CN111733281A

CN111733281A - 一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用

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Publication number: CN111733281A
Application number: CN202010782791.3A
Authority: CN
Inventors: 耿洪伟; 夏先春; 严勇亮; 王丽丽; 王继庆; 战帅帅; 任毅
Original assignee: Xinjiang Agricultural University; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Xinjiang Agricultural University; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111733281B

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用。本发明提供了用于鉴定小麦过氧化物酶活性的成套引物，由引物对1、引物对2和引物对3组成；所述引物对1由序列1和序列2所示的单链DNA组成；所述引物对2由序列3和序列4所示的单链DNA组成；所述引物对3由序列5和序列6所示的单链DNA组成。本发明的分子标记能快速鉴定TaPod‑A3a、TaPod‑A3b和TaPod‑A3c等位变异及其与小麦POD活性的相关关系，并筛选出具有较高POD活性的小麦品种，不仅加速了优质小麦新品种的育成步伐，而且对利用分子标记辅助选择高POD活性小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

Description

一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用。

背景技术

小麦籽粒中过氧化物酶(Peroxidase,POD)对面粉及其制品同时具有褐变和漂白的作用，POD活性越高，小麦面粉颜色越白。随着人们生活水平的提高，小麦的品质已变成我国小麦育种和生产的重要目标，也是小麦产业间竞争力的重要影响要素。小麦品质主要包括磨粉品质、加工品质、营养品质和淀粉品质。小麦磨粉品质是指小麦在制粉过程中所表现出来的品质特征，主要由千粒重、容重、灰分和出粉率决定。加工品质主要由传统贮藏蛋白中的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白决定。营养品质是指小麦籽粒中各类人类所需的营养成分、蛋白质以及氨基酸组成的平衡程度。淀粉品质主要由淀粉合成酶、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶(DBE)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)等决定。面粉的质量和制粉精度主要体现在小麦面粉的白度，因此，小麦面粉的白度是影响小麦磨粉品质的重要因素，也是对面粉进行分级的重要指标。面粉白度属于数量性状，受遗传和环境条件的双重影响，包括基因型(品种)、气候(光照、温度和降水等)和栽培条件(种植年份、地点、水、肥和栽培措施等)等。

通过遗传途径改良我国小麦加工品质是一种有效途径，而育种上突破性的成就取决于关键基因的发掘和利用。影响小麦面粉白度的酶主要包括过氧化物酶、脂肪氧化酶、儿茶酚酶、酚酶、多酚氧化酶和氯原酸酶等。POD存在与LOX类似的对胡萝卜素的漂白活性，能通过氧化作用降解面粉中累积的色素物质，从而提高面粉的白度。全麦粉的POD活性明显高于去掉麸皮的面粉，相比LOX，POD是一种天然的抗氧化剂且具有更少的破坏面制品风味的特性，从而已取代LOX成为主要的生物类食品添加剂且具有最佳的漂白效果，可以取代苯甲酰过氧化物作为面团的漂白剂。POD活性是由多基因控制的复杂数量性状，受环境影响大，直接对POD活性高低进行选择难度较大，利用分子标记聚合POD活性相关基因，是进行POD活性改良的重要途径。功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性序列开发出来的一种新型分子标记，由于来自基因内的功能性基序，从理论上来讲此类标记不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无，且目前可用功能标记较少。因此，发掘小麦POD活性相关基因，开发基因特异性分子标记，是进行基因聚合育种和品质性状分子机理研究的重要基础，对培育具有优良品质的小麦新品种，具有重要的理论与现实意义。

小麦籽粒POD活性主要受基因型影响，主效QTL挖掘的研究尚不深入。虽然环境因素对POD活性有一定影响，但POD活性主要受遗传因素影响。有关小麦品种间POD活性变异及主效位点挖掘的研究相对较少。Brenchley R等研究发现普通小麦染色体组成复杂，过氧化物酶基因种类多，分布广，在整个小麦A，B，D中都有分布。Takasaki等根据禾本科作物共线性原理，推测小麦POD活性的重要基因位于第3同源染色体组上，经定位结果发现小麦POD活性基因位于第3和7同源染色体组上。为了便于人们更深入的从分子学角度研究POD的结构与功能，不少学者开始从POD基因克隆及其表达载体构建的角度来研究POD。据报道，曾家豫通过RT-PCR技术获得了大豆POD基因，再将该基因与表达载体双酶切连接后，分别在大肠杆菌和比赤酵母中构建了原核表达载体和真核表达载体。目前针对POD的研究主要集中于酶学特性、分布定位、同工酶谱带以及抗逆等，但是人们对POD与面粉品质的研究却很少，对POD的类型、分布定位、基因克隆等方面还不清楚。

魏景欣利用豆麦/石4185RIL群体的SNP标记结合QTL定位，结果定位到3A，4B和5A染色体上，克隆并开发了3A染色体的POD活性基因TaPod-A1功能标记POD-3A1和POD-3A2。时佳等利用两个自然群体结合90K iSelect芯片首次对小麦籽粒POD活性进行了GWAS，在找到了2A，2D，7B和7D稳定遗传的位点，克隆并开发了位点贡献率最大的7D染色体的POD活性基因TaPod-D1功能标记POD-7D1和POD-7D6目前参与高等植物POD生物合成的主要基因克隆已有报道，但对其调控机制尚未进行深入研究为了更准确地鉴定小麦品种POD活性的基因型，有必要对重要主效位点基因克隆，并根据该基因位点不同等位基因的序列开发共分离的功能标记，进一步提高分子标记选择的准确性和育种效率为改良小麦POD活性提供有效的分子标记，最终为分子标记辅助育种及该基因的图位克隆奠定基础。

发明内容

本发明一个目的是提供用于鉴定小麦POD活性的成套引物。

本发明提供的成套引物，由引物对1、引物对2和引物对3组成；

所述引物对1为如下(a1)-(a3)中任一所示的引物对：

(a1)由序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对；

(a2)由将序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；

(a3)由经序列7所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；

所述引物对2为如下(b1)-(b3)中任一所示的引物对：

(b1)由序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成的引物对；

(b2)由将序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；

(b3)由经序列8所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；

所述引物对3为如下(c1)-(c3)中任一所示的引物对：

(c1)由序列5所示的单链DNA和序列6所示的单链DNA组成的引物对；

(c2)由将序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对；

(c3)由经序列9所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对。

本发明还有一个目的是提供用于鉴定小麦POD活性的PCR试剂或含有所述PCR试剂的试剂盒。

本发明提供的PCR试剂为由PCR试剂1、PCR试剂2和PCR试剂3组成的成套试剂；

或所述PCR试剂为PCR试剂1或PCR试剂2或PCR试剂3；

所述PCR试剂1包括上述成套引物中的所述引物对1；所述PCR试剂2包括上述成套引物中的所述引物对2；所述PCR试剂3包括上述成套引物中的所述引物对3。

上述的成套引物或上述的PCR试剂或上述试剂盒在如下任一中的应用也是本发明保护的范围：

(d1)鉴定或辅助鉴定待测小麦为高POD活性小麦还是低POD活性小麦；

(d2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(d3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(d4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(d5)鉴定或辅助鉴定待测小麦是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因；

(d6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(d7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(d8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(d9)培育高POD活性小麦或培育低POD活性小麦。

本发明还有一个目的是提供检测待测小麦基因组是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的物质在如下中应用：

(e1)鉴定或辅助鉴定待测小麦为高POD活性小麦还是低POD活性小麦；

(e2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(e3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(e4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(e5)鉴定或辅助鉴定待测小麦是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因；

(e6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(e7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(e8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(e9)培育高POD活性小麦或培育低POD活性小麦。

上述应用中，所述检测待测小麦籽粒基因组是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的物质为上述成套引物或上述PCR试剂或所述试剂盒。

本发明还有一个目的是提供如下方法。

本发明提供的如下方法：

A、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦为高POD活性小麦还是低POD活性小麦的方法，为如下任一：

(A1)包括如下步骤：检测待测小麦基因组中携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因，

若所述待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3a，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3b，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3c，则所述待测小麦为或候选为高POD活性小麦；

(A2)包括如下步骤：用上述成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

若所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为882bp的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则所述待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，则所述待测小麦为或候选为高POD活性小麦；

B、一种鉴定或辅助鉴定待测小麦POD活性的方法，为如下任一：

(B1)包括如下步骤：检测待测小麦基因组中携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因，携带等位基因TaPod-A3c的小麦品种的POD活性高于或候选高于携带等位基因TaPod-A3a的小麦品种或携带等位基因TaPod-A3b的小麦品种的POD活性；

(B2)包括如下步骤：用上述的成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

若满足如下条件c的小麦的POD活性高于或候选高于满足如下条件a或b的小麦:

所述条件a:所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段；

所述条件b:所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为882bp的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段；

所述条件c:所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段；

C、一种培育籽粒高POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的携带等位基因TaPod-A3c的小麦品种；

或，一种培育籽粒高POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的满足条件c的小麦品种；

D、一种培育籽粒低POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的携带等位基因TaPod-A3a或TaPod-A3c的小麦品种；

或，一种培育籽粒低POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的满足条件a或b的小麦品种。

上述方法中，所述检测待测小麦基因组中携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的方法包括如下步骤：

用上述的成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

若引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，且引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3a；

若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为882bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3b；

若所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，且引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，则待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3c。

本发明还有一个目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，为如下：

f1、等位基因TaPod-A3a、等位基因TaPod-A3b和/或等位基因TaPod-A3c；

所述等位基因TaPod-A3a的核苷酸序列为序列7；

所述等位基因TaPod-A3b的核苷酸序列为序列8；

所述等位基因TaPod-A3c的核苷酸序列为序列9；

f2、序列7的第943-1158位所示DNA分子(大小为216bp的片段)、序列8的第151-1032位所示DNA分子(大小为882bp的片段)和/或序列9的第1007-1162位所示DNA分子(大小为156bp的片段)；

f3、含有序列7的第943-1158位的DNA分子、含有序列8的第151-1032位的DNA分子和/或含有序列9的第1007-1162位的DNA分子。

上述DNA片段在如下中的应用也是本发明保护的范围：

(e2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(e3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(e4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(e6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(e7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(e8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(e9)培育高POD活性小麦或培养低POD活性小麦。

上述低POD活性小麦中的POD活性小于等于2.51×10³U·g^-1·min^-1；单位POD活性(U)被定义为每克全麦粉每分钟反应产物在470nm处的吸光度增加0.01。

所述高POD活性小麦中的POD活性大于2.51×10³U·g^-1·min^-1；单位POD活性(U)被定义为每克全麦粉每分钟反应产物在470nm处的吸光度增加0.01。

所述等位基因TaPod-A3a的核苷酸序列为序列7；

所述等位基因TaPod-A3b的核苷酸序列为序列8；

所述等位基因TaPod-A3c的核苷酸序列为序列9。

在本发明中，所述POD活性均表示过氧化物酶活性。

在本发明中，小麦的POD活性通过小麦籽粒的POD活性体现，即小麦POD活性为小麦籽粒POD活性。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度，所述引物对1为66℃；所述引物对2为66℃；所述引物对3为63℃。

上文中，所述待测小麦具体可为表1中的至少一种小麦。

实验证明：本发明的分子标记可以快速鉴定出TaPod-A3a、TaPod-A3b和TaPod-A3c等位变异情况及其POD活性的高低，运用于本发明的分子标记能快速筛选出具有较高POD活性的小麦品种(材料)，不仅加速优质小麦新品种的育成步伐，而且对利用分子标记辅助选择高POD活性小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

附图说明

图1为部分样本的电泳图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中小麦籽粒过氧化物酶(POD)含量：

当POD活性小于等于2.51×10³U·g^-1·min^-1时，单位POD活性(U)是在过氧化氢存在下,每克全麦粉每分钟催化愈创木酚氧化生成的茶褐色物质在470nm处的吸光度增加0.01，表明该小麦籽粒为低POD活性小麦；

当POD活性大于2.51×10³U·g^-1·min^-1时单位POD活性(U)是在过氧化氢存在下,每克全麦粉每分钟催化愈创木酚氧化生成的茶褐色物质在470nm处的吸光度增加0.01，表明该小麦籽粒为高POD活性小麦。

单位POD活性(U)被定义为在过氧化氢存在下,每克全麦粉每分钟催化愈创木酚氧化生成的茶褐色物质在470nm处的吸光度增加0.01。

实施例1、鉴定小麦籽粒过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的分子标记及方法的建立

一、鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记

小麦中TaPod-A1基因存在的3种等位变异形式，对应的等位基因为TaPod-A3a、TaPod-A3b和TaPod-A3c，其中等位基因TaPod-A3a的核苷酸序列为序列7；等位基因TaPod-A3b的核苷酸序列为序列8；等位基因TaPod-A3c的核苷酸序列为序列9。

基于TaPod-A1基因的3种等位变异形式设计特异引物对1(扩增等位基因TaPod-A3a部分片段)、引物对2(扩增等位基因TaPod-A3b部分片段)和引物对3(扩增等位基因TaPod-A3c部分片段)如下：

引物对1的上游引物(序列1)：5’-CACGAGACGCTGTGGAAGGACAG-3’；

引物对1的下游引物(序列2)：5’-TCGCATTCAAGGACGCATACA-3’；

引物对2的上游引物(序列3)：5’-TATTTTTTTTTTTTTTGCGTTC-3’；

引物对2的下游引物(序列4)：5’-GGATCTCCCCCTTGCGTGCCGGTCTT-3’。

引物对3的上游引物(序列5)：5’-AAGACCGGCACGCAGGGGGAGA-3’；

引物对3的下游引物(序列6)：5’-TCGCATTCAAGGACGCATACA-3’。

引物对1的扩增产物为大小为216bp的片段，其核苷酸序列为序列表中序列7第943-1158位；

引物对2的扩增产物为大小为882bp的片段，其核苷酸序列为序列表中序列8第151-1032位；

引物对3的扩增产物为大小为156bp的片段，其核苷酸序列为序列表中序列9第1007-1162位。

二、鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的方法的建立

1、提取待测小麦籽粒的基因组DNA。

2、以上述1获得的基因组DNA为模板，分别采用步骤一中获得的引物对1、引物对2和引物对3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增的反应体系：模板DNA约80ng，2×Es Taq MasterMix(康为世纪，9μL，上游引物和下游引物各1μL(引物在反应体系中的终浓度为0.4uM)，用无菌超纯水补充反应体系至25μl。

引物对1的PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、66℃复性30s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。将得到的PCR扩增产物分别进行测序。

引物对2的PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、66℃复性30s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。将得到的PCR扩增产物分别进行测序。

引物对3的PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、63℃复性30s、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。将得到的PCR扩增产物分别进行测序。

扩增产物经1.0％的琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液体系电泳后，进行溴化乙锭染色，根据如下A或B判断：

A、

先根据扩增产物大小按照如下标准判断待测小麦基因组是否携带等位基因TaPod-A3a、TaPod-A3b和TaPod-A3c：

若引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3a；

若所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，则待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3c；

再根据携带的等位基因种类判断小麦POD活性高低：

若待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3a，则该待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3b，则该待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若待测小麦基因组中携带等位基因TaPod-A3c，则该待测小麦为或候选为高POD活性小麦；

或，携带等位基因TaPod-A3c的小麦品种的POD活性高于或候选高于携带等位基因TaPod-A3a的小麦品种或携带等位基因TaPod-A3b的小麦品种的POD活性。

B、

根据扩增产物大小按照如下判断小麦品种的POD活性高低：

若引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为882bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段，则待测小麦为或候选为低POD活性小麦；

若所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，则待测小麦为或候选为高POD活性小麦；

或，若满足如下条件c的小麦的POD活性高于或候选高于满足如下条件a或b的小麦:

条件a:引物对1的PCR扩增产物含有大小为216bp的片段，且引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段。

条件b:引物对2的PCR扩增产物含有大小为882bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对3的PCR扩增产物不含有大小为156bp的片段。

条件c:引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段。

低POD活性小麦为小麦籽粒POD活性小于等于2.51×10³U·g^-1·min^-1小麦；

高POD活性小麦为小麦籽粒POD活性大于2.51×10³U·g^-1·min^-1小麦。

实施例2、分子标记鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性

实验材料：25份中国冬小麦主推品种(如表1所示)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所的国家种质资源库获得。

一、小麦籽粒的POD活性检测

在新疆玛纳斯种植表1所示的各个小麦品种，收获后检测小麦籽粒的POD活性，每个小麦材料的POD活性重复检测两次，如果两次检测结果的误差超过10％，则需进行第三次重复检测，结果取平均值。

测定籽粒的POD活性的方法如下所示：

1、小麦全麦粉的制备

(1)称取5g去杂去劣的小麦籽粒，采用配备0.8mm筛子的旋风磨(瑞典LaboratoryMill 120)研磨。

(2)将全麦粉放入自封袋中，置于4℃备用。

2、小麦籽粒POD的提取

(1)称取0.1g全麦粉放置入2mL离心管，加入1mL在4℃下预冷的0.1mol/L PH 7.5磷酸缓冲液(母液A:0.2mol·L^-1Na₂HPO₄溶液即Na₂HPO₄·12H₂O 71.64g用蒸馏水容至1000ml),母液B:0.2mol·L^-1溶液即NaH₂PO₄·2H₂O 31.21g用蒸馏水容至1000ml),84.0ml A+16.0ml B稀释至200ml)，混匀振荡后冰浴摇晃2h；

(2)以10,000rpm的转速，在4℃条件下离心15min。

(3)吸取上清液，立即放入4℃冰箱待测，得到POD粗酶液。

3、愈创木酚法测定POD活性

(1)吸取5μL上述2制备的POD粗酶液加入25μL H₂O₂、5μL 2％(体积百分含量)的愈创木酚和145μL 0.05M PH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液(10.3mL 0.2mol/L Na₂HPO₄和9.7mL0.1mol/L Na₂HPO₄)充分混合待测定，POD活性测定实验以空白溶液(5μL PH 7.5磷酸缓冲液、25μL H₂O₂、5μL 2％的愈创木酚和145μL 0.05M PH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液)为参比，应用酶标仪，采用动力学检测方法，在30℃、470nm下测定POD粗酶液在50-150s的吸光度A值，总检测时间为150s，间隔时间为10s，每个小麦品种的POD活性重复检测两次，同一重复内材料使用同一批次配置的底物检测POD活性，以避免因底物浓度误差导致的实验误差，如果两次检测结果的相差超过10％，需重复检测。

单位POD活性(U)被单位POD活性(U)是在过氧化氢存在下,每克全麦粉每分钟催化愈创木酚氧化生成的茶褐色物质在470nm处的吸光度增加0.01。

各个品种小麦籽粒的POD活性检测结果如表1第6列所示。

二、TaPod-A1基因分子标记鉴定小麦籽粒过氧化物酶(POD)活性的方法

采用实施例1的二的方法检测表1所示各个品种过氧化物酶活性情况及其含有的等位基因。

各个品种过氧化物酶活性情况及其含有的等位基因检测结果如表1所示：24个新疆冬小麦品种(系)扩增得到的PCR扩增产物按大小分为三种：一种为216bp(对应引物对1)；一种为882bp(对应引物对2)；另一种为156bp(对应引物对3)。

部分样本的电泳图见图1，为3张图上下拼接而成，上图为引物1的鉴定结果，中图为引物2的鉴定结果，下图为引物3的鉴定结果；其中，泳道01-09分别为Marker，表中小麦品种新冬32号,新冬33号,新冬34号,新冬21号,哈阿热托司曼,库车白冬麦,新冬29号,白蚰包,喀冬4号，Marker。

表1为TaPod-A1基因分子标记PCR检测结果和POD活性检测结果

上表1中，第1列为品种编号，第2列为品种名称，第3列为引物对1扩增结果，第4列为引物对2扩增结果，第5列为引物对3扩增结果，第6列为上述一的小麦籽粒的POD活性检测结果。

从表1可以看出，22个小麦品种(系)中：13个品种携带等位基因TaPod-A3a，POD活性平均值为2.06×10³U·g^-1·min^-1；5个品种携带等位基因TaPod-A3b，POD活性平均值为2.35×10³U·g^-1·min^-1；7个品种携带等位基因TaPod-A3c，POD活性平均值为2.66×10³U·g^-1·min^-1。

将上述13个携带等位基因TaPod-A3a品种、8个携带等位基因TaPod-A3b品种7个携带等位基因TaPod-A3c的POD活性平均值进行统计，结果如表2所示：

表2为携带等位基因品种的POD活性

等位基因名称	POD活性	株数
			等位基因TaPod-A3a	2.06×10<sup>3</sup>	13
等位基因TaPod-A3b	2.35×10<sup>3</sup>	8
			等位基因TaPod-A3c	2.66×10<sup>3</sup>	7

从上述可以看出，携带等位基因TaPod-A3c的小麦品种的POD活性高于携带等位基因TaPod-A3a或TaPod-A3b的小麦品种的POD活性，两者具有显著差异(P<0.05)。

关于分子鉴定准确性分析：10个携带等位基因TaPod-A3a的小麦品种中，9个为低POD活性品种，即通过是否携带等位基因TaPod-A3a辅助鉴定低POD活性小麦的准确率为90.0％；5个携带等位基因TaPod-A3b的小麦品种中，3个为低POD活性品种，即通过是否携带等位基因TaPod-A3b辅助鉴定低POD活性小麦的准确率为60.0％；7个携带等位基因TaPod-A3c的小麦品种中，5个为高POD活性品种，即通过是否携带等位基因TaPod-A3c辅助鉴定高POD活性小麦的准确率为71.4％。

对比例：

用TaPod-A1a和TaPod-A1b等位基因鉴定表3所示的材料(引物序列和鉴定方法参考授权专利一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用(专利号：201410843177.8)，采用的分子标记为POD-3A1和POD-3A2，结果如表3所示。

表3为TaPod-A1a和TaPod-A1b鉴定结果

上述结果表明，TaPod-A1a辅助鉴定低POD活性小麦的准确率为36.8％；TaPod-A1b辅助鉴定高POD活性小麦的准确率为40.0％。

由此可见，TaPod-A1功能标记POD-3A1和POD-3A2鉴定POD活性不及本发明。

序列表

<110> 新疆农业大学中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cacgagacgc tgtggaagga cag 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tcgcattcaa ggacgcatac a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tatttttttt ttttttgcgt tc 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggatctcccc cttgcgtgcc ggtctt 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aagaccggca cgcaggggga ga 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tcgcattcaa ggacgcatac a 21

<210> 7

<211> 1108

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 7

tgtctccggc tgcaagcaag ctagctaggt tcaggaatgc atggtacgcc ggcaatttcc 60

tttctactat aagcaacaga ttaattatta aacagcagcg tcacactagc aggttgaaca 120

cggtgtagta ggagtagtat tggttatgac tatttttttt tttttgcgtt cgtattggtt 180

atgactagga cacctatgta tagttaacca gtgcaaaaat aatgcatcaa ataacgtagt 240

atacatcatc ttaattgcgg tgctctccat gtgatatgaa cccaccatgc atgcagggct 300

gtgattcatc ggtgctcctg tccgtcaacc ccggcggagg cacgacggag cgcgaggcag 360

cgccgaacaa cccgagcctg cgcggcttcg cggtcgtgga cgccgccagg gcggcattgg 420

agcagagctg cccgcgcacg gtgtcatgcg ccgacatcct ggccttcgcc gcccgggaca 480

gcgtgaacat caccggcagc aacgccttct accaggtccc ttccggccgc cgcgacggga 540

acctctcgac cgacaccggc gcgttcaccc tcccggggcc gaacctgacg gcggacggcc 600

tcgtcagggg gttcgcggac cggaacctga ccgccgagga catggtggtc ctgtcgggct 660

cccacaccct gggccgctcc cactgcaact ccttcatcgt ccggaaccgg gagcggctgg 720

cgagcggcac catcagcccg gcgtaccagg cgctgctgga ggcgctgtgc ccggcgaaca 780

cgagccagtt caccaacgtg acgacggaga tcgacctgag cacgccggtg gtgctggaca 840

acaactacta caagctggtg cagctcaacc tgggcctgca cttctccgac gaccagctca 900

tccgcaacgc caccctcaag gccttcgtcg acgcctcgcc gccacgagac gctgtggaag 960

gacagttcct cgccgccatg atcagatggg caacatcagc cccagaccgg cacgcagggg 1020

agatcgctcc tcaactgcag cctcgtcaac ccggcctcct cttcttcgtc cgcctacgct 1030

ggggtgatcg agatgctccg ccgacagggc tccgacgata aggtcgccaa gggctgatgt 1090

atgcgtcctt gaatgcga 1108

<210> 8

<211> 1034

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 8

tgtctccggc tgcaagctag ctagctaggt tcaggaatgc atggtacgcc ggcaatttcc 60

tttctactat aagcaacaga ttaattatta aacagcagcg tcacactagc aggttgaaca 120

cggtgtagta ggagtagtat tggttatgac tatttttttt ttttttgcgt tcgtattggt 180

tatgactagg acacctatgt atagttaacc agtgcaaaaa taatgcatca aataacgtag 240

tatacatcat cttaattgcg gtgctctcca tgtgatatga acccaccatg catgcagggc 300

tgtgattcat cggtgctcct gtccgtcaac cccggcggag gcacgacgga gcgcgaggca 360

gcgccgaaca acccgagcct gcgcggcttc gcggtcgtgg acgccgccag ggcggcattg 420

gagcagagct gcccgcgcac ggtgtcatgc gccgacatcc tggccttcgc cgcccgggac 480

agcgtgaaca tcaccggcag caacgccttc taccaggtcc cttccggccg ccgcgacggg 540

aacctctcga ccgacaccgg cgcgttcacc ctcccggggc cgaacctgac ggcggacggc 600

ctcgtcaggg ggttcgcgga ccggaacctg accgccgagg acatggtggt cctgtcgggc 660

tcccacaccc tgggccgctc ccactgcaac tccttcatcg tccggaaccg ggagcggctg 720

gcgagcggca ccatcagccc ggcgtaccag gcgctgctgg aggcgctgtg cccggcgaac 780

acgagccagt tcaccaacgt gacgacggag atcgacctga gcacgccggt ggtgctggac 840

aacaactact acaagctggt gcagctcaac ctgggcctgc acttctccga cgaccagctc 900

atccgcaacg ccaccctcaa ggccttcgtc gacgccttcg ccgccacgag acgctgtgga 960

aggacaagtt cctcgccgcc atgatcagat gggcaacatc agccccaaga ccggcacgca 1020

agggggagat ccgc 1034

<210> 9

<211> 1182

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 9

tgtctccggc tgcaagcaag ctagctaggt tcaggaatgc atggtacgcc ggcaatttcc 60

tttctactat aagcaacaga ttaattatta aacagcagcg tcacactagc aggttgaaca 120

cggtgtagta ggagtagtat tggttatgac tatttttttt ttttgcgttc gtattggtta 180

tgactaggac acctatgtat agttaaccag tgcaaaaata atgcatcaaa taacgtagta 240

tacatcatct taattgcggt gctctccatg tgatatgaac ccaccatgca tgcagggctg 300

tgattcatcg gtgctcctgt ccgtcaaccc cggcggaggc acgacggagc gcgaggcagc 360

gccgaacaac ccgagcctgc gcggcttcgc ggtcgtggac gccgccaggg cggcattgga 420

gcagagctgc ccgcgcacgg tgtcatgcgc cgacatcctg gccttcgccg cccgggacag 480

cgtgaacatc accggcagca acgccttcta ccaggtccct tccggccgcc gcgacgggaa 540

cctctcgacc gacaccggcg cgttcaccct cccggggccg aacctgacgg cggacggcct 600

cgtcaggggg ttcgcggacc ggaacctgac cgccgaggac atggtggtcc tgtcgggctc 660

ccacaccctg ggccgctccc actgcaactc cttcatcgtc cggaaccggg agcggctggc 720

gagcggcacc atcagcccgg cgtaccaggc gctgctggag gcgctgtgcc cggcgaacac 780

gagccagttc accaacgtga cgacggagat cgacctgagc acgccggtgg tgctggacaa 840

caactactac aagctggtgc agctcaacct gggcctgcac ttctccgacg accagctcat 900

ccgcaacgcc accctcaagg ccttcgtcga cgccttcgcc gccaacgaga cgctgtggaa 960

ggacaagttc ctcgccgcca tgatcaagat gggcaacatc agccccaaga ccggcacgca 1020

gggggagatc cgcctcaact gcagcctcgt caacccggcc tcctcttctt cgtccgccta 1080

cgctggggtg atcgagatgc tccgccgaca gggctccgac gataaggtcg ccaagggctg 1160

atgtatgcgt ccttgaatgc ga 1182

Claims

1.用于鉴定小麦POD活性的成套引物，由引物对1、引物对2和引物对3组成；

所述引物对1为如下(a1)-(a3)中任一所示的引物对：

所述引物对2为如下(b1)-(b3)中任一所示的引物对：

所述引物对3为如下(c1)-(c3)中任一所示的引物对：

2.用于鉴定小麦POD活性的PCR试剂或含有所述PCR试剂的试剂盒，

所述PCR试剂为由PCR试剂1、PCR试剂2和PCR试剂3组成的成套试剂；

或所述PCR试剂为PCR试剂1或PCR试剂2或PCR试剂3；

所述PCR试剂1包括权利要求1所述成套引物中的所述引物对1；所述PCR试剂2包括权利要求1所述成套引物中的所述引物对2；所述PCR试剂3包括权利要求1所述成套引物中的所述引物对3。

3.权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的PCR试剂或所述试剂盒在如下任一中的应用：

(d2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(d3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(d4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(d6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(d7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(d8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(d9)培育高POD活性小麦或培育低POD活性小麦。

4.检测待测小麦基因组是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的物质在如下中应用：

(e2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(e3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(e4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(e6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(e7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(e8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(e9)培育高POD活性小麦或培育低POD活性小麦。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述检测待测小麦基因组是携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的物质为权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的PCR试剂或所述试剂盒。

6.如下方法：

(A2)包括如下步骤：用权利要求1所述的成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

若所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为156bp的片段，且所述引物对1的PCR扩增产物不含有大小为216bp的片段，且所述引物对2的PCR扩增产物不含有大小为882bp的片段，则所述待测小麦为或候选为高POD活性小麦。

(B2)包括如下步骤：用权利要求1所述的成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

或，一种培育高POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的满足条件c的小麦品种；

D、一种培育低POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的携带等位基因TaPod-A3a或TaPod-A3c的小麦品种；

或，一种培育低POD活性小麦的方法，为培育上述B中选取的满足条件a或b的小麦品种。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：

所述检测待测小麦基因组中携带TaPod-A3a等位基因、TaPod-A3b等位基因还是TaPod-A3c等位基因的方法包括如下步骤：

用权利要求1所述的成套引物中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3分别对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；

8.一种DNA片段，为如下：

所述等位基因TaPod-A3a的核苷酸序列为序列7；

所述等位基因TaPod-A3b的核苷酸序列为序列8；

所述等位基因TaPod-A3c的核苷酸序列为序列9；

f2、序列7的第943-1158位所示DNA分子、序列8的第151-1032位所示DNA分子和/或序列9的第1007-1162位所示DNA分子；

9.权利要求8所述的DNA片段在如下中的应用：

(e2)鉴定或辅助鉴定低POD活性小麦品种；

(e3)鉴定或辅助鉴定高POD活性小麦品种；

(e4)比较或辅助比较不同待测小麦POD活性高低；

(e6)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3a等位基因的小麦品种；

(e7)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3b等位基因的小麦品种；

(e8)鉴定或辅助鉴定携带TaPod-A3c等位基因的小麦品种；

(e9)培育高POD活性小麦或培育低POD活性小麦。