CN112375129B

CN112375129B - Ssip1小肽在提高种子和花器官大小中的应用

Info

Publication number: CN112375129B
Application number: CN202011285673.8A
Authority: CN
Inventors: 李晓云; 盘诗雨
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112375129A

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用，本发明涉及一种源于拟南芥天然功能小肽(基因ID号AT2G36440，命名为SSIP1)的潜在应用，该小肽目前在烟草、花生、甘薯、胡萝卜中发现有其同系物，但在玉米和水稻中并没有发现，动物细胞中也未见其同系物，过表达该小肽，可以使种子和花器官显著增大，对提高作物产量和增大观赏花卉花瓣具有潜在的应用价值。

Description

SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用。

背景技术

小肽(small peptide)，泛指在长度上少于100个氨基酸的肽段，也有人定义为5-60个氨基酸长度。小肽从来源上可以分成3类：原前体蛋白加工；独立的小ORF(开放阅读框)直接翻译；编码正常蛋白的5’端或3’端UTR上的小ORF直接翻译。小肽作为信号分子，发挥作用的位置及其合成的部位可以相同也可以距离很远。小肽具有物种特异性和环境诱导性，发挥生理功能的浓度很低，外源施加不会对环境构成风险。

植物小肽总体上可分为两类：分泌型和非分泌型,分泌型小肽又分为翻译后修饰小肽和富含半胱氨酸小肽(形成分子内二硫键)。植物小肽参与了细胞增殖、根系发育,花粉育性、抵御病虫害等生物学过程。如番茄中首次报道了植物源的第一个功能小肽-系统素(systemin)，其参与了调控番茄对病虫害引起的伤害反应。番茄病程相关蛋白1(PR-1b)C端的小肽CAPE1，可以显著诱导抗病反应。拟南芥小肽CLV3(CLAVATA3)调控茎尖干细胞的数目。拟南芥IMA1小肽参与对铁的吸收。拟南芥小肽EPF1可以降低气孔密度。拟南芥C端编码小肽1(CEP1)调控侧根发育。

从系统素在植物系统中被首次报道以来，陆续报道了多种参与植物生长发育和环境适应的小肽，但动物中鉴定到的小肽数量远远大于植物中鉴定的数量，极大限制了植物小肽的开发应用。拟南芥基因组分析揭示植物比动物含有10倍以上可能的肽转运蛋白和受体，推测植物应该比动物含有更多的小肽，但它们的功能尚待挖掘。

SSIP1小肽来源于拟南芥，在拟南芥中单一拷贝，全长74个氨基酸，相对分子质量为8.9KD，目前其功能及是否存在受体尚不清楚。研究表明，在芥菜，胡萝卜，甘薯，花生等双子叶植物中发现有SSIP1的同源基因，但单子叶水稻和玉米中没有发现其同系物。故其在玉米和水稻等单子叶的育种、观赏花卉培养中具有潜在的应用价值。

目前，尚未有关于利用SSIP1提高种子和花器官大小的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用，经研究发现，通过过表达SSIP1小肽可以显著增大种子和花器官，对于提高作物产量和增大观赏花卉花瓣具有潜在的应用价值。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用。

优选地，所述种子和花器官包括但不限于拟南芥植物的种子和花器官。

本发明涉及源于拟南芥植物的小肽(基因ID号AT2G36440，命名为SSIP1)，其CDS序列和蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明经研究发现，过表达SSIP1可以促使种子和花朵增大，由于在油菜，胡萝卜，甘薯，花生等双子叶植物中发现有SSIP1的同源基因，而单子叶水稻和玉米中没有发现其同系物，故SSIP1在玉米和水稻等单子叶的育种及观赏花卉培养中具有潜在的应用价值。

本发明还提供了一种提高种子和花器官方法，即将SSIP1基因转化到受体表达菌中，然后用转化后的受体表达菌浸染植物花苞，获得SSIP1过表达的植株即可。

优选地，所述受体表达菌包括但不限于农杆菌。

作为本发明实施例的一个优选实施方式，上述的一种提高种子和花器官方法包括以下步骤：

S1、构建SSIP1表达载体；

S2、SSIP1表达载体转化农杆菌；

S3、采用菌液浸染花苞的方法使转化后的农杆菌介导转化植物，获得SSIP1过表达的植株。

优选地，所述SSIP1表达载体搭建有抗性基因。

进一步的，所述抗性基因包括但不限于除草剂抗性基因bar。

优选地，所述SSIP1表达载体搭建有标记基因，方便SSIP1过表达的植株的筛选。

进一步的，所述标记基因包括但不限于GFP标签。GFP是一种标签蛋白，可以通过荧光进行植株的筛选。

通过在SSIP1表达载体上同时搭建抗性基因和标记基因，可以结合使用抗性筛选和标记筛选两种方法对植株进行双重筛选，使筛选结果更精确，避免假阳性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明涉及一种源于拟南芥天然功能小肽(基因ID号AT2G36440，命名为SSIP1)的潜在应用，该小肽目前在烟草、花生、甘薯、胡萝卜中发现有其同系物，但在玉米和水稻中并没有发现，动物细胞中也未见其同系物，过表达该小肽，可以使种子和花器官显著增大，对提高作物产量和增大观赏花卉花瓣具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为p35S:GFP-SSIP1植株的种子及花器官形态。

图中：野生型，SSIP1突变体，SSIP1过表达植株(p35S:GFP-SSIP1植株)的花器官为长日照条件(16h光照，8h黑暗)下培养30d后的体视显微镜观察和拍照图；各种子为吸胀12h后的体视显微镜观察和拍照图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1 SSIP1小肽对种子和花器官大小的影响

(1)p35S(启动子):GFP(绿色荧光蛋白)-SSIP1表达载体的构建

采用Trizol法提取14d日龄大小的拟南芥叶片总RNA，以1μg RNA为模板，按照TaKaRa Prime Script RT reagent kit with DNA Eraser试剂盒的说明书反转录合成cDNA。以拟南芥cDNA为模板，设计引物对SSIP1的CDS序列进行PCR扩增，上游引物SSIP1-F:5′-AAGCTTGATATCGAATTCATGAGCGGCAAAACATCG-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物SSIP1-R:5′-TTATCTAGAACTAGTGGATCCTTATTTCTTCTGTTCGTCATCTTCT-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。采用同源重组的方法构建载体，按如下反应体系加入目的片段与pGreen0229IT载体进行连接反应(37℃，30min)，反应体系如下：5×CEⅡBuffer 4μL，酶切pGreen0229IT载体X ng，目的片段Yng，ExnaseⅡ2μL，超纯水加至20μL，最适克隆载体使用量X＝(0.02×克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol)，最适插入片段使用量Y＝(0.04×片段碱基对数)ng(0.06pmol)，载体和插入片段摩尔比为1：2。将10μL重组产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上放置30min，42℃热击1min 30s，冰上继续放置5min，加入LB液体培养基，37℃、160rpm振荡培养2-3h，10000rpm常温离心2min，丢弃上清900μL，将剩余大肠杆菌转化液涂布在含氨苄青霉素(50mg/L)的LB平板上，经菌落PCR验证为阳性的克隆，进行测序鉴定，挑取测序正确的重组质粒p35S:GFP-SSIP1备用。

(2)p35S:GFP-SSIP1表达载体转化农杆菌

将测序正确的重组质粒p35S:GFP-SSIP1加入到农杆菌GV3101感受态细胞，冰上放置30min，液氮速冻1min，37℃解冻1-2min，加入1mL含利福平(50mg/L)、庆大霉素(25mg/L)和四环素(5mg/L)的YEP培养基，28℃，110rpm振荡培养1-5h，2000rpm、4℃离心2min，收集100μL农杆菌转化液，涂布在含利福平(50mg/L)、庆大霉素(25mg/L)、四环素(5mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP平板上，28℃培养24-36h，待长出单菌落，挑取进行PCR鉴定，得到重组菌p35S:GFP-SSIP1(GV3101)，-80℃保菌备用。

(3)p35S:GFP-SSIP1农杆菌介导转化拟南芥

将10μL重组菌p35S:GFP-SSIP1(GV3101)接种于1mLYEP液体培养基(50mg/L利福平，25mg/L庆大霉素，5mg/L四环素，50mg/L卡那霉素)中，28℃、160rpm振荡培养12-24h，按1∶50的比例将菌液转接入100mLYEP液体培养基(50mg/L利福平，25mg/L庆大霉素，5mg/L四环素，50mg/L卡那霉素)中，扩培培养8-9h至OD₆₀₀为0.8左右。将菌液分装到50mL离心管，3000rpm离心10min收集菌体，用农杆菌转化渗透液(30μL表面活性剂+5g蔗糖+100mL超纯水)重悬菌体。

采用菌液浸染花苞的方法，首先将拟南芥(Col)的荚果和已开的花剪掉，剩下的花蕾浸入带有p35S:GFP-SSIP1的农杆菌GV3101悬浮液中，轻轻搅动1min，用吸水纸吸干叶片和茎上的残留液体，然后平放植物，黑色布覆盖，放在22℃培养室中培养2d后，揭开黑色布，[当新一批花苞产生(约7-14d)时，可再进行一次转化]，转化后正置培养生长约1-2月后，收种干燥备用。

(4)p35S:GFP-SSIP1拟南芥植株的筛选

收取T1代经p35S:GFP-SSIP1转化的拟南芥种子，点种于湿润泥炭土上，置于长日照条件(16h光照，8h黑暗)进行培养，待长出绿苗后，可喷施除草剂(pGreen0229IT载体带有除草剂抗性基因bar)，隔7-14d喷，最多3次，在除草剂选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化拟南芥植株死亡，转化的由于有抗性，可继续存活，之后可将绿色幼苗移至新的穴盘中进行光培养，待幼苗长至抽薹时可取叶片提取DNA进行PCR鉴定,上游引物35S-F：5′-GACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTC-3′,下游引物SSIP1-R:5′-TTATCTAGAACTAGTGGATCCTTATTTCTTCTGTTCGTCATCTTCT-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，单株收取T2代PCR鉴定正确的种子，用75％酒精对种子进行消毒1min，再用100％酒精消毒1min，均匀撒在1/2MS固体培养基上，4℃避光层积处理2d，置于长日照条件(16h光照，8h黑暗)进行培养，通过正置荧光显微镜对光培养5d的p35S:GFP-SSIP1幼苗的GFP荧光进行观察，将带有GFP荧光的幼苗移栽至湿润泥炭土上进行光培养。重复进行以上步骤，直至筛选出喷施除草剂后全部可继续存活并带有GFP荧光的绿色幼苗，即为p35S:GFP-SSIP1纯合体。

(5)p35S:GFP-SSIP1植株的种子及花器官形态

以花期野生型植株、SSIP1突变体植株为对照,通过体式显微镜对SSIP1过表达植物(p35S:GFP-SSIP1植株)的种子及花器官形态进行观察(图1)，发现SSIP1可以增加花器官及种子的大小，对提高农作物的产量或增大观赏花卉花瓣具有潜在的应用价值。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用

<140> 2020110712898

<141> 2020-10-09

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> SSIP1的CDS序列(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgagcggca aaacatcgat cactagcagg tcagacgaat ttcaaaggca gatagatcat 60

aaagagatgc ctcgagatca ccaaattgaa aggcacactc atattcacac gacgcgttac 120

cgagggggca gtctagttga ggaggtcatc gagaagcttg agagattcaa agtacgtacg 180

gttaacatct tggtgggagg agaagatgac gaacagaaga aataa 225

<210> 2

<211> 74

<212> PRT

<213> SSIP1的蛋白序列(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Ser Gly Lys Thr Ser Ile Thr Ser Arg Ser Asp Glu Phe Gln Arg

1 5 10 15

Gln Ile Asp His Lys Glu Met Pro Arg Asp His Gln Ile Glu Arg His

20 25 30

Thr His Ile His Thr Thr Arg Tyr Arg Gly Gly Ser Leu Val Glu Glu

35 40 45

Val Ile Glu Lys Leu Glu Arg Phe Lys Val Arg Thr Val Asn Ile Leu

50 55 60

Val Gly Gly Glu Asp Asp Glu Gln Lys Lys

65 70

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> SSIP1-F(人工序列)

<400> 3

aagcttgata tcgaattcat gagcggcaaa acatcg 36

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> SSIP1-R(人工序列)

<400> 4

ttatctagaa ctagtggatc cttatttctt ctgttcgtca tcttct 46

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 35S-F(人工序列)

<400> 5

gacccttcct ctatataagg aagttc 26

Claims

1.SSIP1小肽在提高种子和花器官大小中的应用，其特征在于，所述SSIP1小肽的CDS序列和蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述种子和花器官为拟南芥植物的种子和花器官。

2.一种提高种子和花器官方法，其特征在于，将权利要求1所述SSIP1小肽的基因转化到受体表达菌中，然后用转化后的受体表达菌浸染植物花苞，获得SSIP1过表达的植株即可。

3.根据权利要求2所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，所述受体表达菌包括农杆菌。

4.根据权利要求3所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建SSIP1表达载体；

S2、SSIP1表达载体转化农杆菌；

5.根据权利要求4所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，所述SSIP1表达载体搭建有抗性基因。

6.根据权利要求5所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，所述抗性基因包括除草剂抗性基因bar。

7.根据权利要求4所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，所述SSIP1表达载体搭建有标记基因。

8.根据权利要求7所述的一种提高种子和花器官方法，其特征在于，所述标记基因包括GFP。