ES2646138T3 - Proteínas de dedos de cinc manipuladas genéticamente dirigidas a los genes de planta involucrados en la biosíntesis de ácidos grasos - Google Patents

Proteínas de dedos de cinc manipuladas genéticamente dirigidas a los genes de planta involucrados en la biosíntesis de ácidos grasos Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende un dominio funcional, que es un dominio regulador transcripcional o un dominio de escisión y una proteína de dedos de cinc natural, que comprende las regiones de hélice de reconocimiento mostradas en una fila única de la Tabla 1, donde la proteína de fusión modula la expresión de al menos un gen de ß-cetoacil-ACP sintetasa (KAS) endógeno.

Description

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DESCRIPCION
Protemas de dedos de cinc manipuladas geneticamente dirigidas a los genes de planta involucrados en la biosmtesis de acidos grasos
Campo tecnico
La descripcion se refiere generalmente a los campos de la ingeniena de genoma y expresion de protema en las plantas. En particular, la presente descripcion se refiere a los dominios de union de ADN manipulados geneticamente, por ejemplo, protemas de dedos de cinc, que dirigen los genes involucrados en la smtesis de acidos grasos y procedimientos de uso de tales protemas de dedos de cinc en la modulacion de la expresion genica, inactivacion genica, y modificacion del gen dirigida para generar plantas con perfiles de acidos grasos alterados.
Antecedentes
Las dietas ricas en grasas saturadas aumentan las lipoprotemas de baja densidad (LDL), lo que a su vez provoca el deposito de colesterol en los vasos sangumeos, una condicion previa estrechamente relacionada con la aterosclerosis y la enfermedad cardfaca coronaria Conner et al., Coronary Heart Disease:Prevention, Complications, and Treatment, J.B. Lippincott, Philadelphia, 1984 pp. 43-64). Por el contrario, se ha demostrado que las dietas ricas en grasas monoinsaturadas reducen la enfermedad cardfaca. El acido oleico, la unica grasa monoinsaturada en la mayona de los aceites vegetales comestibles, disminuye el LDL tan efectivamente como el acido linoleico, pero no afecta los niveles de lipoprotemas de alta densidad (HdL) (Mensink et al. (1989) New England J. Med., 321:436441). Ademas, las dietas ricas en grasas monoinsaturadas tambien se correlacionan con una presion arterial sistolica (Williams et al. (1987) J. Am. Med. Assoc., 257:3251-3256, 1987).
A la luz del efecto de los acidos grasos en la dieta y la salud, se han realizado intentos para alterar el perfil de acidos grasos de las plantas utilizadas con fines comestibles e industriales. Sin embargo, los procedimientos convencionales de alteracion de plantas para mejorar el perfil de acidos grasos se basan en la mutagenesis (por ejemplo, qmmica, radiacion, etc.) y/o en mejoramiento genetico y requieren mucho tiempo, son laboriosos y no se dirigen espedficamente a genes seleccionados. Vease, por ejemplo, Patente U.S. N° 5.861.187.
Por ejemplo, las tres referencias siguientes describen la regulacion de la expresion de KAS en plantas mediante procedimientos de direccionamiento no espedficos.
Pidkowich et al. ((2007) PNAS 104 (11):4742-4747) describe el papel de la protema transportadora beta-cetoacil- acilo (ACP) sintasa II (KAS II) e informa que la modulacion de la actividad de KAS II puede producir cambios sustanciales en la composicion de acidos grasos de almacenamiento de la semilla. Este documento demuestra ademas que la manipulacion de la actividad KAS II es un potente regulador de la composicion de aceite de la semilla y suficiente para convertir su composicion de semilla oleaginosa templada a la de un aceite tropical similar a la palma (pagina 4743, columna izquierda, final del segundo parrafo).
La patente U.S. N° 6.323.395 se refiere a procedimientos y composiciones para obtener aceites vegetales que tienen niveles saturados alterados mediante la modificacion de los niveles de expresion y actividad de KAS II dentro de la celula.
La Solicitud de patente internacional N° WO 93/10240 A1 describe un fragmento de acido nucleico que codifica una beta-cetoacil-ACP sintetiza II y que es util para controlar la composicion de acidos grasos en cultivos de semillas oleaginosas.
Recientemente, los dominios de union a ADN manipulados geneticamente tales como dominios de union a ADN de meganucleasa y protemas de dedos de cinc (ZFP) se han usado ventajosamente para modular selectivamente la expresion genica y para la alteracion dirigida de secuencias genicas en las plantas (veanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nros. 7.262.054; 7.235.354, 7.220.719, 7.001.768 y 6.534.261; las Publicaciones de patente U.S. Nros. 2008/0182332 y U.S. Serie N° 12/284.888). Por ejemplo, la Patente U.S. N° 7.220.719 describe un procedimiento para modular la expresion de un gen celular endogeno en una celula. Desde la pagina 24 hasta la 26 bajo el capftulo llamado "Regulacion de la expresion genica en plantas", se describe que las ZFP se pueden usar para manipular geneticamente plantas y, en particular, para mejorar la produccion de aceite mediante la modificacion de los acidos grasos. Mas particularmente, las ZFP se usan para regular la expresion del gen FAD2-1 en los porotos de soja. Las protemas de dedos de cinc (ZFP) son protemas que se unen al ADN, ARN y/o protema, de una manera espedfica de la secuencia, en virtud de un dominio estabilizado de metal conocido como dedos de cinc. Ver, por ejemplo, Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609 - 1614; Rhodes et al. (1993) Sci. Amer. 268 (2):56 - 65; y Klug (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218. Las ZFP se encuentran comunmente en los factores de transcripcion, y hasta la fecha, se han identificado mas de 10.000 secuencias de dedos de cinc en varios miles de factores de transcripcion conocidos o putativos.
Los dominios de union a ADN tambien se pueden usar con dominios nucleasa para obtener nucleasas modificadas geneticamente. Por ejemplo, el dominio de union a ADN de una endonucleasa de asentamiento se puede alterar para generar nuevas endonucleasas de asentamiento. De forma similar, los dominios de dedos de cinc tambien se
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han combinado con los dominios de escision de nucleasa para producir nucleasa de dedos de cinc (ZFN) para el direccionamiento espedfico de una ruptura de cadena doble en la region de un genoma donde se desea la modificacion (por ejemplo, supresion, mutacion, recombinacion homologa, o insercion de una secuencia exogena) (vease, por ejemplo, las Publicaciones de la solicitud de patente U.S. Nros. 2007/0134796; 2005/0064474; 2008/0182332). Las ZFP manipuladas geneticamente facilitan enormemente la insercion de secuencias exogenas o la modificacion de secuencias endogenas en sitios blanco espedficos en las plantas y proporcionan la alteracion dirigida de genomas de plantas con mayores eficiencias que los procedimientos convencionales (veanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nros 7.262.054, 7.235.354, 7.220.719, 7.001.768 y 6.534.261).
No obstante, aun existe la necesidad de composiciones y procedimientos para la alteracion dirigida de genes implicados en la smtesis de acidos grasos con el fin de producir plantas y productos de planta (por ejemplo, aceites vegetales) que tengan acidos grasos seleccionados. Mediante la produccion de variedades de plantas con niveles reducidos de grasas saturadas individuales y totales en aceite de semilla, se pueden producir productos alimenticios a base de aceite que contienen menos grasas saturadas. Tales productos beneficiaran la salud publica mediante la reduccion de la incidencia de aterosclerosis y enfermedad cardfaca coronaria.
Compendio
La presente descripcion describe composiciones y procedimientos para modular la expresion y para alteracion dirigida en plantas enteras o celulas de planta de uno o mas genes vegetales involucrados en la biosmtesis de acidos grasos, de este modo se altera la composicion de acidos grasos en la planta entera o celulas de planta. Las plantas enteras o celulas de planta pueden ser de especies de plantas monocotiledoneas (monocotiledoneas) o dicotiledoneas (dicotiledoneas), que incluyen en algunas realizaciones particulares plantas productoras de aceite, y tambien incluyen celulas cultivadas, celulas en una planta en cualquier etapa de desarrollo y celulas de planta que se han retirado de una planta entera y estas celulas (o sus descendientes) se regeneraran en plantas. Las celulas de planta pueden contener una o mas secuencias genicas homeologas o paralogas, cualquier numero de las cuales o todas las cuales pueden ser el blanco de modificacion mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un dominio de union a ADN (por ejemplo, protema de dedos de cinc (ZFP)) que se une espedficamente a un gen involucrado en una via de biosmtesis de acidos grasos de plantas. En algunas realizaciones, el gen es un gen de Brassica napus. En algunos aspectos particulares, el gen de Brassica napus puede codificar acetil-COA carboxilasa (ACCasa), p-cetoacil-ACP sintetasas (KAS, por ejemplo, KAS I-KAS IV), acido graso tioesterasa B (FATB, por ejemplo, FATB1-FATB, u otras tioesterasas plastfdicas) acido graso sintasa (FAS), acido graso elongasa (FAE, por ejemplo, FAE1), acido graso tioesterasa A (FatA), acido graso desaturasa (Fad2, Fad3), G-3-P deshidrogenasa plastfdica (GPDH), gliceroquinasa (GK), desaturasa de protema transportadora de estearoli-acilo (S-ACP-DES) y oleoil-ACP hidrolasa. En algunos aspectos particulares, el gen puede ser un ortologo o un homologo de estos genes en otras especies de plantas productoras de aceite.
En una realizacion preferida la presente invencion proporciona una protema de fusion que comprende un dominio funcional, que es un dominio regulador transcripcional o un dominio de escision y una protema de dedos de cinc natural, que comprende las regiones de la helice de reconocimiento mostrada en una fila unica de la Tabla 1, en la que la protema de fusion modula la expresion de al menos un gen de 13-cetoacil-ACP sintetasa (KAS) endogeno. Mas preferentemente el gen KAS esta contenido dentro de una planta de Brassica. En una realizacion aun preferida, la protema de dedos de cinc se une a un sitio blanco como se muestra en la Tabla 2.
En otro aspecto adicional, tambien se proporcionan protemas de fusion que comprenden cualquiera de los dominios de union a ADN (por ejemplo, ZFP) descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la protema de fusion comprende una protema de dedos de cincy un dominio regulador transcripcional (por ejemplo, dominio de activacion
0 represion), tambien conocido como ZFP TF. En otras realizaciones, la protema de fusion comprende una ZFP y un dominio de nucleasa para formar una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) que se escinde en una region genomica de interes con el gen blanco. En ciertos aspectos, la ZFN comprende un polipeptido de fusion que comprende un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente que tiene especificidad por un gen involucrado en una via de biosmtesis de acidos grasos de plantas (por ejemplo, un gen que codifica ACCase, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK o S-ACP-DES) y un dominio de escision, y/o uno o mas polipeptidos de fusion que comprenden un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente y un semidominio de escision. En ciertos aspectos, los dominios de union del dedos de cinc se unen a un sitio blanco como se muestra en la Tabla 2 o en la Tabla 10A. En ciertos aspectos, los dominios de union del dedos de cinc comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en protemas de dedos de cinc que comprenden los dominios de reconocimiento (por ejemplo, una fila unica) mostrados en la Tabla 1 o la Tabla 10B. Se pueden obtener dominios de escision y semidominios de escision, por ejemplo, a partir de diversas endonucleasas de restriccion y/o endonucleasas de asentamiento. En un aspecto, los semidominios de escision se derivan de una endonucleasa de restriccion de tipo IIS (por ejemplo, Fok I).
En una realizacion preferida la presente invencion proporciona un polinucleotido que codifica una o mas protemas de dedos de cinc que comprenden las regiones de la helice de reconocimiento mostradas en una fila unica de la Tabla
1 o protemas de fusion que comprenden un dominio funcional, que es un dominio regulador transcripcional o un
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dominio de escision y una protema de dedos de cinc natural que comprende las regiones de la helice de reconocimiento que se muestran en una fila unica de la Tabla 1, en la que dicha protema de fusion modula la expresion de al menos un gen de 13-cetoacil-ACP sintetasa (KAS) endogeno.
En otros aspectos, en la presente se describen polinucleotidos que codifican cualquiera de los dominios de union a ADN (por ejemplo, protemas de dedos de cinc) y/o protemas de fusion descritas en la presente memoria. En ciertos aspectos, la presente se describe un vector de expresion de ZFP que comprende a polinucleotido, que codifica una o mas ZFP descritas en la presente memoria, unidas operativamente a un promotor. En una realizacion, una o mas de las ZFP son ZFN.
Las ZFP y las protemas de fusion que comprenden estas ZFP se pueden unir y/o escindir un gen involucrado en la smtesis de acidos grasos dentro de la region codificadora del gen o en una secuencia no codificadora dentro o adyacente al gen, tal como, por ejemplo, una secuencia lfder, secuencia de remolque o intron, o dentro de una region no transcripta, corriente arriba o corriente abajo de la region codificadora. En ciertos aspectos, las ZFP o ZFN se unen y/o escinden una secuencia codificadora o una secuencia reguladora de un gen involucrado en la biosmtesis de acidos grasos.
En otro aspecto, se describen en la presente memoria composiciones que comprenden una o mas protemas, protemas de fusion o polinucleotidos descritos en la presente memoria. Las celulas de plantas pueden contener un blanco genico unico o copias paralogas multiples del mismo gen. Por lo tanto, las composiciones pueden comprender una o mas protemas que contienen ZFP (y polinucleotidos que las codifican) que se dirigen a uno o mas genes involucrados en la smtesis de acidos grasos en una celula de planta. Las ZFP se pueden dirigir a todos los genes paralogos u homeologos y a los genes paralogos u homeologos particulares seleccionados en una celula de planta o una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una celula huesped de planta que comprende una o mas protemas o polinucleotidos (por ejemplo, vector de expresion de ZFP) como se describe en la presente memoria. Para los polinucleotidos, la celula huesped de planta se pueden transformar de forma estable o transfectar de forma transitoria o una combinacion de las mismas con uno o mas vectores de expresion de ZFP. En una realizacion, el uno o mas vectores de expresion de ZFP expresa una o mas ZFN en la celula huesped de planta. En otra realizacion, el uno o mas vectores de expresion de ZFP expresa una o mas ZFP TF en la celula huesped de planta.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de modificacion de uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos en la celula de planta, el procedimiento que comprende:(a) introducir, en la celula de planta, uno o mas vectores de expresion que codifican una o mas ZFP TF que se unen a un sitio blanco en los uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos en condiciones tales que las ZFP TF se expresan y la expresion de los uno o mas genes se modifica, y mas particularmente la una o mas protemas de dedos de cinc, que comprenden las regiones de la helice de reconocimiento que se muestran en una fila unica de la Tabla 1, se expresan y la expresion de uno o mas genes KAS se modifica. La modificacion comprende modular la expresion de al menos un gen KAS. La modulacion pueden ser activacion o represion de la expresion de al menos un gen KAS. En ciertos aspectos, al menos un sitio blanco esta en un gen de AcCasa, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, y/o S-ACP-DES. En otros aspectos, se modula mas de un gen involucrado en la biosmtesis de acidos grasos. En cualquiera de los procedimientos de modificacion de uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos descritos en la presente memoria, el procedimientos produce celulas de plantas con contenido de acido graso modificado, por ejemplo, una reduccion de la cantidad de grasas saturadas en las celulas de planta. En algunas realizaciones, el contenido de acido graso modificado en las celulas de planta produce un contenido de acido graso modificado en las semillas de la planta, por ejemplo, una reduccion de la cantidad de grasas saturadas en las semillas de la planta. En algunas realizaciones la planta es una planta productora de aceite con contenido de acido grado modificado en las semillas de la planta productora de aceite (por ejemplo, grasas saturadas reducidas). En alguna realizacion particular, la planta es una planta de Brassica napus con contenido de acido graso modificado en las semillas de la planta de Brassica napus (por ejemplo, grasas saturadas reducidas).
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un procedimiento para escindir uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos en una celula de planta, el procedimiento que comprende:(a) introducir, en la celula de planta, uno o mas vectores de expresion que codifican una o mas nucleasas (por ejemplo, ZFN) que se unen a un sitio blanco en los uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos en condiciones tales que las nucleasas (por ejemplo, ZFN) se expresan y los uno o mas genes se escinden, y mas particularmente, al menos se escinde un gen kAs. En ciertos aspectos, al menos un sitio blanco esta en un gen que codifica ACCasa, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, y/o S-ACP-DES. En otros aspectos, se escinde mas de un gen involucrado en la biosmtesis de acidos grasos. Ademas, en cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, la escision de los uno o mas genes puede producir supresion, adicion y/o sustitucion de nucleotidos en la region escindida.
Tambien se describe en la presente memoria un procedimiento para introducir una secuencia exogena en el genoma de una celula de planta, el procedimiento comprende las etapas de:(a) poner en contacto la celula con una secuencia exogena (vector donante); y (b) expresar una o mas nucleasas (por ejemplo, nucleasas de dedos de cinc)
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como se describe en la presente memoria en la celula, en que la una o mas nucleasas escinden ADN cromosomico; de modo que la escision del ADN cromosomico en la etapa (b) estimula la incorporacion del vector donante en el genoma mediante recombinacion homologa. En ciertos aspectos, la una o mas nucleasas son fusiones entre el dominio de escision de una endonucleasa de restriccion de tipo II y un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente. En otros aspectos, la nucleasa comprende una endonucleasa de asentamiento, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento con un dominio de union a ADN modificado. En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, la secuencia exogena puede codificar un producto de protema.
En aun otro aspecto, tambien se proporciona una celula de planta transgenica o no transgenica obtenida de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una planta que comprende una celula de planta transgenica o no transgenica obtenida como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una semilla de planta que comprende una celula de planta transgenica o no transgenica obtenida como se describe en la presente memoria.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe un aceite proveniente de una semilla extrafda de una planta que comprende una celula de planta transgenica o no transgenica obtenida como se describe en la presente memoria.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un esquema que representa la vfas de biosmtesis de acidos grasos en canola (B. napus). Esto fue adaptado por John Shanklin, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY (Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic engineering 4:12-21).
La Figura 2 es un esquema que describe las ubicaciones del sitio blanco dentro del gen KASII para varios ejemplos de ZFP TF dirigidos a KASII. Los numeros indican los sitios blanco para las ZFP contenidas dentro de los constructos que se muestran en la Tabla III. Los disenos de ZFP se muestran en las Tablas I y II.
La Figura 3 es un grafico que representa la expresion de ARNm de CASI en las hojas de planta To transformadas con el constructo de ZFP tF de activacion KASII 4695, analizado por qRT-PCR. Se uso un promedio de 27 plantas de control para calcular la regulacion por aumento que se muestra en el grafico. Se observo una regulacion por aumento de mas de tres veces de ARNm de KASII en ciertos eventos.
La Figura 4 es un grafico que representa las relaciones de expresion de KASII-ZFP TF/tubulina en hojas de plantas Ti detectadas mediante qRT-PCR. Se compararon tres eventos junto con los valores nulos correspondientes.
La Figura 5 es un grafico que representa las relaciones de expresion de ARNm de KASII/tubulina promedio en las plantas Ti que contienen zFp TF y nulos segregantes de cada uno de los tres eventos determinado por qRT-PCR. Se observaron 2-3 veces la regulacion por aumento de ARNm de KASII en estas hojas de plantas Ti.
Las Figures 6A y 6B son graficos, extrafdos con el software estadfstico JMP para el analisis de una via de acidos grasos blanco, que representan una disminucion constante y significativa (p = <0.001) en el C16 total (6A) y una disminucion en las relaciones de C16 total/C18 total (6B) en las plantas ZFP TF positivas y nulas hermanas dentro de cada evento. El C16 total estaba compuesto por los contenidos de C16:0 y C16:1 y Cl8 total estaba compuesto por los contenidos de C18:0, 18:1, 18:2 y 18:3.
La Figura 7 representa un alineamiento de secuencia de AF318307 y AF244520. El sombreado que las regiones de homologfa exacta.
La Figura 8 representa un alineamiento de secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:30, AC189461, y BH723504. Las secuencias de cebador directo e inverso (SEQ ID NOs 28 y 29) para la amplificacion del ADNc de p-cetoacil-ACP sintetasa II se resaltan mediante lmeas discontinuas por encima de la secuencia correspondiente. El sombreado indica regiones de homologfa exacta.
La Figura 9 representa las expresiones del gen FatB4 y FatB en lmeas de callo de B. napus transgenicas para diferentes disenos de TF ZFP presentes en los constructos pDAB4690 - pDAB4692. Se analizaron 17 lmeas para control y 25 lmeas para cada uno de los constructos de ZFP. Barras negras = expresion de ARNm de FatB4; barras grises = expresion de ARNm de FatB.
La Figura 10 muestra las expresiones de FatB4 y FatB en hojas de plantas transgenicas B. napus T0 analizadas con qRT-PCR. Se analizaron tres constructos que comprenden ZFP TF, pDAB4689 - pDAB4691 en plantas transgenicas. El numero total de plantas transgenicas T0 independientes analizadas para este experimento fue de 40, 62, 41 y 22 para pDAB 4689 - pDAB4691 y pDAB8210, respectivamente. El control Nex710 estaba compuesto por 10 plantas. El noventa y siete por ciento de los eventos transgenicos para 3 constructos de ZFP TF fueron positivos para la expresion de ZFP TF, segun se determino mediante el ensayo de expresion de ZFP TF (Ejemplo
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8.3). Se obtuvieron resultados similares cuando se uso la expresion de ARNm de tubulina nativa como referencia para normalizar las expresiones genicas de FatB. Barra negra = expresion de FatB4; barra gris = expresion de FatB.
La Figura 11 es un diagrama que muestra una relacion lineal entre los genes FatB y la expresion de tubulina cuando se analiza a partir de plantas Ti. Cuadrados negros = expresion de FatB4; diamantes grises = expresion de FatB.
La Figura 12 muestra qRT-PCR para la expresion de FatB4 y FatB en hojas de planta Ti transgenicas para el constructo de TF ZFP pDAB4691. Cuadrados negros = expresion de FatB4; diamantes grises = expresion de FatB.
La Figura 13 es un analisis de una via del contenido de C18:0 por muestra utilizando el software estadfstico JMP.
La Figura 14 muestra un analisis de una via del contenido de C16/C18 por muestra utilizando el software estadfstico JMP.
La Figura 15 representa un analisis de los perfiles T1 FA de semillas maduras que comprende 4 eventos de constructos ZFP TF se muestra con el software estadfstico JMP. Los paneles A y B representan un analisis de una via por muestra (constructo) de contenido de C18:0 y contenido de C16:0/C18:0, respectivamente.
La Figura 16 representa un analisis de los perfiles T1 FA de semillas maduras que comprende 4 eventos de constructo ZFP TF se muestra con el software estadfstico JMP. Los paneles A y B muestran el analisis de una via por muestra (constructo) de contenido C14:0 y C16:1 respectivamente, se resalta el atributo diferenciador del constructo pDAS5227. El analisis de los perfiles de FA de T1 de semilla madura que comprende 4 eventos de constructos TF ZFP se muestra con el software estadfstico JMP. Los paneles A y B muestran el analisis de una via por muestra (constructo) del contenido C14:0 y C16:1 respectivamente, se resalta el atributo diferenciador del constructo pDAS5227.
La Figura 17 muestra la regulacion por disminucion del ARNm de FatB (barras negras) en la semilla inmadura T2 transformada con el constructo pDAS5227 ZFP TF. La expresion de ZFP TF esta representada por la expresion de ERF3 (barras grises). Se analizaron 25 semillas DAF inmaduras de cuatro plantas T1 nulas, tres heterocigotas (5227_12ZF -1) y cuatro homocigotas (5227_12ZF - 2) del evento 5227-12.
La Figura 18 muestra la regulacion por disminucion del ARNm de FatB (barras negras) en la semilla inmadura T2 transformada con el constructo pDAS5212 ZFP TF. La expresion de ARNm de ZFP TF esta representada por la expresion de KRAB1 (barras grises). Se analizaron 25 semillas DAF inmaduras de cinco plantas nulas, tres heterocigotas y cuatro homocigotas del evento 5212-4.
La Figura 19 muestra un analisis de una via de los acidos grasos saturados totales (sat) por cigosidad en la semilla T2 del evento ZFP TF 5227-12. Las semillas T2 obtenidas de las plantas T1 originales nulas, heterocigotas y homocigotas de T1 se marcan como 5227-12ZF nulo, 5227-12ZF (1) y 5227-12ZF (2), respectivamente.
La Figura 20 muestra un analisis de una via de los acidos grasos saturados totales (sat) por cigosidad en la semilla T2 del evento ZFP TF 5212-4. Las semillas T2 obtenidas de las plantas T1 originales nulas, heterocigotas y homocigotas se marcan como 5227-12ZF nulo, 5227-12ZF (1) y 5227-12ZF (2), respectivamente.
Descripcion detallada
En la presente memoria se describen composiciones y procedimientos utiles para la modulacion de la expresion y la escision dirigida y la alteracion de uno o mas genes involucrados en la srntesis de acidos grasos en plantas. La regulacion de tales genes se puede modular, por ejemplo, usando factores de transcripcion de ZFP manipulados geneticamente o modificacion de regiones reguladoras de genes. Los genes se pueden alterar, por ejemplo, mediante escision dirigida seguida de recombinacion homologa intracromosomica o mediante escision dirigida seguida de recombinacion homologa entre un polinucleotido exogeno (que comprende una o mas regiones de homologfa con la secuencia de nucleotidos del gen) y una secuencia genomica.
Las secuencias genomicas incluyen aquellas presentes en cromosomas, episomas, genomas de organelas (por ejemplo, mitocondrias, plastidos), cromosomas artificiales y cualquier otro tipo de acido nucleico presente en una celula tal como, por ejemplo, secuencias amplificadas, cromosomas de doble minuto y genomas bacterias y virus endogenos o infecciosos. Las secuencias genomicas pueden ser normales (es decir, de tipo salvaje) o mutantes; las secuencias mutantes pueden comprender, por ejemplo, inserciones, supresiones, translocaciones, reordenamientos y/o mutaciones puntuales. Una secuencia genomica tambien puede comprender uno de numerosos alelos diferentes.
Las composiciones descritas en la presente memoria comprenden una o mas ZFP que comprenden dominios de union por dedos de cinc manipulados geneticamente, polinucleotidos que codifican estos polipeptidos y combinaciones de ZFP y polinucleotidos que codifican ZFP. Un dominio de union del dedos de cinc puede comprender uno o mas dedos de cinc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o mas dedos de cinc), y se puede manipular geneticamente para unirse a cualquier secuencia genomica de un gen, que incluyen secuencias reguladoras unidas operativamente al gen, involucrado en la biosrntesis de acidos grasos.
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Las ZFP como se describen en la presente memoria se pueden usar para regular la expresion genica, ya sea a traves de la activacion o represion de la transcripcion genica. Las ZFP que comprenden fusiones de dominios de dedos de cinc unidos a dominios reguladores se pueden construir para crear factores de transcripcion quimericos que activan o reprimen la transcripcion. Las ZFP tambien se pueden usar para la escision dirigida de una region genomica de interes mediante la union de dominios de dedos de cinc con dominios de escision de nucleasas (o semidominios de escision) para producir nucleasas de dedos de cinc. Por lo tanto, mediante la identificacion de una region genomica blanco de interes en la que se desea la regulacion, escision o recombinacion genica, se puede construir, de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente invencion, una protema de dedos de cinc que comprende una o mas protemas de fusion que comprenden uno o mas dominios reguladores y/o dominios de escision (o semidominios de escision) unidos a un dominio de dedos de cinc manipulado geneticamente para reconocer una secuencia del gen en esa region genomica. La presencia de tal ZFP que comprende una protema de fusion (o protemas) en una celula producira la union de la protema de fusion a su sitio de union y alteracion de la regulacion o escision dentro o cerca de la region genomica. Ademas, si una region genomica se escinde y un polinucleotido exogeno homologo a esa region genomica tambien esta presente en la celula, la recombinacion homologa se produce a una tasa alta entre la region genomica y el polinucleotido exogeno.
Como se muestra en la Figura 1, existen varios genes que estan involucrados en la biosmtesis de acidos grasos. En consecuencia, las composiciones descritas en la presente memoria pueden dirigir uno o mas de estos genes en una celula de planta, que incluye, pero sin limitacion genes de ACCasa, KAS I, KAS II, KAS III, KAS IV, FATB1, FATB2, FATB3, FATB4, FATB, FAS, FAE1, FatA, Fad2, Fad3, GPDH, GK, o S-ACP-DES y ortologos, paralogos y homeologos de estos genes. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos pueden ser dirigidos por protemas (por ejemplo, ZFP) descritos en la presente memoria. En consecuencia, una o mas ZFP o vectores de expresion que codifican ZFP de diferentes especificidades se pueden combinar para dirigir los genes deseados de interes en una planta.
General
La puesta en practica de los procedimientos, asf como la preparacion y el uso de las composiciones descritas en la presente memoria emplean, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa molecular, bioqmmica, estructura y analisis de cromatina, qmmica de computacion, cultivos celulares, ADN recombinante y campos relacionados que se encuentran en la pericia de la tecnica. Estas tecnicas se explican totalmente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edicion, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periodicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOlOgY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definiciones
Los terminos "acido nucleico", "polinucleotido" y "oligonucleotido" se usan indistintamente y se refieren a un polfmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, en conformacion lineal o circular, y en forma de cadena simple o cadena doble. A los fines de la presente descripcion, estos terminos no se deben interpretar como limitantes respecto de la longitud de un polfmero. Los terminos pueden abarcar analogos conocidos de nucleotidos naturales, asf como nucleotidos modificados en la base, residuos de azucar y/o fosfato (por ejemplo, esqueletos de fosforotioato). En general, un analogo de un nucleotido particular tiene la misma especificidad de apareamiento de bases; es decir, un analogo de A se apareara con T.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se usan indistintamente para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. El termino tambien se aplica a polfmeros de aminoacidos en los cuales uno o mas aminoacidos son analogos qmmicos o derivados modificados de un aminoacido natural correspondiente.
"Union" se refiere a una interaccion espedfica de secuencia, no covalente, entre macromoleculas (por ejemplo, entre una protema y un acido nucleico). No todos los componentes de una interaccion de union necesitan ser espedficos de secuencia (porejemplo, los contactos con residuos fosfato en un esqueleto de ADN), siempre que la interaccion como un todo sea espedfica de secuencia. Dichas interacciones generalmente se caracterizan por tener una constante de disociacion (Kd) de 10-6M-1 o inferior. “Afinidad” se refiere a la fuerza de union, el aumento de la afinidad de union se correlaciona con una menor Kd.
Una "protema de union" es una protema que es capaz de unirse en forma no covalente a otra molecula. Una protema de union se puede unir, por ejemplo, a una molecula de ADN (una protema de union a ADN), una molecula de ARN (una protema de union a ARN) y/o una molecula de protema (una protema de union a protema). En el caso de una protema de union a protema, se puede unir con sf mismo (para formar homodfmeros, homotnmeros, etc.) y/o se puede unir a una o mas moleculas de diferente protema o protemas. Una protema de union puede tener mas de un tipo de actividad de union. Por ejemplo, las protemas de dedos de cinc tienen actividad de union a ADN, union a ARN y de union a protemas.
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Una "protema de union a ADN de dedos de cinc" (o dominio de union) es una protema o un dominio dentro de una protema mas grande, que se une al ADN en forma espedfica de secuencia a traves de uno o mas dedos de cinc, los cuales son regiones de la secuencia de aminoacidos dentro del dominio de union cuya estructura se estabiliza mediante la coordinacion de un ion cinc. El termino protema de union a ADN de dedos de cinc a menudo se abrevia como protema de dedos de cinc o ZFP.
Los dominios de union de dedos de cinc se pueden "manipular geneticamente" para unirse a una secuencia de nucleotidos predeterminada (por ejemplo, una secuencia blanco en cualquier gen involucrado en biosmtesis de acidos grasos). Los ejemplos no limitantes de procedimientos para manipular geneticamente las protemas de dedos de cinc son el diseno y la seleccion. Una protema de dedos de cinc disenada es una protema que no se encuentra en la naturaleza, cuyo diseno/composicion es principalmente el resultado de criterios racionales. Los criterios racionales de diseno incluyen la aplicacion de normas de sustitucion y algoritmos computados para procesar informacion en una base de datos que almacena informacion sobre los disenos de ZFP y los datos de union existentes. Ver, por ejemplo, las patentes U.S 6.140.081, 6.453.242, 6.534.261 y 6.785.613; ver, tambien WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536 y WO 03/016496; y las patentes U.S. 6.746.838; 6.866.997; y 7.030.215. En consecuencia, una protema de dedos de cinc "manipulada geneticamente" o protema de dedos de cinc "no natural" es una en la que uno o mas de los dominios de union a ADN de dedos de cinc componente (helices de reconocimiento) no son naturales y se han manipulado geneticamente para unirse a un sitio blanco preseleccionado.
Una protema de dedos de cinc “seleccionada" es una protema que no se encuentra en la naturaleza, cuya produccion es principalmente el resultado de un proceso empmco tal como despliegue en fago, trampa de interaccion o seleccion de dbridos. Vease, por ejemplo, US 5.789.538; US 5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; US 6.733.970; US RE39.229; y WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970WO 01/88197 y WO 02/099084.
El termino "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleotidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser de cadena simple o de cadena doble. El termino "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleotidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 250.000 nucleotidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o por encima de este), preferentemente entre aproximadamente 100 y 5000 nucleotidos de longitud (o cualquier numero entero entre ellos), con mas preferencia entre aproximadamente 200 y 2500 nucleotidos de longitud.
Una "secuencia homologa" se refiere a una primera secuencia que comparte un grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, y cuya secuencia puede ser identica a la de la segunda secuencia. Una "secuencia homologa no identica" se refiere a una primera secuencia que comparta cierto grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, pero cuya secuencia no es identica a la de la segunda secuencia. Por ejemplo, un polinucleotido que comprende la secuencia de tipo salvaje de un gen mutante es homologo y no identico a la secuencia del gen mutante. En ciertas realizaciones, el grado de homologfa entre las dos secuencias es suficiente para permitir la recombinacion homologa entre ellas, mediante la utilizacion de mecanismos celulares normales. Dos secuencias homologas no identicas pueden tener cualquier longitud y su grado de no homologfa puede ser tan pequeno como de un nucleotido unico (por ejemplo, para la correccion de una mutacion genomica puntual mediante recombinacion homologa dirigida) o tan grande como de 10 o mas kilobases (por ejemplo, para la insercion de un gen en un sitio predeterminado en un cromosoma). Dos polinucleotidos que comprenden las secuencias homologas no identicas no necesariamente tienen la misma longitud. Por ejemplo, se puede usar un polinucleotido exogeno (es decir, polinucleotido donante) de entre 20 y 10.000 nucleotidos o pares de nucleotidos.
Las tecnicas para determinar la identidad de las secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos son conocidas en la tecnica. Generalmente, dichas tecnicas incluyen determinar la secuencia de nucleotido del ARNm de un gen y/o determinar la secuencia de aminoacidos asf codificada, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleotidos o aminoacidos. Las secuencias genomicas tambien se puede determinar y comparar de esta manera. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta entre nucleotido a nucleotido o aminoacido a aminoacido en dos secuencias de polinucleotidos o polipeptidos, respectivamente. Dos o mas secuencias (polinucleotido o aminoacido) se pueden comparar mediante la determinacion de su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, sean secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos, es la cantidad de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas, dividida por la longitud de las secuencias mas cortas y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado de las secuencias de acidos nucleicos es provisto por el algoritmo de homologfa local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a las secuencias de aminoacidos mediante el uso de la matriz de puntuacion desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, y normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Un ejemplo de implementacion de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia es provisto por Genetics Computer Group (Madison, WI) en la aplicacion de utilidad “BestFit”. Los parametros predeterminados para este procedimiento se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI). Un procedimiento preferido para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente descripcion es usar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S.
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Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman donde se usan los parametros predeterminados para la tabla de puntuacion (por ejemplo, penalidad de brecha abierta de 12, penalidad de extension de brecha de uno y una brecha de seis). A partir de los datos generados, el valor "Coincidencia" refleja la identidad de secuencia. Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o semejanza entre las secuencias son conocidos en general en la tecnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parametros predeterminados. Por ejemplo, se pueden usar BLASTN y BLASTP mediante los siguientes parametros predeterminados:codigo genetico = estandar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62 (para BLASTP); Descripciones = 50 secuencias; calificados por = HIGH SCORE; base de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones GenBank CDs + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden hallar en Internet. Con respecto a las secuencias descritas en la presente, el rango de grados deseados de identidad de secuencia es de aproximadamente 35% a 100% y cualquier valor entero entre ellos. Generalmente, los porcentajes de identidad entre secuencias son de al menos 35%-40%; 40%-45%; 45%-50%; 50%-60%; 60%- 70%; 70-75%, preferentemente 80-82%, con mas preferencia 85-90%, aun con mas preferencia 92%, aun con mas preferencia 95%, y con maxima preferencia 98% de identidad de secuencia.
Alternativamente, el grado de semejanza de secuencia entre polinucleotidos se puede determinar por hibridacion de polinucleotidos en condiciones que permiten la formacion de duplex estables entre regiones homologas, seguida de digestion con nucleasas espedficas de cadenas unicas y determinacion del tamano de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de acidos nucleicos o de dos polipeptidos son sustancialmente homologas entre sf cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 70%-75%, preferentemente 80%-82%, mas preferentemente 85%- 90%, mas preferentemente aun 92%, con aun mayor preferencia 95%, y con maxima preferencia 98% de identidad de secuencia para una longitud definida de las moleculas, tal como se determina mediante los procedimientos anteriores. Tal como se usa en la presente memoria, sustancialmente homologo tambien se refiere a secuencias que muestran completa identidad con una secuencia espedfica de ADN o polipeptido. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas se pueden identificar en un experimento de hibridacion Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, tal como se define para dicho sistema particular. La definicion de las condiciones de hibridacion adecuadas esta dentro de la pericia en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).
La hibridacion selectiva de dos fragmentos de acido nucleico se puede determinar de la siguiente manera. El grado de identidad de secuencia entre dos moleculas de acido nucleico afecta la eficiencia y la fuerza de los eventos de hibridacion entre dichas moleculas. Una secuencia parcialmente identica de acido nucleico inhibira al menos parcialmente la hibridacion de una secuencia completamente identica a una molecula blanco. La inhibicion de la hibridacion de la secuencia completamente identica se puede evaluar mediante ensayos de hibridacion bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, transferencia Southern (ADN), transferencia Northern (ARN) hibridacion en solucion, o similares, vease Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Segunda Edicion, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tales ensayos se pueden realizar mediante el uso de grados variables de selectividad, por ejemplo, mediante condiciones que vanan de baja a alta rigurosidad. Si se emplean condiciones de baja rigurosidad, se puede evaluar la ausencia de union no espedfica mediante una sonda secundaria que carece incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda con menos de aproximadamente 30% de identidad de secuencia con la molecula blanco), de manera tal que en ausencia de eventos de union no espedficos, la sonda secundaria no se hibrida con el blanco.
Cuando se utiliza un sistema de deteccion basado en hibridacion, se elige una sonda de acido nucleico que es complementaria a una secuencia de acido nucleico de referencia, y luego, por seleccion de las condiciones adecuadas, la sonda y la secuencia de referencia se hibridan selectivamente, o unen entre sf para formar una molecula doble. Una molecula de acido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia referencia en condiciones moderadamente rigurosas de hibridacion generalmente se hibrida en condiciones que permiten la deteccion de una secuencia de acido nucleico blanco de al menos aproximadamente 10-14 nucleotidos de longitud que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia con la secuencia de la sonda de acido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridacion rigurosas generalmente permiten la deteccion de secuencias de acido nucleico blanco de al menos aproximadamente 10-14 nucleotidos de longitud que tienen una identidad de secuencia superior a aproximadamente 90-95% con la secuencia de la sonda seleccionada de acido nucleico. Las condiciones de hibridacion utiles para hibridar la secuencia de sonda/referencia, donde la sonda y la secuencia de referencia tienen un grado espedfico de identidad de secuencia, se pueden determinar tal como se conoce en la tecnica (vease, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach, editores B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).
Las condiciones de hibridacion son bien conocidas por los expertos en la tecnica. La rigurosidad de hibridacion se refiere al grado hasta el cual las condiciones de hibridacion desfavorecen la formacion de los hubridos que contienen nucleotidos no coincidentes, la mayor rigurosidad se correlaciona con una menor tolerancia para hfbridos no coincidentes. Los factores que afectan la rigurosidad de la hibridacion son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, sin limitaciones, temperatura, pH, fuerza ionica, y concentracion de disolventes organicos tales como, por ejemplo, formamida y dimetilsulfoxido. Como es bien sabido por los expertos en la tecnica, la rigurosidad
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de la hibridacion aumenta con temperaturas mas altas, fuerza ionica menor y concentraciones de disolventes mas bajas.
Con respecto a las condiciones de rigurosidad para la hibridacion, es bien conocido en la tecnica que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer una rigurosidad particular al variar, por ejemplo, los siguientes factores: la longitud y la naturaleza de las secuencias, la composicion de bases de las diversas secuencias, las concentraciones de sales y otros componentes de la solucion de hibridacion, la presencia o ausencia de agentes bloqueantes en las soluciones de hibridacion (por ejemplo, sulfato de dextrano y polietilenglicol), parametros de temperatura y tiempo de la reaccion de hibridacion, asf como variadas condiciones de lavado. La eleccion de un conjunto particular de condiciones de hibridacion se selecciona segun procedimientos estandar en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
“Recombinacion" se refiere a un proceso de intercambio de informacion genetica entre dos polinucleotidos. A los fines de la presente descripcion, "recombinacion homologa (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparacion de las rupturas de la cadena doble en las celulas. Este proceso requiere la homologfa de secuencia de nucleotidos, que usa una molecula "donante" para reparar el molde de una molecula "blanco" (es decir, la que experimento la ruptura de la cadena doble), y es conocida de manera diversa como "conversion genica sin entrecruzamiento" o "conversion genica de tracto corto", porque lleva a la transferencia de informacion genetica de la donante al blanco. Sin pretender estar ligado por cualquier teona particular, dicha transferencia puede implicar la correccion de la falta de coincidencia de ADN heteroduplex que se forma entre el blanco roto y donante, y/o "apareamiento de cadenas dependiente de la smtesis" en que se usa la donante para resintetizar la informacion genetica que pasara a formar parte del blanco, y/o procesos relacionados. Tal HR especializada a menudo produce una alteracion de la secuencia de la molecula blanco de manera tal que parte o la totalidad de la secuencia de polinucleotidos donante se incorpora al polinucleotido blanco.
"Escision" se refiere a la ruptura del esqueleto covalente de una molecula de ADN. La escision puede ser iniciada por diversos procedimientos que incluyen, sin limitaciones, la hidrolisis enzimatica o qmmica de un enlace fosfodiester. La escision de la cadena simple y escision de la cadena doble son posibles, y la escision de la cadena doble puede ocurrir como resultado de dos eventos de escision de cadena simple bien diferenciados. La escision del ADN puede generar la produccion de extremos romos o extremos escalonados. En ciertas formas de realizacion, se usan polipeptidos de fusion para la escision dirigida del ADN de cadena doble.
Un "dominio de escision" comprende una o mas secuencias de polipeptidos que posee actividad catalttica para la escision del ADN. Un dominio de escision puede estar contenido en una cadena de polipeptido unica o la actividad de escision puede ser el resultado de la asociacion de dos (o mas) polipeptidos.
Un "semidominio de escision" es una secuencia de polipeptido que, en conjuncion con un segundo polipeptido (sea identico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escision (por ejemplo, actividad de escision de cadena doble).
Cromatina" es la estructura de nucleoprotema que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende el acido nucleico, principalmente ADN, y protema, que incluye las histonas y protemas cromosomicas no histona. La mayor parte de la cromatina celular eucariota existe en la forma de nucleosomas, en el que un nucleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociadas con un octamero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y ADN ligador (de longitud variable segun el organismo) se extiende entre los nucleos del nucleosoma. Una molecula de histona H1 generalmente se asocia con el ADN ligador. A los fines de la presente descripcion, el termino “cromatina” significa que abarca todos los tipos de nucleoprotema celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye tanto la cromatina cromosomica como episomica.
Un "cromosoma" es un complejo de cromatina que comprende la totalidad o una porcion del genoma de una celula. El genoma de una celula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la coleccion de la totalidad de los cromosomas que comprenden el genoma de la celula. El genoma de una celula puede comprender uno o mas cromosomas.
Un "episoma" es un acido nucleico en replicacion, complejo de nucleoprotema u otra estructura que comprende un acido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosomico de una celula. Los ejemplos de episomas incluyen plasmidos y ciertos genomas virales.
Una "region accesible" es un sitio de la cromatina celular en la cual un sitio blanco presente en el acido nucleico se puede unir a una molecula exogena que reconoce el sitio blanco. Sin pretender estar limitado por cualquier teona particular, se cree que una region accesible es la que no esta empaquetada en una estructura de nucleosoma. La estructura diferenciada de una region accesible a menudo se puede detectar por su sensibilidad a sondas qmmicas y enzimaticas, por ejemplo, nucleasas.
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Un "sitio blanco" o "secuencia blanco" es una secuencia de acido nucleico que define una porcion de un acido nucleico al que se unira la molecula de union, siempre que existan suficientes condiciones de union. Por ejemplo, la secuencia 5'-GAATTC-3' es un sitio blanco para la endonucleasa Eco RI de restriccion.
Una molecula "exogena" es una molecula que normalmente no esta presente en una celula, pero que se puede introducir en la celula mediante uno o mas procedimientos geneticos, bioqmmicos o de otro tipo. La “presencia normal en la celula” se determina con respecto a la particular etapa de desarrollo y las condiciones ambientales de la celula. En consecuencia, por ejemplo, una molecula que esta presente en las celulas solo durante las primeras etapas de desarrollo embrionario del musculo es una molecula exogena con respecto a una celula muscular adulta. De modo similar, una molecula inducida por shock de calor es una molecula exogena con respecto a una celula no sometida al shock de calor. Una molecula exogena puede comprender, por ejemplo, una version funcional de una molecula endogena que funciona mal o una version que funciona mal de una molecula endogena que funciona normalmente.
Una molecula exogena puede ser, entre otras cosas, una molecula pequena, tal como la generada por un proceso de qmmica combinatorio, o una macromolecula tal como una protema, acido nucleico, hidrato de carbono, lfpido, glucoprotema, lipoprotema, polisacarido, cualquier derivado modificado de las moleculas anteriores, o cualquier complejo que comprende una o mas de las moleculas anteriores. Los acidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser de cadena simple o doble; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden tener cualquier longitud. Los acidos nucleicos incluyen los que tienen capacidad para formar duplex, asf como acidos nucleicos formadores de triplex. Vease por ejemplo, las patentes U.S. Nros. 5.176.996 y 5.422.251. Las protemas incluyen, pero sin limitacion, protemas de union a aDn, factores de transcripcion, factores de remodelacion de cromatina, protemas de union a ADN metiladas, polimerasas, metilasas, demetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.
Una molecula exogena puede ser el mismo tipo de molecula que una molecula endogena, por ejemplo una protema o acido nucleico exogeno. Por ejemplo, un acido nucleico exogeno puede comprender un genoma viral infectante, una cadena T Agrobacterium tumefaciens, un plasmido o episoma introducido en la celula o un cromosoma que normalmente no esta presente en la celula. Los procedimientos para la introduccion de moleculas exogenas en las celulas son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero sin limitacion, transferencia mediada por lfpidos (es decir, liposomas, que incluye lfpidos neutros y cationicos), electroporacion, inyeccion directa, fusion celular, bombardeo de partmulas, coprecipitacion de fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector viral. La molecula exogena es una molecula no de planta, por ejemplo, un anticuerpo de mairnfero (por ejemplo, humano o humanizado.
En contraste, una molecula "endogena" es una que normalmente esta presente en una celula particular en una etapa particular de desarrollo en condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un acido nucleico endogeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otra organela, o un acido nucleico episomico natural. Las moleculas endogenas adicionales pueden incluir protemas, por ejemplo, factores de transcripcion y enzimas.
Una molecula de "fusion" es una molecula en la cual dos o mas moleculas de subunidades estan ligadas, con preferencia, covalentemente. Las moleculas de subunidades pueden ser el mismo tipo qmmico de molecula, o pueden ser distintos tipos qmmicos de moleculas. Los ejemplos del primer tipo de molecula de fusion incluyen, pero sin limitacion, protemas de fusion (por ejemplo, una ZFN que comprende una fusion entre un dominio de union a ADN de ZFP y un dominio de escision y acidos nucleicos de fusion (por ejemplo, un acido nucleico que codifica la protema de fusion descrita supra). Los ejemplos del segundo tipo de molecula de fusion incluyen, pero sin limitacion, una fusion entre un acido nucleico formador de triplete y un polipeptido, y una fusion entre un ligador del surco menor y un acido nucleico.
La expresion de una protema de fusion en una celula puede ser el resultado de la administracion de la protema de fusion a la celula o por administracion de un polinucleotido que codifica la protema de fusion a una celula, en que el polinucleotido se transcribe, y la transcripcion se traduce para generar la protema de fusion. En la expresion de una protema en una celula tambien pueden intervenir el transempalme, escision del polipeptido y ligacion del polipeptido. Los procedimientos para la administracion de polinucleotidos y polipeptidos a las celulas se presentan en otra parte de la presente descripcion.
Un "gen", a los fines de la presente descripcion, incluye una region ADN que codifica un producto genico (vease infra), asf como todas las regiones de aDn que regulan la produccion del producto genico, sean o no estas secuencias reguladoras adyacentes a las secuencias codificadoras y/o transcriptas. En consecuencia, un gen incluye, pero no necesariamente se limita a secuencias de promotores, terminadores, secuencias reguladoras de la traduccion tales como sitios de union de ribosomas y sitios de entrada internos del ribosoma, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos limitantes, ongenes de replicacion, sitios de union de la matriz y regiones de control del locus.
La "expresion genica" se refiere a la conversion de la informacion contenida en un gen en un producto genico. Un producto genico puede ser el producto de la transcripcion directa de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN
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antisentido, ribozima, ARNsh, micro ARN, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una protema producida por traduccion de un ARNn. Los productos genicos tambien incluyen ARN modificados por procesos tales como colocacion de capuchon, poliadenilacion, metilacion y edicion, y protemas modificadas, por ejemplo, por metilacion, acetilacion, fosforilacion, ubicuitinacion, ADP-ribosilacion, miristilacion y glucosilacion.
La "modulacion" de la expresion genica se refiere a un cambio de la actividad de un gen. La modulacion de la expresion puede incluir, pero sin limitacion, la activacion genica y la represion genica.
Las celulas de "planta" incluyen, pero sin limitacion, celulas de planas monocotiledoneas (monocot) o dicotiledoneas (dicot). Los ejemplos no limitantes de monocotiledoneas incluyen plantas de cereales tales como mafz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, cana de azucar, anana, cebolla, banana y coco. Los ejemplos no limitantes de dicotiledoneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodon, remolacha azucarera, papa, lechuga, melon, poroto de soja, canola (semilla de colza), y alfalfa. Las celulas de plantas pueden provenir de cualquier parte de la planta y/o de cualquier etapa de desarrollo de la planta. Por lo tanto, las celulas de planta pueden ser celulas de las semillas de la planta. En algunas realizaciones, la planta o celula de planta es, o se deriva de, una planta implicada en la produccion de aceites vegetales para usos comestibles y/o industriales (es decir, una "planta productora de aceite"). Los ejemplos de plantas productoras de aceite incluyen, pero sin limitacion Brassica sp. (por ejemplo, Brassica napus que incluye cultivares de canola), mafz, soja, crambe, mostaza, semilla de ricino, mam, sesamo, algodon, semilla de lino, cartamo, aceite de palma, lino, girasol y coco.
Una "region de interes" es cualquier region de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificadora dentro o adyacente a un gen, en la que es deseable unirse a una molecula exogena. La union puede tener por finalidad la escision de ADN dirigida y/o la recombinacion dirigida. Una region de interes puede estar presente por ejemplo, en un cromosoma, un episoma, un genoma de organela (por ejemplo, mitocondrial, cloroplastico), o un genoma viral infeccioso. Una region de interes puede estar dentro de la region codificadora de un gen, dentro de regiones no codificadoras transcriptas tales como, por ejemplo, secuencias lfderes, secuencias de remolque o intrones, o dentro de regiones no transcriptas, sean corriente arriba o corriente abajo respecto de la region codificadora. Una region de interes puede ser tan pequena como un unico par de nucleotidos o de hasta 25.000 pares de nucleotidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleotidos.
Los terminos "union operativa" y "unido operativamente" (o "unido operablemente") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposicion de dos o mas componentes (elementos como elementos de secuencia), en la que los componentes se disponen de manera tal que ambos componentes funcionan normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una funcion que se ejerce sobre al menos uno de los demas componentes. A modo de ilustracion, una secuencia reguladora de la transcripcion, tal como un promotor, esta unido operativamente a una secuencia codificadora si la secuencia reguladora de la transcripcion controla el nivel de transcripcion de la secuencia codificadora en respuesta a la presencia o ausencia de uno o mas factores reguladores de la transcripcion. Una secuencia reguladora transcripcional generalmente esta unida operativamente en cis con una secuencia codificadora, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripcion que esta unida operativamente a una secuencia codificadora, aun cuando no sean contiguas.
Con respecto a los polipeptidos de fusion, el termino "unido operativamente" se puede referir al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma funcion en union con el otro componente, como si no estuvieran unidos de este modo. Por ejemplo, con respecto a un polipeptido de fusion en el cual un dominio de union al ADN ZFP se fusiona a un dominio regulador, el dominio de union al ADN ZFP y el dominio regular estan en union operativa si, en el polipeptido de fusion, la porcion del dominio de union al ADN ZFP es capaz de unirse a su sitio blanco y/o su sitio de union, mientras que el dominio regulador es capaz de regular la expresion de ADN en la cercama del sitio blanco.
Un "fragmento funcional" de una protema, polipeptido o acido nucleico es una protema, polipeptido o acido nucleico cuya secuencia no es identica a la protema, polipeptido o acido nucleico de longitud completa, pero retiene la misma funcion que la protema, polipeptido o acido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer mas, menos o la misma cantidad de residuos que la correspondiente molecula nativa, y/o puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos o nucleotidos. Los procedimientos para determinar la funcion de un acido nucleico (por ejemplo, funcion codificadora, capacidad para hibridarse a otro acido nucleico) son bien conocidos en la tecnica. De modo similar, los procedimientos para determinar la funcion proteica son bien conocidos. Por ejemplo, la funcion de union a ADN de un polipeptido se puede determinar, por ejemplo, por union a un filtro, cambio de movilidad electroforetica o ensayos de inmunoprecipitacion. La escision de ADN se puede analizar por electroforesis en gel. Vease Ausubel et al., supra. La capacidad de una protema para interactuar con otra protema se puede determinar, por ejemplo, por coinmunoprecipitacion, ensayos de dos tnbridos o complementacion, tanto genetica como bioqmmica. Vease por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; patente U.S. N° 5.585.245 y PCT WO 98/44350.
Como se usa en la presente memoria, "acidos grasos saturados" incluyen pero sin limitacion, acidos laurico (C12:0), minstico (C14:0), palmftico (C16:0) y estearico (C18:0). De modo similar, los “acidos grasos monoinsaturados" y "acidos grasos poliinsaturados" incluyen, pero sin limitacion acidos grasos C18 tal como acido oleico (C18:1), acido linoleico reducido (C18:2) y acido linolenico reducido (C18:3).
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Sitios blanco
Los procedimientos y composiciones descritos incluyen las protemas de fusion que comprenden un dominio de union al ADN (por ejemplo, ZFP) y un dominio regulador o dominio de escision (nucleasa) (o un semidominio de escision), en que el dominio de union al ADN (por ejemplo, dominio de dedos de cinc), mediante la union a una secuencia en la cromatina celular en un gen involucrado en la smtesis de acidos grasos, dirige la actividad del dominio regulador transcripcional o dominio de escision (o semidominio de escision) en la proximidad de la secuencia y, en consecuencia, modula la transcripcion o induce la escision en la proximidad de la secuencia blanco.
Como se expone en otra parte en esta descripcion, un dominio de dedos de cinc se puede manipular geneticamente para unirse practicamente a cualquier secuencia deseada. Por consiguiente, despues de identificar una region de interes que contiene una secuencia en la que se desea la regulacion, escision, o recombinacion del gen, uno o mas dominios de dedos de cinc se pueden manipular geneticamente para unir una o mas secuencias en la region de interes.
La seleccion de un sitio blanco en una region genomica de interes en la cromatina celular de cualquier gen involucrado en biosmtesis de acidos grasos (por ejemplo, vease Figura 1) para la union por un dominio de dedos de cinc (porejemplo, un sitio blanco) se puede obtener por ejemplo, de acuerdo con procedimientos descritos en la en la Patente en copropiedad U.S:N° No. 6.453.242 (17 de septiembre de 2002), que tambien describe procedimientos para disenar ZFP para que se unan a una secuencia seleccionada. Sera evidente para los expertos en la tecnica que la simple inspeccion visual de una secuencia de nucleotidos tambien se puede usar para la seleccion de un sitio blanco. Por consiguiente, se puede usar cualquier medio para la seleccion del sitio blanco en los procedimientos reivindicados
Los sitios blanco se componen generalmente de una pluralidad de subsitios blanco adyacentes. Un subsitio blanco se refiere a la secuencia (usualmente un triplete de nucleotidos, o un cuadruplete de nucleotidos que se puede superponer en un nucleotido con un cuadruplete adyacente) unido por un dedos de cinc individual. Vease, por ejemplo, WO 02/077227. Si la cadena con la que una protema de dedos de cinc hace mayor contacto se denomina “cadena de reconocimiento primario” o “cadena de contacto primario” de la cadena blanco, algunas protemas de dedos de cinc se unen a un triplete de tres bases en la cadena blanco y una cuarta base en la cadena no blanco. Un sitio blanco generalmente tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos y, por consiguiente, se une mediante un dominio de union de dedos de cinc que comprende al menos tres dedos de cinc. Sin embargo, tambien es posible la union de, por ejemplo, un dominio de union de 4 dedos a un sitio blanco de 12 nucleotidos, un dominio de union de 5 dedos a un sitio blanco de 15 nucleotidos o un dominio de union de 6 dedos a un sitio blanco de 18 nucleotidos. Como sera evidente, la union de los dominios de union mas grandes (porejemplo, 7, 8, 9 dedos y mas) a los sitios blanco mas largos tambien es posible.
No es necesario que un sitio blanco sea multiplo de tres nucleotidos. Por ejemplo, en los casos en que se producen interacciones de cadena cruzada (vease, por ejemplo, patente U.S. 6.453.242 WO 02/077227), uno o mas de los dedos de cinc individuales de un dominio de union de multiples dedos se puede unir a subsitios de cuadruplete superpuestos. Como resultado, una protema de tres dedos puede unir una secuencia de 10 nucleotidos, en la que el decimo nucleotido es parte de un cuadruplete unido por un dedo terminal, una protema de cuatro dedos puede unir una secuencia de 13 nucleotidos, en la que el decimotercero nucleotido es parte de un cuadruplete unido por un dedos terminal, etc.
La longitud y naturaleza de secuencias de ligador de aminoacidos entre los dedos de cinc individuales en un dominio de union de dedos multiples tambien afecta a la union a una secuencia blanco. Por ejemplo, la presencia de un llamado "ligador no canonico", "ligador largo" o "ligador estructurado" entre los dedos de cinc adyacentes en un dominio de union de dedos multiples puede permitir que los dedos se unan a los subsitios que no son inmediatamente adyacentes. Los ejemplos no limitantes de tales ligadores se describen, por ejemplo, en las patentes U.S Nros 6.479.626 WO 01/53480. En consecuencia, uno o mas subsitios, en un sitio blanco para un dominio de union de dedos de cinc, puede estar separado entre sf por 1, 2, 3, 4, 5 o mas nucleotidos. Para proporcionar un solo ejemplo, un dominio de union de cuatro dedos se puede unir a un sitio blanco de 13 nucleotidos que comprende, en secuencia, dos subsitios de 3 nucleotidos contiguos, un nucleotido interviniente, y dos subsitios de tripletes contiguos. Vease, tambien, la solicitud U.S. N°. 61/130.099 para las composiciones y procedimientos para ligar las nucleasas artificiales que se unen a sitios blanco separados por diferentes numeros de nucleotidos. La distancia entre las secuencias (por ejemplo, sitios blanco) se refiere al numero de nucleotidos o pares de nucleotidos que intervienen entre dos secuencias, medida desde los bordes de las secuencias mas cercanas entre sf.
En ciertas realizaciones, se disenan ZFP con funcion del factor de transcripcion, Para la funcion de factor de transcripcion, la proximidad de union simple y suficiente al promotor es todo lo que generalmente se necesita. La ubicacion exacta respecto del promotor, orientacion, y dentro de los lfmites, la distancia no importa mucho. Esta caractenstica permite una flexibilidad considerable en la eleccion de los sitios blanco para la construccion de factores de transcripcion artificiales. El sitio blanco reconocido por ZFP puede ser cualquier sitio adecuado en el gen blanco que permita la activacion o represion de la expresion genica, y una ZFP opcionalmente ligada a un dominio regulador. Los sitios blanco preferidos incluyen las regiones adyacentes, corriente abajo o corriente arriba del sitio de inicio de transcripcion. Ademas, los sitios blanco que se encuentran en las regiones potenciadoras, sitios
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represores, sitios de pausa de ARN polimerasa y sitios reguladores espedficos (por ejemplo, sitios SP-1, elementos de respuesta a la hipoxia, elementos de reconocimiento de receptores nucleares, sitios de union a p53), sitios en la region que codifica ADNc o en una region codificadora de la marca de la secuencia (EST) expresada.
En otras realizaciones, se disenan ZFP con actividad de nucleasa. La expresion de una ZFN que comprende una protema de fusion que comprende un dominio de union de dedos de cinc y un dominio de escision (o de dos protemas de fusion, cada una que comprende un dominio de union de dedos de cinc y un semidominio de escision), en una celula, efectua la escision en la proximidad de la secuencia blanco. En ciertas realizaciones, la escision depende de la union de dos moleculas de fusion del dominio de dedos de cinc/semidominio de escision para separar los sitios blanco. Los dos sitios blanco pueden estar en las cadenas de ADN opuestas, o alternativamente, ambos sitios blanco pueden estar en la misma cadena de ADN.
Dominios de union al ADN
Cualquier dominio de union al ADN se puede usar en la practica de la presente invencion. En ciertas realizaciones, el dominio de union al ADN comprende un dominio de union de dedos de cinc de uno o mas dedos de cinc. Miller et al. (1985) EMBO J.4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65; patente U.S. N° 6.453.242. Generalmente, un dominio de dedos de cinc unico tiene aproximadamente 30 aminoacidos de longitud. Los estudios estructurales han demostrado que cada dominio de dedos de cinc (motivo) contiene dos hojas beta (sostenidos en un giro beta que contiene los dos residuos cistema no variantes) y una helice alfa (que contiene los dos residuos histidina no variantes), que se mantienen en una particular conformacion debido a la coordinacion de un atomo de cinc mediante las dos cistemas y las dos histidinas.
Los dedos de cinc incluyen tanto los dedos de cinc canonicos C2H2 (es decir, aquellos en los cuales el ion cinc esta coordinado por dos residuos cistema y dos residuos histidina) y dedos de cinc no canonicos, tales como, por ejemplo, los dedos de cinc C3H y C2HC (aquellos en los cuales el ion cinc es coordinado por tres residuos de cistema y un residuo de histidina). Vease tambien Publicacion de patente U.S. N° 2008/0182332) y dedos de cinc C4 (aquellos en los que el ion de cinc esta coordinado por cuatro residuos de cistema). Vease tambien el documento WO 02/057293.
Los dominios de union de dedos de cinc se pueden manipular geneticamente para unirse a una secuencia de eleccion. Vease, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente (o no natural) puede tener una nueva especificidad de union, en comparacion con una protema de dedos de cinc natural. Los procedimientos de manipulacion genetica incluyen, sin limitaciones, un diseno racional y diversos tipos de seleccion. El diseno racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden tripletes (o cuatripletes) de secuencias de nucleotidos y secuencias de aminoacidos de dedos de cinc individuales, en los cuales cada secuencia de nucleotidos triplete o cuatriplete se asocia con una o mas secuencias de aminoacidos de dedos de cinc que se unen a la secuencia de triplete o cuatriplete particular. Vease, por ejemplo, Patentes U.S. en copropiedad 6.453.242 y 6.534.261. Se describen procedimientos de diseno adicionales, por ejemplo, en las patentes U.S. 6.746.838; 6.785.613; 6.866.997; y 7.030.215.
Los ejemplos de procedimientos de seleccion, que incluyen sistemas de despliegue en fago y de dos tnbridos, se describen en las patentes U.S. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759 y 6.242.568; asf como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237.
El mejoramiento de la especificidad de union de los dominios de union de los dedos de cinc se ha descrito, por ejemplo, en la patente U.S. en copropiedad N° 6.794.136.
Debido a un dedo de cinc individual se une a una secuencia de tres nucleotidos (es decir, triplete) (o una secuencia de cuatro nucleotidos que se puede superponer, por un nucleotido, con el sitio de union de cuatro nucleotidos de un dedo de cinc adyacente), la longitud de una secuencia para la cual un dominio de union de un dedo de cinc se manipula geneticamente para unir (por ejemplo, una secuencia blanco) determinara la cantidad de dedos de cinc en un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente. Por ejemplo, para las ZFP en las cuales los motivos de dedo no se unen a los subsitios superpuestos, una secuencia blanco de seis nucleotidos se une a un dominio de union de dos dedos; una secuencia blanco de nueve nucleotidos se une a un dominio de union de tres dedos, etc. Como se indica en la presente memoria, los sitios de union para dedos de cinc individuales (es decir, subsitios) en un sitio blanco no necesitan ser contiguos, sino que pueden estar separados por uno o varios nucleotidos, segun la longitud y la naturaleza de las secuencias de aminoacidos entre los dedos de cinc (es decir, los ligadores entre dedos) en un dominio de union de dedos multiples.
En un dominio de union de dedos de cinc de dedos multiples, los dedos de cinc adyacentes pueden estar separados por secuencias ligadoras de aminoacidos de aproximadamente 5 aminoacidos (los denominados ligadores entre dedos “canonicos”) o, alternativamente, por uno o mas ligadores no canonicos. Vease, por ejemplo, las patentes en copropiedad U.S Nros 6.453.242 y 6.534.261. Para los dominios de union de dedos de cinc manipulados geneticamente que comprenden mas de tres dedos, la insercion de ligadores entre dedos mas largos (“no
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canonicos”) entre algunos de los dedos de cinc puede ser preferida ya que puede incrementar la afinidad y/o especificidad de la union mediante el dominio de union. Vease, por ejemplo, la patente U.S. N° 6,479,626 y WO 01/53480. En consecuencia, los dominios de union de dedos de cinc de dedos multiples tambien se pueden caracterizar con respecto a la presencia y la ubicacion de ligadores entre dedos no canonico. Por ejemplo, un dominio de union de dedos de cinc de seis dedos que comprende tres dedos (unidos por dos ligadores entre dedos canonicos), un ligador largo y tres dedos adicionales (unidos por dos ligadores entre dedos canonicos) se indica como una configuracion 2x3. De modo similar, un dominio de union que comprende dos dedos (con un ligador canonico entre ellos), un ligador largo y dos dedos adicionales (unidos por un ligador canonico) se indica como una configuracion 2x2. Una protema que comprende tres unidades de dos dedos (en que cada uno de dos dedos se unen mediante un ligador canonico), y en que cada unidad de dos dedos se une a la unidad de dos dedos adyacentes con un ligador largo, se denomina como una configuracion 3x2.
La presencia de un ligador entre dedos largo o no canonico entre dos dedos de cinc adyacentes en un dominio de union de multiples dedos a menudo permite que los dos dedos se unan a subsitios que no son inmediatamente contiguos en la secuencia blanco. Por consiguiente, puede haber brechas de uno o mas nucleotidos entre los subsitios en un sitio blanco; es decir, un sitio blanco puede contener uno o mas nucleotidos que no se ponen en contacto con un dedo de cinc. Por ejemplo, un dominio de union de dedos de cinc 2x2 puede unirse a dos secuencias de seis nucleotidos separadas por un nucleotido, es decir, se une a un sitio blanco de 13 nucleotidos. Vease tambien Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441 y WO 01/53480.
Como se discutio previamente, un subsitio blanco es una secuencia de tres a cuatro nucleotidos que se une por medio de un dedo de cinc unico. Para determinado fines, una unidad de dos dedos se indica como modulo de union. Un modulo de union se puede obtener, por ejemplo, mediante la seleccion de dos dedos adyacentes en el contexto de una protema de dedos multiples (generalmente tres dedos) que se unen a una secuencia blanco de seis nucleotidos particular. De modo alternativo, los modulos se pueden construir mediante el ensamblaje de los dedos de cinc individuales. Vease tambien WO 98/53057 y WO 01/53480.
En una realizacion, en la presente memoria se describe un dominio de union de dedos de cinc que comprende una secuencia de aminoacidos como se muestra en la Tabla 1. En otra realizacion, la descripcion proporciona un polinucleotido que codifica un dominio de union de dedos de cinc, en el que el dominio de union de dedos de cinc comprende una secuencia de aminoacidos como se muestra en la Tabla 1.
De modo alternativo, el dominio de union al ADN se puede derivar de una nucleasa. Por ejemplo, se conocen las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de asentamiento y meganucleasas tales como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, Pl-Sce, I-ScelV, I-CsmI, I-PanI, 1-SceII, I-PpoI, 1-SceIII, I-Crel, I-TevI, I-TevII y I-TevIII. Vease tambien la Patente U.S. N° 5.420.032; patente U.S. N° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 and the New England Biolabs catalogue. Ademas, la especificidad de union de ADN de las endonucleasas de asentamiento y meganucleasas se pueden manipular geneticamente para unirse a sitios blanco no naturales. Vease, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicacion de patente U.S. N° 20070117128.
Dominios reguladores
Los dominios de union a ADN (por ejemplo, ZFP) descritos en la presente memoria se pueden asociar opcionalmente con dominios reguladores para la modulacion de la expresion genica. La ZFP se puede asociar de forma covalente o no covalente con uno o mas dominios reguladores, alternativamente dos o mas dominios reguladores, con los dos o mas dominios que son dos copias del mismo dominio o dos dominios diferentes. Los dominios reguladores se pueden unir covalentemente a la ZFP, por ejemplo, a traves de un ligador de aminoacidos, como parte de una protema de fusion. Las ZFP tambien se pueden asociar con un dominio regulador a traves de un dominio de dimerizacion no covalente, por ejemplo, un cierre de leucina, un dominio N terminal de protema STAT o una protema de union a FK506 (vease, por ejemplo, O'Shea, Science 254:539 (1991), Barahmand-Pour et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:121-128 (1996); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16:569-592 (1998); Klemm et al., Annu. Rev. Immunol. 16:569-592 (1998); Ho et al., Nature 382:822-826 (1996); y Pomeranz et al., Biochem. 37:965 (1998)). El dominio regulador se puede asociar con la ZFP en cualquier posicion adecuada, que incluye el extremo C o N de la ZFP.
Los dominios reguladores comunes para la adicion a la ZFP incluyen, por ejemplo, dominios efectores de factores de transcripcion (activadores, represores, coactivadores, correpresores), silenciadores, receptores de hormonas nucleares, factores de transcripcion de oncogenes (por ejemplo, miembros de la familia myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos, etc.); enzimas de reparacion del ADN y sus factores y modificadores asociados; enzimas de reordenamiento del ADN y sus factores y modificadores asociados; protemas asociadas a la cromatina y sus modificadores (por ejemplo, quinasas, acetilasas y desacetilasas); y enzimas que modifican el ADN (por
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ejemplo, metiltransferasas, topoisomerasas, helicasas, ligasas, quinasas, fosfatasas, polimerasas, endonucleasas) y sus factores y modificadores asociados.
Los polipeptidos del factor de transcripcion a partir de los cuales se puede obtener un dominio regulador incluyen los que estan involucrados en la transcripcion regulada y basal. Tales polipeptidos incluyen factores de transcripcion, sus dominios efectores, coactivadores, silenciadores, receptores nucleares de hormonas (vease, por ejemplo, Goodrich et al., Cell 84:825-30 (1996) para una revision de protemas y elementos de acido nucleico involucrado en la transcripcion; los factores de transcripcion en general se revisan en Barnes and Adcock, Clin. Exp. Allergy 25 Suppl. 2:46-9 (1995) and Roeder, Methods Enzymol. 273:165-71(1996)). Los factores de transcripcion del receptor de la hormona nuclear se describen, por ejemplo, en Rosen et al., J Med. Chem. 38:4855-74 (1995). La familia de factores de transcripcion C/EBP se revisa en Wedel et al., Immunobiology 193:171-85 (1995). Los coactivadores y correpresores que median la regulacion de la transcripcion por receptores de hormonas nucleares se revisan en, por ejemplo, Meier, Eur. JEndocrinol. 134(2):158-9 (1996); Kaiser et al., Trends Biochem. Sci. 21:342-5 (1996); and Utley et al., Nature 394:498-502 (1998)). Los factores de transcripcion GATA, que estan involucrados en la regulacion de la hematopoyesis, se describen en, por ejemplo, Simon, Nat. Genet. 11:9-11 (1995); Weiss et al., Exp. Hematol. 23:99-107. La protema de union a la caja TATA (TBP) y sus polipeptidos TAP asociados (que incluyen TAF30, TAF55, TAF80, TAF10, TAFI50 y TAF250) se describen en Goodrich and Tjian, Curr. Opin. Cell Biol. 6:403-9 (1994) and Hurley, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:69-75 (1996). La familia STAT de factores de transcripcion se revisa en, por ejemplo, Barahmand-Pour et al., Curr. Top. Microbial Immunol. 211:121-8 (1996). Los factores de transcripcion involucrados en la enfermedad se revisan en Aso et al., J Clin. Invest. 97:1561-9 (1996).
En un aspecto, el dominio de represion de KRAB de la protema KOX-1 humana se usa como un represor transcripcional (Thiesen et al., New Biologist 2:363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:45094513 (1994); Pengue et al., Naccl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:4514-4518 (1994)). En otro aspecto, KAP-1, un correpresor de KrAb se usa con KRAB (Friedman et al., Genes Dev. 10:2067-2078 (1996)). Alternativamente, KAP-1 se puede usar solo con una ZFP. Otros factores de transcripcion y dominios del factor de transcripcion preferidos que actuan como represores transcripcionales incluyen MAD (ver, por ejemplo, Sommer et al., J. Biol. Chem. 273:6632-6642 (1998); Gupta et al., Oncogene 16:1149-1159 (1998); Queva et al., Oncogene 16:967-977 (1998); Larsson et al., Oncogene 15:737-748 (1997); Laherty et al., Cell 89:349-356 (1997); and Cultraro et al, Mol Cell. Biol. 17:2353-2359 (19977)); FKHR (cabeza de tenedor en el gen de rhapdosarcoma; Ginsberg et al., Cancer Res. 15:3542-3546 (1998); Epstein et al, Mol. Cell. Biol. 18:4118-4130 (1998)); EGR-1 (producto genico 1 de respuesta de crecimiento temprano; Yan et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 95:8298-8303 (1998); y Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)); el dominio represor del factor represor ets2 (ERD; Sgouras et al., EMBO J 14:4781-4793 ((19095)); el dominio de interaccion Mad smSIN3 (SID; Ayer et al., Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781 (1996)); y el dominio de represion anfifflico ERF3 (factor de respuesta al etileno 3), EAR (Ohta, M., et al. (2001), Celula de planta 13:1959-1968).
En un aspecto, el dominio de activacion de VP16 HSV se usa como un activador de transcripcion (vease, por ejemplo, Hagmann et al., J. Virol. 71:5952-5962 (1997)). Otros factores de transcripcion preferidos que pueden suministrar dominios de activacion incluyen el dominio de activacion VP64 (Seipel et al., EMBO J. 11:4961-4968 (1996)); receptores de hormonas nucleares (vease, por ejemplo, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373 - 383 (1998)); la subunidad p65 del factor nuclear kappa B ((Bitko and Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) and Doyle and Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997));; EGR-1 (producto de gen de respuesta al crecimiento temprano 1; Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:8298-8303 (1998); and Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)); y la protema reguladora de la via biosintetica de antocianina del mafz, C1 (S.A. Goff, y col., (1991), Genetics and Development 5:298-309).
Las quinasas, fosfatasas y otras protemas que modifican los polipeptidos involucrados en la regulacion de genes tambien son utiles como dominios reguladores para las ZFP. Tales modificadores a menudo estan involucrados en la activacion o desactivacion de la transcripcion mediada, por ejemplo, por hormonas. Las quinasas involucradas en la regulacion transcripcional se revisan en Davis, Mol. Reprod. Dev. 42:459-67 (1995), Jackson et al., Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 28:279-86 (1993), y Boulikas, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5:1-77 (1995), mientras que se revisan las fosfatasas en, por ejemplo, Schonthal and Semin, Cancer Biol. 6:239-48 (1995). Las tirosina quinasas nucleares se describen en Wang, Trends Biochem. Sci. 19:373-6 (1994).
Como se describe, tambien se pueden obtener dominios utiles a partir de los productos genicos de oncogenes (por ejemplo, miembros de la familia myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos) y sus factores y modificadores asociados. Los oncogenes se describen en, por ejemplo, Cooper, Oncogenes, 2nd ed., The Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, Mass., Jones and Bartlett Publishers, 1995. Los factores de transcripcion se revisan en Waslylk et al., Eur. J. Biochem. 211:7-18 (1993) and Crepieux et al., Crit. Rev. Oncog. 5:615-38 (1994). Los oncogenes Myc se revisan en, por ejemplo, Ryan et al., Biochem. J. 314:713-21 (1996). Los factores de transcripcion jun y fos se describen en, por ejemplo, The Fos and Jun Families of Transcription Factors, Angel and Herrlich, eds. (1994). El oncogen max se revisa en Hurlin et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:109-16. La familia del gen myb se revisa en Kanei-Ishii et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:89-98 (1996). La familia mos se revisa en Yew et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3:19-25 (1993).
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Las ZFP pueden incluir dominios reguladores obtenidos de las enzimas de reparacion de ADN y sus factores y modificadores asociados. Los sistemas de reparacion de ADN se revisan en, por ejemplo, Vos, Curr. Opin. Cell Biol. 4:385-95 (1992); Sancar, Ann. Rev. Genet. 29:69-105 (1995); Lehmann, Genet. Eng. 17:1-19 (1995); and Wood, Ann. Rev. Biochem. 65:135-67 (1996). Los sistemas de reordenamiento de ADN y sus factores y modificadores asociados tambien se pueden usar como dominios reguladores (vease, por ejemplo, Gangloff et al., Experientia 50:261-9 (1994); Sadowski, FASEB J. 7:760-7 (1993)).
De forma similar, los dominios reguladores se pueden derivar de enzimas que modifican el ADN (por ejemplo, ADN metiltransferasas, topoisomerasas, helicasas, ligasas, quinasas, fosfatasas, polimerasas) y sus factores y modificadores asociados. Las helicasas se revisan en Matson et al., Bioessays, 16:13-22 (1994), y las metiltransferasas se describen en Cheng, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:4-10 (1995). Las protemas asociadas a cromatina y sus modificadores (por ejemplo, quinasas, acetilasas y desacetilasas), tales como histona desacetilasa (Wolffe, Science 272:371-2 (1996)) tambien son utiles como dominios para la adicion a la ZFP de eleccion. En un aspecto preferido, el dominio regulador es una ADN metil transferasa que actua como un represor transcripcional (vease, por ejemplo, Van den Wyngaert et al., FEBS Lett. 426:283-289 (1998); Flynn et al., J. Mol. Biol. 279:101-116 (1998); Okano et al., Nucleic Acids Res. 26:2536-2540 (1998); y Zardo and Caiafa, J. Biol. Chem. 273:16517-16520 (1998)). En otra realizacion preferida, las endonucleasas tales como Fok1 se usan como represores transcripcionales, que actuan a traves de la escision genica (vease, por ejemplo, WO95/09233 y PCT/US94/01201).
Los factores que controlan la estructura, el movimiento y la localizacion de la cromatina y el ADN y sus factores y modificadores asociados; los factores derivados de microbios (por ejemplo, procariotas, eucariotas y virus) y los factores que los asocian con o modifican tambien se pueden usar para obtener protemas quimericas. En un aspecto, las recombinasas e integrasas se usan como dominios reguladores. En un aspecto, la histona acetiltransferasa se usa como un activador transcripcional (vease, por ejemplo, Jin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18:4377-4384 (1998); Wolffe, Science 272:371-372 (1996); Taunton et al., Science 272:408-411 (1996); y Hassig et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:3519-3524 (1998)). En otro aspecto, se usa la histona desacetilasa como un represor transcripcional (vease, por ejemplo, Jin and Scotto, Mol. Cell. Biol. 18:4377-4384 (1998); Syntichaki and Thireos, J. Biol. Chem. 273:24414-24419 (1998); Sakaguchi et al., Genes Dev. 12:2831-2841 (1998); y Martinez et al, J. Biol. Chem. 273:23781-23785 (1998)).
Se pueden incluir dominios ligadores entre dominios polipeptfdicos, por ejemplo, entre dos ZFP o entre una ZFP y un dominio regulador. Tales ligadores son tfpicamente secuencias polipeptfdicas, tales como secuencias de poli-gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoacidos. Los ligadores pueden ser subsecuencias de aminoacidos flexibles o ngidas que se sintetizan como parte de una protema de fusion recombinante. Vease, por ejemplo, la Patente U.S. N° 6.534.261; Liu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:5525-5530 (1997); Pomerantz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:9752-9756 (1995); Kim et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 93:1156-1160 (1996).
Alternativamente, los ligadores flexibles se pueden disenar racionalmente usando un programa de computadora capaz de modelar tanto los sitios de union al ADN como los peptidos mismos (Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:2256-2260 (1993), Desjarlais and Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11099-11103 (1994) o mediante procedimientos de despliegue en fagos.
Un ligador qrnmico se usa para conectar secuencias de dominio producidas de manera sintetica o recombinante. Tales ligadores flexibles son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los ligadores de poli(etilenglicol) estan disponibles en Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos ligadores tienen opcionalmente uniones amida, uniones sulfhidrilo o uniones heterofuncionales. Ademas de la union covalente de las ZFP con los dominios reguladores, se pueden usar procedimientos no covalentes para producir moleculas con ZFP asociadas con dominios reguladores.
Dominios de escision
Como se indico anteriormente, el dominio de union al ADN tambien se puede asociar con un dominio de escision para formar una nucleasa de dedos de cinc (ZFN). La porcion del dominio de escision de las protemas de fusion descritas en la presente se puede obtener de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Los ejemplos de endonucleasas de las cuales se puede derivar un dominio de escision incluyen, pero sin limitacion, endonucleasas de restriccion y endonucleasas de asentamiento. Vease, por ejemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3379-3388. Se conocen otras enzimas adicionales que escinden ADN (por ejemplo, S1 Nucleasa; nucleasa de porotos mung; ADNasa pancreatica I; nucleasa de micrococos; endonucleasa HO de levaduras; vease tambien Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o mas de estas enzimas (o fragmentos funcionales de estos) se pueden usar como una fuente de los dominios de escision y semidominios de escision.
De forma similar, un semidominio de escision se puede derivarse de cualquier nucleasa o porcion de esta, como se expone anteriormente, que requiere dimerizacion para la actividad de escision. En general, se requieren dos protemas de fusion para la escision si las protemas de fusion comprenden semidominios de escision. Alternativamente, se puede usar una protema unica que comprende dos semidominios de escision. Los dos semidominios de escision se pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o
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cada semidominio de escision se puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Ademas, los sitios blanco para las dos protemas de fusion estan dispuestos preferentemente uno con respecto al otro, de modo que la union de las dos protemas de fusion a sus respectivos sitios blanco situa a los semidominios de escision en una orientacion espacial entre sf que permite a los semidominios de escision para formar un dominio de escision funcional, por ejemplo, por dimerizacion. Por lo tanto, en ciertos aspectos, los bordes cercanos de los sitios blanco estan separados por 5-8 nucleotidos o por 15-18 nucleotidos. Sin embargo, cualquier numero entero de nucleotidos o pares de nucleotidos puede intervenir entre dos sitios blanco (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleotidos o mas). En general, el sitio de escision se encuentra entre los sitios blanco.
Las endonucleasas de restriccion (enzimas de restriccion) estan presentes en muchas especies y tienen capacidad para unirse al ADN en forma espedfica de secuencia (en un sitio de reconocimiento), y escindir ADN en o cerca del sitio de union. Ciertas enzimas de restriccion (por ejemplo, tipo IIS) escinden el ADN en sitios retirados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de union y escision separables. Por ejemplo, la enzima de tipo Type IIS Fok I cataliza la escision de ADN de cadena doble, a 9 nucleotidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y 13 nucleotidos de su sitio se reconocimiento en la otra. Vease, por ejemplo, patentes US 5.356.802; 5,436,150 y 5,487,994; asf como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. En consecuencia, en un aspecto, las protemas de fusion comprenden el dominio de escision (o semidominio de escision) de al menos una enzima de restriccion Tipo IIS y uno o mas dominios de union de dedos de cinc, que pueden estar o no manipulados geneticamente.
Un ejemplo de enzima de restriccion de tipo IIS, cuyo dominio de escision es separable del dominio de union, es Fok I. Esta enzima particular es activa como dfmero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acas Sci. USA 95:10,57010,575. En consecuencia, a los fines de la presente descripcion, la porcion de la enzima Fok I usada en las protemas de fusion descritas se considera un semidominio de escision. En consecuencia, para la escision de cadena doble dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de dedos de cinc-Fok I, se pueden usar dos protemas de fusion, cada una que comprende un semidominio de escision de FokI, para reconstituir un dominio de escision catalfticamente activo. Alternativamente, tambien se puede usar una molecula de polipeptido unica que contiene un dominio de union de dedos de cinc y dos semidominios de escision Fok I. Los parametros para la escision dirigida y la alteracion de secuencia dirigida mediante las fusiones dedo de cinc-Fok I se proveen en otra parte de esta descripcion.
Un dominio de escision o semidominio de escision puede ser cualquier porcion de una protema que retiene la actividad de escision, o que retiene la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizar) para formar un dominio de escision funcional.
Los ejemplos de sistemas de restriccion tipo III se describen en la publicacion Internacional WO 07/014275. Las enzimas de restriccion adicionales tambien contienen dominios de union y escision separables, y estas se contemplan en la presente descripcion. Vease, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
En ciertos aspectos, el dominio de escision comprende uno o mas semidominios manipulados geneticamente (tambien denominados como mutantes del dominio de dimerizacion) que minimizan o evitan la homodimerizacion, como se describe en la Publicacion de patente U.S. Nros 20050064474; 20060188987; 20080131962. Los residuos de aminoacidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, y 538 de FokI son todos blancos para influir sobre la dimerizacion de los semidominios de escision de FokI.
Los ejemplos de semidominios de escision manipulados geneticamente de Fok I que forman los heterodfmeros obligados incluyen un par en que un primer semidominio de escision incluye las mutaciones en los residuos de aminoacidos en las posiciones 490 y 538 del Fok I y un segundo semidominio de escision incluye las mutaciones en los residuos de aminoacidos 486 y 499.
En consecuencia, en ciertos aspectos, la mutacion en 490 reemplaza Glu (E) con Lys (K); la mutacion en 538 reemplaza Iso (I) con Lys (K); la mutacion en 486 reemplaza Gln (Q) con Glu (E); y la mutacion en la posicion 499 reemplaza Iso (I) con Lys (K). En forma espedfica, los semidominios de escision manipulados geneticamente descritos en la presente memoria se prepararon mediante la mutacion de las posiciones 490 (E^K) y 538 (I^K) en un semidominio de escision para producir un semidominio de escision manipulado geneticamente denominado “E490K:I538K” y mediante la mutacion de posiciones 486 (Q^E) y 499 (I^L) en otro semidominio de escision para producir un semidominio de escision manipulado geneticamente denominado “Q486E:I499L”. Los semidominios de escision manipulados geneticamente descritos en la presente son mutantes del heterodfmero obligados en que se minimiza o anula la escision aberrante. Vease, por ejemplo, Ejemplo 1 de la Publicacion de patente U.S. N° 2008/0131962. Vease, tambien Szczepek et al. (2007) Nat Biotechnol 25:786-793. En ciertas realizaciones, el semidominio de escision manipulado geneticamente comprende mutaciones en las posiciones 486, 499 y 496 (numerados con respecto a FoKI tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el residuo de Gln (Q) tipo salvaje en la posicion 486 con un residuo de Glu (E), el residuo Iso (I) tipo salvaje en la posicion 499 con un residuo Leu (L) y el residuo de Asn (N) tipo salvaje en la posicion 496 con un residuo de Asp (D) o Glu (E) (tambien denominado como dominios “ELD” y “ELE”, respectivamente). En otros aspectos, el semidominio de escision manipulado geneticamente comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numerados en relacion con
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FokI tipo salvaje), por ejemplo, mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) tipo salvaje en la posicion 490 con un residuo de Lys (K), el residuo de Iso (I) tipo salvaje en la posicion 538 con un residuo de Lys (K), y el residuo de His (H) tipo salvaje en la posicion 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (tambien denominado como dominios “KKK” y “KKR”, respectivamente). En otros aspectos, el semidominio de escision manipulado geneticamente comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numerado en relacion con FokI tipo salvaje), por ejemplo, las mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) tipo salvaje en la posicion 490 con un residuo de Lys (K) y el residuo de His (H) tipo salvaje en la posicion 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (tambien denominado como dominios “KIK” y “KIR”, respectivamente). (Vease solicitud provisional internacional 61/337.769 presentada el 8 de febrero de 2010). En otros aspectos, el semidominio de escision manipulado geneticamente comprende las mutaciones “Sharkey” y/o “Sharkey'” (vease Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060).
Los semidominios de escision manipulados geneticamente descritos en la presente memoria se pueden preparar usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por mutagenesis dirigida al sitio de semidominios de escision tipo salvaje (Fok I) como se describe en las publicaciones de patente U.S. Nros. 20050064474 y 20080131962.
Otra enzima de restriccion tipo IIS preferida es BfiI (vease Zaremba et al, (2004) J. Mol Biol. 336 (1):81-92). El dominio de escision de esta enzima se puede separar de su dominio de union al ADN y unirse operativamente a un dominio de union al ADN de dedos de cinc para crear una ZFN.
Protemas de fusion
Los procedimientos para el diseno y la construccion de las protemas de fusion (y polinucleotidos que codifican las mismas) son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los procedimientos para el diseno y la construccion de las protemas de fusion que comprenden los dominios de union al ADN (por ejemplo, dominios del dedo de cinc) y dominios reguladores o de escision (o semidominios de escision), y polinucleotidos que codifican tales protemas de fusion, se describe en las patentes U.S. en copropiedad 6.453.242 y 6.534.261 y publicaciones de la solicitud de patente U.S. 2007/0134796 y 2005/0064474.
En ciertas realizaciones, se construyen polinucleotidos que codifican las protemas de fusion. Estos polinucleotidos se pueden insertar en un vector y el vector se puede introducir en una celula (ver mas adelante para la descripcion adicional con respecto a vectores y procedimientos para introducir los polinucleotidos en las celulas).
Como se indico anteriormente, en ciertas realizaciones, la protema de fusion comprende una protema de dedos de cinc que se une a un sitio blanco en un gen involucrado en biosmtesis de acidos grasos y al menos un dominio regulador transcripcional, por ejemplo un dominio de activacion o represion.
En otros aspectos de los procedimientos descritos en la presente memoria, una nucleasa de dedos de cinc comprende una protema de fusion que comprende un dominio de union de dedos de cinc o un semidominio de escision de la enzima de restriccion FokI, y dos de estas protemas de fusion se expresan en una celula. La expresion de dos protemas de fusion en una celula pueden provenir de la administracion de dos protemas a la celula; administracion de una protema y un acido nucleico que codifica una de las protemas a la celula; administracion de dos acidos nucleicos, cada uno que codifica una de la protemas, a la celula; o por la administracion de un acido nucleico unico, que codifica ambas protemas, a la celula. En aspectos adicionales, una protema de fusion comprende una cadena polipeptfdica simple que comprende dos semidominios de escision y un dominio de union a dedos de cinc. En esta caso, una protema de fusion unica se expresa en la celula y, sin desear estar ligado por teona alguna, se considera que escinde el ADN como resultado de la formacion de un dfmero intramolecular de los semidominios de escision.
En ciertos aspectos, los componentes de las nucleasas de dedos de zinc (por ejemplo, fusiones ZFP-Fok I) se disponen de manera tal que el dominio de dedos de cinc esta mas cerca del amino terminal de la protema de fusion, y el semidominio de escision esta mas cerca del carboxilo terminal. Esto refleja la orientacion relativa del dominio de escision en dominios de escision dimerizante naturales tales como los derivados de la enzima Fok I, en los que el dominio de union de ADN esta mas cerca del estos aspectos, la dimerizacion de los semidominios de escision para formar una nucleasa funcional se realiza mediante la union de las protemas de fusion a los sitios en cadenas de ADN opuestas, con los extremos 5' de los sitios de union proximales entre sf.
En aspectos adicionales, los componentes de las protemas de fusion (por ejemplo, las fusiones ZFP-Fok I) se disponen de manera tal que el semidominio de escision esta mas cerca del amino terminal de la protema de fusion, y el dominio de dedos de cinc esta mas cerca de carboxilo terminal. En estos aspectos, la dimerizacion de los semidominios de escision para formar una nucleasa funcional se realiza por la union de las protemas de fusion a sitios en cadenas de ADN opuestas, con los extremos 3' de los sitios de union proximales entre sf.
En otros aspectos adicionales, una primera protema de fusion contiene el semidominio de escision mas cerca del amino terminal de la protema de fusion, y el dominio de dedo de cinc mas cerca del carboxilo terminal, y una segunda protema de fusion se disponen de manera tal que el dominio de dedos de cinc esta mas cerca del amino terminal de la protema de fusion, y el semidominio de escision esta mas cerca del carboxilo terminal. En estos
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aspectos, ambas protemas de fusion se unen a la misma cadena de ADN, con el sitio de union de la primera protema de fusion que contiene el dominio de dedo de cinc mas cercano del carboxilo terminal ubicado en el lado 5' del sitio de union de la segunda protema de fusion que contiene el dominio de dedo de cinc mas cerca del amino terminal.
En ciertos aspectos, protemas de fusion descritas, la secuencia de aminoacidos entre el dominio de dedos de cinc y el dominio de escision (o semidominio de escision) se indica como “ligador ZC”. El ligador ZC se debe distinguir de los ligadores entre dedos descritos anteriormente. Vease, por ejemplo, publicaciones de patente U.S. 20050064474A1 y 20030232410, y Publicacion de patente internacional WO05/084190 para detalles sobre la obtencion de ligadores ZC que optimizan la escision.
En una realizacion, la descripcion proporciona una ZFN que comprende una protema de dedos de cinc que tiene una o mas de secuencias de aminoacidos de la helice de reconocimiento que se muestran en una fila unica de la Tabla 1. En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un vector de expresion ZFP que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una ZFP que tiene las helices de reconocimiento mostradas en la Tabla 1 o Tabla 10.
Regulacion de la expresion genica
Una variedad de ensayos se puede utilizar para determinar si una ZFP modula la expresion genica. La actividad de una ZFP particular se puede evaluar utilizando una variedad de ensayos in vitro e vivo, mediante la medicion, por ejemplo, de los niveles de protema o ARNm, niveles de producto, actividad enzimatica, activacion o represion transcripcional de un gen indicador, usando, por ejemplo, inmunoensayos (por ejemplo, ELISA y ensayos inmunohistoqmmicos con anticuerpos), ensayos de hibridacion (por ejemplo, proteccion de ARNasa, Northern, hibridacion in situ, estudios de matriz de oligonucleotidos), ensayos colorimetricos, ensayos de amplificacion, ensayos de actividad enzimatica, ensayos fenotipicos, y similares.
Las ZFP se analizan tfpicamente primero para determinar la actividad in vitro utilizando ensayos ELISA y a continuacion, usando celulas renales. La zFp a menudo se analiza primero utilizando un sistema de expresion transitorio con un gen indicador y luego se analiza la regulacion del gen endogeno blanco en las celulas y en plantas enteras, tanto in vivo como ex vivo. La ZFP se puede expresar de modo recombinante en una celula, expresar de forma recombinante en las celulas trasplantadas en una planta, expresar de forma recombinante en una planta transgenica, asf como administrarse como una protema a la planta o celula utilizando vehmulos de administracion como se describe a continuacion. Las celulas pueden estar inmovilizadas, estar en solucion, inyectarse en una planta, o ser de origen natural en una planta transgenica o no transgenica.
La modulacion de la expresion genica se analiza usando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente memoria. Las muestras o ensayos se tratan con una ZFP y se comparan con muestras de control sin el compuesto de prueba, para examinar el grado de modulacion. Para la regulacion de la expresion genica endogena, la ZFP tfpicamente tiene una Kd de 200 nM o menos, mas preferentemente 100 nM o menos, mas preferentemente 50 nM, con maxima preferencia 25 nM o menos.
Los efectos de las ZFP se pueden medir mediante el examen de cualquiera de los parametros descritos anteriormente. Cualquier expresion genica, fenotfpica o cambio fisiologico adecuado se puede usar para evaluar la influencia de una zFp. Cuando las consecuencias funcionales se determinan usando celulas o plantas intactas, tambien se puede medir una variedad de efectos tales como crecimiento de plantas, cambios transcripcionales en marcadores geneticos conocidos y no caracterizados (por ejemplo, transferencias Northern o estudios de matrices de oligonucleotidos), cambios en el metabolismo celular tales como crecimiento celular o cambios de pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares, como cGMP.
Los ensayos preferidos para la regulacion de ZFP de la expresion genica endogena se pueden realizar in vitro. En un formato de ensayo in vitro preferido, la regulacion de ZFP de la expresion genica endogena en celulas cultivadas se mide mediante el examen de la produccion de protema usando un ensayo ELISA. La muestra de prueba se compara con celulas de control tratadas con un vector vacm o una ZFP no relacionada que esta dirigida a otro gen.
En otro aspecto, la regulacion de ZFP de la expresion genica endogena se determina in vitro mediante la medicion del nivel de expresion del ARNm del gen blanco. El nivel de expresion genica se mide usando amplificacion, por ejemplo, usando PCR, LCR o ensayos de hibridacion, por ejemplo, hibridacion Northern, proteccion con RNasa, transferencia de puntos. El nivel de protema o ARNm se detecta usando agentes de deteccion marcados directa o indirectamente, por ejemplo, acidos nucleicos marcados fluorescentemente o radiactivamente, anticuerpos marcados radiactivamente o enzimaticamente y similares, como se describe en la presente memoria.
Alternativamente, se puede idear un sistema de gen indicador usando el promotor del gen blanco unido operativamente a un gen indicador tal como luciferasa, protema fluorescente verde, CAT o (3-gal. El constructo indicador tfpicamente se cotransfecta en una celula cultivada. Despues del tratamiento con la ZFP de eleccion, la cantidad de transcripcion, traduccion o actividad del gen indicador se mide de acuerdo con tecnicas estandar conocidas por los expertos en la materia.
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Las plantas transgenicas y no transgenicas tambien se utilizan para examinar la regulacion de la expresion de genes endogenos in vivo. Las plantas transgenicas pueden expresar de forma estable la ZFP de eleccion. Alternativamente, se pueden utilizar plantas que expresan transitoriamente la ZFP de eleccion, o a la que se ha administrado la ZFP en un vehmulo de administracion. La regulacion de la expresion de genes endogenos se analiza usando uno de los ensayos descritos en la presente memoria.
Procedimientos para la escision dirigida
Los procedimientos y las composiciones descritas se pueden usar para escindir ADN en una region de interes en la cromatina celular (por ejemplo, en un sitio deseado o predeterminado en un genoma, por ejemplo, dentro de o adyacente a un gen involucrado en biosmtesis de acidos grasos). Para tal escision de ADN dirigida, un dominio de union de dedos de cinc se manipula geneticamente para unirse a un sitio blanco en o cerca del sitio de escision predeterminado, y una protema de fusion que comprende el dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente y un dominio de escision se expresa en una celula. Despues de la union de la porcion de de dedos de cinc de la protema de fusion al sitio blanco, el ADN se escinde cerca del sitio blanco en el dominio de escision. El sitio exacto de escision puede depender de la longitud del ligador de ZC.
De forma alternativa, dos protemas de fusion, cada una que comprende un dominio de union de dedos de cinc y un semidominio de escision, se expresan en una celula y se unen a los sitios blanco que se yuxtaponen de manera tal que se reconstituye un dominio de escision funcional y se escinde el ADN en la proximidad de los sitios blanco. En un aspecto, la escision se produce entre los sitios blanco de los dos dominios de union de dedos de cinc. Uno o ambos dominios de union de dedos de cinc se pueden manipular geneticamente.
Para la escision dirigida usando un polipeptido de fusion del dominio de union de dedos de cinc-dominio de escision, el sitio de union puede abarcar el sitio de escision, o el borde cercano del sitio de union puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 o mas nucleotidos (o cualquier valor entero entre 1 y 50 nucleotidos) del sitio de escision. La ubicacion exacta del sitio de union, con respecto al sitio de escision, dependera del dominio de escision particular, y la longitud del ligador de ZC. Para los procedimientos en que se usan dos polipeptidos de fusion, cada uno que comprende un dominio de union de dedos de cinc y un semidominio de escision, los sitios de union generalmente abarcan el sitio de escision. El consecuencia el borde cercano del primer sitio de union puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 o mas nucleotidos (o cualquier valor entero entre 1 y 50 nucleotidos) en un lado del sitio de escision, y el borde cercano del segundo sitio de union puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 o mas nucleotidos (o cualquier valor entero entre 1 y 50 nucleotidos) en el otro lado del sitio de escision. Los procedimientos para mapear los sitios de escision in vitro e in vivo son conocidos por los expertos en la tecnica.
En consecuencia, los procedimientos descritos en la presente memoria pueden emplear un dominio de union de dedos de cinc manipulado geneticamente fusionado a un dominio de escision. En estos casos, el dominio de union se manipula geneticamente para unirse a una secuencia blanco, en o cerca de donde se desea la escision. La protema de fusion, o un polinucleotido que codifica la misma, se introduce en una celula de planta. Una vez que se introduce en, o expresa en la celula, la protema de fusion se une a la secuencia blanco y escinde en o cerca de la secuencia blanco. El sitio exacto de la escision depende de la naturaleza del dominio de escision y/o la presencia y/o naturaleza de las secuencias ligadoras entre los dominios de union y escision. En los casos en que se usan dos protemas de fusion, cada una que comprende un semidominio de escision, la distancia entre los bordes cercanos de los sitios de union puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 o mas nucleotidos (o cualquier valor entero entre 1 y 50 nucleotidos). Los niveles optimos de escision tambien pueden depender de la distancia entre los sitios de union de las dos protemas de fusion (ver, por ejemplo Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res.28:3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol.21:289-297) y la longitud del ligador ZC en cada protema de fusion. (Vease, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297) y al longitud del ligador ZC en cada protema de fusion. Vease, tambien, la Publicacion de patente U.S. 20050064474A1 y las Publicaciones de patente internacional W005/084190W005/014791 y WO03/080809.
En ciertos aspectos, el dominio de escision comprende dos semidominios de escision, lo que son parte de un polipeptido unico que comprende un dominio de union, un primer semidominio de escision y un segundo semidominio de escision. Los semidominios de escision pueden tener la misma secuencia de aminoacidos o diferentes secuencias de aminoacidos, siempre que actuen para escindir el ADN.
Los semidominios de escision tambien se pueden proporcionar en moleculas separadas. Por ejemplo, dos polipeptidos de fusion se pueden introducir en una celula, en que cada polipeptido comprende un dominio de union y un semidominio de escision. Los semidominios de escision pueden tener la misma secuencia de aminoacidos o diferentes secuencias de aminoacidos, siempre que actuen para escindir el ADN. Ademas, los dominios de union se unen a las secuencias blanco que estan normalmente dispuestas de manera tal, que despues de la union de los polipeptidos de fusion, los dos semidominios de escision se presentan en una orientacion espacial entre sf que permite la reconstitucion de un dominio de escision (porejemplo, por la dimerizacion de los semidominios), de este modo se ubican los semidominios entre sf formar un dominio de escision funcional, lo que produce la escision de la cromatina celular en una region de interes. En general, la escision mediante los dominios de escision reconstituidos se produce en un sitio ubicado entre las dos secuencias blanco. Una o ambas protemas se pueden manipular geneticamente para unirse a su sitio blanco.
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Las dos protemas de fusion se pueden unir en la region de interes en la misma u opuesta polaridad, y sus sitios de union (es dear, sitios blanco) se puede separar por cualquier numero de nucleotidos, por ejemplo, de 0 a 200 nucleotidos o cualquier valor entero entre ellos. En ciertos aspectos, los sitios de union para dos protemas de fusion, cada uno que comprende un dominio de union de dedos de cinc y un semidominio de escision, se pueden ubicar separados entre 5 y 18 nucleotidos, por ejemplo, separados por 5-8 nucleotidos, o separados por 15-18 nucleotidos, o separados por 6 nucleotidos, o separados por 16 nucleotidos, medidos desde el borde de cada sitio de union mas cercano al otro sitio de union, y la escision se produce entre los sitios de union.
El sitio en el cual se escinde el ADN generalmente se encuentra entre los sitios de union de las dos protemas de fusion. La ruptura de la doble cadena de ADN a menudo es el resultado de dos rupturas de cadenas simples, o “mellas” compensadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas nucleotidos, (por ejemplo, la escision de ADN de cadena doble por Fok I nativa es el resultado de rupturas de cadenas simples separadas por 4 nucleotidos). En consecuencia, la escision no necesariamente ocurre en sitios exactamente opuestos de cada cadena de ADN. Ademas, la estructura de las protemas de fusion y la distancia entre los sitios blanco puede influir sobre si la escision se produce junto a un par de nucleotidos unico, o si la escision se produce en varios sitios. Sin embargo, para muchas aplicaciones, que incluyen la recombinacion dirigida y la mutagenesis dirigida, (vease infra) la escision dentro de un rango de nucleotidos generalmente es suficiente, y no se requiere la escision entre pares de bases particulares.
Como se indico con anterioridad, la protema de fusion se puede introducir como polipeptidos y/o polinucleotidos. Por ejemplo, dos polinucleotidos, cada uno que comprende secuencias que codifican uno de los polipeptidos mencionados anteriormente, se pueden introducir en la celula, y cuando los polipeptidos se expresan y cada uno se une a su secuencia blanco, se produce la escision en la secuencia blanco o cerca de ella. Alternativamente, se introduce un polinucleotido unico que comprende secuencias que codifican ambos polipeptidos de fusion en una celula. Los polinucleotidos pueden ser ADN, ARN o cualquier forma modificada o analogos o ADN y/o ARN.
Para mejorar la especificidad de escision, las composiciones adicionales tambien se pueden emplear en los procedimientos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los semidominios de escision unicos pueden exhibir actividad de escision de cadena doble limitada. En procedimientos en los que dos protemas de fusion, cada una que contiene un dominio de dedos de cinc de tres dedos y un semidominio de escision, se introducen en la celula, cada protema especifica un sitio blanco de aproximadamente 9 nucleotidos. Aunque la secuencia blanco agregada de 18 nucleotidos es probable que sea unica en un genoma de mairnfero y plantas, cualquier sitio blanco de 9 nucleotidos dado aparece, en promedio, aproximadamente 23.000 veces en el genoma humano. Por lo tanto, se puede producir la escision no espedfica, debido a la union espedfica de sitio de un semidominio unico. En consecuencia, los procedimientos descritos en la presente memoria contemplan el uso de una mutante dominante negativa de un semidominio tal como Fok I (o un acido nucleico que codifica el mismo) que se expresa en una celula junto con las dos protemas de fusion. La mutante dominante negativa es capaz de dimerizarse pero es incapaz de escindir, y tambien bloquea la actividad de escision de un semidominio al cual se dimeriza. Al proporcionar la mutante dominante-negativa en exceso molar para las protemas de fusion, solo las regiones en las que se unen ambas protemas de fusion tendran una concentracion local suficientemente alta de semidominios de escision funcionales para que se produzca la dimerizacion. En sitios en los que solo se une una de las dos protemas de fusion, su semidominio de escision forma un dfmero con el semidominio mutante negativo dominante, y no se produce escision indeseable ni espedfica.
Vector de expresion
Un acido nucleico que codifica una o mas protemas de fusion (por ejemplo, ZFP) como se describe en la presente memoria se puede clonar en un vector para la transformacion en celulas procariotas o eucariotas para la replicacion y/o expresion. Los vectores pueden ser vectores procarioticos (por ejemplo, plasmidos, o vectores de lanzadera, vectores de insectos o vectores eucarioticos. Tambien se puede clonar un acido nucleico que codifica una protema de fusion en un vector de expresion para la administracion a una celula de planta.
A fin de expresar las protemas de fusion, las secuencias que codifican las protemas de fusion generalmente se subclonan en un vector de expresion que contiene un promotor para dirigir la transcripcion. Los promotores bacterianos o eucarioticos adecuados son bien conocidos en la tecnica y han sido descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual Patronton Press, New York (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra). Los sistemas de expresion bacteriana para expresar ZFP estan disponibles, por ejemplo, en E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Los kits para dichos sistemas de expresion estan disponibles en el comercio. Los sistemas de expresion eucarioticos para celulas de marnfferos, levaduras e insectos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y tambien estan disponibles en el comercio.
El promotor usado para dirigir la expresion de un acido nucleico que codifica la protema de fusion depende de la aplicacion particular. Por ejemplo, generalmente se usa un promotor constitutivo fuerte adecuado para la celula huesped para la expresion y purificacion de las ZFPs.
En contraste, cuando se administra una ZFP in vivo para la regulacion de un gen de planta (ver, la seccion siguiente de “Administracion de acidos nucleicos a las celulas de planta”), se usa un promotor constitutivo o inducible, segun
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el uso particular de la ZFP. Los ejemplos no limitantes de promotores vegetales incluyen secuencias promotoras derivadas de ubiquitina-3 de A. thaliana (ubi-3) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); manopinasintetasa de A. tumifaciens (Amas) (Petolino et al., patente U.S. N° 6.730.824); y/o virus del mosaico de las nervaduras de yuca (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139). Vease, tambien, Ejemplos.
Ademas del promotor, el vector de expresion generalmente contiene una unidad de transcripcion o casete de expresion que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresion del acido nucleico en las celulas huesped, sean eucarioticas o procarioticas. Un tfpico casete de expresion en consecuencia contiene un promotor unido operativamente, por ejemplo, a una secuencia de acido nucleico que codifica la ZFP y las senales requeridas, por ejemplo, para la eficiente poliadenilacion del transcripto, terminacion de la transcripcion, sitios de union del ribosoma o terminacion de la traduccion. Los elementos adicionales del casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores, senales de empalme heterologas, y/o senal de localizacion nuclear (NLS).
El vector de expresion particular usado para transportar la informacion genetica en una celula se selecciona con respecto al uso pretendido de las ZFP por ejemplo, la expresion en plantas, animales, bacterias, hongos, protozoos, etc. (vease vectores de expresion descritos mas adelante). Los vectores de expresion bacterianos y animales estandares son conocidos en la tecnica y se describen en detalle, por ejemplo, en la Publicacion de la patente U.S. 20050064474A1 y las publicaciones de patente internacionales WO05/084190WO05/014791 y WO03/080809.
Los procedimientos de transfeccion estandares se pueden usar para producir lmeas celulares bacterianas, de mairnferos, levaduras o insectos que expresan grandes cantidades de protema, que luego se pueden purificar mediante tecnicas estandares (vease, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, inMethods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformacion de celulas eucarioticas y procarioticas se realiza de acuerdo con tecnicas estandares (vease, por ejemplo,Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss and Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983).
Se puede usar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleotidos extranas en dichas celulas huesped. Estos incluyen el uso de transfeccion de fosfato de calcio, polibreno, fusion de protoplastos, electroporacion, procedimientos ultrasonicos (por ejemplo, sonoporacion), liposomas, microinyeccion, ADN desnudo, vectores plasmfdicos, vectores virales, tanto episodicos como integradores y cualquier otro procedimiento bien conocido para introducir ADN genomico clonado, ADNc, ADN sintetico u otro material genetico extrano en una celula huesped (vease, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Solo es necesario que el procedimiento de ingeniena genetica particular usado sea capaz de introducir con exito al menos un gen en la celula huesped capaz de expresar la protema elegida.
Administracion de acido nucleico a las celulas de plantas
Como se indico anteriormente, se pueden introducir constructos de ADN en (por ejemplo, en el genoma de) una planta huesped deseada mediante una variedad de tecnicas convencionales. Para las revisiones de dichas tecnicas vease, por ejemplo, Weissbach and Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; and Grierson and Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9.
Por ejemplo, el constructo de ADN genomico se puede introducir directamente en el ADN genomico de la celula de planta mediante tecnicas tales como electroporacion y microinyeccion de protoplastos de celulas de planta, o los constructos de ADN se pueden introducir directamente al tejido vegetal mediante procedimientos biolfsticos, tales como bombardeo de partmulas de ADN (vease, por ejemplo, Klein et al (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, los constructos de aDn se pueden combinar con adecuadas regiones flanqueantes de T-ADN e introducir en un vector huesped de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las tecnicas de transformacion mediadas por Agrobacterium tumefaciens, que incluye el desarmado y uso de vectores binarios, estan bien descritas en la bibliograffa cientffica. Vease, por ejemplo Horsch et al., (1984) Science 233:496-498, and Fraley et al., (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803.
Ademas, se puede lograr la transferencia genica mediante el uso de bacterias distintas de Agrobacterium o virus tales como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, virus de papa X, virus mosaico de coliflor y virus mosaico de nervaduras de yuca y/o virus de mosaico de tabaco, Vease, por ejemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4.
Las funciones de virulencia del huesped Agrobacterium tumefaciens dirigiran la insercion del constructo y el marcador adyacente hacia el interior del ADN de la celula de planta cuando la celula es infectada por la bacteria mediante un vector de ADN-T binario (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) o el procedimiento de cocultivo (Horsch et al (1985) Science 227:1229-1231). Generalmente, el sistema de transformacion de Agrobacterium se usa para manipular geneticamente plantas dicotiledoneas (Bevan et al (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). El sistema de transformacion de Agrobacterium tambien se puede usar para transformar, asf como transferir, ADN a plantas monocotiledoneas y celulas de plantas. Vease, Patente U.S. N° 5.591.616; Hernalsteen et al., (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al., (1984) Nature 311:763-
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764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40.; and Gould et al., (1991) Plant Physiol. 95:426-434.
Los procedimientos alternativos de transferencia genica y transformacion incluyen, pero sin limitacion, transformacion de protoplastos por captacion de ADN desnudo mediada por calcio, polietilenglicol (PEG) o electroporacion (vease Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; y Shimamoto (1989) Nature 338:274276) y electroporacion de tejidos vegetales (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505). Otros procedimientos para la transformacion de celulas de planta incluyen microinyeccion, captacion de ADN mediada por carburo de silicio (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), y bombardeo de micorpartfculas (vease Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; and Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618) o nanopartfculas.
Los procedimientos y composiciones descritos se pueden usar para insertar secuencias exogenas en una ubicacion predeterminada en un genoma de celula de planta. Esto es util en la medida en que la expresion de un transgen introducido en un genoma de planta depende esencialmente de su sitio de integracion. En consecuencia, se pueden insertar genes que codifican, por ejemplo, nutrientes, antibioticos o moleculas terapeuticas, mediante recombinacion dirigida, en regiones de un genoma vegetal favorables para su expresion.
Las celulas de planta transformadas que se producen por cualquiera de las tecnicas de transformacion anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta entera, que posea el genotipo transformado y en consecuencia el fenotipo deseado. Dichas tecnicas de regeneracion dependen de la manipulacion de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento del cultivo tisular, generalmente que dependen de un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleotido deseadas. La regeneracion de la planta a partir de protoplastos cultivados es describe en Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 Tambien se puede lograr la regeneracion a partir de callos vegetales, explantes, organos, polen, embriones o partes de estos. Dichas tecnicas de regeneracion se describen en general en Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
Los acidos nucleicos introducidos en una celula de planta se pueden usar para conferir rasgos deseados en esencialmente cualquier planta. Una amplia variedad de plantas y sistemas de celulas de planta se pueden manipular geneticamente para obtener las caractensticas fisiologicas y agronomicas deseadas descritas en la presente memoria mediante el uso de los constructos de acidos nucleicos de la presente descripcion y los diversos procedimientos de transformacion mencionados anteriormente. Las plantas y celulas de planta blanco para manipulacion genetica incluyen, sin limitaciones, las plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, tales como cultivos que incluyen cultivos de granos (por ejemplo, trigo, mafz, arroz, mijo, cebada), cultivos de frutas (por ejemplo, tomate, manzana, pera, frutilla, naranja), cultivos de forraje (por ejemplo, alfalfa), cultivos de hortalizas de rafz (por ejemplo, zanahoria, patata, remolacha azucarera, batata), cultivos de hortalizas de hoja (por ejemplo, lechuga, espinaca); plantas de flor (por ejemplo, petunia, rosa, crisantemo), comferas y pinos (por ejemplo, pino de mar, abeto); plantas usadas en fitomedicamentos (por ejemplo, plantas que acumulan metales pesados); cultivos oleaginosos (por ejemplo, girasol, semilla de colza, soja) y plantas usadas con fines experimentales (por ejemplo, Arabidopsis). En consecuencia, los procedimientos y las composiciones descritas se utilizan en una amplia variedad de plantas, que incluyen pero sin limitacion, especies de los generos Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna, y Zea.
Un experto en la tecnica reconocera que despues de que el casete de expresion se incorpora de forma estable en plantas transgenicas y se confirma que es operable, se puede introducir en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede usar cualquiera de numerosas tecnicas de cultivo estandar, de acuerdo con la especie para cruzar.
Una celula de planta, callo, tejido o planta transformada se puede identificar y aislar mediante la seleccion o analisis del material de la planta manipulado geneticamente por rasgos codificados por los genes marcadores presentes en ADN de transformacion. Por ejemplo, la seleccion se puede realizar por cultivo del material vegetal manipulado geneticamente en medios que contienen una cantidad inhibidora de antibioticos o herbicidas a los cuales el constructo de gen transformante confiere resistencia. Ademas, las plantas y celulas de plantas transformadas tambien se pueden genes de la p-glucuronidasa), luciferasa o C1), que pueden estar presentes en los constructos de acido nucleico recombinante. Estas metodologfas de seleccion y deteccion son bien conocidas por los expertos en la materia.
Tambien se pueden usar procedimientos ffsicos y bioqmmicos para identificar transformantes de plantas o celulas de planta que contienen constructos genicos insertados. Estos procedimientos incluyen pero sin limitaciones:1) analisis Southern o amplificacion por PCR para detectar y determinar la estructura del inserto de ADN recombinante; 2) transferencia Northern, proteccion de S1 ARNsa, extension de cebador o amplificacion por PCR de transcriptasa inversa para detectar y examinar transcriptos de ARN de los constructos genicos; 3) ensayos enzimaticos para detectar actividad de enzimas o ribozima, cuando dichos productos genicos son codificados por el constructo genico;
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4) electroforesis en gel de protemas, tecnicas de transferencia Western, inmunoprecipitacion, o inmunoensayos ligados a enzima, cuando los productos de la construccion genica son protemas. Otras tecnicas, tales como hibridacion in situ, tincion de enzimas e inmunotincion, tambien se pueden usar para detectar la presencia o expresion del constructo recombinante en organos y tejidos vegetales espedficos. Los procedimientos para llevar a cabo todos estos ensayos son bien conocidos en la tecnica.
Los efectos de la manipulacion genica mediante los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden observar, por ejemplo, mediante transferencias Northern del ARN (por ejemplo, ARNm) aislado de los tejidos de interes. Generalmente, si el ARNm esta presente o la cantidad de ARNm ha aumentado se puede suponer que el correspondiente gen endogeno se esta expresando en una tasa mayor que antes. Se pueden usar otros procedimientos para medir la actividad genica y/o CYP74B. Se pueden usar diferentes tipos de ensayos enzimaticos, segun el sustrato usado y el procedimiento para detectar el incremento o la disminucion de un producto de reaccion o subproducto. Ademas, los niveles de protema y/o CYP74B expresados se pueden medir por inmunoqmmica, es decir, ELISA, RIA, EIA y otros ensayos basados en anticuerpos bien conocidos por los expertos en la tecnica, tales como ensayos de deteccion por electroforesis (con tincion o transferencia western). El transgen se puede expresar en forma selectiva en algunos tejidos de la planta o en algunas etapas de desarrollo, o el transgen se puede expresar en sustancialmente todos los tejidos vegetales, sustancialmente a lo largo de todo el ciclo de vida. Sin embargo, tambien se aplica cualquier modo de expresion combinatoria.
La presente descripcion tambien abarca semillas de las plantas transgenicas descritas anteriormente, en las que a semilla tiene el constructo del transgen o gen, y que incluye las semillas con los perfiles de aceite modificados. La presente descripcion tambien abarca la progenie, clones, lmeas celulares o celulas de las plantas transgenicas descritas anteriormente en las que dicha progenie, clon, lmea celular o celula posee el constructo transgenico o genico.
La administracion de cantidades efectivas se produce por cualquiera de las vfas normalmente usadas para introducir ZFP en contacto ultimo con la celula vegetal tratada. Las ZFP se administran de cualquier manera adecuada, preferentemente con portadores aceptables. Los procedimientos adecuados para administrar dichos moduladores estan disponibles y son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y si bien se puede usar mas de una via para administrar una composicion particular, a menudo una via particular puede proporcionar una reaccion mas inmediata y mas efectiva que otra via.
Tambien se pueden usar portadores y se determinan en parte por la composicion particular que se administra, asf como por el procedimiento particular usado para administrar la composicion. En consecuencia, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmaceuticas disponibles.
Aplicaciones
Como se indico anteriormente, la modulacion dirigida de los genes involucrados en la smtesis de acidos grasos se puede usar para generar de manera rapida y eficiente aceites de planta del perfil de acidos grasos deseado.
La alteracion de las composiciones de acidos grasos de los aceites de planta de las plantas productoras de aceite, tales como, por ejemplo, canola, tiene profundas implicaciones para la produccion de alimentos y, por consiguiente, para la salud de la dieta. Por ejemplo, las variedades Brassica de semillas oleaginosas de calidad canola con niveles reducidos de acidos grasos saturados en el aceite de semilla se pueden usar para producir productos alimenticios que promuevan la salud cardiovascular. Los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria se pueden usar para generar plantas productoras de aceite con bajo contenido de acido palmttico y/o estearico, que reducen los niveles de acidos grasos saturados en el aceite de planta. Del mismo modo, la generacion de plantas productoras de petroleo con niveles aumentados de contenido de acido oleico tambien reducira la cantidad de acidos grasos saturados en el aceite de planta.
Ademas, los procedimientos y las composiciones que se describen en la presente memoria se pueden usar para aumentar el contenido de acido palmttico, por ejemplo en aceites producidos a partir de tales plantas, Los aceites ricos en contenido de acido palmftico son particularmente utiles en la formulacion de las margarinas.
Ademas, la alteracion dirigida de los perfiles de acidos grasos como se describe en la presente memoria se puede usar para generar plantas (y aceites de planta) que tienen bajo contenido de acido linolenico. Los aceites con bajo contenido de acido linolenico muestran aumento de estabilidad; los alimentos elaborados usando estos aceites no se estropean en terminos de sabor u olor tan rapido como los alimentos elaborados con materiales vegetales con altas concentraciones de acido linolenico.
Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de aspectos espedficos descritos en la presente memoria.
Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, obviamente, se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales.
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Ejemplo 1: Identificacion de secuencia blanco en Brassica napus L
1.1 Identificacion de secuencia blanco
En este ejemplo, se identificaron las secuencias de ADN endogeno que codifican la enzima p-cetoacil-ACP sintetasa II (KAS II) nativa de Brassica napus L (canola). Estos genes se seleccionaron como ejemplos de blancos para demostrar la regulacion transcripcional a traves de factores de transcripcion de protemas con dedos de cinc manipulados geneticamente (ZFP TF), lo que produce la modificacion deseada de la biosmtesis de acidos grasos y los perfiles de aceite de semilla alterados concomitantes. La enzima p-cetoacil-ACP sintetasa II cataliza la conversion de 16:0-ACP a 18:0-ACP y la posterior formacion de acido oleico (Ohlrogge and Browse, 1995, The Plant Cell, 7:957-970). Una mutante fabl de Arabidopsis thaliana del gen p-cetoacil-ACP sintetasa II produjo una reduccion de 65% en la actividad enzimatica y aumentos concomitantes del contenido de acido estearico en un 7% y un 3% en hojas y rafces, respectivamente (Wu et al., 1994, Plant Physiology, 106:143-150). Un transgen de p- cetoacil-ACP sintetasa II de soja transformado de expresion estable disminuyo el contenido de acido palmftico de semilla en 0.8% y la introduccion del mismo gen en tabaco disminuyo el contenido de acido palmftico en 2% (Publicacion de patente japonesa N° 501446/1995).
Se han informado secuencias de ADNc de p-cetoacil-ACP sintetasa II a partir de multiples especies de planta que incluyen Arabidopsis thaliana (GenBank:AF318307) y Brassica napus (GenBank:AF244520). El alineamiento de las secuencias de ADNc de A. thaliana ay B. napus (GenBank:AF318307 y AF244520, respectivamente) mostro que la secuencia AF244520 estuvo incompleta (Figura 7). A esta secuencia de ADN de B. napus truncada le faltaban varios cientos pares de bases en el extremo 5'. Ademas, debido a que B. napus es una especie anfidiploide resultante de la combinacion de los conjuntos cromosomicos de B. rapa (2n = 20, AA) y B. oleracea (2n = 18, CC) (Morinaga, 1934, Cytologia, 6:62-67; U.N., 1935, Japanese J. Bot., 7:389-452), se predice que puede existir mas de un gen de p- cetoacil-ACP sintetasa II en esta especie. Se identificaron y se obtuvieron las secuencias 5 'UTR adicionales presentes en las secuencias de ADNc. Estas secuencias genicas de 5 'p-cetoacil-ACP sintetasa II sirvieron como blancos para la regulacion por aumento transcripcional a traves de ZFP-TF en los ejemplos presentes.
1.2 Aislamiento de ARN total
El ARN total se aislo de semilla inmadura del genotipo de Brassica napus (canola) Nex710 (Certificado de cultivo 997049208-501) 15 dfas despues de la floracion (dAf) usando el RNEASY®PlAnT MINI KIT de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA). El ARNm total se trato con ADNasa libre de ARNasa segun las recomendaciones del fabricante para eliminar cualquier ADN contaminante que podna amplificarse durante la RT-PCR cuantitativa.
1.3 5' RACE y analisis de secuencia
La amplificacion rapida de extremos de ADNc (RACE) especfticos para el extremo 5 'del ADNc de p-cetoacil-ACP sintetasa II de B. napus (GenBank AF244520) se realizo usando el kit FIRSTCHOICE® RLM-RACE de Ambion (Ambion, Austin, TX) por recomendaciones del fabricante. Para obtener la secuencia de ADNc 5', un adaptador de ARN sintetico se apareo a la region de ARNm sin termancion 5'. Un cebador suministrado con el kit (5'- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAA - 3 ') (SEQ ID NO:1) y un segundo cebador (5'- CTCGAGCTGCTACTGCTAGTTCCGGTGGAGGAGCC - 3') (SEQ iD NO:2) que se diseno para unirse dentro de la secuencia de ADNc de B. napus parcial (GenBank AF244520) se usaron para amplificar un fragmento para determinar la secuencia corriente arriba desconocida. La amplificacion 5 'RACE identifico aproximadamente de 500 pares de bases de nuevas secuencias de B. napus. Se identificaron contigos de cuatro secuencias de ADNc 5' claramente diferentes de los genes de p-cetoacil-ACP sintetasa II (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:30) cuando se alinearon las secuencias amplificadas (Figura 8). Estas secuencias 5 'mostraron altos niveles de homologfa con las secuencias de B. rapa (GenBank:AC189461) y B. oleracea (GenBank:BH723504) de la misma region.
Las secuencias de union de ZFP TF se identificaron en las secuencias de 5 'cDNA de genes de p-cetoacil-ACP sintetasa II. Las secuencias de la region corriente arriba de los genes de p-cetoacil-ACP sintetasa II (Tabla 2) sirvieron como blancos para la union de ZFP TF (Tabla 1). Constructos de plasmido:pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697, y pDAB4698 que contienen los disenos de ZFP TF manipulados geneticamente se usaron para transformar de forma estable B. napus como se describe en las siguientes secciones. Se planteo la hipotesis de que las ZFP TF manipuladas geneticamente despues de la expresion en celulas de planta se pueden unir a sus blancos de p-cetoacil-ACP sintetasa II endogenos, lo que produce la expresion de ARNm modificada del blanco.
Ejemplo 2: Diseno de los dominios de ADN de ZFP espedficos para el gen de p-cetoacil-ACP sintetasa II
Las protemas de dedos de cinc se disenaron contra varios sitios blanco en la region promotora del gen de p-cetoacil- ACP sintetasa II de B. napus y en la region 5' traducida y no traducida. Vease, Figura 2. Las helices de reconocimiento para los disenos representativos de ZFP se muestran a continuacion en la Tabla 1. Los sitios blanco de los disenos de dedos de cinc se muestran a continuacion en la Tabla 2.
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Tabla 1: Disenos de dedos de cinc de p-cetoacil-ACP sintetasa II
ZFP
F1 F2 F3 F4 F5 F6
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RSDNLSV (SEQ ID NO:5) QKINLQV (SEQ ID NO:6) RSDTLSE (SEQ ID NO:7) TRSSRIN (SEQ ID NO:8) RSDALAR (SEQ ID NO:9) N/A
14033
RSDHLSA (SEQ ID NO:10) TSSSRIN (SEQ ID NO:11) RSDNLAR (SEQ ID NO:12) DRSHLAR(SEQ ID NO:13) RSDNLSE (SEQ ID NO:14) RNAHRTT (SEQ ID NO:15)
14035
QSGNLAR (SEQ ID NO:16) RSDHLSE (SEQ ID NO:17) QKANRTK (SEQ ID NO:18) RSDDLTR (SEQ ID NO:19) TSANLSR (SEQ ID NO:20) N/A
14047
RSDDLSK (SEQ ID NO:21) RSANLTR (SEQ ID NO:22) RSDDLTR (SEQ ID NO:19) RSDHLSE (SEQ ID NO:17) DKSNRKK (SEQ ID NO:23) N/A
Tabla 2:Sitio blancos de dedos de cinc p-cetoacil-ACP sintetasa
ZFP
Sitio blanco (5' a 3') Sitio blanco/union de ZFP presente en las SEQ ID Nos.
14025
cGTGGAGACGtCAAAAGa (SEQ ID NO:24) 3, 4, 46 y 30
14033
aAGGAAGGGCGAGAAAAGGg (SEQ ID NO:25) 3 y 4
14035
aGATGCGTAACAGGAAg (SEQ ID NO:26) 3, 4, 46 y 30
14047
cTACCGGGCGGAGTCGt (SEQ ID NO:27) 3, 4 y 30
Los disenos de p-cetoacil-ACP sintetasa II se incorporaron en el vector de expresion de dedos de cinc que codifica una protema que tiene al menos un dedo con una estructura CCHC. Vease, Publicacion de patente U.S. N° 2008/0182332. En particular, el ultimo dedos de cada protema tema una estructura CCHC (arquitectura).
Las secuencias que codifican los dedos de cinc se fusionaron luego a secuencias que codifican un dominio de activacion de VP16 y una senal de localizacion nuclear opaque-2. La expresion de las protemas de fusion fue impulsada por un promotor constitutivo relativamente fuerte tal como un promotor derivado del promotor Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10). Los ejemplos de vectores se muestran en la Tabla 3 a continuacion.
Ejemplo 3: Regulacion por aumento mediado por ZFP TF del gen p-cetoacil-ACP sintetasa II nativo en B. napus
Con el fin de evaluar la funcionalidad de las protemas de dedos de cinc disenadas en celulas de plantas, se utilizaron procedimientos para la expresion de tales protemas en celulas de planta vivas. El ADN que codifica las protemas del dedos de cinc se puede administrar a las celulas de planta en condiciones en las que el ADN no se incorpora al genoma de la celula vegetal. Por lo tanto, la molecula de ADN se mantiene transitoriamente en las celulas de planta y actua como un molde para la expresion genica. Alternativamente, el ADN que codifica las protemas del dedos de cinc se puede administrar a las celulas de planta en condiciones que permitan que el ADN se incorpore en el genoma de la celula vegetal, lo que da como resultado la transgenesis de los genes que codifican la protema del dedos de cinc de modo que la molecula de ADN se mantiene de forma estable en las celulas de planta y actua como molde para la expresion genica. Un experto en la tecnica puede utilizar la expresion transitoria o transgenica de protemas con dedos de cinc que codifican ADN con el fin de evaluar la funcionalidad de estas protemas en celulas de plantas vivas.
3.1 Diseno del constructo
Los plasmidos binarios disenados y construidos para este proyecto se listan en la Tabla 3.
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Tabla 3: Descripcion del constructo para ZFP TF dirigidos a B. napus KAS II
S.N.
ZFP Constructo No. Casete genico
1
14025 pDAB4695 Atubi10/ZFP1-Vp16/AtuORF23/CsVMV/pat/AtuORF1
2
14033 pDAB4696 Atubi10/ZFP2-Vp16/AtuORF23/CsVMV/pat/AtuORF1
3
14035 pDAB4697 Atubi10/ZFP3-Vp16/AtuORF23/CsVMV/pat/AtuORF1
4
14047 pDAB4698 Atubi10/ZFP4-Vp16/AtuORF23/CsVMV/pat/AtuORF1
AtUbi10 = Promotor de Ubiquitina 10 Arabidopsis thaliana, CsVMV = promotor del virus de mosaico de las nervaduras de yuca, ZFP = gen de protema de dedos de cinc, pat = gen de fosfinotricina acil transferasa ATuORF1 = 3' UTR 1 Agrobacterium tumefaciens y AtuORF23 = 3' UTR 23 Agrobacterium tumefaciens.
pDAB4695 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de 14025 v3/VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 (Region de union de la matriz (Thompson et al., 1997, WO9727207)) ::Promotor v2 AtUbi10 (Promotor de Ubiquitina-10 de Arabidopsis thaliana (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) :: Fusion 14025 v3 dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1 (Marco de lectura abierto 23, region 3' no traducida de Agrobacterium tumefaciens (Gelvin et al., 1987, EP222493))::Promotor v2 CsVMV (Promotor del virus de mosaico de las nervaduras de yuca (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139))::pat v5 (Fosfinotricina acetil transferasa (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37))::AtuORF 1 3'UtR v4 (Marco de lectura abierto 1, region 3' no traducida Agrobacterium tumefaciens (Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)). El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion 14025 v3 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3916 por medio de los sitios de restriccion Ncol- Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8221 contema el casete de expresion del gen Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14025 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1. pDAB8221 se clono en el binario pDAB7309 por medio de una reaccion L-R Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4695 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4696 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de 14033 v3/VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 ::Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14033 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 CsVMV ::pat v5 ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la Fusion 14033 v3 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3916 por medio de los sitios de restriccion NcoI - Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8222 contema el casete de expresion del gen Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14033 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1. pDAB8222 se clono en el binario pDAB7309 por medio de una reaccion L-R Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4696 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4697 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de 14035 v3/VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 ::Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14035 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 CsVMV ::pat v5 ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la Fusion 14035 v3 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3916 por medio de los sitios de restriccion Ncol- Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8223 contema el casete de expresion del gen Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14035 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1. pDAB8223 se clono en el binario pDAB7309 por medio de una reaccion L-R Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4697 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4698 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de 14047 v3/VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 ::Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14037 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 CsVMV ::pat v5 ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la Fusion 14037 v3 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3916 por medio de los sitios de restriccion Ncol- Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8224 contema el casete de expresion del gen Promotor v2 AtUbi10 ::Fusion 14037 v3 Dedos de cinc/VP16 ::Atu ORF23 3'UTR v1. pDAB8224 se clono en el binario pDAB7309 por medio de una reaccion L-R Gateway® (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4698 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
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3.2 Transformacion de Agrobacteriumn
Se prepararon celulas de Agrobacterium para la electroporacion usando el protocolo descrito en Weigel D., Glazebrook J. Arabidopsis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002:pg123-124. Se realizaron modificaciones menores en el protocolo que permitieron el crecimiento optimo de Agrobacterium (es decir, el medio LB se sustituyo con YEP). Independientemente, se anadieron 1,5-3 |jg de ADN plasirndico para cada constructo a 50 jl de celulas de Agrobacterium tumefaciens C58 ::Z707 y se mezclaron suavemente. La mezcla se transfirio a cubetas GENE PULSER® de 0,2 cm fnas (BioRad Hercules, CA) y se coloco sobre hielo. Las cubetas se colocaron luego en una gradilla GENE PULSER® fna (BioRad, Hercules, CA) y se sometieron a electroporacion en las siguientes condiciones: salida de capacitancia de 25 jFarad, extensor de capacitancia 960 jFarad, resistencia de 200 ohmios y voltaje de 2,5 kV. Inmediatamente despues de la electroporacion, se anadieron 950 jl de medio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la mezcla se transfirio a un tubo Falcon 2059 (Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) o equivalente. Las celulas transformadas se incubaron luego a 28 °C durante 1 hora. Despues de la incubacion, 50 jl, 100 jl y 200 jl de celulas se sembraron en placas de medio YEP separadas (10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 5 g de NaCl, 10 g de sacarosa y 15 g de agar en 1 litro de agua) que contienen antibioticos segun corresponda Las placas se cultivaron invertidas a 28 °C durante aproximadamente 36-48 horas. Se recogieron colonias individuales y se propagaron en 50 ml de YEP lfquido (10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 5 g de NaCl y 10 g de sacarosa en 1 litro de agua), que contienen antibioticos segun correspondfa, a 28 °C durante aproximadamente 36 horas
La cepa de Agrobacterium tumefaciens se confirmo mediante una prueba de cetolactosa. Las colonias putativamente transformadas se sembraron en estnas en agar con lactosa y se incubaron a 28 °C durante 48 horas. Las placas luego se inundaron con la solucion de Benedict. Las placas se controlaron; las cepas sembradas en estnas que convirtieron la solucion de Benedict de azul a amarillo se confirmaron como Agrobacterium Bouzar, H., Jones, J., Bishop, A. "Simple Cultural Tests for Identification of Agrobacterium Biovars." Methods in Molecular Biology, Volume 44. Humana Press, 1995:9-13).
Despues de completar un protocolo de mini preparacion de copias de QIAGEN® (Qiagen, Valencia, CA), se preparo ADN de plasmido purificado a partir de cultivos bacterianos. La integridad del ADN se evaluo mediante digestion de restriccion. Se identificaron clones con los patrones de bandas esperados y se prepararon patrones de glicerol mediante la adicion de 500 jl de cultivo bacteriano a 500 jl de glicerol esteril (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e inversion para mezclar. Los patrones de glicerol se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C.
3.3 Transformacion de B. napus con ZFP TF
Preparacion de los segmentos de hipocotilo: las semillas del genotipo de B. napus, Nex 710, se esterilizaron en superficie con blanqueador comercial 10% durante 10 minutos y se enjuagaron 3 veces con agua destilada esteril. Las semillas se secaron con una toalla de papel esteril y luego se colocaron en una bandeja de Phyta que contema "medio de germinacion" que consiste en la mitad de la concentracion de medio basal Ms (Murashige y Skoog, Physiol Plant 15 (3):473-497, 1962), 20 g/L de sacarosa, y 8 g/L de agar TC (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS) y se mantuvieron en regimen de crecimiento ajustado a 23 °C, y un fotopenodo de 16 h luz/8 h de oscuridad.
El dfa 5, se verifico la esterilidad de las plantulas y se coloco la bandeja Phyta dentro de una campana de flujo laminar EDGEGARD® (The Baker Company, Sanford, ME) para mantener la esterilidad. Usando pinzas esteriles y tijeras de diseccion, las plantas se retiraron de la bandeja Phyta y las regiones aereas (meristemas y cotiledones) y las rafces se desprendieron y descartaron. Los hipocotilos se colocaron en una placa Petri de 100 x 25 mm que contiene agua destilada esteril que se requiere para evitar el secado. Los hipocotilos se colocaron sobre la tapa de una placa de Petri de 100 x 25 mm y se cortaron transversalmente en segmentos de 3 mm usando un bistun #10. Los segmentos de hipocotilo se colocaron en un "medio de induccion de callo" que consiste en medio MS que contiene 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de quinetina y 1 mg/l de 2,4-D solidificado con 7 g/l de agar TC que inclma un papel de filtro esteril. Las placas se colocaron en una cuba transparente STERILITE® y se mantuvieron bajo el mismo regimen de crecimiento durante 3 dfas, como un pretratamiento.
El dfa 8, los segmentos luego se transfirieron a una placa de Petri esteril de 100 x 25 que contiene 20 ml de "medio de cultivo lfquido" que consiste en medio basal Linsmaier y Skoog (1965) que contiene 30 g/l de glucosa, vitaminas Gamborg de A concentracion (1968), 215,2 mg/l de quinetina y 221,04 mg/12,4-D para un pretratamiento de 1 hora. El "medio de cultivo lfquido" se retiro de los segmentos de hipocotilo y 40 ml de suspension de Agrobacterium (que contiene pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697 o pDAB4698 en Z707) a 50 Klett se agitaron en vortex brevemente y se vertieron en la placa de Petri de 100 x 25 mm que contiene segmentos de hipocotilo para un tratamiento de 30 minutos. Despues de 30 minutos, toda la suspension de Agrobacterium se retiro usando una pipeta doble apilada. Los hipocotilos tratados se volvieron a colocar sobre el "medio de induccion de callo" mas papeles de filtro, se devolvieron a la cuba STERILITE®, se cubrieron con una tapa oscura y se devolvieron a la sala de cultivo bajo el mismo regimen de crecimiento que antes, durante un penodo de cocultivo de 3 dfas. Despues de 3 dfas, los hipocotilos se colocaron directamente en un "medio de induccion de callos" que contiene 1 mg/l de HERBIACE®, se volvieron a colocar en la cuba con una tapa transparente y se devolvieron a la sala de cultivo, manteniendo el mismo regimen de crecimiento que antes. Despues de 1 semana, los hipocotilos se transfirieron directamente al "medio de
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induccion de callos" con seleccion a 3 mg/l de HERBIACE® durante 2 semanas para el desarrollo de callos adicionales y se transfirieron al "medio de induccion de callos" con seleccion a 5 mg/l de HERBIACE durante 2-8 semanas para el desarrollo de callos adicionales. Una vez que estuvo disponible una cantidad suficiente de callos, se envio para analisis moleculares.
Regeneracion de plantas de callos de canola envejecida: se coloco tejido de callo de canola en 'medio de regeneracion de brotes' que consiste en medio MS que contiene 30 g/l de sacarosa, 3 mg/l de benzaminopurina, 0,5 g/l de MES [acido 2- (N-morfolino)etansulfonico], 5 mg/l de nitrato de plata, 1 mg/l de zeatina, 250 mg/l de carbenicilina, 300 mg/l de timentina y 7 g/l de agar TC con seleccion a 5 mg/l de HERBIACE®, las placas se envolvieron con cinta de 3M y se colocaron en regimen de crecimiento ajustado a 23 °C, y un fotopenodo de 16 horas luz/8 horas oscuridad. Los tejidos se movieron luego al 'medio de elongacion de brotes' que consistea en medio MS que contiene 0,5 g/l de mEs, 300 mg/l de timentina, 20 g/l de sacarosa y 7 g/l de agar TC con seleccion a 5 mg/l de HERBIACE®. Las plantulas se transfirieron a un 'medio de enraizamiento' que consiste en medio A MS que contiene 10 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de acido indolbutmco, 300 mg/l de timentina y 8 g/l de agar TC con seleccion a 5 mg/l de HERBIACE®.
Una vez que las rafces se establecieron en la plantula in vitro, se trasplantaron a macetas de 5 %" que contienen Metro Mix 360. Las plantas se cubrieron con una copa Solo transparente y se colocaron en un conviron para aclimatacion. Despues de 48-72 horas, se retiraron las copas para permitir la circulacion de aire. Despues de un total de siete dfas, las macetas se cambiaron del conviron a una bahna de invernadero para su posterior desarrollo. Las plantas se cultivaron en un fotopenodo de 16:8 horas, con temperatura diurna y nocturna entre 22 y 24 °C. Cuando el tallo primario de floracion comenzo a alargarse y formar capullos florales, la planta entera se cubrio con una bolsa de autofecundacion para evitar el cruzamiento. Las semillas derivadas de las autopolinizaciones se cosecharon aproximadamente cuatro meses despues del trasplante.
Preparacion de Agrobacterium: El Agrobacterium de un patron de glicerol se sembro en estnas, cuatro dfas antes del tratamiento, sobre "medio de cultivo bacteriano semisolido" que consiste en 10 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 10 g/L de sacarosa mas 100 mg/L de espectinomicina y 250 mg/L de estreptomicina y solidificada con 15 g/L de Bacto Agar y se cultivaron durante dos dfas en un incubadora (Incubadora Fisher Scientific Isotemp) a 28 °C. Despues de 2 dfas, se coloco un pequena asa de siembra de Agrobacterium en un matraz con deflector descartable esteril de 500 ml que contiene 150 ml de 'medio de cultivo bacteriano lfquido" (el mismo que el anterior menos el agente solidificante), 250 mg/l de estreptomicina y 100 mg/l de espectinomicina, cultivada durante 16 dfas. horas durante la noche a 28 °C en la oscuridad en un agitador cerrado (agitador de incubador refrigerado New Brunswick Scientific Innova 4330) a 200 rpm. Despues de 16 horas, el cultivo de Agrobacterium se retiro del agitador y se alicuoto en tubos de centnfuga de 50 ml (uno que contiene 35 ml para la preparacion y dos que contienen 50 ml para la revalidacion). Los tubos de centnfuga se colocan en una centnfuga (centnfuga Beckman Modelo J2-21) y se centrifugan a 6.000 rpm durante 15 minutos y posteriormente se resuspender en el 'medio de cultivo lfquido' hasta una densidad final de Klett 50 con un filtro rojo.
Ejemplo 4: Analisis de las muestras de callos transformados
Las muestras de callo de B. napus transformadas putativamente se analizaron en busca de alteraciones en las expresiones de ARNm para el gen endogeno de p-cetoacil-ACP sintetasa II, el gen endogeno de tubulina y el transgen de ZFP TF. Los niveles de ARNm de tubulina se usaron como un control interno para normalizar la expresion de ARNm de ZFP TF y p-cetoacil-ACP sintetasa II. Los datos de expresion de ARNm de ZFP TF se usaron para confirmar la presencia de al menos un transgen de ZFP TF funcional en callos transformados.
4.1 Preparacion de la muestra de callo
Aproximadamente 40-50 muestras de callo de ocho semanas de B. napus se obtuvieron despues de la transformacion de tejido de hipocotilo Nex710. Se transformaron individualmente con los constructos de ZFP TF, pDAB4695, pDAB4696, pDAB4697 y pDAB4698 como se describio anteriormente en el Ejemplo 3.3. Las muestras de control se obtuvieron por transformacion de una constructo binario de control que contiene un casete de expresion del gen pat (Promotor v2 AtUbi10 ::pat v3 ::Atu ORF1 3'UTR v3). Todas las muestras se cultivaron en medio de cultivo celular complementado con HERBIACE hasta su recoleccion.
El ARN total se preparo a partir del tejido de callo fresco usando el kit QIAGEN RNEASY 96 (Qiagen, Valencia, CA). El ARN se trato con ADNasa libre de ARNasa de acuerdo con las instrucciones del kit para eliminar cualquier contaminante de ADN genomico. La smtesis de la primera cadena se establecio de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la enzima de transcriptasa inversa Superscript® III (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se activo usando hexameros aleatorios. Las cadenas de ADNc sintetizadas se diluyeron en agua a relaciones de 1:10 y 1:50 (esto proporciona un molde suficiente para amplificar por PCR multiples blancos). Cada alfcuota se guardo a -20 °C indefinidamente.
4.2 Analisis de la expresion de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II
Se prepararon mezclas de reaccion qRT-PCR para la amplificacion del ADNc de la p-cetoacil-ACP sintetasa II de la siguiente manera:7,5 pl de tampon Master 2X LC480 Probes (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 0,3 pl de cebador
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directo espedfico del gen (SEQ ID NO :28:5'-TTGACTCGAGCTGCTACTGC-3'; posiciones de nucleotidos 544 - 563 para la SEQ ID NO:3 en el alineamiento de la Figura 8) a partir del patron de 10 jM, 0,3 |jl de cebador inverso espedfico del gen (SEQ ID NO:29:5'- TTTCCATATCCATCGCAACA - 3 '; posiciones de nucleotidos 588 - 607 para SEQ ID NO:3 en el alineamiento de la Figura 8) a partir de 10 jM de patron, 0,15 jl de sonda UPL # 25 de LIGHTCYCLER® 480 Probes Master, (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 1,5 jl de polivinilpirrolidona-40 10 % (p/v) (PVP-40) y 3,9 jl de agua. La sonda UPL (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) es un acido nucleico bloqueado y, por lo tanto, tiene una Tm superior a la calculada de otro modo. Todos los componentes se volvieron a colocar en el congelador antes de manipular los estandares y los desconocidos. Se demarco y marco una microplaca de 384 pocillos, se anadieron 13,5 jl de mezcla maestra por pocillo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la microplaca. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3.000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. Se anadieron 1,5 jl de cadenas de ADNc sintetizado diluido y descongelado. Ademas, se anadieron 1,5 jl de estandares de numero de copias de ADN plasmfdico a pocillos separados en una serie de diluciones de concentraciones mas bajas a mas altas, estos estandares se compararon con el ADNc de p-cetoacil-ACP sintetasa II (sintetizado a partir de ARNm total) para cuantificar el numero de copias. Se prepararon series estandar de numero de copias de ADN de p-cetoacil-ACP sintetasa por clonacion del amplicon blanco en un plasmido pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se realizo una serie de diluciones para cuantificar el numero de copias. Se fijo firmemente un sello laminado a la placa y se centrifugo como se describio previamente. Un programa de PCR se realizo de la siguiente manera: i. Activar 95 °C durante 5 minutos; ii. Desnaturalizar 95 °C durante 10 segundos @ 4.8 °C/segundos; iii. Aparear/extender 60 °C durante 25 segundos a 2.5 °C/ segundos; iv. Adquirir 72 °C durante 1 segundos @ 4.8 °C/segundos; Repetir la etapa ii - iv, 40-50 mas veces; Enfriar a 38 °C durante 5 segundos. El ADN se amplifico en instrumentacion de PCR en tiempo real LC480 (Roche, Indianapolis, IN) o equivalente. El tamano del amplicon fue de 64 pares de bases. Las secuencias de cebador directo e inverso empleadas en este ensayo de PCR coincidieron perfectamente con las secuencias correspondientes presentes en dos de los blancos del gen de p- cetoacil-ACP sintetasa II, SEQ ID NOs:3 y 30 (Figura 8). Por lo tanto, este ensayo represento la expresion cuantitativa de dos blancos del gen de p-cetoacil-ACP sintetasa II.
4.3 Analisis de la expresion de ARNm de tubulina
El gen de tubulina, un gen nativo de Brassica napus (GenBank:AF258790 y GenBank:DU106489), se uso como estandar de referencia para normalizar con exactitud la senal de expresion de ARNm a traves de os genes en ensayos de qRT-PCR. El ADNc sintetizado para el ensayo qRT-PCR de p-cetoacil-ACP sintetasa II (descrito en el ejemplo 4.1) tambien se uso en el ensayo qRT-PCR de de tubulina como se describe a continuacion.
Se monto un qRT-PCR con 0,3 pL de un cebador directo espedfico del gen (SEQ ID NO:31:5'- ACAGCGATTGCCTACAAGG -3') (patron de 10 pM) y 0,3 pL de un cebador inverso espedfico del gen (SEQ ID NO:32:5'-AGATGGTTAAGATCACCAAAGG -3') (patron de 10 pM), 1,5 pL de PVP-40 10% (p/v), 3,9 pL de agua y
7.5 pL de mezcla maestra 2X LIGHTCYCLER® 480 SYBR Green I (Roche, Indianapolis, IN) para detectar y cuantificar ADN. Se demarco y marco una microplaca de 384 pocillos, se anadieron 13,5 jl de mezcla maestra por pocillo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la microplaca. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3.000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. Se retiro la lamina de sellado y se anadieron 1,5 jl de cadenas de ADNc sintetizado diluido y descongelado, Adicionalmente, se anadieron 1,5 jl de estandares de numero de copias de ADN plasmfdico a pocillos separados en una serie de diluciones de concentraciones mas bajas a mas altas, estos estandares se compararon con el ADNc de tubulina (sintetizado a partir de ARNm total) para cuantificar el numero de copias. Se prepararon series estandar de numero de copias de ADN de tubulina por clonacion del amplicon blanco en un plasmido pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se realizo una serie de diluciones para cuantificar el numero de copias. Se fijo firmemente un sello laminado a la placa y se centrifugo como se describio previamente. Un programa de PCR se realizo de la siguiente manera: i. Activar 95 °C durante 5 minutos; ii. Desnaturalizar 95 °C durante 10 segundos @ 4.8 °C/segundos; iii. Aparear/extender 55 °C durante 20 segundos a
2.5 °C/ segundos; iv. Adquirir 72 °C durante 20 segundos @ 4.8 °C/segundos; las etapas ii - iv se repitieron 39 veces mas; vi. Enfriar a 38 °C durante 5 segundos. El ADN se amplifico en instrumentacion de PCR en tiempo real LC480 o equivalente. Un amplicon de de 307 pares de bases se amplifico en esta reaccion. Este cebador inverso abarca un intron de 78 pb basado en la secuencia de GenBank. Por lo tanto, los amplicones amplificados a partir del ADN genomico no estaban favorecidos y los contaminantes de ADN genomico pueden ser de mayor peso molecular y se pueden diferenciar facilmente de los de ADNc mediante la corrida de los amplicones en un gel de agarosa.
4.4 Analisis de la expresion de ARNm en ZFP TF
La expresion del ARNm de ZFP TF se cuantifico a partir de muestras de ADNc que se sintetizaron originalmente para ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II (descrito anteriormente en el Ejemplo 4.1). Se diseno un ensayo de PCR TaqMan a partir del casete de ZFP mediante el anclaje de cebadores a la secuencia NLS opaque-2 en la secuencia 5' y VP16 en el 3'. El ensayo de PCR se monto usando: 0,5 jl de cebador directo "OP2_NlS_F1" "OP2_NLS_F1" (sEq ID NO:33:5'- AAGGAAGAGGAAGGAGTCTAACAG -3') a partir del patron de 10 pM, 0,5 pL de cebador inverso "VP16_R1" (SEQ ID 34:5'- CTTCTGCTCTCCACCGTA -3') a partir del patron de 10 pM, 0,25 pL de sonda "VP16_MGB_185" (SEQ ID NO:45:5'-TTGATGGTGAAGATGT -3') a partir del patron de 5 pM, 1,5 pL de PVP-40 10% (p/v), 1,5 pL de tampon de PCR 10x Hot Start, 1,0 pL de MgC^25 mM, 1,2 pL de dNTP (2,5 mM cada uno), 0,15 pL de polimerasa Hot Start Taq (Qiagen, Valencia, CA), y 6,9 pL de agua, el coctel se amplifico usando LIGHTCYCLER® 480 (Roche Diagnostics, USA). Se demarco y marco una microplaca de 384 pocillos, se anadieron
13.5 |jl de mezcla maestra por pociMo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la microplaca. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3.000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. Se fijo firmemente un sello laminado a la placa y se centrifugo como se describio previamente. Un programa de PCR se realizo de la siguiente manera: i. Activar 95 °C durante 5 minutos; ii. Desnaturalizar 95 °C durante 20 segundos @ 4,8°C/segundos; iii.
5 Aparear/extender 60°C durante 20 segundos @ 2,5°C/segundos; iv. Adquirir 72°C durante 55 segundos @ 4,8°C/segundos; las ii - iv se repitieron 44 veces; vi. Enfriar a 38°C durante 5 segundos. El ADN se amplifico en instrumentacion de PCR en tiempo real LC480 o equivalente. El tamano del amplicon fue de 775 pares de bases. Se determino el numero de copia de ADNc /ARNm de ZFP TF usando una serie estandar en la que el amplicon blanco se clono en un plasmido y se prepararon series de dilucion para ensayos de PCR como se describe para los 10 ejemplos de p-cetoacil-ACP sintetasa II y tubulina anteriores.
4.5 Analisis de la expresion de las muestras de callo
La expresion de ARNm de ZFP TF se midio en muestras de callos transgenicos de 8 semanas transformados putativamente con TF ZFP y que crecen en medio de seleccion HERBIACE® (vease el Ejemplo 3). La expresion de ARNm cuantitativa de ZFP TF, medida con el ensayo de qRT-PCR, se detecto en muestras transformadas con 15 constructos que contienen solo TF ZFP pero no en muestras que conteman el constructo de control. Estos datos indicaron que el ensayo era espedfico para la expresion de ZFP TF y que los callos de control conteman ek transgen de ZFP TF.
Las relaciones de p-cetoacil-ACP sintetasa II y la expresion de ARNm de tubulina se calcularon, sobre la base de los resultados de qRT-PCR, para discernir las diferencias de expresion entre muestras de callos. La regulacion por 20 aumento del ARNm mas alta de p-cetoacil-ACP sintetasa II se observo en muestras de callos de canola transformadas con el constructo pDAB4695 (Tabla 4). Esta regulacion por aumento de 27% fue estadfsticamente significativa (p = 0.05) respecto de las muestras de control.
Tabla 4: Expresion de ARNm KASII en muestras de callo de B. napus transformadas con diferentes constructos de ZFP TF
Constructo
Numero de callos analizados Media de expresion de KasII/Tubulina STDEV de expresion de KasII/Tubulina
4695
23 3,69 1,20
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20 2,81 0,84
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24 3,18 0,93
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24 3,03 0,68
Control
14 2,90 1,12
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Ejemplo 5:Analisis de las muestras de planta T0 transformadas
5.1 Analisis de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II, Tubulina y ZFP TF
Expresion
Se cultivaron plantas de canola T0 que contienen el contracto del transgen pDAB4695 hasta la etapa de planta de 6 30 hojas y se analizaron las expresiones de ARNm del gen endogeno de p acil-ACP sintetasa II, gen endogeno de tubulina y transgen ZFP TF. Las plantas transgenicas se compararon con muestras de control que se habfan transformado con un constructo binario que contiene un casete de expresion del gen pat (Promotor v2 AtUbi10 ::pat v3 ::Atu ORF1 3'UTR v3). Seis perforaciones de hojas de un perforador de papel de tamano estandar de cada planta de muestrearon en hielo y se extrajo el ARNm total con el kit de extraccion de ARN RNeasy de 96 pocillos Qiagen 35 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Qiagen, Carlsbad, CA). Los analisis de expresion de ARNm de p- cetoacil-ACP sintetasa II, tubulina y ZFP se completaron usando los protocolos descritos anteriormente en el Ejemplo 4.
La expresion del ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II vario entre las plantas T0 transgenicas independientes. Se observo una regulacion por aumento de ARNm superior a 3 veces entre los 16 eventos analizados (Figura 3). Todas 40 las plantas fueron positivas para la expresion de ZFP TF. Ademas, se usaron 27 plantas de control para calcular una
lmea base de expresion de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II. La expresion media del ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II del control inicial se comparo con la expresion del ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II de eventos de plantas ZFP TF individuales para calcular el nivel de aumento de la expresion (Figura 3). Estas plantas se cultivaron hasta la madurez para obtener la semilla Ti. Antes de la floracion, todas las plantas se cubrieron individualmente con 5 bolsas de autofecundacion para facilitar la autopolinizacion de las flores dentro de una planta. Las semillas Ti de estas plantas se recolectaron aproximadamente 4 meses despues de su transferencia al invernadero.
Los eventos 3, 6 y 12.2 (de aqrn en adelante denominado como el evento 12), que representan diferentes rangos de expresion de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II, se seleccionaron para un estudio adicional.
Ejemplo 6: Analisis de muestras de plantas Ti transformadas
10 6.1 Analisis de acidos grasos de la semilla Ti
El analisis de acidos grasos de semilla individual se realizo en 24 semillas T1 individuales, por evento, para estudiar los efectos de ZFP TF sobre la alteracion en los contenidos de acidos grasos (Tabla 5). Se empleo un procedimiento de analisis de ester metilico de acidos grasos (FAME) basado en el procedimiento AOCS Ce2 - 66 (97) y todos los numeros en la Tabla 5 se muestran como un porcentaje de acidos grasos totales presentes en las semillas de 15 canola.
Tabla 5: Perfil de acidos grasos de semillas Ti individuales medido analisis FAME
Eventos
C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C18 total
3 Bajo
2,8 0,3 1,6 76,1 12,2 3,7 93,6
3 Bajo
2,9 0,3 1,4 76,7 11,8 4,0 93,9
3 Bajo
2,9 0,3 1,4 75,7 13,0 3,8 93,9
3 Alto
3,6 0,3 1,4 75,1 13,0 3,5 93,1
3 Alto
3,8 0,4 1,4 75,6 12,0 3,8 92,8
3 Alto
4,0 0,4 1,5 74,8 12,6 3,7 92,5
Media (n = 24)
3,3 0,3 1,5 75,7 12,4 3,8 93,3
Desv. Est (n = 24)
0,5 0,1 0,1 0,7 0,5 0,1 0,34
12 Bajo
3,1 0,2 1,5 76,4 12,0 3,8 93,6
12 Bajo
3,2 0,3 1,4 77,0 11,5 3,4 93,3
12 Bajo
3,2 0,2 1,8 80,9 7,5 3,2 93,5
12 Alto
3,6 0,3 1,5 76,8 11,7 3,1 93,2
12 Alto
3,6 0,3 1,6 76,0 11,9 3,5 93,0
12 Alto
3,6 0,3 1,8 77,3 10,8 3,0 92,9
Media (n = 24)
3,4 0,3 1,6 77,4 10,9 3,3 93,2
Desv. Est (n = 24)
0,2 0,0 0,2 1,8 1,7 0,3 0,23
6 Bajo
3,2 0,5 1,9 81,3 8,1 2,1 93,3
5
10
15
20
25
30
35
Eventos
C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C18 total
6 Bajo
3,3 0,5 1,2 79,6 10,1 2,3 93,1
6 Bajo
3,5 0,5 2,6 80,6 7,5 1,9 92,6
6 Alto
4,4 0,5 2,4 77,7 10,7 1,5 92,2
6 Alto
4,5 0,6 2,2 77,1 10,5 1,8 91,6
6 alto
4,6 0,7 1,3 77,4 11,0 1,7 91,4
Media (n = 24)
3,9 0,5 1,9 78,9 9,6 1,9 92,4
Desv. Est (n = 24)
0,6 0,1 0,6 1,8 1,5 0,3 0,54
Nex710 Media (n=216)
3,8 0,4 2,3 78,1 9,5 2,5 92,5
Desv. Est (n=216)
0,2 0,0 0,6 1,8 1,6 0,7 0,45
Para la preparacion de la muestra, las semillas individuals se colocaron en tubos cluster etiquetados en una placa de extraccion de 96 pocillos que contiene una bola de acero de 1/8 "(Small Parts, Miramar, FL) Se taparon los tubos y las semillas se molieron en seco en un GenoGrinder (SPEX CertiPrep Group, Metuchen, NJ) durante 3,0 minutos a 1300 golpes/minuto. Se retiraron las tapas y se anadieron 0,6 ml de heptano a cada pocillo. Los pocillos se taparon de nuevo y se volvieron a colocar en el GenoGrinder para una molienda adicional durante 2,0 minutos a 1200 golpes/min. Las muestras luego se retiraron y centrifugaron a 3700 rpm durante 10,0 minutos a 6 °C. Usando un Beckman Coulter MC Robot, el sobrenadante se transfirio a una placa de 96 pocillos con insertos de vidrio (MicroLiter, Suwanee, GA). Se anadieron 40 pl de metoxido de sodio 1% a la muestra. El metoxido de sodio se diluyo a partir de una solucion patron 30% con metanol (Fluka/Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las placas se taparon con una placa revestida de teflon y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 4 horas antes del analisis de GC.
Las muestras se analizaron para determinar el contenido de acidos grasos en un Agilent 6890 GC-FID (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado con una columna J & W Scientific DB-23, 15 metros x 0,25 mm de ID y 0,25 pm de espesor de pelfcula (J & W Scientific, Folsom, CA). La temperatura inicial del horno fue de 200 °C y esta temperatura se mantuvo durante la corrida. La entrada se ajusto a una relacion de division de 1:100 y una temperatura de 280 °C. Se mantuvo una tasa de flujo en rampa de 0,8 ml/min de helio durante los dos minutos iniciales. Luego se aumento el flujo a una tasa de 1,0 ml/min a 2,5 ml/min y se mantuvo durante 1,5 minutos. El detector se ajusto a 300 °C con una composicion de gas de portador constante y flujo de columna de 30 ml/min, flujo de hidrogeno de combustible de 30 ml/min y flujo de oxidante de 400 ml/min. Se utilizo un volumen de inyeccion de 2 pl para todas las muestras.
Los picos de ester metilico de acido graso individual se identificaron por comparacion con los tiempos de retencion de los estandares de referencia del ester metilico (GLC n° 428, Nu-Chek-Prep, Inc., Elysian, MN) usando Waters Corp. Empower Software. Se calcularon las areas porcentuales individuales para todos los analitos en el estandar de referencia en funcion de las areas del pico de cromatograffa integradas totales. Tambien se tomo un blanco de heptano para identificar cualquier contaminacion en el GC.
Una comparacion de la semilla T1 con los tres niveles mas bajos de C16:0 (que muy probablemente son plantas ZFP TF positivas) y los tres niveles mas altos de C16:0 (que son mas probablemente las plantas ZFP TF nulas) indicaron que los cambios en el contenido de C16:0 se puede deber a la segregacion del transgen ZFP TF (Tabla 5). Un cambio correspondiente en C18 total (C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3) tambien se observo en todos los eventos; las semillas con niveles bajos de C16:0 teman niveles totales de C18 incrementados y viceversa. Esto fue a pesar de la variabilidad en los contenidos de acidos grasos individuales de C18:0, C18:1, C18:2 y C18:3 debido a la segregacion de los genes mutantes fad2 y fad3 (Hu, X., y col., Theor. Appl. Genet 2006, 113:497-507) en el genotipo Nex710 que se transformo. Por lo tanto, se llevo a cabo la siguiente etapa para identificar las plantas ZFP TF positivas y nulas hermanas en una poblacion segregante T1 de cada evento para detectar el cambio real en el perfil de acidos grasos en trasfondos geneticos similares.
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6.2 Analisis de presencia de ZFP TF en plantas T1
Se analizaron 100-150 plantulas Ti de los tres eventos transgenicos 3, 6 y 12 para identificar las plantas ZFP TF positivas y nulas hermanas (Tabla 6). Las plantas se analizaron para detectar la presencia de al menos un casete de longitud completa del transgen ZFP TF. El ADN genomico total de las hojas de estas plantas se aislo segun las recomendaciones del fabricante con el kit de extraccion QIAGEN PLANT DNEASY (Qiagen, Valencia, CA). El protocolo se modifico mediante la adicion de PVP-40 al tampon Qiagen API a una concentracion final del 1%. El ADNg purificado se cuantifico mediante un protocolo de cuantificacion de ADN PICOGREEN® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Las muestras de ADN se analizaron para determinar la presencia de como mmimo una copia de longitud completa del transgen de ZFP TF en un ensayo de PCR que contiene los siguientes reactivos:5 jl de tampon Taq 10X EX (Takara Bio Inc., Otsu, Siga, Japon), 5 jl de polivinilpirrolidona-40 10%, 1,0 jl de cebador directo ubi10 (SEC ID N°:35:5'-GGTCAACGGATCAGGATATTCTTG -3') a partir del patron de 10 jM, 1,0 jl de cebador inverso AtuORF23 (SEC ID N°:36:5'- CCATGTTGGCAAAGGCAACC -3'), patron 10 jM, 4 uL de dNTP (2.5 mM cada uno), 0.2 jl de TaKaRa EX Taq™ Hot Start, 31.8 jl de agua y 2 jl de ADN a una concentracion de 10 ng/jl. Las condiciones de ciclado de PCR fueron las siguientes:94 °C durante 2 min, 10 ciclos de PCR touch-down (decreciente) con 98 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 20 segundos con una temperatura decreciente de 0,5 °C en cada ciclo a 60 °C seguido a 72 °C durante 3:00 min. Esto fue seguido por 35 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 3 minutos y una extension final de 72 °C durante 10 minutos. Se corrieron 5 jl de cada reaccion en un gel de agarosa 1% para detectar la presencia del tamano esperado de la banda ZFP TF de 2662 pb.
Se desarrollo un ensayo de PCR en tiempo real cuantitativa para el gen pat, que esta unido molecularmente a TF ZFP en el constructo pDAB4695, y se aplico para identificar plantas pat positivas y nulas para confirmar su segregacion genetica con el casete ZFP TF al que esta unido molecularmente.
Tabla 6: Identificacion de plantas ZFP TF positivas y nulas hermanas en la poblacion Ti segregante de los tres eventos
Eventos
Semilla Ti total plantada Plantas T1 ZFP TF/nulas identificadas Plantas T1 ZFP TF/nulas avanzadas a semilla
3
150 115/7 12/7
6
100 66/27 5/5
12
150 126/6 8/6
La mezcla de reaccion para el ensayo de TaqMan RT-PCR pat estaba compuesta de los siguientes:3 pL de mezcla maestra Roche LIGHtCyCLER® Cycler 480 II Probes 2X, 0,6 pL de PVP-40 10%, 0,2 pL de cada uno del cebador directo de pat (SEQ ID NO:37:5'-ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT -3') a partir del patron de 10 pM, 0,2 pL de cebador inverso PAT (SEQ ID NO:38:5'- CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT -3') a partir del patron de 10 pM, 0,2 pL de sonda (SEQ ID NO:39:5'-6FAM-CCAGCGTAAGCAATACCAGCCACAACACC-inactivador) a partir del patron de 5 pM, y se multiplexo con los siguientes reactivos para el estandar interno de referencia de HMG (GenBank:AF127919), de la siguiente manera:0,2 pL de cada cebador directo de HMG (SEQ ID NO:40:5'- CCTCTCTACCACCGTCTCACATG -3') a partir del patron de 10 pM, 0,2 pL de cebador inverso HMG (SEQ ID NO:41:5'- GATCTGGCCGGACTGTTTCA -3') a partir del patron de 10 pM, 0,2 pL de sonda (SEQ ID NO:42:5'- 6FAM-CGCTCCTCAGCTACCACCTCAACCA-inactivador-3'), a partir del patron de 50 pM, 1 pL de ADN y 0,2 pL de agua. Las condiciones de ciclado de PCR fueron:1 ciclo de 95 °C durante 5 min, 40 ciclos de 95°C durante 10 segundos, 60°C durante 40 segundos y 72°C durante 1 segundo. Todas las muestras se amplificaron por triplicado en placas de 384 pocillos justo con 1 a 4 copias de estandares de ADN genomico transgenico en una maquina Roche LIGHTCYCLER® 480.
Sobre la base de las relaciones de segregacion de las plantas ZFP TF positivas y nulas dentro de cada evento, los eventos 3, 6 y 12 conteman aproximadamente 2, 1 y 2 inserciones respectivamente del transgen de ZFP TF en el genoma de B. napus (Tabla 6, Columna 3) Estos datos coinciden con los datos de segregacion de genes pat en los tres eventos.
6.3 Regulacion por aumento de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II en las plantas T1
Todas las plantas T1 ZFP TF positivas y nulas hermanas mostradas en la Tabla 6, Columna 3 se sometieron luego al analisis de expresion de ARNm para el gen de p-cetoacil-ACP sintetasa endogeno, transgen de ZFP TF y gen de tubulina endogeno. Este ultimo sirvio como un gen de referencia para normalizar las expresiones del gen de p- cetoacil-ACP sintetasa II y ZFP TF. Seis perforaciones de hoja de cada una etapa de la planta de 6 hojas se
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muestrearon en hielo y se extrajo el ARN total utilizando el kit QIAGEN RNAEASY®. La smtesis de cadena de ADNc y las diluciones se completaron como se describe en el Ejemplo 4.1.
El analisis de qRT-PCR del ADNc sintetizado se completo para los tres genes. El analisis de expresion del ARNM de p-cetoacil-ACP sintetasa II y tubulina se realizo como se describe en los Ejemplos 4.2 y 4.3, respectivamente. El ensayo ZFP TF se modifico. La reaccion de PCR se monto de la siguiente manera: Las condiciones de reaccion fueron las siguientes:7,5 pl de tampon maestro 2X LC480 Probes (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), 0,3 pl de cebador directo espedfico del gen gen #1 (SEQ ID NO:43:5'- TCGaTcTTGATATGTTGGGAGA -3') (patron 10 pM), 0,3 pl de cebador inverso espedfico del gen #2 (SEQ ID NO:44:5'- AGGTGCAGAATCATGTGGTG - 3') (patron 10 pM), 0,15 pL de sonda UPL #85, 1,5 pl de PVP-40 10% (p/v) y 3,9 pl de agua. Se demarco una microplaca de 384 pocillos y se anadieron 13,5 pl de la mezcla descrita anteriormente por pocillo. Se fijo una lamina de sellado a la placa, y la placa se centrifugo durante 1 minuto a 3000 rpm. La pelfcula se retiro y se anadieron 1,5 pL de las primeras cadenas diluidas y descongeladas por pocillo. Ademas, se anadieron estandares de ADNc a pocillos de control separados. El sello laminado se sello sobre la placa y se repitio la etapa de centrifugacion. Se corrio un programa de PCR con las siguientes condiciones; 1. Activar 95 °C durante 5 minutos, ii. Desnaturalizar 95 °C durante 10 segundos (@ 4,8 °C/segundos), iii. Aparear/extender 60°C durante 25 segundos (@ 2,5°C/segundos), iv. Adquirir 72°C durante 1 segundos (@ 4,8°C/segundos), v. Repetir las etapas ii - iv 39-49 veces mas, vi. Enfriar a 38°C durante 5 segundos.
La expresion de ARNm de ZFP TF fue la mas baja en el evento 6 y la mas alta en el evento 3 de las muestras positivas para ZFP TF (Figura 4). Las plantas nulas no expresaron ARNm de ZFP TF lo que indica que el ensayo ZFP TF era espedfico para la presencia de transgen de ZFP TF. Los niveles de ARNm del gen de la p-cetoacil-ACP sintetasa II, el blanco para ZFP TF, se regularon por aumento en las plantas ZFP TF positivas de todos los eventos (Figura 5). Se observo hasta un aumento de 3-4 veces en la expresion de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II mediante comparaciones por pares de las plantas ZFP TF positivas y las correspondientes nulas hermanas dentro de cada evento. La regulacion por aumento de los niveles de ARNm de p-cetoacil-ACP sintetasa II fue relativa al aumento en los niveles de expresion de ARNm de ZFP TF dentro de cada evento (Figura 4), es decir, mas bajo en el evento 6 y mas alto en el evento 3.
6.4 Analisis de acidos grasos de las hojas de las plantas T1
Se recogio un segundo conjunto de muestras de hojas T1 para analisis de acidos grasos concurrentes a la recoleccion de muestras de analisis de ARNm descritas en el Ejemplo 6.3. Sin embargo, solo un subconjunto de las muestras se analizo para acidos grasos solo para aquellas plantas que avanzaron a la madurez como se muestra en la Tabla 6, columna 4. El analisis de ester medico de acido graso (FAME) del material foliar se completo de la siguiente manera. Se recogio material de hoja de 10-100 mg en hielo y luego se liofilizo antes de una reaccion de transmetilacion con metoxido de sodio 0,25 M en metanol anhidro a 40 °C durante 20 minutos. Despues de la reaccion de transmetilacion, los acidos grasos se extrajeron tres veces con una solucion de heptano que contiene heptadecanoma como un estandar sustituto. Las fracciones de hexano aisladas se secaron y se resuspendieron en un volumen conocido de heptano. El ester medico de acidos grasos resultante (FAME) se analizo mediante GC-FID usando una columna capilar BPX 70 de SGE (15 m x 0,25 mm x 0, 25 pm). Cada FAME se identifico por su tiempo de retencion y se cuantifico mediante la inyeccion de una mezcla de referencia de aceite de colza de Matreya lLc como estandar de calibracion. La completitud de la reaccion se verifico mediante el control de la presencia de FAMES endogenos en una cuarta extraccion/derivacion.
Los tres eventos mostraron una disminucion en el contenido total de C16:0 y un aumento concomitante en el contenido total de C18 en las comparaciones por pares de plantas ZFP TF positivas y las correspondientes nulas hermanas dentro de cada evento (Tabla 7). Por ejemplo, las plantas ZFP tF positivas del evento 12 demostraron una reduccion en el contenido de C16:0 en un 6,3% y un aumento en el contenido total de C18 en un 1,44% en comparacion con sus propias plantas nulas hermanas.
Tabla 7: Perfil de acidos grasos de hoja Ti
Nombre de muestra
Plantas analizadas C16:0 C18 total
Media Desv. Est Media Desv. Est
12 nulo
6 10,98 0,31 69,93 0,91
12ZFP
8 10,29 0,39 70,94 1,02
3 nulo
7 10,79 0,56 69,84 1,18
3ZFP
12 10,34 0,29 71,25 0,74
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Nombre de muestra
Plantas analizadas C16:0 C18 total
Media Desv. Est Media Desv. Est
6 nulo
5 11,94 0,47 70,36 1,91
6ZFP
5 10,44 0,62 72,16 2,88
Ejemplo 7: Analisis de semilla T2 transgenica ZFP TF
Un subconjunto de plantas ZFP TF positivas que demostraron las expresiones mas altas de ARNm de p-cetoacil- ACP sintetasa II y plantas nulas hermanas dentro de cada evento que avanzaron a la madurez para obtener las semillas T2 (Tabla 6, columna 4). La excepcion fue el evento 3, en el que tambien avanzaron algunas plantas positivas para ZFP TF con rangos de expresion mas bajos. Estos podnan representar la otra insercion segregante del transgen pDAB4695. Cada planta T1 se cubrio con una bolsa de malla para facilitar la autopolinizacion dentro de una planta determinada. Se recolectaron las semillas y se analizaron los niveles de acidos graso.
El analisis de acidos grasos T2 se realizo en una mezcla de 24 semillas por planta como se describe para el analisis de semillas T1 en el Ejemplo 6.1. Los resultados mostraron una disminucion en el contenido de C16:0 en plantas ZFP TF positivas de los tres eventos por comparacion por pares con sus correspondientes plantas nulas hermanas (Tablas 8A y 8B). Esta disminucion en los contenidos de C16:0 fue del 12.6%, 11.2% y 22.3% para los eventos 12, 3 y 6, respectivamente. Tambien se observo una disminucion constante en el contenido de C16:1. Correspondiente a la disminucion en los contenidos de C16:0 y C16:1, se observo un aumento concomitante en el contenido de C18 total (C18:0 + C18:1 + C18:2 + C18:3) en plantas ZFP TF positivas en una comparacion por pares con las plantas nulas hermanas correspondientes. Las tres comparaciones por pares de las plantas ZFP TF positivas y las correspondientes nulas hermanas fueron estadfsticamente significativas (p = <0.001) para aumentos en el contenido de C16 total (C16:0 + C16:1) y contenido de C16 total/C18 total en el analisis con el software estadfstico JMP (Figura 6, A y B). Aunque los tres eventos fueron variables en su contenido de C16:0 basado en observaciones de plantas nulas hermanas (Tablas 8A y 8B), ZFP TF fue eficaz en la disminucion del contenido de C16:0 a niveles aproximadamente similares; entre ~ 2.93 a 3.05. Mientras que todas las plantas ZFP TF positivas de los eventos 3 y 12 establecen las semillas (Tablas 8 y 9), solo una planta que contiene ZFP TF del evento 6 establecio la semilla. Esta planta particular del evento 6 fue la de contenido mas alto de C16:0 sobre la base de los datos de acidos grasos de las hojas T1. Las Tablas 8A y 8B muestran la comparacion del perfil de acidos grasos T2 de tres eventos transgenicos de B. napus de pDAB4695 ZFP TF positivo y las correspondientes plantas nulas hermanas. Estos datos se obtuvieron con el analisis FAME y se describe en la Seccion 6.1. Se analizaron los acidos grasos C12:0 a C24:1 y se muestran los principales en estas tablas. Todos los numeros se representaron como un porcentaje de acidos grasos totales presentes en las semillas de B. napus.
Tabla 8A: Analisis de acidos grasos C16:0, C16:1, C18:0, C:18:1, C:18:2 y C:18:3
Muestras
C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
12 Nulo Media
3,49 0,26 1,29 76,59 11,45 3,73
Desv. Est (n=6)
0,06 0,01 0,05 0,25 0,21 0,04
12ZFP Media
3,05 0,20 1,33 76,53 11,63 3,87
DEV EST (n=8)
0,11 0,02 0,04 0,39 0,33 0,06
3Nulo Media
3,30 0,25 1,31 74,34 13,18 3,94
Desv. Est (n=7)
0,17 0,02 0,10 1,04 0,86 0,25
3ZFP Media
2,93 0,18 1,30 74,10 13,62 4,14
Muestras
C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
DEV EST
(n=12)
0,12 0,01 0,08 1,80 1,45 0,25
6Nulo Media
3,77 0,38 2,02 73,46 12,42 3,66
Desv. Est (n=4)
0,15 0,08 0,14 2,80 2,44 0,66
6ZFP (n=1)
2,93 0,17 1,07 77,89 10,65 3,24
Tabla 8B: Analisis de acidos grasos C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0 y C24:1
Muestras
C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0 C24:1
12Nulo Media
0,53 1,26 0,05 0,33 0,02 0,14 0,14
Desv. Est (n=6)
0,03 0,07 0,01 0,04 0,01 0,02 0,02
12ZFP Media
0,55 1,37 0,06 0,36 0,02 0,15 0,16
DEV EST (n=8)
0,02 0,05 0,01 0,02 0,01 0,01 0,02
3Nulo Media
0,59 1,49 0,06 0,43 0,02 0,15 0,21
Desv. Est (n=7)
0,07 0,11 0,01 0,07 0,01 0,03 0,04
3ZFP Media
0,57 1,57 0,07 0,42 0,03 0,15 0,19
DEV EST (n=12)
0,04 0,21 0,02 0,07 0,01 0,04 0,04
6Nulo Media
0,80 1,49 0,07 0,54 0,03 0,30 0,24
Desv. Est (n=4)
0,08 0,13 0,01 0,08 0,01 0,07 0,02
6ZFP (n=1)
0,52 1,86 0,07 0,42 0,04 0,20 0,22
La Tabla 9 muestra los perfiles de acidos grasos totales basados en los acidos grasos individuals mostrados en las 5 Tablas8A y 8B.
Tabla 9
Muestras
C18 total* Total LC** Sat totales***
12 Nulo Media
93,06 95,52 5,83
Muestras
C18 total* Total LC** Sat totales***
DEV EST (n=6)
0,13 0,05 0,09
12ZFP Media
93,36 96,01 5,48
DEV EST (n=8)
0,11 0,13 0,09
3 Nulo Media
92,78 95,74 5,82
DEV EST (n=7)
0,39 0,17 0,32
3ZFP Media
93,16 96,14 5,41
DEV EST (n=12)
0,41 0,13 0,19
6 Nulo Media
91,55 95,01 7,47
DEV EST (n=4)
0,36 0,29 0,40
6ZFP (n=1)
92,85 96,18 5,17
*C18 total representa una suma de los siguientes carbonos:C18:0, C18:1, C18:2 y C18:3. **LC o cadena larga total representa una suma de los siguientes carbonos:C18 total + C20 total (C20:0 + C20:1 + C20:2) + C22 total (C22:0 + C22:1) + total C24 (C24:0 + C24:1) ***Sat totales representa todos los acidos grasos saturados mostrados en las Tablas 8A y 8B.
Combinando todos los acidos grasos de cadena larga (C18 total, C20 total, C22 total y C24 total), se observo un aumento de 0.4% a 1.2% en las plantas ZFP TF positivas de diferentes eventos en comparacion con las nulas hermanas. Entre los acidos grasos de cadena mas larga, se observo un aumento de C20:1 en un 25% en plantas 5 ZFP TF positivas para el evento 6. Tambien se observo una disminucion en el contenido de acidos grasos saturados totales en plantas que contienen ZFP TF en todos los eventos. Vario de una reduccion del 6% en el evento de 12 a 31% de reduccion en el evento 6.
En resumen, se ejemplifico la regulacion por aumento transcripcional mediada por ZFP TF del gen de p-cetoacil- ACP sintetasa II en plantas To y T1 y la disminucion concomitante del contenido de acidos grasos totales de C16 y 10 aumento de C18 en la semilla T2. Estos datos demuestran la aplicacion exitosa de nuevas tecnologfas ZFP TF para dirigir y modificar genes espedficos en la via de biosmtesis de acidos grasos, lo que produce cambios predichos en los perfiles de aceite de las semillas, que son heredables a traves de generaciones de progenie.
Ejemplos 8-15: Regulacion por aumento/Regulacion por disminucion
Los plastidos son el sitio principal para la biosmtesis de novo de acidos grasos en plantas superiores (Ohlrogge et 15 al., 1979, Proc Natl Acad Sci U S A 76:1194-8; Thelen and Ohlrogge, 2002, Metabolic Engineering 4:12-21). Los acidos grasos no utilizados en los plastidos se exportan al citoplasma a traves de la actividad espedfica de acil-ACP tioesterasas (FAT) mediante la hidrolizacion de las protemas portadoras de acil-acilo (acil-ACP) para liberar acidos grasos libres. Hay dos clases de enzimas FAT en plantas, FATA y FATB. La clase FATA prefiere 18:1-ACP in vitro mientras que la clase FATB prefiere los sustratos acil-ACP saturados, tales como 16:0-ACP y 18:0-ACP, pero 20 tambien muestra otra especificidad de sustrato heterogeneo Doermann et al, 1995, Arch. Biochem. Biophys. 316:612-618; Voelker et al., 1997, Plant Physiology 114:669-677; Salas and Ohlrogge, 2002, Archives of Biochemistry and Biophysics, 403:25-34). De modo similar a FATA, tambien se considera que FATB esta presente en todos los tejidos vegetales, pero se expresa predominantemente en semillas en desarrollo (Jha et al., 2006, Plant Physiology and Biochemistry 44:645-655).
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45
El genoma nuclear de Arabidopsis codifica dos genes FatA y un solo gen FatB. La inactivacion de la actividad de FatB puede disminuir drasticamente el contenido de acidos grasos saturados en glicerol^pidos. Por ejemplo, en una mutante FatB creado por la insercion de un ADN-T, el contenido de palmitato (16:0) y estearato (18:0) se redujo en un 42-56% y 30-50% respectivamente de acuerdo con el tejido (Buenaventura) et al., The Plant Cell, 2003 15:1020 - 1033). La tasa de crecimiento de la planta fue muy afectada en este mutante, lo que dio como resultado un 50% menos de peso fresco a las 4 semanas en comparacion con el tipo salvaje. Este hallazgo apoya la opinion de que FatB sirve como un factor importante que rige el destino de los acidos grasos saturados en las plantas.
El principal cultivo de semillas oleaginosas, Brassica napus, es una especie anfidiploide estrechamente relacionada con la especie modelo Arabidopsis, pero tiene un tamano del genoma aproximadamente ocho veces mayor que el de Arabidopsis. Como resultado, se informaron seis genes FatB en esta especie (documento WO 2009/007091) en comparacion con uno en Arabidopsis. Esta complejidad hace que sea diffcil comprender la funcion de los genes FatB individuales para su manipulacion. Por el contrario, la presencia de un mayor numero de genes hace que sea mas facil manipular la expresion de multiples genes hacia el objetivo de acidos grasos deseado en lugar de inactivar uno por completo. Se sabe que los factores de transcripcion de dedos de cinc se unen esencialmente a cualquier secuencia de ADN y modulan la funcion genica de los genes dirigidos (Van Eenennaam et al., Metab. Eng. 2004 6:101-108; Sanchez et al., 2006, Plant Biotechnology Journal 4:103-114). Como resultado, esta herramienta se puede aplicar a los genes FatB para comprender su funcion en B. napus. Este conocimiento puede ayudar a manipular la expresion de uno a multiples genes FatB hacia el aceite de semilla de canola "mas saludable" deseado que tenga menor contenido de acidos grasos saturados.
Los ejemplos 8-15 siguientes demuestran la regulacion por aumento transcripcional de los genes FatB en Brassica napus L. lo que produce cambios en el perfil de acidos grasos en las semillas.
Ejemplo 8: Identificacion de la secuencia blanco para genes FatB en Brassica napus L.
8.1 Identificacion de secuencia blanco
Se empleo un protocolo modificado de Genome Walking para descubrir y caracterizar las secuencias promotoras de los genes FatB de la variedad Nex710 de Brassica napus. Estas secuencias de nucleotidos se aislaron e identificaron para el diseno y la produccion de las ZFP TF, que se pueden usar para modificar la expresion genica del gen FatB. Se construyeron nueve bibliotecas Genome Walking usando el kit de Clontech Genome Walking (Palo Alto, CA). Estas bibliotecas se usaron para obtener ~ 1 kb de secuencia corriente arriba del sitio de inicio de la transcripcion para los genes FatB. Se diseno y sintetizo un par de cebadores directos espedficos de genes FatB anidados sobre la base de las secuencias EST FatB disponibles de bases de datos publicas. Se diseno y sintetizo un par de cebadores inversos anidados para hibridar con las secuencias adaptadoras. Se amplificaron multiples fragmentos de PCR de las nueve bibliotecas. Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron en vectores TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Y se secuenciaron para identificar las secuencias del promotor FatB. Se identificaron dos genes FatB diferentes, FatB4 y FatB, basados en este enfoque. Se observo que aunque las secuencias codificdoras de estos genes FatB estaban altamente conservadas, las secuencias divergfan en las regiones 5 'UTR y promotoras.
La expresion de FatB y la cuantificacion de los genes FatB4 y FatB a traves del analisis de RT-PCR cuantitativo en las semillas de B. napus en desarrollo sugirio que los genes estaban altamente expresados en la semilla de B. napus. El ARN total se aislo, se cuantifico y los sitios de iniciacion de la transcripcion se mapearon como se describio anteriormente en el Ejemplo 1. Las secuencias promotoras de estos dos genes se utilizaron para disenar ZFP TF para la modificacion de la expresion transcripcional.
Ejemplo 9: Diseno de dominios de union al ADN de ZFP espedficos para los genes FatB
Se disenaron protemas de dedos de cinc contra varios sitios blanco del gen FatB. Los sitios blanco y las helices de reconocimiento para los disenos de ZFP representativos se muestran a continuacion en las Tablas 10A y 10B.
Tabla 10A: Sitios de union blanco para ZFP TF de FatB
ZFP
Sitio blanco FatB4 (5' a 3') Sitio blanco FatB (5' a 3') Especificidad de FatB
13685*
aaCGAAAGgAGATCGAGAGAGg agagag (SEQ ID NO:47) Sin sitio de union FatB4
13714
Sin sitio de union cgAAAGGGAGATCGAGAGAG gcaccgca (SEQ ID NO:48) FatB
ZFP
Sitio blanco FatB4 (5' a 3') Sitio blanco FatB (5' a 3') Especificidad de FatB
13722
aaGG AG A AcTTT AGGGTTTGGgg agact (SEQ ID NO:49) aaGG AG A AfTTT AGGGTTTGG ggagact (SEQ ID NO;50) FatB4 y FatB
13743**
ctCCGAAGAGATTGGCGTAAcac ttcgt (SEQ IDNO:51) ctCCGAAGAGATTGGCGTAAc cttcatt (SEQ ID NO:52) FatB4 y FatB
Tabla 10B:Regiones de la helice de reconocimiento de ZFP
ZFP
sj *** 2 3 4 5 6
13685
RSDNLSA (SEQ ID NO:75) QSAHRKT (SEQ ID NO76) RSDDLSK (SEQ ID NO:21) QSSHRKT (SEQ ID NO:77) RSDHLSV (SEQ ID NO:78) QNAHRIE (SEQ ID NO:79)
13714
RSDNLSA (SEQ ID NO:75) QSAHRKT (SEQ ID NO:76) RSDDLSK (SEQ ID NO:21) QSSHRKT (SEQ ID NO:77) RSDHLSK (SEQ ID NO:80) QNANRIT (SEQ ID NO:81)
13722
RSDHLST (SEQ ID NO:82) HSNTRKN (SEQ ID NO:83) RSDHLSQ (SEQ ID NO:84) NSASRKN(SEQ ID NO:85) QSGNLAR (SEQ ID NO:16) QSGHLSR (SEQ ID NO:86)
13743
NSDSLTE (SEQ ID NO:87) RRADLSR (SEQ ID NO:88) RSDSLSA (SEQ ID NO:89) QNAHRKT (SEQ ID NO:90) RSDHLSQ (SEQ ID NO:84) RNADRIT (SEQ ID NO:91)
* Las letras mayusculas representan la secuencia de union de ZFP, mientras que las letras minusculas flanqueantes representan el contexto de la secuencia flanqueante para el sitio de union de ZFP TF. Las letras minusculas en cursiva entre las letras mayusculas representan las bases omitidas en el diseno de ZFP. ** La secuencia de union de ZFP es la misma entre FatB4 y FatB, pero la secuencia flanqueante 3' es diferente entre los dos genes. *** los numeros representan los dedos de cinc (1 es dedos 1, 2 es dedos 2, etc.)
Ejemplo 10: Regulacion por aumento mediada por ZFP TF de los genes de FatB nativos en B. napus
5 Para ejemplificar la-regulacion por aumento mediada por ZFP TF de FatB dentro de las celulas de B. napus, se construyeron constructos que contienen cuatro disenos de genes ZFP TF (Tablas 10 y 11), estos genes se administraron de forma estable en celulas de B. napus a traves de la transformacion mediada por Agrobacterium.
10.1 Diseno del constructo
Los plasmidos binarios ZFP TF disenados y construidos se enumeran en la Tabla 11 a continuacion. La expresion 10 de los genes ZFP TF fue dirigida por un promotor constitutivo relativamente fuerte, tal como un promotor derivado del promotor del virus del mosaico de las nervaduras de la yuca (CsVMV). La transformacion de la planta mediada por Agrobacterium se realizo como se describe en el Ejemplo 3.2 para incorporar de forma estable TF ZFP en el genoma de B. napus.
Tabla 11: Descripcion de ZFP TF dirigidas a los genes FatB de B. napus
S.N.
ZFP Constructo No. Casete del gen
1
13685 pDAB4689 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13685 VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
5
10
15
20
25
30
35
40
45
S.N.
ZFP Constructo No. Casete del gen
2
13714 pDAB4690 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13714-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
3
13722 pDAB4691 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13722-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
4
13743 pDAB4692 RB7 MAR/CsVMV/Op-2 NLS-ZFP 13743-VP16/AtuORF23 3' UTR/AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
pDAB4689 es un plasmido binario que contiene la secuencia de localizacion nuclear opaque-2 (Op-2) o los casetes de expresion del gen NLS /13685/ VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 (Region de union de la matriz (Thompson et al., 1997, WO9727207)) ::Promotor v2 CsVMV (Promotor del virus de mosaico de las nervaduras de la yuca (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)) ::NLS opaque-2 (Van Eenennaam et al., 2004, Metabolic Engineering 6:101-108; Holmes-Davis et al., 2005, Plant Molecular Biology 57:411-423)/13685 Dedos de cinc/VP16 (Jamieson et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 2006, 348:873-879) Fusion ::AtuORF23 3'UTR v1 (Marco de lectura abierto 23, region 3' no traducida de Agrobacterium tumefaciens (Gelvin et al., 1987, EP222493))::Promotor v2 AtUbi10 (Promotor de Ubiquitina-10 de Arabidopsis thaliana (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)) ::pat v5 (Fosfinotricina acetil Transferasa (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)) ::AtuORF 1 3'UTR v4 (Marco de lectura abierto 1, region 3' no traducida de Agrobacterium tumefaciens (Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)). El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion NLS opaque-2 /13685 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3912 por medio de los sitios de restriccion Ncol - Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8215 contema el casete de expresion del gen fusion de Promotor v2 CsVMV ::NLS opaque-2 /13685 Dedos de cincNP16 Fusion ::AtuORF23 3'UTR v1. pDAB8215 se clono en el binario pDAB4668 por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4689 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4690 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de NLS opaque-2/13714NP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; rB7 MAR v3 ::Promotor v2 CsVMV ::Fusion NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion del NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3912 por medio de los sitios de restriccion Ncol - Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8216 contema el casete de expresion del gen de Promotor v2 CsVMV :: Fusion de NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1. pDAB8216 se clono en el binario pAB4668 por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4690 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4691 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de NLS opaque-2/13722NP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; rB7 MAR v3 ::Promotor v2 CsVMV ::Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 (Fosfinotricina Acetil transferasa ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion de NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/VP16 en pDAB3912 por medio de los sitios de restriccion Ncol - Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8217 contema el casete del gen Promotor v2 CsVMV ::Fusion de NLS opaque-2 /13722 dedos de cincLS/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1. pDAB8217 se clono en el binario pDAB4668 por medio de una reaccion L-R Gateway (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4691 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAB4692 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de NLS opaque-2/13743/VP 16 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 (Region de union de la matriz ::Promotor v2 CsVMV ::Fusion NlS opaque-2/13743 Dedos de cinc/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 (Promotor de Ubiquitina-10 Arabidopsis thaliana ::pat v5 ::AtuORF 1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion de NLS opaque-2/13743 Dedos de cinc/VP16 en pDAB3912 por medio de los sitios de restriccion Ncol - Sacl. El constructo resultante que se marco como pDAB8218 contema el casete de expresion genica del Promotor v2 CsVMV ::NLS opaque-2 /13743 Dedos de cinc/VP16 ::AtuORF23 3'UTR v1. pDAB8218 se clono en el binario pDAB4668 por medio de una reaccion L-R Gateway (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAB4692 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ejemplo 11: Analisis de muestras de callo transformado
Las lmeas de callos de B. napus transgenicas se produjeron mediante la transformacion de cuatro constructos de ZFP TF, pDAB4689 - pDAB4692, y un constructo de control, pDAB8210, a traves de la transformacion de plantas mediada por Agrobacterium como se describe en el Ejemplo 3.2. El constructo de control, pDAB8210, estaba compuesta por un casete de expresion del gen pat (Promotor AtUbi10/pat/AtuORF 1 3 'UTR) y un casete ZFN no blanco (promotor CsVMV/ZFN/AtuORF23 3' UtR). Se extrajo el ARN total y se sintetizo ADNc de todas las lmeas como se describe en el Ejemplo 4.1. La unica modificacion del protocolo descriito anteriormente fue el uso de cebadores Oligo dT para cebar las reacciones de ADNc en lugar de hexameros aleatorios y la modificacion correspondiente de la reaccion de ADNc, segun las especificaciones del fabricante.
11.1 Analisis de expresion de ARNm de FatB4 y FatB
11.1.1 Ensayo PCR (qRT-PCR) de tiempo real cuantitativa FatB4 para B. napus
Se preparo una mezcla de PCR de la siguiente manera para la amplificacion de ADNc de FatB4:1,5 pL de tampon PCR 10X Hot Start (Qiagen, Valencia, USA), 1,2 pL de dNTP 10 mM, 1 pL de MgCh25 mM, 0,15 pL de Qiagen Hot Start Taq (5 U/pL), 0,5 pL de cebador zz143 FW del patron 10 pM (SEQ ID NO:53:CTTTGAACGCTTATCTTCCTC) (patron 10 pM), 0,5 pL de cebador REV FATB_R4 del patron 10 pM (SEQ ID NO:54:TTCCACAACATCTCCCCAAG), 0,25 pL de Sonda TaqMan MGB (Life Technologies, Carlsbad, California) FatB4_MGB_Probe_4 del patron de 5 pM (SEQ ID NO:55:FAM-CTCAGGCTCCACCC), 1,5 pL de PVP-40 10% (p/v)), y H2O a 13,5 yL por reaccion. Los cuadrantes apropiados de una microplaca de 384 pocillos se demarcaron y se cargaron con 13,5 pl de mezcla maestra por pocillo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la placa. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3,000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. A continuacion, se anadieron 1,5 pl de las primeras cadenas de ADNc sintetizado diluido y descongelado a posillos apropiados, seguido por la adicion de 1,5 pL de estandares de ADNc de plasmido desde la concentracion mas baja a mas alta de ADN en los pocillos de control. Finalmente, se fijo firmemente una lamina de sellado a la placa y se centrifugo. El programa de PCR se corrio en el sistema PCR de tiempo real LIGHTCICLOR® 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), usando el siguiente programa:1) activar 95 °C durante 15 minutos; 2) desnaturalizar 95 °C durante 20-30 segundos (@ 4,8°C/segundos); 3) aparear 60 °C durante 20-30 segundos (@ 2,5°C/segundos); 4) adquirir 72°C durante 45-60 segundos (@ 4,8°C/segundos); repetir etapa 2) -- 4), 39-49 veces mas; 5) enfriar a 38°C durante 5 segundos para detener la reaccion.
El amplicon de FatB4 tema 678 bp de tamano. Esta secuencia abarca un intron de 79 pb basado en la secuencia genomica. Ademas, el cebador inverso se diseno para que abarcara un intron, de este modo se favorece la amplificacion espedfica de solo ADNc de FatB4, asf se elimina la amplificacion del ADN genomico.
11.1.2 Ensayo de qRT-PCR de FatB para B. napus
Se preparo una mezcla de PCR de la siguiente manera para la amplificacion de ADNc de FatB:1,5 pL de tampon PCR 10X Hot Start (Qiagen, Valencia, USA), 1,2 pL de dNTP 10 mM, 1 pL de MgCh25 mM, 0,15 pL de Qiagen Hot Start Taq (5U/pl), 0,5 pL de cebador FW zz145 de patron de 10 pM (SEQ ID
NO:56:CTTTGAAAGCTCATCTTCCTC), 0,5 pL de cebador REV FATB_R4 del patron de 10 pM (SEQ ID NO; 57:TTCCACAACATCTCCCCAAG), 0,25 pL de Sonda TaqMan MGB (Life technologies, Carlsbad, California) FatB_MGB_Probe_1 del patron de 5 pM (SEQ ID NO:58:FAM-AACCTTCATCCTCCCA), 1,5 pL de PVP-40 10% (p/v)), y H2O a 13,5 pL por reaccion. El ensayo restante y las especificaciones del ciclo pCr fueron como se describio para el ensayo de qRT-PCR FatB4 en el Ejemplo 11.1.1.
El amplicon producido tema 678 bp de tamano. Esta secuencia de ADNc abarca un intron de 76 pb basado en la secuencia genomica. Ademas, el cebador inverso se diseno para que abarcara un intron, de este modo se favorece la amplificacion espedfica de FatB, asf se elimina la amplificacion del ADN genomico.
11.2 Analisis de expresion de ARNm de tubulina
Este ensayo se completo como se describe en el Ejemplo 4.3.
11.3 Analisis de expresion de ARNm de ZFP TF
Se completo el analisis de ARNm de ZFP TF de la muestra de T0 como en el Ejemplo 4.4. El tamano de amplicon en este ensayo fue menor de 1 Kb de acuerdo con el tamano de ZFP en cada uno de los disenos. La cuantificacion de la expresion de ZFP TF de la planta T0 se realizo con un ensayo basado en el dominio de activacion de VP16 de la siguiente manera. Se preparo una mezcla de qRT-PCR VP16 como sigue para la amplificacion de cDNA de ZFP TF:7,5 pl de tampon 2X LIGHTCICLOR® 480 Probes Master (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 0,3 pL de cebador VP16_UPL_F1 del patron de 10 pM (SEQ ID NO:59:TCGATCTTGATATGTTGGGAGA), 0,3 pL de VP16_UPL_R1 del patron de 10 pM (SEQ ID NO:60:AGGTGCAGAATCATGTGGTG), 0,15 pL de UPL Probe#85 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 1,5 pL de PVP-40 10% (p/v)), y H2O a 13,65 pL. Los cuadrantes apropiados de una microplaca de 384 pocillos se demarcaron y se cargaron con 13,5 pl de mezcla maestra por pocillo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la placa. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. Se anadieron primeras cadenas de ADNc sintetizado diluido y descongelado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
A 1,5 |jL, seguido por la adicion de 1,5 jL estandares de ADNc plasirndico de las concentraciones mas bajas a mas altas en los pocillos control. Se fijo firmemente una lamina de sellado a la placa y se centrifugo. Se corrio un programa de PCR en un sistema de PCR tiempo real LIGHTCICLOR® 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) usando las siguientes condiciones:1) activar 95°C durante 5 minutos; 2) desnaturalizar 95°C durante 10 segundos (@ 4,8°C/segundos); 3) aparear/extender 60°C durante 25 segundos (@ 2,5°C/segundos); 4) adquirir 72°C durante 1 segundos (@ 4,8°C/segundos); 5) repetir las etapas 2-4, 39-49 veces mas. Finalmente, la reaccion se enfrio a 38 °C durante 5 segundos para detener la reaccion.
El tamano del amplicon VP16 fue 68 bp, este tamano de fragmento corresponde al fragmento VP16 que se esperaba fuera producido por la amplificacion de PCR.
11.4 Analisis de expresion de las muestra de callo
Las lmeas de callos transgenicos que crecen en la seleccion de HERBIACE® se analizaron para determinar los niveles de expresion de FatB4, FatB, tubulina y ZFP TF mediante qRT-PCR. El gen de tubulina sirvio como un gen de referencia para normalizar la expresion de los niveles de ARNm de FatB4, FatB y ZFP TF. Se calcularon las relaciones FatB4/tubulina y FatB/tubulina para normalizar las expresiones de ARNm. Los resultados mostraron una regulacion por aumento estadfsticamente significativa de ARNm de FatB4 y ARNm de FatB para los disenos de constructo pDAB4691 (p = 0,005; Fig. 9). Las lmeas de callos pDAB4692 mostraron una tendencia a la regulacion por aumento en el ARNm de FatB4 y FatB, pero la tendencia no fue estadfsticamente significativa. Las lmeas de callos pDAB4689 tambien se analizaron en un experimento separado, que mostro una tendencia de regulacion por aumento, pero no fue estadfsticamente significativa (datos no mostrados). Las lmeas celulares de control no amplificaron un amplicon espedfico de ZFP TF, lo que confirma que el ensayo de ZFP TF era espedfico para las lmeas que expresaban solo ZFP TF.
Ejemplo 12: Analisis de expresion de las muestras de plantas T0 transgenicas
12.1 Ensayo para actina de B. napus para uso como un control interno para qRT-PCR
El ARN total se extrajo y se sintetizo el ADNc de todas las lmeas como se describe en el Ejemplo 11. Se preparo una mezcla de PCR de la siguiente manera para la amplificacion de ADNc de actina (Bo Yang et al., 2007, Plant Science 173:156-171; gen de actina Genbank acceso n°. AF111812):7,5 jL de tampon 2X LIGHTCICLOR® 480 SYBR Green I Master, 0,3 jL de cebador BN_Actin_F del patron de 10 jM (SEQ ID NO:61:ACGAGCTACCTGACGGACAAG), 0,3 jL de BN_Actin_R del patron de 10 jM (SEQ ID NO:62:GAGCGACGGCTGGAAGAGTA), 1,5 jL de PVP-40 10% (p/v)), y q/s con H2O a 13,5 jL. Los cuadrantes apropiados de una microplaca de 384 pocillos se demarcaron y se cargaron con 13,5 pl de mezcla maestra por pocillo. Una lamina de sellado se unio suavemente a la placa. La placa se centrifugo durante 1 minuto a 3000 rpm en una centnfuga de microplacas Qiagen. Se anadieron primeras cadenas de ADNc sintetizado diluido y descongelado. at1,5 jL, seguido por la adicion de 1,5 jL estandares de ADNc de las concentraciones bajas a altas en los pocillos control. Se fijo firmemente una lamina de sellado a la placa y se centrifugo. Se corrio un programa de PCR en un sistema de PCR tiempo real LIGHTCICLOR® 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) usando las siguientes condiciones:1) activar 95°C durante 10 minutos; 2) desnaturalizar 95°C durante 10 segundos (@ 4,8°C/segundos); 3) aparear/extender 60°C durante 20 segundos (@ 2,5°C/segundos); 4) adquirir 72°C durante 20 segundos (@ 4,8°C/segundos); 5) repetir las etapas 2-4, 39-49 mas veces. Finalmente, la reaccion se enfrio a 38°C durante 5 segundos para detener la reaccion. El amplicon producido fue de 80 bp de tamano.
12.2 Analisis de expresion de ARNm de FatB4 y FatB
Las plantas de B. napus que se habfan transformado con pDAB4689-pDAB4691 se analizaron para determinar la expresion de ARNm aumentada de FatB4 y FatB. Ademas, se usaron dos tipos de controles. Un control no transgenico que consiste en plantas Nex710 sirvio como control negativo. Tambien se analizo un segundo control transgenico de plantas de B. napus Nex710 que se habfan transformado con pDAB8210. El diseno del constructo pDAB8210 consistio en dos casetes de expresion genica. El casete de expresion del gen pat (Promotor AtUbi10 ::gen ZFN ::AtuORF23 3' UTR). No se esperaba que el ZFN expresado en pDAB8210 se uniera y escindiera el genoma de las plantas de B. napus Nex710 y no debena alterar el fenotipo de estas plantas.
Los callos transgenicos putativos que crecen en la seleccion de HERBIACE® se regeneraron en plantas (Ejemplo 3.3). Se recogieron muestras de hojas de las plantas de 6 hojas B. napus que crecen en el invernadero para el analisis de expresion de ARNm. Seis perforaciones de hoja de cada planta se aislaron y se colocaron en hielo antes de la extraccion de ARN. El ARN total se extrajo utilizando el kit QIAGEN RNEASY. La smtesis de ADNc y las diluciones posteriores se completaron como se describe en el Ejemplo 11. El protocolo de analisis de expresion para FatB4 y FatB mediante QRT-PCR se describio anteriormente. El analisis de expresion de ZFP TF fue mas/menos con el ensayo. El ensayo qRT-PCR del gen de referencia de actina se describe anteriormente.
La expresion de la hoja T0 para los genes FatB4 y FatB vario entre los constructos (Fig. 10). La regulacion por aumento mas alta de ARNm de FatB4 y FatB se observo en eventos de plantas transgenicas pDAB4691 que produjo un aumento general de 2,0 - 2,5 veces en expresiones de ARNm en comparacion con controles no transgenicos Nex710 y transgenicos pDAB8210. La expresion de ambos genes fue estadfsticamente significativa (por debajo de p
= 0.05) en comparacion con los controles. Por lo tanto, se continuo la caracterizacion adicional de los constructos con pDAB4691.
Ejemplo 13: Analisis de las plantas Ti transgenicas
13.1 Analisis de acido graso de semilla Ti
5 Se observo una diferencia significativa en el contenido de C18:0 entre la semilla de contenido de aceite "bajo" y "alto" del evento pDAB4691-003-049.1 ("evento 49") (Tabla 12). El contenido de C18:0 de la semilla de la categona "Bajo" fue similar al de las lmeas Nex710 (control no transgenico) y pDAB8210 (control transgenico). El contenido de C18:0 en la semilla "Alto" se correlaciono con la expresion de ZFP TF que dio como resultado la regulacion por aumento de los genes de FatB. Algunos aumentos en C20:0, C22:0 y C24:0 tambien se observaron sobre la base 10 del flujo de C18:0 en acidos grasos de cadena mas larga. El contenido de C16:0 en la semilla individual no parecio cambiar dentro de ninguna de las categonas "Bajo" o "Alto". Este resultado es indicativo del hecho de que pDAB4691 ZFP TF se une y regula por aumento los genes FatB espedficos para reacciones enzimaticas C18:0- ACP a C18:0 en lugar de las reacciones C16:0-ACP a C16:0 (vease Ejemplo 1, Fig. 1).
Tabla 12: Perfil de acidos grasos de las semillas T1 individuales con analisis FAME
Muestras*
Sat totales C16:0 C16:1 C18:0 C20:0 C22:0 C24:0
Evento 49 Bajo
6,35 4,11 0,48 1,45 0,46 0,21 0,07
Evento 49 Bajo
6,35 3,70 0,35 1,62 0,58 0,30 0,12
Evento 49 Bajo
6,49 3,64 0,36 1,66 0,62 0,32 0,18
Evento 49 Alto
7,50 3,55 0,42 2,59 0,80 0,34 0,17
Evento 49 Alto
7,74 3,63 0,45 2,59 0,88 0,38 0,22
Evento 49 Alto
7,93 3,67 0,47 2,82 0,86 0,38 0,17
Evento 49 Media (n=24)
6,90 3,70 0,40 2,03 0,67 0,31 0,15
Evento 49 Desv. Est (n=24)
0,51 0,14 0,05 0,37 0,10 0,04 0,03
Nex710 Media (n=24)
6,47 3,70 0,45 1,79 0,57 0,26 0,11
Nex710 Desv. Est (n=24)
0,35 0,24 0,06 0,17 0,06 0,04 0,03
8210 Media (n=150)
6,27 3,51 0,34 1,63 0,61 0,33 0,14
8210 Desv. Est(n=150)
0,40 0,24 0,07 0,25 0,08 0,05 0,04
* El analisis de acidos grasos se realizo en 24 semillas individuales T1 del evento 49 y Nex710, y 144 semillas de pDAB8210 compuesto por 6 eventos. Las categonas "Bajo" y "Alto" representan el contenido de FA espedfico de la semilla individual cuando se clasifican segun el contenido C18:0.
15
13.2 Analisis de presencia de ZFP TF en las plantas T1
Se plantaron 100 semillas T1 del evento 49 en el invernadero. Noventa y siete plantas germinaron en plantulas. Se estimo el numero de copias de ZFP TF usando un ensayo qRT-PCR de pat como se describe en el Ejemplo 6.2 para material vegetal aislado de la etapa de 2-4 hojas. El evento 49 conterna multiples inserciones (~ 3 inserciones) y 0-7
gen pat, y por lo tanto ZFP TF, las copias se segregaron en la poblacion Ti. Solo se identifico una planta nula de la poblacion Ti.
13.3 Regulacion por aumento de ARNM de FatB4 y FatB en las plantas Ti
El analisis de expresion del gen de FatB nativo se realizo en las 97 plantas de la poblacion Ti segregante. Las 5 plantas Nex710 no transgenicas que se plantaron al mismo tiempo se incluyeron en el estudio como controles. Se recogieron perforaciones de seis hojas por planta y se colocaron en hielo hasta que se pudo completar la extraccion de ARN. El ARN total se extrajo utilizando el kit QIAGEN RNEASY. La smtesis de ADNc y las diluciones posteriores se completaron como se describe en el Ejemplo 11. El analisis de expresion de FatB4, FatB, tubulina y VP16 (ZFP TF) se realizo como se describio anteriormente.
10 El analisis estadfstico de las relaciones de FatB4/FatB y tubulina mostro tendencias lineales significativas con la expresion de tubulina (Fig. 11) lo que indica que los aumentos en FatB4/FatB no teman una relacion 1:1 con aumentos en el control endogeno, tubulina. Como tal, las relaciones no se usaron en este analisis, y la tubulina se incluyo como una covariable en los modelos de expresion de FatB4/FatB. Para eliminar cualquier colinealidad entre tubulina y VP16 (ZFP TF), las matrices de incidencia para las ecuaciones del modelo se ortogonalizaron.
15
El siguiente modelo se ajusto a todos los conjuntos de datos en el estudio actual: donde el estadoi es el estado transgenico de yyk (transgenico o nulo/control);
= estado . + VP16 transgenico * + eijk
VP16 transgenico* es una regresion lineal en VP16 anidado dentro de lmeas transgenicas; y eijk es el residuo 20 aleatorio. Debido que hubo tres mediciones repetidas para cada muestra, se utilizo una estructura residual correlacionada:
imagen1
#t
<p
Donde In es la matriz de identidad con rango igual al numero de muestras y 0 es la correlacion entre los residuos de las mediciones repetidas.
25 Los resultados del analisis para el evento 49 detectaron una regulacion por aumento significativa en FatB4 con regresiones anidadas de la expresion de FatB4 en VP16 que muestran pendientes positivas altamente significativas (Fig. 12, Tabla 13). Para FatB, las regresiones anidadas mostraron pendientes positivas para la regulacion por aumento, y la pendiente fue estadfsticamente significativa. Para los eventos de regulacion por aumento se debe tener en cuenta que las plantas transformadas y de control no proveman de la misma lmea, por lo que podna haber 30 cierta confusion entre los efectos de la lmea y la transformacion.
Tabla 13: Resultados para los eventos de regulacion por aumento
Evento
Gen EfectoA Solucion Valor p
4691-3-049,001
FatB4 Transformado-control 10331,11 <0,00001
VP16 transformado*
0,764E-05 <0,00001
FatB
Transformado-control 5084,09 <0,00001
VP16 transformado*
0,308E-05 <0,00001
ATransformado-control = la diferencia en la expresion de la media de mmimos cuadrados entre las lmeas transformadas y las lmeas que no portan transgenes. VP16 Transformado* = regresion de la expresion de FatB4/FatB en la expresion de VP16 anidada en lmeas transgenicass.
5
10
15
20
25
30
35
40
Las plantas Ti del Evento 49 se clasificaron luego sobre la base de las relaciones de expresion de FatB4/tubulina y luego de FatB/tubulina para encontrar las plantas de mayor expresion para el avance a la generacion de T2 en el invernadero. Ocho de las plantas de FatB4 de mayor expresion se seleccionaron para el avance hasta la madurez. Seis de estas plantas tambien fueron las de mayor expresion para FatB. El numero de copias de ZFP TF en estas plantas de mayor expresion vario de 2 a 4 copias, mientras que el numero de copias que se segrego en la progenie de Ti entera fue de 0 a 7 copias. Para las plantas de control, una planta nula de las plantas del evento 49 y diez plantas control Nex710 tambien avanzaron a la madurez para la recoleccion de semillas T2.
13.4 Analisis de acidos grasos de las semillas T2
El analisis de acidos grasos (FA) se realizo en un granel de 24 semillas de todas las plantas como se describe en el Ejemplo 6.1. El perfil de FA de una planta nula se combino con diez plantas de control Nex710 para los calculos de perfil de FA control. En promedio, se observo un aumento del 12% en el contenido de C18:0 para el evento 49 en comparacion con el de Nex710 (Tablas 14A y 14B). Este aumento fue estadfsticamente significativo a p = 0.05 (Fig. 13). Los FA de cadena larga, tal como C20:0, C22:0 y C24:0, tambien mostraron algunos aumentos que llevan al aumento en el contenido de FA saturados totales en un 5%. Debido a que la enzima FatB cataliza la conversion de FA libre C18:0 ACP en C18:0, se acumulara mas C18:0 como resultado de la regulacion por aumento transcripcional de FatB4 y FatB (Fig. 1). El pDAB4691 (Ejemplo 6, Tablas 1 y 2), es espedfico tanto para los genes FatB4 como para FatB, lo que dio como resultado un cambio significativo en el perfil FA (Tablas 14A y 14B).
Tabla 14A: Perfil de acidos grasos (C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2 y C18:3) de las muestras del evento 49 transgenico y Nex710 control
S.N.
Planta ID Sat totales C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
1
4691-3-049 (8) 6,42 3,47 0,24 1,61 76,32 11,20 3,52
2
Nexera710 (11) 6,11 3,40 0,23 1,44 76,26 11,25 3,76
Los numeros entre parentesis de la columna 2 representan numeros de plantas analizadas.
Tabla 14B: Perfil de acidos grasos (C20:0, C20:1, C20:2, C22:0, C22:1, C24:0, C24:1) de las muestras del evento 49 transgenico y Nex710 control
S.N.
Planta ID Sat totales C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0 C24:1
1
4691-3-049 (8) 6,42 0,66 1,39 0,05 0,43 0,02 0,21 0,18
2
Nexera710 (11) 6,11 0,61 1,43 0,06 0,41 0,02 0,20 0,17
Los numeros entre parentesis de la columna 2 representan numeros de plantas analizadas.
No se observaron cambios significativos en el contenido total de C16 con la regulacion por aumento genica de FatB4 y FatB nativos. Es probable que la catalisis de C16:0-ACP a C16:0 ocurra con otros genes FatB pero no con FatB4 y FatB, los blancos ejemplificados para la regulacion por aumento usando el diseno pDAB4691 ZFP TF (Fig. 1).
El contenido de C16:0 de la semilla individual no parecio cambiar en las categonas "Bajo" y "Alto" de semilla T1 (Tabla 12), lo que indica que el diseno pDAB4691 ZFP TF se une mas espedficamente al gen FatB para la reaccion enzimatica C18:0 -ACP a C18:0 en lugar de la reaccion C16:0-ACP a C16:0 (Fig. 1).
Se debe observar que la regulacion por aumento de los genes de (3-cetoacil-ACP sintetasa II nativa (Ejemplos 1-6) inducidos por ZFP TF produjo diferentes cambios en el perfil de FA en comparacion con las regulaciones por aumento del gen de FatB4 y FatB nativo. Por ejemplo, la regulacion por aumento del gen de p-cetoacil-ACP sintetasa II provoco una reduccion estadfsticamente significativa en los contenidos de C16:0 y C16:1 y un aumento concomitante en el contenido total de C18 en comparacion con sus segregantes nulos (Ejemplo 6, Fig. 6, Tablas 5 y 8). Comparativamente, la regulacion por aumento de los genes de FatB mediada por ZFP-TF provoco aumentos estadfsticamente significativos en el contenido de C18:0 pero ningun cambio aparente en el contenido de C16:0 (Fig. 14). De nuevo, estos cambios en los perfiles FA a traves de la regulacion por aumento mediada por ZFP TF de los genes de (3-cetoacil-ACP sintetasa II y FatB coinciden segun la via de biosrntesis de FA (Fig. 1).
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 14: Disenos de constructos ZFP TF para la transformacion de plantas
Se disenaron y construyeron cuatro constructos para la regulacion por disminucion transcripcional de los genes FatB en B. napus L (Tabla 15). Los mejores disenos de ZFP de regulacion por aumento de FatB, 13722 y 13714, se emplearon para la demostracion de la regulacion por disminucion regulacion por disminucion de FatB (Ejemplos 9 - 13). Estos disenos de ZFP se fusionaron a una senal de localizacion nuclear opaque-2 y un dominio de represion que consiste en KRAB1 (Hanna-Rose and Hansen, 1996, Trends in Genetics, 12:229-234) o NtERF3 (Ohta et al., The Plant Cell, 2001, 13:1959-1968), para construir ZFP TF funcionales. Todas las ZFP TF se expresaron bajo promotores espedficos de semilla; se usaron el promotor de protema de transferencia lipidica Arabidopsis thaliana (promotor AtLTP170) (Genbank ID:NC_003076) o el promotor de U-Faseolina de Phaseolus vulgaris (promotor PvPhas) (Patente U.S:N° 5.591.605).
Tabla 15: Detalles del constructo de ZFP TF para la regulacion por disminucion dirigida de los genes de FatB
S.N.
Diseno de ZFP Constructo No. Casetes genicos
1
13722 pDAS5203 AtLTP170/Op-2* NLS-ZFP-13722-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
2
13714 pDAS5204 AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13714-KRAB1/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
3
13722 pDAS5212 PvPhas/Op-2-NLS-ZFP13722-KRAB1/Phas 3' UTR//AtUbilO/Pat/AtuORF1 3' UTR
4
13722 pDAS5227 AtLTP170/Op-2 NLS-ZFP-13722-NtERF3/ORF23 3' UTR//AtUbi10/Pat/AtuORF1 3' UTR
* Op-2 = Senala de localizacion nuclear Opaque-2
pDAS5203 es un plasmido binario que contema los casetes de expresion genicos NLS opaque-2 /13722/KRAB1 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opague-2 /13722 dedos de cincLS/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 ::AtuORF1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/KRAB1 en un vector donante Gateway. El constructo resultante contema el casete de expresion genica Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1. Este constructo se clono en un plasmido binario por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAS5203 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAS5204 es un plasmido binario que contema los casetes de expresion genicos NLS opaque-2/13714/KRAB1 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 ::AtuORF1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la Fusion NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/KRAB1 en un vector donante Gateway. El constructo resultante contema el casete de expresion genica Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opaque-2/13714 Dedos de cinc/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1. Este constructo se clono en un plasmido binario por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAS5204 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAS5212 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica NLS opaque-2/13722/KRAB1 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; Promotor PvPhas ::Fusion nLs opaque-2/13722 dedos de cincLS/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 ::AtuORF1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene la Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/KRAB1 en un vector donante Gateway. El constructo resultante contema el casete de expresion genica de Promotor PvPhas ::Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/KRAB1 ::AtuORF23 3'UTR v1. Este constructo se clono en un plasmido binario por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAS5212 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
pDAS5227 es un plasmido binario que contiene los casetes de expresion genica de NLS opaque-2/13722/NtERF3 y pat. Este constructo incluye los siguientes elementos genicos; RB7 MAR v3 ::Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/NtERF3 ::AtuORF23 3'UTR v1 ::Promotor v2 AtUbi10 ::pat v5 ::AtuORF1 3'UTR v4. El plasmido binario se construyo mediante la clonacion de un fragmento de ADN que contiene el casete de expresion genica NLS opaque-2/13722 dedos de cincLS/NtERF3 en un vector donante Gateway. El constructo
resultante contema el casete de expresion genica Promotor 170 AtLTP ::Fusion NLS opaque-2/13722 dedos de cinc LS/NtERF3::AtuORF23 3'UTR v1. Este constructo se clono en un plasmido binario por medio de una reaccion L-R Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta reaccion produjo pDAS5227 y se confirmo mediante digestiones con enzimas de restriccion y reacciones de secuenciacion.
5 Los constructos se transformaron de manera estable en la variedad Nex710 de B. napus mediante transformacion mediada por Agrobacterium de explantes de hipocotilo (Ejemplo 3.2 - 3.3). Las plantas que crecen en el invernadero se autopolinizaron y las semillas Ti se recolectaron cuatro meses despues del trasplante.
Ejemplo 15: Analisis de semilla Ti transgenica para 4 constructos de ZFP TF
Las semillas Ti se obtuvieron a partir de eventos transgenicos (lmeas) 8, 20, 37 y 15 de los constructos pDAS5203, 10 pDAS5204, pDAS5212 y pDAS5227, respectivamente. Se usaron cinco semillas de plantas Nex710 como controles.
El analisis de FA se realizo en 24 semillas individuales de cada uno de los eventos transgenicos de T1, como se describio anteriormente en el Ejemplo 6.1, para identificar primero el constructo ZFP TF que altera mas efectivamente el perfil de FA.
15.1 Analisis de acidos grasos (FA) de las semillas T1
15 Los constructos pDAS5203, pDAS5212 y pDAS5227 produjeron eventos transgenicos con los perfiles de FA saturados totales mas bajos en comparacion con el Nex710 control (Tabla 16). Las diferencias de pares entre cada uno de los dos eventos del constructo, pDAS5203 y pDAS5212, y el Nex710 control fueron significativas (p = <0.005). Sin embargo, la diferencia entre pares de pDAS5227 exhibio una fuerte tendencia (p = 0.06). Uno de los eventos de pDAS5203 contema el contenido de FA saturada total mas bajo de 5.3% (no mostrado) en comparacion 20 con un promedio de 6.38% en el Nex710 control. Esta es una reduccion del 17% en los FA saturados totales.
Tabla 16A: Perfil de FA de semillas T1 de multiples eventos transgenicos del constructo
Constructo No.
Tipo de analisis Sat totales C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
pDAS5212
Media (n=37)* 6,00 0,05 3,60 0,24 1,38 75,88 12,24 3,41
pDAS5212
Desv. Est (n=37) 0,21 0,01 0,20 0,02 0,14 1,36 1,03 0,41
pDAS5212
valor p** 0,01 0,07 0,89 0,47 <0,0001 0,39 0,37 0,94
pDAS5204
Promedio (n=20) 6,26 0,05 3,52 0,25 1,65 76,33 11,52 3,58
pDAS5204
Desv. Est (n=20) 0,29 0,01 0,15 0,02 0,16 0,78 0,66 0,30
pDAS5204
valor p 0,43 0,72 0,52 0,69 0,32 0,16 0,04 0,34
pDAS5203
Promedio (n=8) 5,98 0,05 3,68 0,26 1,33 75,32 12,74 3,55
pDAS5203
Desv. Est (n=8) 0,36 0,01 0,25 0,05 0,13 1,76 1,31 0,47
pDAS5203
valor p 0,02 0,06 0,45 0,96 0,0001 0,96 0,98 0,49
Constructo No.
Tipo de analisis Sat totales C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
pDAS5227
Promedio (n=15) 6,09 0,03 3,63 0,32 1,32 75,43 12,32 3,73
pDAS5227
Desv. Est (n=15) 0,35 0,00 0,29 0,09 0,12 1,69 1,36 0,37
pDAS5227
valor p 0,07 0,002 0,69 0,012 <0,0001 0,84 0,48 0,1
Nex710
Promedio (n=5) 6,38 0,04 3,59 0,26 1,73 75,28 12,76 3,40
Nex710
Desv. Est (n=5) 0,61 0,01 0,15 0,03 0,49 3,00 2,76 0,43
* Los numeros entre parentesis muestran el numero de eventos incluidos en el analisis.
** valor de p igual o menor de 0,05 se considero estad^sticamente significativo y se calculo con el software JMP.
Tabla 16B: Perfil de FA de semillas Ti de multiples eventos transgenicos del constructo
Constructo No.
Tipo de analisis Sat totales C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
pDAS5212
Media (n=37)* 6,00 0,54 1,33 0,06 0,30 0,13 0,08
pDAS5212
Desv. Est (n=37) 0,21 0,04 0,11 0,01 0,03 0,05 0,04
pDAS5212
valor p** 0,01 0,03 0,003 0,14 0,76 0,26 0,23
pDAS5204
Promedio (n=20) 6,26 0,59 1,20 0,05 0,32 0,13 0,11
pDAS5204
Desv. Est (n=20) 0,29 0,06 0,17 0,01 0,05 0,05 0,03
pDAS5204
valor p 0,43 0,79 0,20 0,87 0,68 0,29 0,63
pDAS5203
Promedio (n=8) 5,98 0,51 1,28 0,05 0,29 0,12 0,11
pDAS5203
Desv. Est (n=8) 0,36 0,03 0,15 0,01 0,02 0,01 0,05
pDAS5203
valor p 0,02 0,006 0,048 0,42 0,56 0,55 0,84
5
10
15
20
25
Constructo No.
Tipo de analisis Sat totales C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
pDAS5227
Promedio (n=15) 6,09 0,56 1,39 0,06 0,39 0,15 0,16
pDAS5227
Desv. Est (n=15) 0,35 0,07 0,23 0,01 0,10 0,08 0,05
pDAS5227
valor p 0,07 0,21 0,0005 0,066 0,008 0,081 0,004
Nex710
Promedio (n=5) 6,38 0,60 1,10 0,05 0,31 0,11 0,10
Nex710
Desv. Est (n=5) 0,61 0,13 0,09 0,01 0,07 0,05 0,08
* Los numeros entre parentesis muestran el numero de eventos incluidos en el analisis. ** valor de p igual o menor de 0,05 se considero estadfsticamente significativo y se calculo con el software JMP.
Los perfiles FA espedficos de los eventos pDAS5203, pDAS5212 y pDAS5227 dieron como resultado una reduccion del 21-25% en C18:0 en comparacion con Nex710 (Fig. 15A). Todas estas diferencias fueron estad^sticamente significativas en o por debajo de p = 0,001 (Tabla 16). Otros Fa de cadena larga, C20:0, C22:0 y C24:0 tambien mostraron disminuciones en la concentracion. Sin embargo, no se observaron cambios en el contenido de C16:0, lo que da como resultado un aumento significativo en el contenido de C16:0/C18:0 en los tres eventos transgenicos del constructo (Fig. 165B).
El perfil de FA de la semilla transgenica pDAS5227 mostro una diferencia clara en comparacion con pDAS5203 y pDAS5212. Se observo una reduccion de 23% en el contenido de C14:0 (p = 0,002) y un aumento de 19% en C16:1 (p = 0,01) en semillas pDAS5227 en comparacion con Nex710 (Fig. 16A y B, Tabla 16). El diseno de ZFP TF pDAS5227 es identico al de pDAS5203 y pDAS5212 excepto por la presencia de un dominio de regulacion por disminucion ERF3 fusionado a ZFP en lugar de un dominio KRAB1 (Tabla 15).
Un diseno de ZFP diferente, 13714, presente en pDAS5204 no fue tan efectivo en la reduccion de C18:0 en comparacion con el diseno de 13722 (Tabla 16). A diferencia del diseno 13722 que se une tanto a los genes FatB4 como a FatB, el diseno 13714 se une solo al gen FatB (Ejemplo 9, Tabla 10B).
15.2 Identificacion de plantas para el analisis de ARNm
Dos eventos transgenicos, 5212 [1] -004 y 5227 [4] -012, que se produjeron por transformacion con los constructos pDAS5212 y pDAS5227, respectivamente, se seleccionaron para el analisis de regulacion por disminucion transcripcional de FatB. Cincuenta a cien semillas T1 se sembraron en el invernadero y las plantas se cultivaron. Se recogieron cuatro perforaciones de hoja de las plantas en la etapa de 2-3 hojas. Este material vegetal se analizo para determinar el numero de copias de ZFP TF usando un ensayo qRT-PCR de pat (Ejemplo 6.2). Luego seleccionaron plantas aleatorias de ZFP nula y ZFP positiva para el avance hasta la madurez para recoger la semilla de T2 (Tabla 17). Las vainas inmaduras de las mismas plantas se recogieron 25 dfas despues de la floracion (DAF) para el analisis de ARNm de FatB. Ambos eventos se segregaron como una sola copia. Estos eventos se etiquetaron como 5212-4 y 5227-12.
Tabla 17: Pruebas del evento transgenico para la identificacion de plantas ZFP positivas y nulas.
Nombre del evento
Semilla/planta T1 Planta N° Copia N° #Plantas a T2
5212-004
Semilla plantada 50
Semilla germinada
49
5
10
15
20
25
Nombre del evento
Semilla/planta T1 Planta N° Copia N° #Plantas a T2
Pruebas para el numero de copias de pat
17 Nula 5
26
1 copia 3
5
2 copia 4
1
NT*
Prueba Chi
0,04
5227-12
Semilla plantada 100
Semilla germinada
96
Pruebas para el numero de copias de pat
19 Nula 4
32
1 copia 3
27
2 copia 4
18
NT*
Prueba Chi
0,034
*NT = No analizado
15.3 Extraccion de ARN y desarrollo del ensayo qRT-PCR
Se aislo ARN de semilla de Brassica inmadura con el kit de planta RNAEASY® obtenido de Qiagen (Valencia, CA). Las semillas se colocaron en tubos cluster que contiene tampon RLT (Qiagen)/p-mercaptoetanol (BME) y un microesfera de acero inoxidable. Las muestras se colocaron en una gradilla de tubos cluster y se homogenizaron a 500 golpes por minuto durante 5 minutos en un molino de microesferas (Kleco, Visalia, CA). La gradilla de tubos se giro 180 grados y se homogenizo durante 5 minutos adicionales. Las muestras se transfirieron luego a tubos Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron durante 5 minutos a 20.000 x g y el sobrenadante se transfirio a un tubo nuevo. El ARN se aislo como se describe en el protocolo del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). El ARN se eluyo de las columnas con 50 ul de agua libre de ARNasa y las muestras de ARN se cuantificaron con un NanoDrop 8000 por Thermo Scientific (Wilmington, DE).
Se trataron de diez a veinte microgramos del ARN con ADNasa libre ADN libre TURBO (numero de catalogo AM1907; Applied Biosystems, Foster City, CA) ADNasa en tubos de 1,5 ml libres de ARNasa/ADNasa para eliminar el ADN genomico. Para cada muestra de ARN se preparo una reaccion de cincuenta microlitros que contiene ARN, tampon 1X de ADNasa y 2 unidades de TURBO ADNasa. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Se anadieron cinco microlitros (5 jl) de reactivo de inactivacion de ADNasa a cada tubo y se mezclaron. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante tres minutos, se mezclaron de nuevo y se incubaron a temperatura ambiente durante dos minutos adicionales. Las muestras se centrifugaron a 20,000xg durante cinco minutos. Se extrajeron cuarenta microlitros (40 jl) del sobrenadante mientras se dejaba atras la suspension de inactivacion de ADNasa. Cada muestra tratada con ADNasa se cuantifico con el Nanodrop de manera que se puedan usar cantidades equivalentes de ARN para la smtesis de ADNc.
Se preparo ADN complementario (ADNc) para cada muestra de ARN usando el kit de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA). Brevemente, se usaron 1,5 jg de ARN como molde en una reaccion de cincuenta microlitros que contiene tampon de transcripcion inversa 1x, 1X dNTPs, 1X oligomeros aleatorios y 125 unidades de transcriptasa inversa Multiscribe. Adicionalmente, se prepararon reacciones de control noRT para cada una usando 1,5 |jg de ARN tratado con ADNasa en las mismas condiciones que anteriormente sin la transcriptasa inversa Multiscribe. Todas las muestras se incubaron a 25 °C durante 10 minutos, a 37 °C durante 2 horas, a 85 °C durante 5 minutos y a toda la noche a 4 °C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los cebadores y las sondas se disenaron con el software Primer Express 3 de Applied Biosystems (Foster City, CA) para FATB, KASII, ERF3, KRAB1 y Tubulina. Los cebadores se sintetizaron por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Las siguientes son las secuencias para los cebadores:
SEQ ID NO:63:FATB fwd - 5' TCGCTGCCATAACAACCATTT 3';
SEQ ID NO:64:FATB rev - 5' CGCCTGGGTTTCCAGTCA 3';
SEQ ID NO:65:KRAB1 fwd - 5' AAGGATGTGTTCGTGGATTTCA 3';
SEQ ID NO:66:KRAB rev - 5' CACAATCTGCTGTGCAGTATCAAG 3';
SEQ ID NO:67:ERF3 fwd - 5' GCGGGCGGGAGTTGTTA 3';
SEQ ID NO:68:ERF3 rev - 5' CCCCATCGGCGTTACATG 3';
SEQ ID NO:69:TUBULINA fwd - 5' GAAGCTGAGAACAGCGATTGC 3';
SEQ NO:70:TUBULINA rev - 5' GTTCCTCCTCCCAACGAATG 3'.
Las sondas fuero 6FAM/MGB sintetizadas por Applied Biosystems (Foster City, CA):
SEQ ID NO:71:FATB sonda 6FAM TTTCTCAGCCGCCA;
SEQ ID NO:72:KRAB1 sonda 6FAM TAGGGAAGAGTGGAAGCT;
SEQ ID NO:73:ERF3 sonda 6FAM CAGGCCTCAGCCTT; y
SEQ ID NO:74:TUBULINA sonda 6FAM TACAAGGTTTCCAAGTTT.
La expresion genica de FatB, ERF3, KRAB1 y tubulina se evaluo mediante PCR en tiempo real con Applied Biosystem 7900HT (Foster City, CA). Se preparo una curva estandar usando alfcuotas de varias muestras de ADNc dentro de los diferentes grupos para establecer el rango dinamico y la eficacia del ensayo. Se realizaron diluciones seriadas 1:5 y 1:4 posteriores de la dilucion inicial. Cada muestra de ADNc se diluyo 1:50 con Tris 10 mM, pH 7,5. Las reacciones de PCR se prepararon en un volumen de veinte microlitros que contiene mezcla maestra de Expresion Genica 1X (Applied Biosystems; Foster City, CA), 0,8 pM de cebadores directos e inversos, 0,2 pM de sonda 6FAM/MGB espedfica del gen y 4 microlitros de ADNc diluido. Todas las reacciones se realizaron bajo las siguientes condiciones en Applied Biosystem 7900HT con software SDS version 2.4:Etapa 1) 50 °C durante 2 minutos; Etapa 2) 95 °C durante 10 minutos; Etapa 3) a 95 °C durante 15 segundos, y; Etapa 4) a 60 °C durante 1 minuto. Los etapas 3 y 4 se repitieron durante 39 ciclos adicionales. La expresion del gen de tubulina se evaluo en cada placa, mientras que FatB, ERF3 y KRAB1 se corrieron por separado. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.
Las curvas estandar se evaluaron para la regresion y los valores de pendiente y umbral se ajustaron segun sea necesario. Las muestras noRT (menos controles de transcriptasa inversa que conteman ARN con todos los componentes de reaccion de ADNc, excepto la transcriptasa inversa) se compararon con las muestras correspondientes para garantizar que existia una diferencia de Ct de 5 a 7. Los datos se importaron a Excel para su analisis. El valor de la cantidad promedio de FatB, ERF3 y KRAB1 se normalizo a la cantidad promedio de tubulina y se informo como relaciones de expresion de FatB y tubulina.
15.4 Analisis de regulacion por disminucion de ARNm de FatB espedfico de semilla en semillas inmaduras
Los resultados mostraron que la regulacion por disminucion del ARNm de FatB 25 dfas despues de la floracion (DAF) en la semilla inmadura dependfa del estado de cigosidad de las plantas T1. Por ejemplo, no se observo regulacion por disminucion aparente del ARNm de FatB en las plantas heterocigotas (1 copia) de semilla inmadura 5227-12 (Fig. 17). Sin embargo, cuando la expresion de ZFP tF aumento a 2 veces en las plantas homocigotas (2 copias), se observo una reduccion de 21% en la expresion de ARNm de FatB (p = 0,025). Se obtuvieron resultados similares en otro evento, 5212-4, de un constructo diferente, pDAS5212. En este evento, nuevamente, no se observo una regulacion por disminucion de FatB aparente en las plantas heterocigotas (Fig. 18). Sin embargo, se observo una reduccion de 15% en los transcriptos de FatB en las plantas homocigotas cuando aumento la expresion de TF ZFP.
Las plantas nulas, heterocigotas y homocigotas de ambos eventos avanzaron a madurez y se determino el perfil de FA en una mezcla de 24 semillas de cada planta. Este proceso de segregacion de linajes nulos de los linajes que contienen ZFP TF permitio diferencias de perfil de FA que reflejaban mas estrechamente la presencia de ZFP TF.
15.4 Analisis del perfil de FA en semillas maduras T2
Los perfiles de FA de la semilla madura T2 variaron de acuerdo con la cigosidad de ZFP TF de la planta original T1 para el evento 5227-12 (Tablas 18A y 18B). Aunque las plantas T1 heterocigotas T1 no exhibieron ninguna
regulacion por disminucion del ARNm de FatB aparente en 25 semillas DAF inmaduras, su perfil FA de semilla exhibio una reduccion de 8% en el contenido de C18:0. No se observo una disminucion significativa en el contenido de C16:0. Ademas, se observaron aumentos menores en C18:1 (oleico) y posteriores FA corriente abajo, lo que da da como resultado una reduccion global de 5,5% en los FA saturados totales (Tablas 18A y 18B, Fig. 19). Cuando 5 las plantas Ti 5227-12 fueron homocigotas para ZFP TF, el ARNm de FatB se regulo por disminucion significativamente. El perfil FA de estas semillas T2 fue diferente. Se observo un aumento del 11% en el contenido de C16:1 que produce una reduccion del 2,7% en la FA saturada total (Tablas 18A y 18B). Sin embargo, no se observo una reduccion adicional en C18:0 en comparacion con las plantas heterocigotas. Estos cambios coincidieron con el perfil FA de la semilla madura T1 (Ejemplo 15.1).
10 Tabla 18A:Perfil de FA indicado de semillas maduras T2 del evento 5227-12
Planta ID
Copia # Sat totales C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 (Oleico) C18:1 (vaccenico) C18 total:1 C18:2 C18:3
5227-12 (n=4)
Media 0 7,21 0,05 4,00 0,28 2,06 71,47 5,27 76,74 10,92 3,22
5227-12 Est (n=4)
Desv. 0 0,21 0,01 0,09 0,02 0,10 0,56 0,29 0,62 0,29 0,34
5227-12 (n=3)
Media 1 6,84 0,05 3,82 0,25 1,88 71,99 4,88 76,87 11,03 3,33
5227-12 Est (n=3)
Desv. 1 0,33 0,01 0,33 0,03 0,04 0,50 0,19 0,32 0,05 0,31
5227-12 (n=4)
Media 2 7,00 0,05 3,96 0,30 1,91 70,99 5,09 76,08 11,62 3,30
5227-12 Est (n=4)
Desv. 2 0,29 0,00 0,47 0,03 0,40 1,50 0,25 1,44 1,21 0,26
Tabla 18B:Perfil de FA de semillas maduras T2 del evento 5227-12
Planta ID
Numero de copia Sat totales C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C24:0 C24:1
5227-12 Media (n=4)
0 7,21 0,64 1,01 0,04 0,27 0,13 0,09
5227-12 Desv. Est (n=4)
0 0,21 0,03 0,02 0,01 0,01 0,03 0,01
5227-12 Media (n=3)
1 6,84 0,62 1,07 0,04 0,28 0,12 0,09
5227-12 Desv. Est (n=3)
1 0,33 0,02 0,11 0,00 0,03 0,02 0,01
5227-12 Media (n=4)
2 7,00 0,62 1,06 0,04 0,27 0,12 0,08
5227-12 Desv. Est (n=4)
2 0,29 0,09 0,03 0,01 0,03 0,03 0,01
Se obtuvieron resultados similares en los perfiles de FA de la semilla madura T2 del evento 5212-4. En semillas de 15 plantas heterocigotas, se observo una reduccion del 5,5% en el contenido de C18:0, lo que produce una reduccion de FA saturados totales de 3,2% (Tabla 18, Fig. 20). Tambien se observo un aumento menor en C18:1; de lo contrario, las concentraciones de los FA restantes mostraron reducciones menores. Las plantas homocigotas no mostraron una reduccion mas alta en el contenido de C18:0 en comparacion con la de las plantas hemicigotas a pesar de una regulacion por disminucion significativa del ARNm de FatB.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una protema de fusion que comprende un dominio funcional, que es un dominio regulador transcripcional o un dominio de escision y una protema de dedos de cinc natural, que comprende las regiones de helice de reconocimiento mostradas en una fila unica de la Tabla 1, donde la protema de fusion modula la expresion de al menos un gen de 13-cetoacil-ACP sintetasa (KAS) endogeno.
  2. 2. La protema de fusion de la reivindicacion 1, en la que el gen KAS esta contenido dentro de una planta de Brassica.
  3. 3. La protema de fusion de la reivindicacion 1 o 2, en la que la protema de dedos de cinc se une a un sitio blanco como se muestra en la Tabla 2.
  4. 4. Un polinucleotido que codifica una o mas protemas de dedos de cinc o protemas de fusion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. Un procedimiento de modificacion de uno o mas genes involucrados en la biosmtesis de acidos grasos en una celula de planta, el procedimiento que comprende:
    introducir, en la celula de planta, uno o mas vector de expresion que comprende al menos un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4, en condiciones tales que la una o mas protemas de dedos de cinc, que comprenden las regiones de la helice de reconocimiento mostradas en una fila unica de la Tabla 1, se expresan y se modifica la expresion de uno o mas genes de KAS.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la modificacion comprende la modulacion de la expresion de al menos un gen KAS.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que se activa la expresion de al menos un gen KAS.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que se reprime la expresion de al menos un gen KAS.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que el polinucleotido codifica una nucleasa de dedos de cinc y al menos se escinde un gen de KAS.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 9, que ademas comprende la etapa de introducir un vector donante de modo que el vector donante se introduce en el sitio de escision por recombinacion homologo.
  11. 11. Una celula de planta que comprende una o mas protemas de fusion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o uno o mas polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 4 y que comprende al menos un gen que se ha modificado de cualquiera de los procedimientos de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
  12. 12. La celula de planta de la reivindicacion 11, en la que se modifica el contenido de acido graso dentro de la celula de planta.
  13. 13. Una planta que comprende al menos una celula de acuerdo con la reivindicacion 11 o 12.
  14. 14. La semilla o progenie de una planta de acuerdo con la reivindicacion 13, que comprende una o mas protemas de fusion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o uno o mas polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 4.
  15. 15. Una planta que comprende al menos una celula que comprende la protema de fusion de las reivindicaciones 1 a 3 o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4.
  16. 16. La semilla o progenie de una planta de acuerdo con la reivindicacion 15, que comprende una o mas protemas de fusion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o uno o mas polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 4.
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