CN111020015A - 一种快速检测花生真假杂种的方法 - Google Patents

一种快速检测花生真假杂种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了快速检测花生真假杂种的方法，包括以下步骤，1)DNA的提取、2)PCR扩增和扩增产物进行电泳；3)扩增产物进行电泳并进行条带比对，判断是否为真假杂种。本发明的方法操作简单、便捷，操作过程无需液氮研磨等，检测方法的稳定性和可靠性高。

Description

一种快速检测花生真假杂种的方法
技术领域
本发明涉及农业育种技术领域，具体涉及一种快速检测花生真假杂种的方法。
背景技术
花生是严格的自花授粉作物，通过人工操作可以进行杂交制种，但成功率不高，容易产生假杂种。过往对花生杂种的真伪鉴别主要依靠田间表型观察，当花生品种形态表型差异较小时，不容易区分，通过形态表型鉴别杂种真伪难较大。
近年来，DNA分子标记，如RFLP、RADP、AFLP和SSR等技术开发，在水稻，棉花、油菜等作物有广泛应用。对花生栽培种而言，由于其较低的DNA多态性，育种家们利用SSR鉴别花生F1代假杂种。要快捷准确地进行杂种真伪鉴别，除了借助选择合适的DNA标记外，还必须建立一套快速的实验检测体系。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测花生真假杂种的方法，该方法提供一种快速、简易提取DNA并进行扩增的方法，可快速判定花生是否为真假杂种。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种快速检测花生真假杂种的方法，包括以下步骤：
1)DNA的提取：取花生嫩叶，研磨，加入提取缓冲液混匀，用滤纸条粘取提取液后将滤纸放入洗涤缓冲液洗涤；所述提取缓冲液为含有MEDTA、PVP、NaCl、Tween-20的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液为含有MEDTA、Tween-20的Tris缓冲液；
2)PCR扩增：将洗涤后的液体加入PCR扩增液进行扩增，PCR扩增液包括Taq酶、预混物和特异性SSR引物；
3)PCR扩增产物进行电泳，若含父本特异性带型则为真杂种，否则为假杂种。
该方法通过用离心管快速提取叶片中DNA的方式，进行扩增后比对条带带型，以迅速判断花生是否为真假杂种。该提取缓冲液中，通过加入PVP的方式，使与多酚结合形成复合物，有效避免多酚类化合物介导的DNA降解；Tween-20和NaCl共同作用，以加速花生叶片中的DNA释放；EDTA可以使DNA酶失活，有利于提取完整的DNA；洗涤缓冲液中的Tween-20可以提高洗涤质量，同时也助于Taq酶的稳定性，增加PCR扩增成功率和稳定性。
本方法相对于传统的DNA试剂盒的提取方法，耗时更短、费用更低廉，取样条件更简单，相对于以往1个小时以上的提取时间，可以缩短至1min内，比碱煮法20分钟的提取时间也缩短了不少，可以快速检测花生的真假杂种。本发明的研磨过程也无需液氮，也不用对人体有害酚-氯仿抽提，对实验人员无伤害。
本方法中，含父本特异性带型是通过比对父本的PCR扩增产物的条带信息与母本的PCR扩增产物的条带信息而得出的，选用具有较高清晰度、前后无干扰的带型作为特异性条带，特异性SSR引物的扩增片段长为200-300bp。
步骤1)中，花生叶片研磨时间为15-30s。
进一步地，步骤1)中，使用1-2mL的离心管，取花生嫩叶0.01-0.05g，加入1/3-1/2离心管体积的提取缓冲液。
进一步地，步骤1)中，滤纸的宽度为1-3mm，浸入长度为10-15mm。
进一步地，步骤1)中，所述提取缓冲液为含有10mM EDTA、500mM NaCl、3％PVP、1％Tween-20的100mM Tris(pH＝8.0)缓冲液。
进一步地，所述洗涤缓冲液为含有1mMEDTA，0.1％Tween-20的10mM Tris(pH＝8.0)缓冲液。
进一步地，PCR扩增液为25μL体系，包括：0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、12.5μL2XPCRmix和补足25μL的ddH2O。PCR扩增程序为95℃，2min，95℃30s 58℃30s 72℃90s循环30次72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定。
进一步地，所述特异性SSR引物为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
进一步地，所述特异性SSR引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
进一步地，所述特异性SSR引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种简化的快速检测花生真假杂的方法，该方法能有非常实验时间、非常简陋的实验条件和非常低廉的成本下快速判定花生是否为真假杂种，具有非常高的稳定性和准确性；
本发明提供的快速检测花生真假杂的方法操作方便，实验过程对人体无豁，不需要液氮等苛刻实验条件。
附图说明
图1为DNA的提取操作示意图；
图2为花生叶片fad2基因的克隆电泳结果图；
图3为实施例2的电泳结果图；
图4为实施例3的电泳结果图；
图5为实施例4的电泳结果图。
具体实施方式
下面，结合附图和具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
以下具体实施方式中，所采用的滤纸为双圈牌定性滤纸。
提取缓冲液的配制：取EDTA、NaCl、Tween-20和三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液加水溶解，配制成含有10mM EDTA、500mM NaCl、3％PVP、1％Tween-20的100mMTris(pH8.0)的缓冲液。
洗涤缓冲液的配制，取EDTA、Tween-20和三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液加水溶解，配制成含有1mM EDTA、0.1％Tween-20的100mMTris(pH8.0)的缓冲液。
实施例1：
花生叶片fad2基因的克隆，包括以下步骤：
1)取花生叶片0.01-0.05g放入1.5mL的离心管中，研磨15s，加入500μL提取缓冲液，混合12s，剪取一片滤纸(滤纸尺寸2mm×60mm、浸入长10mm)，在混合后的提取缓冲液液体中沾1s，然后放入200μL洗涤缓冲液中，洗涤3s，然后取出滤纸；DNA的提取示意图如图1所示；
2)将洗涤缓冲液与PCR扩增液混合，即可上机扩增；PCR扩增液包括0.5μL如SEQ IDNo.7所示的fad2上游引物、0.5μL如SEQ ID No.8所示的fad2下游引物、12.5μL 2×PCRmix和补足25μL的ddH2O；并以滤纸浸入提取缓冲液30s后将滤纸放入PCR扩增液中为对比；
fad2上游引物：ACACAACAATGGGAGCTGGA；
fad2下游引物：ATGGCAAATCCACACACACA；
3)PCR程序：95℃，2min，95℃30s 58℃30s 72℃90s循环30次72℃延伸10min；
4)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。图2中，泳道M为DL2000marker；泳道+为阳性对照；泳道1为滤纸浸入提取缓冲液后放入PCR扩增液中的对比；泳道2为洗涤缓冲液与PCR扩增液的扩增产物的结果。
由图1可知，采用在提取缓冲液中洗沾取后再泡入洗涤缓冲液中，对花生fad2基因的扩增量，与使用普通的滤纸浸入提取缓冲液中后进行PCR扩增的相当，使前者操作更加简便，受干扰更小。
实施例2：
一种真假杂种的检测方法，母本为紫狮(高不饱和脂肪酸材料)父本为粤油91(低不饱和脂肪酸材料)，包括以下步骤：
1)取杂交后代F1的嫩叶0.01-0.05g，放入1.5mL的离心管中，研磨15秒，加入500μL提取缓冲液，混合12秒，剪取一片滤纸(滤纸尺寸2mm×60mm,浸入长10mm)，在提取缓冲液中沾一下2秒，然后放入200μL洗涤缓冲液中，洗涤3秒，然后取出滤纸片；
2)将洗涤缓冲液与PCR扩增液混合，上机扩增；PCR扩增液包括0.5μL如SEQ IDNo.1所示的上游引物、0.5μL如SEQ ID No.2所示的下游引物、12.5μL 2×PCRmix和补足25μL的ddH2O；
SEQ ID No.1的序列为：CCCAAGATAAAGCAACGAA；
SEQ ID No.2的序列为：CAAAGCTGCGATTTGGAAGT；
PCR程序：95℃，2min，95℃30s 55℃30s 72℃30s循环30次72℃延伸10min；
3)PCR扩增产物经毛细管电泳，结果如图3所示。泳道1为母本紫狮、泳道2为父本粤油；泳道3-14为杂交后代F1。图3中，箭头所示方向为父本特异性带型，长度为230bp左右，因此，泳道4，6，7，8，9，10，13对应的杂交后代F1都有这个父本带型，因此为真杂种；其它表现为母本带型，为假杂种。
实施例3：
一种真假杂种的检测方法，母本为B33(小果材料)父本为粤油101(大果材料)，包括以下步骤：
1)取杂交后代F1的嫩叶0.01-0.05g，放入1.5mL的离心管中，研磨15秒，加入500μL提取缓冲液，混合12秒，剪取一片滤纸(滤纸尺寸2mm×60mm,浸入长10mm)，在提取缓冲液中沾一下2秒，然后放入200μL洗涤缓冲液中，洗涤3秒，然后取出滤纸片；
2)将洗涤缓冲液与PCR扩增液混合，上机扩增；PCR扩增液包括0.5μL如SEQ IDNo.3所示的上游引物、0.5μL如SEQ ID No.4所示的下游引物、12.5μL 2×PCRmix和补足25μL的ddH2O；
SEQ ID No.3的序列为：TGTTTCTGTCGCAATCCTCC；
SEQ ID No.4的序列为：CCGGATGCGTTCAGATCTAT；
PCR程序：95℃，2min，95℃30s 55℃30s 72℃30s循环30次72℃延伸10min；
3)PCR扩增产物经毛细管电泳，结果如图4所示。泳道1为母本B33、泳道2为父本粤油101；泳道3-8为杂交后代F1。图4中，箭头所示为父本特异性带型，长度为260bp左右，因此，泳道4，5，7，8对应的杂交后代F1都有这个父本带型，因此为真杂种；其它表现为母本带型，为假杂种。
实施例4：
一种父本特异性的比对方法，母本为早蔓生(高油材料)父本为粤油91(低油材料)，包括以下步骤：
1)取父本和母本的嫩叶各0.01-0.05g，分别放入1.5mL的离心管中，研磨15秒，加入500μL提取缓冲液，混合12秒，剪取一片滤纸(滤纸尺寸2mm×60mm,浸入长10mm)，在提取缓冲液中沾一下2秒，然后放入200μL洗涤缓冲液中，洗涤3秒，然后取出滤纸片；
2)将洗涤缓冲液与PCR扩增液混合，上机扩增；PCR扩增液包括0.5μL如SEQ IDNo.5所示的上游引物、0.5μL如SEQ ID No.6所示的下游引物、12.5μL 2×PCRmix和补足25μL的ddH2O；
SEQ ID No.5的序列为：GCTAGGGTTGAAGCCGTTT；
SEQ ID No.6的序列为：GAAGAGAGGGGAAAAGAGGG；
PCR程序：95℃，2min，95℃30s 55℃30s 72℃30s循环30次72℃延伸10min；
3)PCR扩增产物经毛细管电泳，结果如图5所示。泳道1为母本早蔓生、泳道2为父本粤油91，通过对比条带发现，在270bp处父本存在与母本不同的特异性带型，即箭头所示条带。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 广东省农业科学院作物研究所
<120> 一种快速检测花生真假杂种的方法
<130> 广东省农业科学院作物研究所
<141> 2019-11-20
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 45F
<400> 1
cccaagataa agcaacgaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 45R
<400> 2
caaagctgcg atttggaagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 166F
<400> 3
tgtttctgtc gcaatcctcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 166R
<400> 4
ccggatgcgt tcagatctat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 259F
<400> 5
gctagggttg aagccgttt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 259R
<400> 6
gaagagaggg gaaaagaggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> fad2-F
<400> 7
acacaacaat gggagctgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> fad2-R
<400> 8
atggcaaatc cacacacaca 20

Claims (10)

1.一种快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)DNA的提取：取花生嫩叶，研磨，加入提取缓冲液混匀，用滤纸条粘取提取液后将滤纸放入洗涤缓冲液洗涤；所述提取缓冲液为含有MEDTA、PVP、NaCl、Tween-20的Tris缓冲液；所述洗涤缓冲液为含有MEDTA、Tween-20的Tris缓冲液；
2)PCR扩增：将洗涤后的液体加入PCR扩增液进行扩增，PCR扩增液包括Taq酶、预混物和特异性SSR引物；
3)PCR扩增产物进行电泳，若含父本特异性带型则为真杂种，否则为假杂种。
2.如权利要求1所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，步骤1)中，花生叶片研磨时间为15-30s。
3.如权利要求1所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，步骤1)中，使用1-2mL的离心管，取花生嫩叶0.01-0.05g，加入1/3-1/2离心管体积的提取缓冲液。
4.如权利要求3所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，步骤1)中，滤纸的宽度为1-3mm，浸入长度为10-15mm。
5.如权利要求3所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，步骤1)中，所述提取缓冲液为含有10mM EDTA、500mM NaCl、3％PVP、1％Tween-20的100mM Tris(pH＝8.0)缓冲液。
6.如权利要求3所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含有1mMEDTA，0.1％Tween-20的10mM Tris(pH＝8.0)缓冲液。
7.如权利要求6所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，PCR扩增液为25μL体系，包括：0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、12.5μL 2XPCRmix和补足25μL的ddH2O。
8.如权利要求1所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，所述特异性SSR引物为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
9.如权利要求1所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，所述特异性SSR引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
10.如权利要求1所述的快速检测花生真假杂种的方法，其特征在于，所述特异性SSR引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。
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