結した（例えば、密に連結した）分子マーカーが提供される。例えば、ＨＯ形質（ｆａｄ２）に関与する配列を含むＤＮＡセグメントが同定される。これらのセグメントは、ゲノム連鎖群中の突然変異対立遺伝子と連結した（例えば、密に連結した）マーカーの周りおよびその間に位置している。したがって、不活性化突然変異を有する突然変異ＦＡＤ２遺伝子を含む核酸分子も提供される。同定されるセグメント、およびそのマーカーは、一部はダイズゲノムの連鎖群中の位置によって、本主題に含まれる。
本明細書において引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、これにより、それらが本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により組み込まれ、あたかも各参考文献が参照により組み込まれることが個別的かつ具体的に示されており、かつ全体が本明細書に示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書において論じられる参考文献は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本発明者らが先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの承認として解釈されるべきものは本明細書中にない。以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を示すために提供される。これらの実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：５種の大豆栽培品種からのＦＡＤ２標的配列のシーケンシング
シーケンシング反応
ゲノムＤＮＡを大豆組織から単離した。ゲノムＤＮＡを、栽培品種Ｘ５およびＷｅｓｔａｇについては凍結乾燥胚形成浮遊細胞から、また栽培品種Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２およびＭａｖｅｒｉｃｋについては若葉から単離および精製した。製造業者のプロトコルによって、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
ＦＡＤ２ ２．３および２．６遺伝子
プライマーＭＡ４９（配列番号１ ｃａａｇｇｇｔｔｃｃａａａｃａｃａａａｇｃｃ）およびＭＡ５１（配列番号２ ｃａｔｃａａｔａｃｔｔｇｔｔｃｃｔｇｔａｃｃ）、またはＭＡ５０（配列番号３ ｇａａｇａａｇｃｃｔｃｔｃｔｃａａｇｇｇｔｔｃ）およびＭＡ５１を用いたＰＣＲによって、ＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６ゲノムＤＮＡ配列を増幅した。１１４０ｂｐの遺伝子の塩基約４０〜１１４０の断片についてゲノムＤＮＡ配列を得た。ＰＣＲ反応条件は、初期変性について９８℃で１分、次いで、３５サイクルの９８℃で３０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３分、および７２℃で５分の最後の伸長であった。
得られたＰＣＲアンプリコンをＴＥバッファに懸濁し（ＴＥバッファ中１μｇ）、設定：ピーク放射電力１４０、デューティファクタ１０％、２００サイクル／爆発、および処理時間４３０秒を用いたＣｏｖａｒｉｓ Ｅ２２０ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）超音波発生装置（Ｃｏｖａｒｉｓ；Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）により、約３００ｂｐの断片にせん断した。製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Ａｐｏｌｌｏ ３２４ＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＩｎｔｅｇｅｎＸ）でＰｒｅｐＸ ＤＮＡライブラリーキット（商標）（ＩｎｔｅｇｅｎＸ；Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）末端対合（paired-end）シーケンシングライブラリーを調製した。手短に言えば、５’または３’オーバーハングを有するせん断ＤＮＡ断片を、５’リン酸化平滑末端ＤＮＡに変換した。１つのアデニン（Ａ）伸長を末端修復ＤＮＡ断片の３’末端に付加し、引き続いて索引付きＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）末端対合（ＰＥ）アダプターに連結した。最後に、アダプター連結ライブラリー産物をロボットから回収し、初期変性については９８℃で３０秒、次いで１０サイクルの９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒、および７２℃で５分の最後の伸長のサーモサイクリング条件下でＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＰＣＲ（商標）試薬を用いたＰＣＲで富化した。富化ライブラリーを２ｎＭに正規化し、プールした。次いで、プールしたライブラリーを水酸化ナトリウムで変性し、Ｍｉｓｅｑフローセル（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にロードするためにハイブリダイゼーションバッファ中６ｐＭに希釈した。６インデックスサイクルで実行する２ｘ１５０サイクルをＩｌｌｕｍｉｎａの推奨プロトコルにしたがってＭｉｓｅｑ（商標）で行った。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（商標）装置から得られた配列反応産生末端対合解読を、ＴｒｕＳｅｑアダプター配列（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にトリミングした。トリミング後、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（Li H.and Durbin R.(2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.Bioinformatics, 25:1754-60）を用いて、解読を栽培品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２の大豆基準骨格にマッピングした。
各大豆栽培品種を別々のサンプルとして処理したので、各栽培品種のシーケンシング解読を別々にマッピングした。マッピングしたシーケンシング解読の深さが０より大きい骨格上の領域を調査した。これらはアンプリコンからのシーケンシング解読であったので、骨格上の特異的領域のみがこれらにマッピングされた解読を有すると予想された。シーケンシング解読を、異なるサンプルにまたがって大豆染色体１０および２０にマッピングした。各サンプルについて、Ｍｐｉｌｅｕｐコンピュータプログラムを用いてコンセンサス配列を得た。これらの結果は、シーケンシング解読が２つのパラログ推定ＦＡＤ遺伝子にマッピングされることを示した。得られた配列解読をアラインメントして、栽培品種Ｘ５、Ｗｅｓｔａｇ、Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２およびＭａｖｅｒｉｃｋから得られたパラログ推定遺伝子配列間のＳＮＰ／変異を同定した。
配列アラインメントを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．０コンピュータプログラムのＡｌｉｇｎＸ（登録商標）プログラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を介して行い、図１および図２に示す。ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）は、類似性比較およびアノテーションのためにタンパク質または核酸配列の複数の配列アラインメントを作成するために修正Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する。図１および図２に示されるように、単離配列の解析は、それぞれのＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６配列が高レベルの配列類似性を共有していることを示した。
ＦＡＤ２ ２．３遺伝子は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２基準ゲノム配列（配列番号４）の染色体１０上の塩基４９，４１７，０７０〜４９，４１８，２１９に相当する。 ５種の栽培品種（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２、Ｊａｃｋ、Ｍａｖｅｒｉｃｋ、Ｘ５およびＷｅｓｔａｇ）の遺伝子の配列は、塩基４１〜１１４０（使用したプライマーにより得られた被覆率）で同一であった。ＦＡＤ２ ２．６遺伝子は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２基準ゲノム配列（配列番号９）の染色体２０上の塩基３４，１７８，３３０〜３４，１７９，４７５に相当する。 ２３３位（Ｃ＞Ｔ）、３５２位（Ａ＞Ｇ）、６３３位（Ｃ＞Ｔ）、６４５位（Ｔ＞Ｃ）、６５８位（Ｔ＞Ｃ）、８９４位（Ａ＞Ｇ）においてＷｉｌｌｉａｍｓ ８２基準配列に対する配列差異をＸ５配列で同定した。 Ｍａｖｅｒｉｃｋは、３５２位および８９４位においてＸ５と同じ塩基変化を有していた。
実施例２：ＦＡＤ２遺伝子に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＦＡＤ２遺伝子座の種々の機能配列をコードするＤＮＡ配列に向けられたジンクフィンガータンパク質を前記のように設計した。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-651を参照されたい。代表的な標的配列および認識ヘリックスを表１（標的部位）および表２（認識ヘリックス領域設計）に示す。 ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位を、ＦＡＤ２の標的部位に結合するように設計した。ＦＡＤ２ジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造の少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号明細書を参照されたい。特に、各タンパク質の最後のフィンガーは、認識ヘリックスのためのＣＣＨＣ骨格を有していた。非標準ジンクフィンガーコード配列を、４つのアミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）に由来するオペーク−２核移行シグナルを介してＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10564-10569のアミノ酸３８４〜５７９）に融合してＦＡＤ２ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。ＺＦＮ１〜３については野生型ＦｏｋＩとｅＨＦ−ＦｏｋＩドメインの両方（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書参照）を構築したが、ＺＦＮ４〜７についてはｅＨＦ−ＦｏｋＩドメインのみを使用した。
ＦＡＤ２ ２．３および２．６設計ＺＦＮの活性をＤＬＳＳＡアッセイ（米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書参照）で試験して、最高活性を有するＺＦＮを同定した。ＺＦＮによって哺乳動物細胞にクローニングした関連ＦＡＤ２ ２．３および２．６配列の切断を評価した（図３）。 活性を高度活性基準ＺＦＮ（８２６６：８１９６）と比較した；ベースライン活性が示されている。
Figure 2015527082
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実施例３：ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナー構築物
ＺＦＮ構築物
実施例２に記載されるように、アッセイを用いて同定された、代表的なジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含むプラスミドベクターを、設計し、完成させた。
各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置するオペーク−２核移行シグナル（Maddaloni et al.(1989) Nuc.Acids Res.17(18):7532）をコードする配列に融合した。次に、オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対形成した。よって、各構築物は、ゾセア・アシグナウイルスからの２Ａ配列によって分離された２つのオペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列で構成された単一のオープンリーディングフレームからなっていた（Mattion et al.(1996) J.Virol.70:8124-8127）。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成型プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＯＲＦ２３ ３’未翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ）が隣接するプロモーターによって駆動した。
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてベクターをアセンブルした。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。供給業者の指示にしたがってＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド調製を行った。アガローストリス酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片を単離した。全てのアセンブルしたプラスミドのコロニーを最初にミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業的シーケンシング販売業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってシーケンシングした。配列データを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析した。
ダイズプロトプラストに送達する前に、プラスミドＤＮＡを、供給業者の指示にしたがってＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて大腸菌の培養物から調製した。
得られた１１個のプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１１５６０３（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３５４およびＺＦＮ３７３５５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６００（野生型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３５４およびＺＦＮ３７３５５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０５（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３７０およびＺＦＮ３７３７１構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０１（野生型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３７０およびＺＦＮ３７３７１構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０６（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３７４およびＺＦＮ３７３７５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０４（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３６６およびＺＦＮ３７３６７構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０７（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３８４およびＺＦＮ３７３８５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０２（野生型ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３８４およびＺＦＮ３７３８５構築物を含む）、ｐＤＡＢ１１５６０９（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３９８およびＺＦＮ３７３９９構築物を含む）、およびｐＤＡＢ１１５６０８（ｅＨＦ−ＦｏｋＩと共にＺＦＮ３７３９２およびＺＦＮ３７３９３構築物を含む）を、制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングを介して確認した。
ドナー構築物
合成デノボ線状片を高コピープラスミドベクター中に結合することによって、ＦＡＤ２ドナーベクターを構築した。ｐＤＡＢ１１５６２０（図４）およびｐＤＡＢ１１５６２２（図５）を大豆ゲノムのＦＡＤ２座へのドナー組込みに使用した。ドナーベクターの両方を、ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合ドメインを含むように合成した。ｐＤＡＢ１１５６２０（「ドナー１」）は３７３５４：３７３５５ＺＦＮ結合ドメイン、３７３６６：３７３６７ＺＦＮ結合ドメイン、３７３７０：３７３７１ＺＦＮ結合ドメインおよび３７３７４：３７３７５ＺＦＮ結合ドメインを含む。ｐＤＡＢ１１５６２２（「ドナー２」）は３７３８４：３７３８５ＺＦＮ結合ドメイン、３７３９２：３７３９３ＺＦＮ結合ドメインおよび３７３９８：３７３９９ＺＦＮ結合ドメインを含む。ＺＦＮ結合ドメインは対応する発現ジンクフィンガーヌクレアーゼによって認識され、ドナーベクターおよびジンクフィンガーヌクレアーゼベクターを用いた植物細胞の同時形質転換中に切断される。
実施例４：大豆プロトプラストの形質転換
大豆（例えば、ダイズ栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）プロトプラスト系形質転換法を開発した。プロトプラストを、葉外植片から産生されたカルスに由来するＭａｖｅｒｉｃｋ懸濁培養液から単離した。下記の技術が本方法を説明する。
培養液維持
大豆細胞懸濁液を、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄおよび７ｇのｂａｃｔｏ ａｇａｒ、ｐＨ５．７を含む新鮮なＬＳ培地（Linsmaier and Skoog 1965）への１：５希釈によって７日毎に継代培養した。全ての実験は、下記のプロトコルに基づいて、継代培養７日後に開始して行った。
プロトプラスト単離
３０ｍｌの継代培養７日後のＭａｖｅｒｉｃｋ懸濁培養液を５０ｍｌ円錐形遠心管に移し、２００ｇで３分間遠心分離すると、管１本当たり約１０ｍｌの沈降細胞体積（settled cell volume）（ＳＣＶ）が得られた。細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去した。２０ｍｌの酵溶液（ＭＭＧ溶液（４ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中０．３％ペクトリアーゼ（３２０９５２；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、３％セルラーゼ（「Ｏｎｏｚｕｋａ」Ｒ１０（商標）；Ｙａｋｕｌｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、日本））を、懸濁細胞４ＳＣＶ毎に添加し、管をＰａｒａｆｉｌｍ（商標）で包んだ。管をプラットホームロッカーに一晩（約１６〜１８時間）置いた。翌朝、消化細胞のアリコートを顕微鏡的に観察して細胞壁の消化が十分であることを確認した。
プロトプラスト精製
細胞／酵素溶液を１００μＭセルストレーナーを通してゆっくり濾過した。セルストレーナーをＷ５＋培地（１．８２ｍＭ ＭＥＳ、１９２ｍＭ ＮａＣｌ、１５４ｍＭ ＣａＣｌ２、４．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０）１０ｍｌですすいだ。７０μＭスクリーンを用いて濾過工程を繰り返した。Ｗ５＋培地１０ｍｌを添加することによって、最終体積を４０ｍｌにした。管を反転させることによって細胞を混合した。スクロースクッション溶液（５００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０）８ｍｌを、細胞を含む５０ｍｌ円錐形遠心管の底部に添加することによって、プロトプラストをスクロースクッション溶液上にゆっくり積層した。管をスインギングバケットローター中３５０ｇで１５分間遠心分離した。５ｍｌピペットチップを使用してプロトプラストバンド（約７〜８ｍｌ）をゆっくり取り出した。次いで、プロトプラストを５０ｍｌ円錐形管に移し、Ｗ５＋洗浄液２５ｍｌを添加した。管をゆっくり反転させ、２００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ＭＭＧ溶液１０ｍｌを添加し、管をゆっくり反転させてプロトプラストを再懸濁した。血球計算器またはフローサイトメーターを用いてプロトプラスト密度を測定した。典型的には、細胞懸濁液４ＰＣＶが約２００万個のプロトプラストを産生した。
ＰＥＧを用いたプロトプラストの形質転換
ＭＭＧを用いてプロトプラスト濃度を１６０万個／ｍｌに調整した。３００μｌのプロトプラストアリコート（約５００，０００個のプロトプラスト）を２ｍｌ滅菌チューブに移した。プロトプラストをチューブに移す間、プロトプラスト懸濁液を規則的に混合した。実験設計にしたがって、プラスミドＤＮＡをプロトプラストアリコートに添加した。プロトプラストのチューブを含むラックを１分間毎に３回ゆっくり反転させてＤＮＡとプロトプラストを混合した。プロトプラストを室温で５分間インキュベートした。３００μｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）溶液（４０％エチレングリコール（８１２４０−Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３Ｍマンニトール、０．４Ｍ ＣａＣｌ２）をプロトプラストに添加し、チューブのラックを１分間混合し、インキュベーション中に２回穏やかに反転させながら５分間インキュベートした。Ｗ５＋１ｍｌをチューブにゆっくり添加し、チューブのラックを１５〜２０回反転させた。次いで、チューブを３５０ｇで５分間遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ＷＩ培地（４ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．０）１ｍｌを各チューブに添加し、ラックを穏やかに反転させてペレットを再懸濁した。ラックをアルミ箔で覆い、横置きして２３℃で一晩インキュベートした。
形質転換率の測定およびプロトプラストの収穫
Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて、プロトプラストの定量化および形質転換効率を測定した。形質転換約１６〜１８時間後、各複製物から１００μｌをサンプリングし、９６ウェルプレートに入れ、ＷＩ溶液を用いて１：１希釈した。複製物を３回再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて１００μｌを定量化した。サンプルを解析に供する前に、サンプルを２００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、サンプルを液体窒素で瞬間凍結した。次いで、分子解析のために処理するまで、サンプルを−８０℃冷凍庫に入れた。
実施例５：ジンクフィンガーヌクレアーゼ切断およびドナー組込み
上記形質転換方法論を用いて、設計ＺＦＮを大豆プロトプラストに形質転換した。ＦＡＤ２座についての切断効率を、米国仮特許出願第６１／７３６，８５６号明細書に記載されている座破壊アッセイを介して種々のＺＦＮについて評価した。さらに、イン−アウトＰＣＲアッセイを介してドナー配列のＦＡＤ２座へのジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組込みを評価し、得られたＰＣＲアンプリコンをシーケンシングして大豆ゲノムへのドナー組込みを特徴付けた。
実験は、ドナーベクターのみ、ＺＦＮベクターのみ、またはＺＦＮとドナーベクターを合わせたものを含む処理群で構成された（表３）。さらに、実験は、未形質転換細胞またはコントロールベクター、ＣｓＶＭＶプロモーターによって駆動され、高コピー数プラスミド中のＡｔｕＯＲＦ２４ ３’−ＵＴＲが隣接したＧＦＰ発現カセットを含むｐＤＡＢ７２２１（図６）で形質転換された細胞のネガティブコントロール処理群を含んでいた。トランスフェクション約１８〜２４時間後に形質転換サンプルを収穫した。実験データがＺＦＮプラスミド、ｐＤＡＢ１１５６０１の高活性を証明したので、このＺＦＮプラスミドを全てのその後の実験でポジティブコントロールとして使用した。
表３に詳述されるように、形質転換実験はＤＮＡ合計８０μｇを含んでおり、必要に応じてプラスミドｐＤＡＢ７２２１を添加してＤＮＡの総濃度を８０μｇにした。ドナーベクターとＺＦＮ発現プラスミドの比は約１０：１であった。各実験または処理は、６実験反復からなり、これらを独立に処理および解析した。 ＺＦＮを評価する実験は２セットの実験で行い、ＺＦＮプラスミド、ｐＤＡＢ１１５６０１を全ての最終実験にポジティブコントロールとして使用した。
Figure 2015527082
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標的化の解析
座破壊アッセイを用いて標的化実験からのＤＮＡサンプルを解析して、ＦＡＤ２ ＺＦＮ切断部位における修飾を検出またはＮＨＥＪによる標的化を評価した。 ＦＡＤ２標的中の無傷ＺＦＮ結合部位を測定するようｑＰＣＲアッセイを設計した。ＺＦＮ媒介ドナー挿入または切断、引き続いてＮＨＥＪ修復が、ＺＦＮ結合部位の喪失およびその後の検出可能なｑＰＣＲシグナルの減少をもたらす。有意な切断活性を有するＺＦＮは、ドナーのみの処理と比べてシグナルが減少したアンプリコンの産生をもたらした。座破壊アッセイに使用されるプライマーおよびプローブが表４に提供され、ＦＡＤ２座上のその相対位置が図７に示される。
結果を未処理大豆細胞の無傷ＦＡＤ２座から得られたシグナルと比較した。適当なドナーベクターの存在下でのＦＡＤ２ ２．３ ＺＦＮ２＿ＷＴ ＺＦＮ（両実験）およびＦＡＤ２ ２．６ ＺＦＮ ＺＦＮ４＿ＨＦ（１実験）およびＦ２ ＺＦＮ５＿ＨＦ（両実験）によるプロトプラストの処理は、無傷配列（ドナーのみ）から得られたものと比べて統計学的に有意に低いシグナルをもたらした。
Figure 2015527082
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座特異的イン−アウトＰＣＲ
標的化ドナー挿入を確認するために、全ての処理からのＤＮＡを座特異的イン−アウトＰＣＲアッセイに供した。実験のドナーベクターを、ＦＡＤ２座への標的化組込みについて試験されている全てのＺＦＮについて結合部位を含むように設計した。ＺＦＮおよびドナーの大豆細胞への同時送達は、標的およびドナーベクターにおけるＺＦＮ結合部位の切断、ならびに非相同末端結合機構を介したその後のドナーの切断ＦＡＤ２座への組込みをもたらす。ＺＦＮ切断により産生されたＦＡＤ２染色体部位および線状ドナーベクターの末端が、ＦＡＤ２座への組込み前にプロセシングを受け、不完全な末端結合産物をもたらし得る。標的における標的化組込みの確認を「イン−アウト」ＰＣＲ戦略に基づいて行った（「Ｏｕｔ」プライマーは野生のゲノム座の配列を認識し、「Ｉｎ」プライマーはドナーＤＮＡ中の配列に結合する）。挿入ジャンクションの５’末端と３’末端の両方でイン−アウトＰＣＲアッセイを行った。
試験したＺＦＮの全てが、ドナーおよびＺＦＮサンプル中のＰＣＲ産物によって決定されるように、少なくとも１つの実験でドナー断片のＦＡＤ２大豆座への標的化および組込みのいくらかの証拠を示した。ＰＣＲ産物が５’末端と３’末端の両方で６実験反復のうちの少なくとも２つで産生されたので、以下のＺＦＮ；Ｆ２ ＺＦＮ２＿ＷＴ、Ｆ２ ＺＦＮ２＿ＨＦおよびＦ２ ＺＦＮ４＿ＨＦを用いたドナー組込み標的化の結果は再現性があった（表５）。
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イン−アウトＰＣＲ産物のシーケンシング
ｐＤＡＢ１１１５６２０およびＦ２ ＺＦＮ２＿ＷＴ、またはｐＤＡＢ１１１５６２０およびＦ２ ＺＦＮ２＿ＨＦを用いて完了したイン−アウトＰＣＲ標的化実験の各々からの（予想されるサイズの）アンプリコンの２つをプラスミドにクローニングした。Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法を用いて、得られたプラスミドをシーケンシングした。 配列を基準配列（ＦｏｋＩ切断から生じると予想される一本鎖４ｂｐ末端を複製して末端の全ての可能な組み合わせを表した）にアラインメントした。１０個の特有の配列パターンが、得られた２３個のクローニング配列から見出された（図８）。全ての配列パターンがＺＦＮ結合部位間に位置するＦＡＤ２ゲノム基準配列（ＧＡＡＡＴＴＴＣ）の一部を保持したが、これらの配列パターンはＦＡＤ２ゲノム基準配列に対する欠失も有していた。 配列４ＷＴ１および４ＷＴ４は、ＧＡＡＡＴＴＴＣ配列の３’末端上のＺＦＮ結合部位に広がる欠失を含んでいた。２つの配列、１ＨＦ４および６ＨＦ４は一塩基挿入を有していた。観察されたＤＮＡ配列パターンは、ドナーＤＮＡの大豆ＦＡＤ２座への標的化が起こったことを証明している。
特定の代表的な実施形態が本明細書において記載されてきたが、当業者であれば、代表的な実施形態への多くの付加、欠失および修正が以下の請求項の範囲から逸脱することなく行われ得ることを認知および認識するだろう。さらに、一実施形態からの特徴が別の実施形態の特徴と組み合わされてもよい。

Claims (18)

  1. 部位特異的様式で大豆細胞中のＦＡＤ２遺伝子中の標的部位を切断して、それによって前記ＦＡＤ２遺伝子中の破壊を引き起こす工程を含む、大豆細胞のＦＡＤ２遺伝子を修飾する方法であって、前記ＦＡＤ２遺伝子が切断後に修飾される方法。
  2. 対象となる核酸配列を前記破壊に組み込む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＦＡＤ２遺伝子がＦＡＤ２ ２．３、ＦＡＤ２ ２．６遺伝子、または両方である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 部位特異的様式での前記切断が、ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質或いは前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含み、前記融合タンパク質が特異的に前記標的部位に結合し、前記標的部位またはその近くを切断して、それによって前記破壊を引き起こす、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、および前記のいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインがＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項４または請求項５に記載の方法。
  7. 前記融合タンパク質がジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 部位特異的様式での前記切断がＦＡＤ２ ２．３およびＦＡＤ２ ２．６のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記標的部位が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 対象となる前記核酸配列が標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 請求項１から１１のいずれかに記載の方法によって修飾された大豆細胞を含む大豆細胞または大豆植物。
  13. 大豆細胞または植物が、ＦＡＤ２ ２．３および／またはＦＡＤ２ ２．６遺伝子の１つまたはそれ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞または植物である、請求項１２に記載の細胞または植物。
  14. 前記ヌクレオチド配列が前記細胞と異種性または相同性である、請求項１３に記載の細胞または植物。
  15. 前記相同性配列が少なくとも１つの一塩基多型を含む、請求項１４に記載の細胞または植物。
  16. 前記核酸配列が配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれる、請求項１３から１５のいずれかに記載の細胞または植物。
  17. 配列番号１４〜配列番号２０からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
  18. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインが認識ヘリックス領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質が表２の一列に整列され、示される前記認識ヘリックス領域を含む、請求項１７に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
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