JP2013507960A - 脂肪酸生合成に関与する植物遺伝子をターゲッティングする改変ジンクフィンガータンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
当該出願は、2010年10月22日に出願された米国特許仮出願第61/279,528号の恩恵を主張し、その開示全体を本明細書中に援用する。
本開示は、一般的に、ゲノム工学および植物中でのタンパク質発現の分野に関する。特に本開示は、脂肪酸合成に関与する遺伝子を標的とする改変DNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質、ならびに変更された脂肪酸プロフィールを有する植物を作出するための遺伝子発現、遺伝子不活性化および遺伝子修飾を変調する際のこうしたジンクフィンガータンパク質の使用方法に関する。
飽和脂肪を多く含む食事は低密度リポタンパク質(LDL)を上昇させ、それがひいてはアテローム性動脈硬化症や冠状動脈性心臓病に密接に関連する前提条件である血管へのコレステロールの沈着を引き起こす(Conner et al., Coronary Heart Disease: Prevention, Complications, and Treatment, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1984 pp. 43-64)。対照的に、一価不飽和脂肪を多く含む食事は心臓病を減少させることが示された。オレイン酸(ほとんどの食用植物油における唯一の一価不飽和脂肪)は、リノール酸と同じくらい有効にLDLを下げるが、高密度リポタンパク質(HDL)レベルには影響を及ぼさない(Mensink et al (1989) New England J. Meet., 321:436-441)。さらに、一価不飽和脂肪を多く含む食物はさらに、収縮期血圧の低下に関係する(Williams et al., (1987) J. Am. Meet, Assoc., 257:3251-3256, 1987)。
本開示は、植物全体または植物細胞の脂肪酸生合成に関与する1もしくは複数の植物遺伝子の発現の変調ならびに標的化変更により、植物全体または植物細胞の脂肪酸組成を変更するための組成物および方法を提供する。植物全体または植物細胞は、いくつかの特定の実施形態において採油植物を含めた、単子葉(単子葉植物)または双子葉(双子葉植物)の植物種からであり得るし、培養細胞、発生の任意の段階での植物中の細胞、ならびに植物全体から取り出された植物細胞(これらの細胞(またはそれらの子孫)は植物に再生される)も包含する。植物細胞は、1若しくは複数のホメオロガス(homeologous)またはパラロガス遺伝子配列を含有し得るし、その任意数またはその全部が、本明細書中に開示されている方法によって修飾のために標的化され得る。
植物中での脂肪酸合成に関与する1もしくは複数の遺伝子の発現の変調、ならびに標的化切断および変更に有用な組成物および方法を、本明細書中に開示する。そういった遺伝子の調整は、例えば改変ZFP転写因子を使用するか、または遺伝子調節領域を変更することによって変調できる。遺伝子は、例えば標的化切断と、それに続く染色体内の相同組換えによって、または標的化切断と、それに続く外因性ポリヌクレオチド(遺伝子ヌクレオチド配列と相同性を有する1若しくは複数の領域を含む)とゲノム配列の間の相同組換えによって変更できる。
本明細書中に開示される方法の実行、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製および使用は、別記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当該技術分野の技術内であるような関連分野を用いる。これらの技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001;Ausubel et al.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego;Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998;METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, “Chromatin” (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999;およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, “Chromatin Protocols” (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、線状または環状立体配座での、ならびに一本鎖または二本鎖形態での、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの長さに関して限定するよう意図されるべきでない。本用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート主鎖)で修飾されるヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有する;すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対合する。
開示される方法および組成物は、DNA結合ドメイン(例えば、ZFP)および調節ドメインまたは切断(ヌクレアーゼ)ドメイン(または切断半ドメイン)を含む融合タンパク質を包含し、この場合、DNA結合ドメイン(ジンクフィンガードメイン)は、脂肪酸合成に関与する遺伝子内の細胞クロマチン中の配列と結合することにより、転写調節ドメインまたは切断ドメイン(または切断半ドメイン)の活性を配列の付近に向けて、それゆえ、標的配列の近くで転写を変調するかまたは切断を誘導する。
任意のDNA結合ドメインを本発明の実施に使用できる。特定の実施形態において、DNA結合ドメインは、1もしくは複数のジンクフィンガーのジンクフィンガー結合ドメインを含む(Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609-1614;Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65;米国特許第6,453,242号)。典型的には、単一ジンクフィンガードメインは、約30アミノ酸長である。各ジンクフィンガードメイン(モチーフ)は、2つのβシート(2つの不変システイン残基を含有するβターン中に保持される)およびαらせん(2つの不変ヒスチジン残基を含有する)を含有し、これらは、2つのシステインおよび2つのヒスチジンにより亜鉛原子の配位により特定立体配座で保持される、ということを、構造試験は実証した。
本明細書中に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFP)は、任意に、遺伝子発現の変調のために調節ドメインと会合され得る。ZFPは、1もしくは複数の調節ドメイン、代替的には2つまたはそれより多くの調節ドメインと、共有的にまたは非共有的に会合され得るし、2つまたはそれより多くのドメインは、同一ドメインの2つのコピー、または2つの異なるドメインである。調節ドメインは、ZFPと共有的に、例えば、融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介して、連結され得る。ZFPは、非共有的二量体化ドメイン、例えばロイシン/ジッパー、STATタンパク質N末端ドメインまたはFK506結合タンパク質を介しても、調節ドメインと会合され得る(例えば、O’Shea, Science 254: 539 (1991), Barahmand-Pour et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121-128 (1996);Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998);Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998);Ho et al., Nature 382: 822-826 (1996);およびPomeranz et al., Biochem. 37: 965 (1998)参照)。調節ドメインは、任意の適切な位置で、例えばZFPのC−またはN−末端で、ZFPと会合され得る。
先に述べたように、DNA結合ドメインはさらに、切断(ヌクレアーゼ)ドメインとも結び付けられ得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの機能を保持したままで、それらのDNA結合の特異性を変えることもできる。加えて、ジンクフィンガータンパク質はさらに、切断ドメインに融合されて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を形成することもできる。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られる。切断ドメインが由来するエンドヌクレアーゼの例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA;およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388を参照のこと。DNAを切断するさらなる酵素が知られている(例えばS1ヌクレアーゼ;緑豆ヌクレアーゼ;膵臓DNaseI;小球菌ヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照)。これらの酵素(またはその機能的断片)のうちの1つまたは複数は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として用いられ得る。
融合タンパク質(およびそれをコードするポリヌクレオチド)の設計および構築のための方法は、当業者に既知である。例えば、DNA結合ドメイン(例えばジンクフィンガードメイン)および調節または切断ドメイン(または切断半ドメイン)を含む融合タンパク質ならびにこのような融合タンパク質をことするポリヌクレオチドの設計および構築のための方法は、共有米国特許第6,453,242号および第6,534,261号、ならびに米国特許出願公告2007/0134796および2005/0064474(これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される)に記載されている。
種々の検定を用いて、ZFPが遺伝子発現を変調するか否かを確定し得る。特定ZFPの活性は、例えば、イムノアッセイ(例えばELISAおよび免疫組織化学的検定(抗体を用いる))、ハイブリダイゼーション検定(例えばRNase保護、ノーザン、in situハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ試験)、比色検定、増幅検定、酵素活性検定、表現型検定等を用いて、例えばタンパク質またはmRNAレベル、生成物レベル、酵素活性;レポーター遺伝子の転写活性化または抑制を測定することにより、種々のin vitroおよびin vivo検定を用いて査定され得る。
開示される方法および組成物を用いて、細胞クロマチン中の当該領域(例えば脂肪酸の生合成に関与する遺伝子内のまたはそれに隣接するゲノム中の所望のまたは予定の部位)でDNAを切断し得る。このような標的化DNA切断に関して、ジンクフィンガー結合ドメインは、予定切断部位でまたはその付近で、標的を結合するよう改変され、改変ジンクフィンガー結合ドメインおよび切断ドメインを含む融合タンパク質は細胞中で発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の、標的部位との結合時に、DNAは、切断ドメインにより標的部位付近で切断される。切断の正確な部位は、ZCリンカーの長さに依っている。
本明細書中に記載した1もしくは複数のタンパク質(例えばZFP)をコードする核酸は、複製および/または発現のために原核生物または真核生物細胞中への形質転換のためにベクター中でクローン化され得る。ベクターは、原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、ウイルスベクター、または真核生物ベクターであり得る。ZFPをコードする核酸は、植物細胞への投与のために、発現ベクター中でもクローン化され得る。
上記のように、DNA構築物は、種々の慣用的技法により所望の植物宿主中(例えばそのゲノム中)に導入され得る。このような技法の検討に関しては、例えばWeissbach and Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp.421-463;およびGrierson and Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9を参照のこと。
先に述べたとおり、脂肪酸合成に関与する遺伝子の標的化変更は、所望の脂肪酸プロフィールの植物油を迅速、かつ、効率的に作り出すのに使用できる。
以下は、本発明の開示を実行するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示的目的のためにのみ提供されるものであって、如何なる点でも本発明の開示の範囲を限定するよう意図されない。
1.1 標的配列同定
本実施例では、セイヨウアブラナL(Brassica napus L)(キャノーラ)の天然の酵素であるβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII(KAS II)をコードする内因性DNA配列を、同定した。脂肪酸生合成の所望の変更、および付随する種子油プロフィールの変更をもたらすために、改変ジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP TF)による転写制御を実証するための代表的な標的として、これらの遺伝子を選定した。酵素β−ケトアシル−ACPシンテターゼIIは、16:0−ACPから18:0−ACPへの転換と、それに続くオレイン酸の形成を触媒する(Ohlrogge and Browse, 1995, The Plant Cell, 7: 957-970)。β−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子の報告されているシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)fab1突然変異は、酵素活性の65%の低下と、付随する葉および根のそれぞれ7%と3%のステアリン酸含有量の増加をもたらした(Wu etal,, 1994, Plant Physiology, 106: 143- 150)。キャノーラにおいて形質転換したダイズβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII導入遺伝子を安定的に発現することで、種子パルミチン酸含有量を0.8%低下させ、そして、タバコへの同じ遺伝子の導入は、パルミチン酸含有量を2%低下させた(日本国特許公開番号第501446/1995号)。
全RNAを、QiagenのRNEASY(登録商標)PLANT MINI KIT(Qiagen、Valencia, CA)を使用して、開花の15日後(DAF)のセイヨウアブラナ(キャノーラ)遺伝子型Nex710(Crop Certificate99-70492Q8-501)の未熟種子から単離した。総mRNAを製造業者の推奨に従ってRNase不含DNaseによって処理して、定量的RT−PCR中に増幅するかもしれないDNAのあらゆる混入を取り除いた。
セイヨウアブラナのβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII cDNA(GenBank AF244520)の5’末端に特異的なcDNA末端の急速増幅(RACE)を、製造業者の推奨によってAmbion製のFIRSTCHOICE(登録商標)RLM-RACEキット(Ambion、Austin, TX)を使用して実施した。5’cDNA配列を得るために、合成RNAアダプターを5’非キャップmRNA領域にアニールした。キットにより供給されたプライマー(5’−CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAA−3’)(配列番号1)および部分的なセイヨウアブラナcDNA配列(GenBank AF244520)と結合するように改変された二次プライマー(5’−CTCGAGCTGCTACTGCTAGTTCCGGTGGAGGAGCC−3’)(配列番号2)を断片を増幅するために使用して、未知の上流配列を決定した。5’RACE増幅では、約500塩基対の新しいセイヨウアブラナ配列を決定した。β−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子の4種類の明らかに異なる5’cDNA配列のコンティグ(配列番号3、配列番号4、配列番号46、および配列番号30)を、増幅した配列をアラインメントしたときに同定した(図8)。これらの5’配列は、同じ領域からのカブ類(GenBank:AC189461)およびキャベツ類(GenBank:BH723504)の配列に対して高レベルの相同性を示した。
ジンクフィンガータンパク質を、セイヨウアブラナβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子プロモーター領域、ならびに5’非翻訳領域および翻訳領域内の様々な標的部位に対して設計した。図2を参照のこと。代表的なZFP設計に関する認識ヘリックスを、以下の表1に示す。ジンクフィンガー設計の標的部位を、以下の表2に示す。
こうしたプロモーターが融合タンパク質の発現を、比較的強い構成的プロモーター、例えばシロイスナズナUbiquitin10(AtUbi10)プロモーター由来のプロモーターなどによって駆動した。代表的なベクターを、以下の表3に示す。
植物細胞内での設計したジンクフィンガータンパク質の機能性を評価するために、植物生細胞内におけるかかるタンパク質の発現方法を利用した。ジンクフィンガータンパク質をコードするDNAを、そのDNAが植物細胞ゲノム内に組み込まれない条件下で植物細胞内に送達する。よって、DNA分子は一時的に植物細胞内に維持され、そして遺伝子発現のための鋳型として作用する。あるいは、ジンクフィンガータンパク質をコードするDNAは、そのDNAが植物細胞ゲノム内に組み込まれるのを可能にし、そしてそのDNA分子が植物細胞内に安定に維持され、そして遺伝子発現のための鋳型として機能するようにジンクフィンガータンパク質コード遺伝子のトランスジェネシスを結果としてもたらす条件下で植物細胞内に送達されることもできる。当業者は、植物生細胞内のこれらのタンパク質の機能性を評価するために、ジンクフィンガータンパク質コードDNAの一過性発現またはトランスジェニック発現のいずれかを利用できる。
このプロジェクトのために設計し、そして構築したバイナリープラスミドを、表3中に列挙する。
エレクトロポレーションのためにWeigel D., Glazebrook J. Arabidopsis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002: pg123-124に記載のプロトコールを使用して、アグロバクテリウム細胞を調製した。アグロバクテリウムの最適な増殖を可能にするわずかな変更を、プロトコールに加えた(すなわち、YEP培地をLBに置き換えた)。独立に、1.5〜3μgの各構築物のプラスミドDNAを、50μlのC58::Z707sアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞に加え、そしてそっと混合した。混合物を、冷たい0.2cmのGENE PULSER(登録商標)キュベット(BioRad、Hercules, CA)に移し、そして氷上に置いた。そのキュベットを、次に冷たいGENE PULSERRラック(BioRad、Hercules, CA)に置き、以下の条件でエレクトロポレーション処理した:静電容量出力25μFarad、静電容量エクステンダー960μFarad、抵抗200オーム、および電圧2.5kVolts。エレクトロポレーション直後に、950μlのSOC培地(Irnvitrogen、Carlsbad, CA)を加え、そして混合物をFalcon2059チューブ(Becton Dickinson and Co.、Franklin Lakes, NJ)または同等物に移した。次いで、形質転換細胞を28℃にて1時間インキュベートした。インキュベーション後、50μl、100μl、および200μlの細胞を、適宜抗生物質を含む別々のYEP培地プレート(1リットルの水中、10グラムの酵母抽出物、10グラムのペプトン、5グラムのNaCl、10グラムのショ糖、および15グラムの寒天)上で平板培養した。そのプレートを28℃にて約36〜48時間倒立培養した。単一コロニーを取り出し、適宜抗生物質を含む50mlの液体YEP(1リットルの水中、10グラムの酵母抽出物、10グラムのペプトン、5グラムのNaCl、および10グラムのショ糖)中、28℃にて約36時間増殖させた。
胚軸切片の調製:セイヨウアブラナ遺伝子型Nex710の種子を、10%の市販の漂白剤で10分間、表面殺菌処理し、そして滅菌蒸留水で3回すすいだ。種子を無菌のペーパータオルによって乾かし、次いで、MS基本培地(Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15(3): 473-497, 1962)、20g/Lのショ糖、および8g/LのTC寒天(PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS)の2分の1の濃度から成る「発芽培地」を含むPhytaトレー内に置き、23℃、および16時間の明/8時間の暗の光期間を設定した培養体制下で維持した。
推定上の形質転換のセイヨウアブラナカルスのサンプルを、β−ケトアシル−ACPシンテターゼII内因性遺伝子、チューブリン内因性遺伝子、およびZFP TF導入遺伝子のmRNA発現の変化に関して分析した。チューブリンmRNAレベルを内部対照として使用して、、ZFP TFおよびβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII mRNAの発現を標準化した。ZFP TF mRNA発現データを、形質転換したカルス内の少なくとも1つの機能的なZFP TF導入遺伝子の存在を確認するために使用した。
Nex710胚軸組織の形質転換後に、約40〜50個の8週齢のセイヨウアブラナのカルスサンプルを得た。それらを、実施例3.3で記載されているように、個別にZFP TF構築物、pDAB4695、pDAB4696、pDAB4697、およびpDAB4698で形質転換した。対照サンプルをpat遺伝子発現カセット(AtUbi10プロモーターv2::pat v3::Atu ORF1 3’UTR v3)を含む対照バイナリー構築物の形質転換によって得た。すべてのサンプルを、それらの収穫までHERBIACE補充細胞培地で栽培した。
qRT−PCR反応ミックスを、以下のとおりβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII cDNAの増幅のために準備した:7.5μLの2X LC480マスターバッファー(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)、10μMのストックからの0.3μLの遺伝子特異的順方向プライマー(配列番号28:5’−TTGACTCGAGCTGCTACTGC−3’;図8のアラインメントにおいて配列番号3の544位〜563位のヌクレオチド)、10μMのストックからの0.3μLの遺伝子特異的逆方向プライマー(配列番号29:5’−TTTCCATATCCATCGCAACA−3’;図8のアラインメントにおいて配列番号3の588位〜607位のヌクレオチド)、LIGHTCYCLER(登録商標)480 Probes Masterからの0.15μLのUPLプローブ#25(Roche Diagnostic, Indianapolis, IN)、1.5μLの10%(w/v)ポリビニルピロリドン−40(PVP−40)、および3.9μLの水。UPLプローブ(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)は固定核酸であり、そのため別の方法で計算するより高いTmを持つ。標準および未知のものを扱う前に、全成分を冷凍庫内に戻した。384ウェルマイクロプレートを区切り、ラベルを付し、ウェルごとに13.5μLのマスターミックスを加えた。密封用ホイルをそっとマイクロプレートに取り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機により3,000rpmで1分間遠心分離した。1.5μLの解凍し、希釈した合成cDNA鎖を加えた。さらに、1.5μLのプラスミドDNAコピー数標準を、最低濃度から最高濃度までの希釈系列で離れたウェルに加え、これらの標準をβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII cDNA(全mRNAから合成)と比較してコピー数を定量した。一連のβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII DNAコピー数標準を、pCR2.1プラスミド(Invitrogen、Carlsbad, CA)内に標的増幅産物をクローニングし、そしてコピー数を定量化するための希釈系列を作ることによって作製した。ホイルシールをしっかりプレートに付け、そして先に記載したように遠心分離した。PCRプログラムを以下のとおり実施した:i.活性化95℃5分間;ii.変性4.8°C/秒にて95℃10秒間;iii.アニール/伸長2.5°C/秒にて60℃25秒間;iv.確保4.8°C/秒にて72℃1秒間;ステップii−ivをあと40〜50回繰り返す;5秒間で38℃に冷やす。DNAを、リアルタイムPCR装置LC480(Roche, Indianapolis, IN)または同等物で増幅した。増幅産物サイズは64塩基対であった。このPCRアッセイで用いた順方向および逆方向プライマー配列は、β−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子標的のうちの2つ、配列番号3および30の中の対応配列に完全に一致した(図8)。そのため、このアッセイは、2つのβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子標的の定量的な発現を表した。
チューブリン遺伝子(セイヨウアブラナの天然遺伝子(GenBank:AF258790およびGenBank:DU106489)を、qRT−PCRアッセイにおいて遺伝子全般でmRNA発現シグナルを正確に標準化する参照標準として使用した。β−ケトアシル−ACPシンテターゼIIqRT−PCRアッセイのために合成したcDNA(実施例4.1に記載)もまた、以下で記載したようにチューブリンqRT−PCRアッセイに使用した。
ZFP TF mRNAの発現を、β−ケトアシル−ACPシンテターゼII mRNAのために元々合成した(実施例4.1で先に記載)cDNAサンプルから定量した。TaqMan PCRアッセイを、5’のopaque−2 NLS配列および3’のVP16配列に対するアンカリング・プライマーによってZFPカセットから設計した。PCRアッセイを、以下のものを使用して準備した:10μMのストックからの0.5μLの順方向プライマー「OP2_NLS_F1」(配列番号33:5’−AAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAG−3’)、10μMのストックからの0.5μLの逆方向プライマー「VP16_R1」(配列番号34:5’−CTTCTGCTCTCCACCGTA−3’)、5μMのストックからの0.25μLのプローブ「VP16_MGB_185」(配列番号45:5’−TTGATGGTGAAGATGT−3’)、1.5μLの10%(w/v)PVP−40、1.5μLの10x HOT START PCRバッファー、1.0μLの25mM MgCl2、1.2μLのdNTP(それぞれ2.5mM)、0.15μLのHot Start Taq Polymerase(Qiagen、Valencia, CA)、および6.9μLの水。その混合物を、LIGHTCYCLER(登録商標)480(Roche Diagnostics、USA)を使用して増幅した。384ウェルマイクロプレートを区切り、ラベルを付し、ウェルごとに13.5μLのマスターミックスを加えた。密封用ホイルをそっとマイクロプレートに取り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機により3,000rpmで1分間遠心分離した。密封用ホイルを外し、そして1.5μLの解凍し、希釈した合成cDNA鎖を加えた。ホイルシールをしっかりプレートに付け、そして先に記載したように遠心分離した。PCRプログラムを以下のとおり実施した:i.活性化95℃15分間;ii.変性4.8°C/秒にて95℃20秒間;iii.アニール/伸長2.5°C/秒にて60℃20秒間;iv.確保4.8°C/秒にて72℃55秒間;ステップii−ivをあと44回繰り返す;5秒間で38℃に冷やす。DNAを、リアルタイムPCR装置LC480または同等物で増幅した。増幅産物サイズは775塩基対であった。ZFP TF cDNA/mRNAのコピー数を、先のβ−ケトアシル−ACPシンテターゼIIやチューブリンの実施例について記載したように、標的増幅産物をプラスミド内にクローン化した一連の標準を使用し、そしてPCRアッセイのための希釈系列を作製して測定した。
ZFP TF mRNA発現を、推定上ZFP TFで形質転換され、そしてHERBIACE(登録商標)選択培地上で栽培した、8週齢のトランスジェニックカルスサンプルで計測した(実施例3を参照のこと)。
qRT−PCRアッセイで計測されるZFP TFの定量的mRNA発現は、構築物を含むZFP TFだけで形質転換したサンプルでは検出されたが、対照構築物を含むサンプルでは検出されなかった。このデータは、アッセイがZFP TF発現に特異的であり、かつ、対照カルスがZFP TF導入遺伝子を含んでいないことを示した。
5.1 β−ケトアシル−ACPシンテターゼII、チューブリン、およびZFP TF mRNA発現の分析
pDAB4695導入遺伝子構築物を含むT0キャノーラを、六葉植物期まで栽培し、そしてβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII内因性遺伝子、チューブリン内因性遺伝子、およびZFP TF導入遺伝子のmRNA発現について分析した。トランスジェニック植物を、pat遺伝子発現カセット(AtUbi10プロモーターv2::pat v3::Atu ORF1 3’UTR v3)を含むバイナリーの構築物で形質転換した対照サンプルと比較した。標準的なサイズのペーパーパンチャーからの6つの葉パンチを、氷上に各植物からサンプル抽出し、そして総mRNAを、製造業者の取扱説明書に従ってQiagen 96ウェルRNeasy RNA抽出キット(Qiagen、Carlsbad, CA)で抽出した。β−ケトアシル−ACPシンテターゼII、チューブリン、およびZFP TF mRNA発現解析を、実施例4において先に記載したプロトコールを使用して完了した。
6.1 T1種子の脂肪酸分析
単一種子の脂肪酸分析を、1事象あたり24個の個々のT1種子に対して実施して、脂肪酸含有量の変化に対するZFP TFの効果を研究した(表5)。AOCS法Ce2−66(97)に基づく脂肪酸メチルエステル(FAME)解析法を利用した、そして表5中のすべて数字が、キャノーラ種子中に存在する総脂肪酸のパーセンテージとして表されている。
全3種類のトランスジェニック事象3、6、および12のT1苗100〜150本を、ZFP TF陽性、および同胞ヌル植物を特定するためにスクリーニングした(表6)。植物を、少なくとも1つのZFP TF導入遺伝子の完全長カセットの存在について試験した。QIAGEN PLANT DNEASY抽出キット(Qiagen、Valencia, CA)を用いて製造業者の推奨に従って、これらの植物の葉から総ゲノムDNAを単離した。プロトコールを、QiagenバッファーAP1に1%の終濃度でPVP40を加えることによって変更した。精製したgDNAを、PICOGREEN(登録商標)DNA定量化プロトコール(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)によって定量化した。DNAサンプルを、最少で1つのZFP TF導入遺伝子の完全長コピーの存在について、以下の試薬を含むPCRアッセイによりアッセイした:5μLの10X EX Taqバッファー(Takara Bio Inc., Otsu, Siga, Japan)、5μLの10%ポリビニル・ピロリドン−40、10μMのストックからの1.0μLのubi10順方向プライマー(配列番号35:5’−GGTCAACGGATCAGGATATTCTTG−3’)、10μMのストックからの1.0μLのAtuORF23逆方向プライマー(配列番号36:5’−CCATGTTGGCAAAGGCAACC−3’)、4μLのdNTP(それぞれ2.5mM)、0.2μLのTaKaRa EX Taq(商標)Hot Start、31.8μLの水、および2μLの10ng/μLの濃度のDNA。PCRサイクル条件は、以下のとおりであった:94℃2分間、10サイクルのタッチダウンPCRに98℃10秒間、65℃20秒間、60℃までサイクルごとに0.5℃温度を下げ、続いて72℃3:00分間。これに、35サイクルの98℃10秒間、60℃20秒間、そして72℃3:00分間、および72℃10分間の最後の伸長が続いた。それぞれの反応物5μlを1%アガロースゲル上で泳動して、2662bpの予想されるサイズのZFP TFバンドを検出した。
表6、3列目に示したすべてのT1 ZFP TF陽性および同胞ヌル植物を、次いで、内因性β−ケトアシル−ACPシンテターゼII遺伝子、ZFP TF導入遺伝子、および内因性チューブリン遺伝子のmRNA発現解析にかけた。後者は、β−ケトアシル−ACPシンテターゼIIおよびZFP TF遺伝子発現を標準化するための参照遺伝子としての役割を果たした。六葉植物期のそれぞれからの6つの葉パンチを氷上にサンプル抽出し、そして全RNAをQIAGEN RNAEASY(登録商標)キットを使用して抽出した。cDNA鎖の合成および希釈を、実施例4.1に記載のとおり完了した。
すなわち、β−ケトアシル−ACPシンテターゼII mRNAレベルの上方制御は、各事象内でのZFP TF mRNA発現レベルの増大に対して関連があった、すなわち、事象6で最も低く、事象3で最も高い(図4)。
T1葉サンプルの第2セットを、実施例6.3に記載のmRNA分析サンプルの採取と同時に脂肪酸分析のために採取した。しかしながら、サンプルのサブセットだけを、表6の4列目に示されている成熟まで進められた植物のみに関して脂肪酸について分析した。葉材料の脂肪酸メチルエステル(FAME)分析を以下のとおり完了した。10〜100mgの葉材料を、氷上に採取し、次いで凍結乾燥し、その後、無水メタノール中、40℃にて20分間の0.25Mのナトリウム・メトキシドを用いたメチル基転移反応を行なった。メチル基転移反応後に、脂肪酸を、代替標準としてヘプタデカノインを含むヘプタン溶液で3回抽出した。単離したヘキサン画分を脱水し、そして既知の量のヘプタンで再懸濁した。得られた脂肪酸メチルエステル(FAME)を、SGE製のBPX70キャピラリーカラム(15mx0.25mmx0.25μm)のを使用してGC−FIDによって分析した。各FAMEを、それらの保持時間によって特定し、そしてキャリブレーション標準としてMatreya LLC製のナタネ油基準ミックスの注入によって定量化した。反応の完全性を、4番目の抽出/導出中の内因性FAMEの存在をチェックすることによって確かめた。
各事象内で最も高いβ−ケトアシル−ACPシンテターゼII mRNA発現を実証したZFP TF陽性植物と同胞ヌル植物のサブセットを、T2種子を得るために成熟まで進展させた(表6、4列目)。例外は事象3であり、低い発現範囲を有するいくつかのZFP TF陽性植物もまた進展させた。これらは、pDAB4695導入遺伝子の他の分離挿入を表す可能性があった。それぞれのT1植物を、メッシュバッグで覆って、所定の植物の中での自家受粉を容易にした。種子を収穫し、そして脂肪酸レベルをアッセイした。
色素体は、高等植物のデノボ脂肪酸生合成の主要な部位である(Ohlrogge etal, 1979, ProcNatlAcad Sci USA 76:1194-8; Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic Engineering 4:12-21)。色素体内で利用されなかった脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質(アシル−ACP)の加水分解によってアシル−ACPチオエステラーゼ(FAT)の特異的活性を通して細胞質にエクスポートされて、遊離脂肪酸を放出する。植物には2つのクラスのFAT酵素、FATAおよびFATBが存在する。FATAクラスは、体外において18:1−ACPを好むが、FATBクラスは飽和アシル−ACP基質、例えば16:0−ACPおよびC18:0−ACPなどを好み、その他の異種基質特異性も示す(Doermann et al, 1995, Arch. Biochem, Biophys. 316:612-618; Voelker et al. 1997, Plant Physiology 114: 669-677; Salas and Ohlrogge, 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34)。FATAと同様に、FATBもまたすべての植物組織中に存在すると見なされるが、発育中の種子で主に発現される(Jha et al., 2006, Plant Physiology and Biochemistry 44:645-655)。
8.1標的配列の同定
変法ゲノムウォーキング・プロトコールを、セイヨウアブラナ変種Nex710のFatB遺伝子のためのプロモーター配列を発見し、そして特徴づけするために利用した。これらのヌクレオチド配列を、ZFP TFの設計そして製造のために単離および同定し、それがFatB遺伝子の遺伝子発現を変更するために使用できた。Clontech Genome Walking Kit(Palo Alto, CA)を使用して、9つのゲノムウォーキングライブラリーを構築した。これらのライブラリーを、〜1kbのFatB遺伝子の転写開始部位の配列上流を得るために使用した。入れ子状態のFatB遺伝子特異的プライマーの順方向の対を、公のデータベースからの入手可能なFatB EST配列に基づいて設計し、そして合成した。入れ子状態のプライマーの逆方向の対を、アダプター配列にハイブリダイズするように設計し、そして合成した。複数のPCR断片を、9つのライブラリーから増幅した。得られたPCR断片を、TOPOベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)内にクローン化し、そして配列決定して、FatBプロモーター配列を同定した。2つの異なるFatB遺伝子、FatB4およびFatB5を、このアプローチに基づいて同定した。これらのFatB遺伝子のコード配列は高度に保存されているが、その配列は、5’UTRおよびプロモーター領域で枝分かれしていることが観察された。
ジンクフィンガータンパク質を、FatB遺伝子中の様々な標的部位に対して設計した。代表的なZFP設計のための標的部位と認識ヘリックスを、以下の表10Aおよび10Bに示す。
セイヨウアブラナ細胞内でのFatBのZFP TF媒介性上方制御を例示するために、ZFP TF遺伝子の4つの設計を含む構築物を構築し(表10および11)、これらの遺伝子をアグロバクテリウム介在形質転換によってセイヨウアブラナ細胞内に安定的に送達した。
設計および構築したZFP TFバイナリープラスミドを、以下の表11で列挙する。ZFP TFの遺伝子の発現を、比較的強力な構成的プロモーター、例えばキャッサバ葉脈モザイク病ウイルス(CsVMV)プロモーターなどに由来するプロモーターによって駆動した。アグロバクテリウム介在植物形質転換を実施例3.2に記載のとおり実施して、セイヨウアブラナゲノム内へのZFP TFを安定的に組み込んだ。
実施例3.2に記載のアグロバクテリウム介在植物形質転換によって、トランスジェニック・セイヨウアブラナ・カルス株を、4つのZFP TF構築物、pDAB4689〜pDAB4692、および対照構築物、pDAB8210での形質転換によって作り出した。対照構築物(pDAB8210)は、pat遺伝子発現カセット(AtUbi10プロモーター/pat/AtuORF1 3’UTR)を含み、そして標的ZFNカセット(CsVMVプロモーター/ZFN/AtuORF23 3’UTR)を含まなかった。全RNAを抽出し、そして実施例4、1に記載のとおり、cDNAをすべての株から合成した。先に記載したプロトコールに対する唯一の変更が、ランダムヘキサマーの代わりにcDNA反応をプライミングするためにオリゴdTプライマーを使用し、そして製造者の仕様書に従ってcDNA反応の対応する変更を加えたことである。
11.1.1 セイヨウアブラナに関するFatB4の定量的なリアルタイムPCR(qRT−PCR)アッセイ
PCRミックスを、FatB4のcDNA増幅のために以下のとおり準備した:1.5μLの10X Hot Start PCR Buffer(Qiagen、Valencia, USA)、1.2μLの10mM dNTP、1μLの25mM MgCl2、0.15μLのQiagen Hot Start Taq(5U/μL)、10μMのストックからの0.5μLのzz143FWプライマー(配列番号53:CTTTGAACGCTTATCTTCCTC)(10μMのストック)、10μMのストックからの0.5μLのFATB5_R4 REVプライマー(配列番号54:TTCCACAACATCTCCCCAAG)、0.25μLのTaqMan MGBプローブ(Life Technologies, Carlsbad, California)、5μMのストックからのFatB4_MGB_プローブ_4(配列番号55:FAMCTCAGGCTCCACCC)、1.5μLの10%(w/v)PVP−40、および1反応あたり13.5μLまでのH2O。384ウェルマイクロプレートの適当な(単数もしくは複数の)象限を区切り、そして1ウェルあたり13.5μLのマスターミックスで満たした。密封用ホイルをそっとプレートに貼り付けた。そのプレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機で3,000rpmで1分間遠心分離した。次に、1.5μLの解凍し、希釈した第一鎖cDNAを適当なウェルに加え、続いて対照ウェル内に最も低いDNA濃度から最も高いDNA濃度へと、1.5μLのプラスミドcDNA標準を加えた。最後に、密封用ホイルをしっかりプレートに付け、遠心分離した。PCRプログラムを、LIGHTCYCLER(登録商標)480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)により、以下のプログラムを使用して実施した:1)活性化95℃15分間;2)変性95℃20〜30秒間(4.8°C/秒間にて);3)アニーリング60℃20〜30秒間(2.5°C/秒間にて);4)確保72℃45〜60秒間(4.8°C/秒間にて);ステップ2)−4)をあと39〜49回繰り返す;5)5秒間で38℃まで冷やして反応を止める。
PCRミックスを、FatB5のcDNA増幅のために以下のとおり準備した:1.5μLの10XHot Start PCR Buffer(Qiagen、Valencia, USA)、1.2μLの10mM dNTP、1μLの25mM MgCl2、0.15μLのQiagen Hot Start Taq(5U/μl)、10μMのストックからの0、5μLのzz145FWプライマー(配列番号56:CTTTGAAAGCTCATCTTCCTC)、10μMストックからの0.5μLのFATB5_R4 REVプライマー(配列番号57:TTCCACAACATCTCCCCAAG)、0.25μLのTaqMan MGBプローブ(Life technologies, Carlsbad, California)、5μMストックのFatB5_MGB_プローブ1(配列番号58:FAM−AACCTTCATCCTCCCA)、1.5μLの10%(w/v)PVP−40)、および1反応あたり13.5μLまでのH2O。残りのアッセイおよびPCRサイクルの明細は、実施例11.1.1のFatB4 qRT−PCRアッセイについて記載したとおりであった。
このアッセイを、実施例4.3に記載のとおり完了した。
T0カルスサンプルZFP TF mRNA解析を、実施例4.4に従って完了した。このアッセイにおける増幅産物サイズは、それぞれの設計におけるZFPサイズに依存して1KB未満であった。T0植物ZFP TF発現の定量化を、以下のとおりVP16活性化のドメイン・ベースのアッセイを用いて実施した。VP16 qRT−PCRミックスを、ZFP TFのcDNA増幅のために以下のとおり準備した:7.5μLのLIGHTCYCLER(登録商標)480 Probes Master 2X Buffer(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)、10μMストックからの0.3μLのVP16_UPL_F1プライマー(配列番号59:TCGATCTTGATATGTTGGGAGA)、10μMストックからの0.3μLのVP16_UPL_R1(配列番号60:AGGTGCAGAATCATGTGGTG)、0.15μLのUPLプローブ#85(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)、1.5μLの10%(w/v)PVP−40、および13.65μLmでのH2O。384ウェルマイクロプレートの適当な(単数もしくは複数の)象限を区切り、1ウェルあたり13.5μLのマスターミックスで満たした。そして、密封用ホイルをそっとプレートに貼り付けた。プレートを、Qiagenマイクロプレート遠心分離機で3000rpmで1分間遠心分離した。解凍し、希釈した第一鎖cDNAを1.5μLで加え、続いて対照ウェル内に低濃度から高濃度までの1.5μLのプラスミドcDNA標準を加えた。密封用ホイルを、しっかりプレートに付け、そして遠心分離した。PCRプログラムを、LIGHTCYCLER(登録商標)480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN、USA)により、以下の条件を使用して実施した:1)活性化95℃5分間;2)変性95℃10秒間(4.8°C/秒間にて);3)アニーリング/伸長60℃25秒間(2.5°C/秒間にて);4)確保72℃1秒間(4.8°C/秒間にて);5)ステップ2−4をあと39〜49回繰り返す。最後に反応物を5秒間で38℃に冷やして、反応を止めた。
HERBIACE(登録商標)選択により増殖するトランスジェニック・カルス株を、FatB4、FatB5、チューブリン、およびZFP TF発現レベルについてqRT−PCRによって分析した。チューブリン遺伝子は、FatB4、FatB5、およびZFP TF mRNAレベルの発現を標準化する参照遺伝子としての役割を果たす。FatB4/チューブリンおよびFatB5/チューブリン比を計算して、mRNA発現を標準化した。結果は、構成設計pDAB4691に関して統計的に有意なFatB4 mRNAおよびFatB5 mRNA上方制御を示した(p=0.005;図9)。pDAB4692カルス株は、FatB4およびFatB5 mRNAにおける上方制御傾向を示したが、その傾向は統計的に有意でなかった。pDAB4689カルス株もまた別々の実験で分析し、上方制御傾向を示したが、統計的に有意でなかった(データ未掲載)。対照細胞株はZFP TF特異的増幅産物を増幅せず、ZFP TFアッセイがZFP TF発現株だけに特異的であったことを確認した。
12.1 qRT−PCRの内部対照として使用するためのセイヨウアブラナ・アクチンのアッセイ
全RNAを抽出し、そしてcDNAを実施例11に記載のとおり、すべての株から合成した。PCRミックスを、アクチンのcDNA増幅のために以下のとおり準備した(Bo Yang et al., 2007, Plant Science 173:156-171;アクチン遺伝子GenBank受入番号AF111812):7.5μLのLIGHTCYCLER(登録商標)480 Probes Master 2X Buffer、10μMストックからの0.3μLのBN_アクチン_Fプライマー(配列番号61:ACGAGCTACCTGACGGACAAG)、10μLストックからの0.3μLのBN_アクチン_R(配列番号62:GAGCGACGGCTGGAAGAGTA)、1.5μLの10%(w/v)PVP−40、および13.5μLに適量のH2O。384ウェルマイクロプレートの適当な(単数もしくは複数の)象限を区切り、1ウェルあたり13.5μLのマスターミックスで満たした。そして、密封用ホイルはそっとプレートに貼り付けた。プレートをQiagenマイクロプレート遠心分離機で3000rpmで1分間遠心分離した。解凍し、希釈した第一鎖cDNAを1.5μL加え、続いて対照ウェル内に低濃度から高濃度までの1.5μLのcDNA標準を加えた。密封用ホイルをしっかりプレートに付け、そして遠心分離した。PCRプログラムを、LIGHTCYCLER(登録商標)480 Real-Time PCR System(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)により、以下の条件を使用して実施した:1)活性化95℃10分間;2)変性95℃10秒間(4.8°C/秒間にて);3)アニーリング/伸長60℃20秒間(2.5°C/秒間にて);4)確保72℃20秒間(4.8°C/秒間にて);5)ステップ2−4をあと39〜49回繰り返す。最後に反応物を5秒間で38℃に冷やして、反応を止めた。生じる増幅産物はサイズが80bpであった。
pDAB4689〜pDAB4691で形質転換したセイヨウアブラナ植物を、FatB4およびFatB5の高いmRNA発現についてアッセイした。加えて、2つのタイプの対照を使用した。Nex710植物から成る非トランスジェニック対照は陰性対照としての役割を果たす。pDAB8210で形質転換した第2のトランスジェニック対照のセイヨウアブラナNex710植物もまた分析した。pDAB8210構築物設計は2つの遺伝子発現カセットから成っていた。pat遺伝子発現カセット(AtUbi10プロモーター::pat遺伝子::AtuORF13’UTR)と非標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)遺伝子発現カセット(AtUbi10プロモーター::ZFN遺伝子::AtuORF23 3’UTR)。pDAB8210により発現したZFNは、セイヨウアブラナNex710植物のゲノムに結合および切断するとは考えられないので、これらの植物の表現型を変更するはずがない。
13.1 T1種子の脂肪酸分析
事象pDAB4691−003−049.1(「事象49」)の「低」油糧種子と「高」油糧種子の間にC18:0含有量の有意差が観察された(表12)。「低」カテゴリーの種子のC18:0含有量は、Nex710(「非トランスジェニック」対照)およびpDAB8210(トランスジェニック対照)株のものと同様であった。「高」種子におけるC18:0含有量は、FatB遺伝子の上方制御をもたらしたZFP TF発現と相関した。C20:0、C22:0およびC24:0のいくつかの増加もまた、C18:0のより長鎖の脂肪酸への流れに基づいて観察された。個々の種子のC16:0含有量は、「低」または「高」カテゴリーのいずれかの中で変化するとは考えにくかった。この結果は、pDAB4691ZFP TFが、C16:0−ACPからC16:0への反応よりむしろC18:0−ACPからC18:0への酵素反応に特異的な(単数もしくは複数の)FatB遺伝子に結合し、そして上方制御するという事実を示唆している(実施例1、図1を参照のこと)
事象49の100個のT1種子を温室内に蒔いた。97本の植物が苗へと発芽した。ZFP TFのコピー数を、二〜四葉期から分離した植物材料について、実施例6.2に記載したpat qRT−PCRアッセイを使用して概算した。事象49には、複数の挿入(〜3つの挿入)および0〜7個のpat遺伝子、したがって、ZFP TFが含まれ、コピーがT1集団に分離された。たった1つのヌル植物をT1集団から同定した。
天然FatB遺伝子の発現解析を、分離T1集団の97の植物すべてに対して実施した。同時に植え付けた非トランスジェニックNex710植物を、対照として研究に組み入れた。1植物あたりの6枚の葉パンチを、採取し、そしてRNA抽出が完了できるまで氷上に置いた。全RNAを、QIAGEN RNEASYキットを使用して抽出した。cDNA合成とその後の希釈を、実施例11に記載のとおり完了した。FatB4、FatB5、チューブリンおよびVP16(ZFP TF)の発現解析を、先に記載したように実施した。
脂肪酸(FA)分析を、実施例6.1に記載したとおり、すべての植物の24個の種子バルクに対して実施した。対照FAプロフィールの計算のために、1つのヌル植物のFAプロフィールを10のNex710対照植物と組合せた。平均して、Nex710のものと比較した事象49に関してC18:0含有量の12%の増加を観察した(表14Aおよび14B)。この増加は、p=0.05にて統計的に有意であった(図13)。長鎖FA、例えばC20:0、C22:0およびC24:0などもまたある程度の増加に示し、そして5%の総飽和FA含有量の増加につながった。FatB酵素がC18:0 ACPのC18:0遊離FAへの転換を触媒するので、FatB4およびFatB5転写上方制御の結果、より多くのC18:0が蓄積する(図1)。pDAB4691(実施例6、表1および2)は、FatB4およびFatB5遺伝子の両方に特異的であり、そしてそれがFAプロフィールの著しい変化をもたらした(表14Aおよび14B)。
4つの構築物を、セイヨウアブラナにおけるFatB遺伝子の転写下方制御のために構築した(表15)。最良のFatB上方制御ZFP設計(13722および13714)を、FatB下方制御のデモンストレーションのために用いた(実施例9〜13)。これらのZFP設計を、KRAB1(Hanna-Rose and Hansen, 1996, Trends in Genetics, 12:229-234)またはNtERF3(Ohta et al., The Plant Cell, 2001,13:1959-1968)のいずれかから成るopaque−2核局在化シグナルおよび抑制ドメインに融合し、機能的なZFP TFを構築した。ZFP TFのすべてが種子特異的プロモーター下で発現された;シロイスナズナ脂質輸送タンパク質2プロモーター(AtLTP170プロモーター)(Genbank ID:NC_003076)またはインゲンマメ(Phaseolus vulgaris)β−ファゼオリンプロモーター(PvPhasプロモーター)(米国特許番号第5,591,605号)のいずれかを使用した。
T1種子を、構築物pDAS5203、pDAS5204、pDAS5212、pDAS5227のそれぞれのトランスジェニック事象(株)8、20、37、および15から得た。5つのNex710植物種子を対照として使用した。FA分析を、T1トランスジェニック事象それぞれの24個の個別の種子に対して実施例6.1で先に記載したように実施して、FAプロフィールを変更するのに最も効果的であるZFP TF構築物をまず特定した。
構築物pDAS5203、pDAS5212、およびpDAS5227は、対照であるNex710との比較で、最低の総飽和FAプロフィールを有するトランスジェニック事象を生じた(表16)。2つの構築事象、pDAS5203とpDAS5212、およびNex710対照の間のそれぞれの対での違いは有意であった(p=<0.005)。pDAS5227の対での違いは強い傾向を示した(p=0.06)。pDAS5203からの事象の1つは、Nex710対照における平均6.38%と比較して、5.3%(未掲載)の最も低い総飽和FA含有量を含んでいた。これは総飽和FAの17%の低下である。
それぞれ構築物pDAS5212およびpDAS5227での形質転換によって生じた2つのトランスジェニック事象、5212[1]−004および5227[4]−012を、FatB5転写下方調節分析のために選択した。50〜100個のT1種子を温室に植え付け、そして植物を栽培した。4つの葉パンチを、二〜三葉期の植物から採取した。この植物材料を、pat qRT−PCRアッセイを使用して、ZFP TFコピー数について分析した(実施例6.2)。次に、ランダムZFPヌル植物およびZFP陽性植物を、T2種子を採取するための成熟までの進展のために選択した(表17)。FatB mRNA分析のために、同じ植物からの未熟なさやを、開花後(DAF)25日で採取した。両方の事象を単一コピーとして分離した。これらの事象を、5212−4および5227−12とラベルした。
RNAを、Qiagen(Valencia、CA)から入手した植物RNAEASY(登録商標)キットを用いて未成熟なアブラナ属種子から単離した。種子を、RLTバッファー(Qiagen)/β−メルカプトエタノール(BME)およびステンレス・ビーズを入れたクラスターチューブに入れた。サンプルをクラスターチューブラックに立て、そしてビーズミル(Kleco、Visalia, CA)により1分あたり500ストロークにて5分間均質化した。チューブラックを180°回転させ、そしてさらに5分間均質化した。次に、1.5mlのエッペンドルフチューブにサンプルを移し、20,000×gにて5分間遠心分離し、そして上清を新しいチューブに移した。RNAを、製造業者のプロトコール(Qiagen;Valencia、CA)によって記述のとおりに単離した。RNAを、50μLのRNase不含水でカラムから溶出し、そしてRNAサンプルを、Thermo Scientific(Wilmington, DE)によってNanoDrop8000を用いて定量化した。
配列番号63:FATB5 fwd−5’TCGCTGCCATAACAACCATTT3’;
配列番号64:FATB5 rev−5’CGCCTGGGTTTCCAGTCA3’;
配列番号65:KRAB1 fwd−5’AAGGATGTGTTCGTGGATTTCA3’;
配列番号66:KRAB1 rev−5’CACAATCTGCTGTGCAGTATCAAG3’;
配列番号67:ERF3 fwd−5’GCGGGCGGGAGTTGTTA3’;
配列番号68:ERF3 rev−5’CCCCATCGGCGTTACATG3’;
配列番号69:TUBULIN fwd−5’GAAGCTGAGAACAGCGATTGC3’;
配列番号70:TUBULIN rev−5’GTTCCTCCTCCCAACGAATG3’。
プローブを、Applied Biosystems(Foster City, CA)によって6FAM/MGB合成した:
配列番号71:FATB5プローブ6FAM TTTCTCAGCCGCCA;
配列番号72:KRAB1プローブ6FAM TAGGGAAGAGTGGAAGCT;
配列番号73:ERF3プローブ6FAM CAGGCCTCAGCCTT;および
配列番号74:TUBULINプローブ6FAM TACAAGGTTTCCAAGTTT。
結果は、開花後(DAF)25日の未熟種子におけるFatB mRNA下方調節がT1植物の接合性の状況に依存していたことを示した。例えば、見かけのFatB5 mRNA下方調節が、5227−12未熟種子のヘテロ接合植物(1コピー)で観察されなかった(図17)。しかしながら、ZFP TF発現がホモ接合植物(2コピー)において2倍まで増加したとき、FatB5 mRNA発現の21%の低下を観察した(p=0.025)。同様の結果を、異なる構築物、pDAS5212の別の事象、5212−4で得た。この事象では、同じように、見かけのFatB5下方調節はヘテロ接合植物では観察されなかった(図18)。しかしながら、ZFP TF発現が増加したとき、FatB5転写産物の15%の低下をホモ接合植物で観察した。
T2成熟種子FAプロフィールは、事象5227−12に関するT1親株のZFP TF接合性によって異なる(表18Aおよび18B)。ヘテロ接合T1植物は25DAF未熟種子において見かけのFatB mRNA下方調節を示さなかったが、それらの種子のFAプロフィールは、C18:0含有量における8%の低下を示した。C16:0含有量の有意な低下は観察されなかった。加えて、C18:1(オレイン酸)および続く下流のFAのわずかな増加が観察され、総飽和FAの全体で5.5%の低下をもたらした(表18Aおよび18B、図19)。5227−12Tt植物がZFP TFに関してホモ接合であったとき、FatB mRNAは有意に下方制御された。これらのT2種子のFAプロフィールは異なっていた。C16:1含有量の11%の増加が観察され、総飽和FAの2.7%の低下をもたらした(表18Aおよび18B)。しかしながら、ヘテロ接合植物と比較して、C18:0のさらなる低下は観察されなかった。これらの変化は、T1成熟種子FAプロフィールに一致した(実施例15.1)。
Claims (19)
- 少なくとも1種類の内因性植物遺伝子の発現を変調する非天然ジンクフィンガータンパク質であって、上記少なくとも1種類の植物遺伝子が脂肪酸生合成に関与し、かつ、それが以下の:β−ケトアシル−ACPシンテターゼ(KAS)遺伝子、脂肪酸チオエステラーゼB(FatB)遺伝子、脂肪酸シンターゼ(FAS)遺伝子、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子、脂肪酸チオエステラーゼ(FatA)遺伝子、色素体G−3−Pデヒドロゲナーゼ(GPDH)遺伝子、グリセロキナーゼ(GK)遺伝子、ステアロイル−アシル担体タンパク質デサチュラーゼ(S−ACP−DES)遺伝子、およびオレオイル−ACPヒドロラーゼ遺伝子から成る群から選択される前記非天然ジンクフィンガータンパク質。
- 請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質と機能ドメインを含む融合タンパク質。
- 前記機能ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインである、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記植物遺伝子がアブラナ属植物の中に含まれている、請求項1〜3のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質または融合タンパク質。
- 前記ジンクフィンガータンパク質が、表2または表10Aに示す標的部位に結合する、請求項4に記載のジンクフィンガータンパク質。
- 前記ジンクフィンガータンパク質が、表1または表10Bの行中に示す認識ヘリックス領域を含む、請求項4に記載のジンクフィンガータンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の1以上のジンクフィンガータンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 植物細胞内の脂肪酸生合成に関与する1以上の遺伝子の変更方法であって、以下のステップ:
請求項7に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む1以上の発現ベクターを、前記1以上のジンクフィンガータンパク質が発現され、そして該1以上の遺伝子が変更されるような条件下、該植物細胞内に導入する、
を含む前記方法。 - 前記変更が、少なくとも1種類の遺伝子の発現を変調することを含む、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも1種類の遺伝子の発現が活性化される、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1種類の遺伝子の発現が抑制される、請求項9または10に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがジンクフィンガーヌクレアーゼをコードし、かつ、少なくとも1種類の遺伝子が切断される、請求項8に記載の方法。
- ドナーベクターが相同組換えにより切断部位に導入されるように、該ドナー核酸を導入するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載の方法によって変更した少なくとも1種類の遺伝子を含む植物細胞。
- 前記細胞が種子内にあり、かつ、該種子の脂肪酸含有量が変更されている、請求項14に記載の植物細胞。
- 請求項14または15に記載の少なくとも1つの細胞を含む植物。
- 請求項16に記載の植物の種子または子孫。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のジンクフィンガータンパク質または請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を含む植物。
- 請求項18に記載の植物の種子または子孫。
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