CN113930536A - 小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于小麦分子育种领域,具体涉及一个小麦籽粒中过氧化物酶(POD)活性显著关联位点qPOD‑2A标记。本发明专利利用全基因关联分析,在小麦2A染色体短臂上鉴定出一个与过氧化物酶活性显著性关联的SNP位点qPOD‑2A,可解释表型变异达10.16%。其第36位碱基存在一个A/G的等位变异;当第36位碱基为A时,为高POD活性的基因型,当第36位碱基为G时,为低POD活性的基因型。充分挖掘与小麦过氧化物酶活性显著相关的优异位点及基因,对于解析小麦POD活性遗传分子机制、开发出相应的检测标记,培育优质小麦新品种,改善面制食品外观品质具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于小麦分子育种领域,具体涉及一个小麦籽粒中过氧化物酶(POD)活性显著关联位点 qPOD-2A标记。
背景技术
随着粮食育种技术进步和育种理念发展,技术人员逐渐将小麦的育种目标从高产和抗病延展到小麦品质的改良。品质已经成为小麦生产和育种的重要目标,也是影响产业间竞争力的重要因素。小麦品质的决定因素中,面粉及其制品的色泽是小麦品质评价的重要指标之一,也是制约我国面粉及其制品品质的重要因素,目前颜色改良已成为小麦品质遗传改良的重要内容。
过氧化物酶(Peroxidase,POD)作为一种氧化活性物质,对于相关颜色表型往往具有较为直观的和明显影响。其在植物组织中以过氧化氢为底物催化各种还原剂的氧化反应:RH2+H2O2→2H2O+R。具体到小麦中,小麦籽粒中过氧化物酶(Peroxidase,POD)能催化阿魏酸等主要酚酸的氧化,并产生发色基团,这是面粉及面制品在加工储藏过程中往往存在褐变和漂白双重变化的主要原因之一。
尽管环境因素对POD活性有一定的影响,但POD活性在一定程度上仍然主要由遗传因素控制。例如,部分统计结果表明,普通小麦的POD活性显著高于硬粒小麦(P <0.05),在不同品种的小麦籽粒中POD活性相差3-10倍。因此,从遗传途径深入研究POD活性调节的遗传分子机制,对于小麦新品种培育、以及最终面制食品外观品质的调节具有重要的科研理论和实际应用意义。
发明内容
在对小麦全基因组关联分析分析基础上,本申请目的在于提供系列与小麦籽粒中过氧化物酶POD活性相关的遗传标记,从而为小麦籽粒中POD活性调控的分子机理研究和最终小麦新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记,该遗传标记名称AX-111134186,位于小麦2A染色体短臂上,其核苷酸序列为:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGG[A/G]GCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT;
在该序列的第36位碱基存在一个A/G的等位基因的突变;当第36位碱基为A时,为高POD活性的基因型,碱基序列(71bp)如SEQ ID No.1所示,具体如下:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGAGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT;
当第36位碱基为G时,为低POD活性的基因型,碱基序列(71bp)如SEQ ID No.2所示,具体如下:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGGGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT。
针对小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记,依据该遗传标记的多态性(核苷酸多态性)所开发KASP标记,可有效用于小麦籽粒中POD活性的检测;
具体KASP标记引物序列设计为:
AX-111134186-F1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGA-3’,
AX-111134186-F2: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGG-3’,
AX-111134186-R12: 5’-TTACAGGGGTTCCAGCACATCGAACA-3’;
具体应用时:
AX-111134186-F1与AX-111134186-R12联合时,用于鉴定基因型为A的高POD活性小麦;
AX-111134186-F2与AX-111134186-R12联合时,用于鉴定基因型为G的低POD活性小麦。
所述KASP标记在小麦育种中应用,用于POD活性高低的区分,具体而言,利用所述KASP标记检测时,基因型为A的小麦品种POD活性显著的高于基因型为G的小麦品种;基因型A是小麦籽粒中POD活性的优异等位基因,可用于筛选高POD活性的小麦品种。
前期研究过程中,发明人利用前期构建的自然群体并结合660K SNP芯片基因型数据,初步筛选获得有效的SNPs 标记位点224706个。另一方面,发明人利用分光光度计法对三个环境下种植的207份自然群体小麦品种进行了POD活性的表型测定,通过采用“Q+K”混合线性模型对小麦籽粒中POD活性进行了全基因组关联分析(Genome-wide associationstudy)。结果在前述筛选所得SNPs 标记位点中筛选获得了一个在2A染色体短臂上与POD活性显著性关联标记AX-111134186(89,486068)。基于上述结果,设计开发了KASP标记,序列分析表明,该标记序列的第36处碱基是一个A/G的等位基因突变,利用该位点的多态性进行基因分型分析,当该位点处碱基为A时,小麦籽粒中的POD活性较高,可有效筛选基因型为A的高POD活性的小麦,从而可为优质小麦新品种的选育提供技术支撑。
总体上,已有研究认为,控制POD 活性基因定位于小麦 2A、2B、2D、4B、7D 和 7A等多个染色体上。因此,充分挖掘、定位与小麦过氧化物酶活性显著相关的潜在优良位点与基因,对于明晰小麦POD活性遗传分子机制以及开发出相应的功能标记,以及对于如何通过遗传途径的方法改变POD活性,改善面制食品外观品质具有重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为三个环境下POD活性的BLUP值在小麦染色体组上SNP分布的曼哈顿图:红色虚线为-log10 P=3的阈值线;
图2为KASP标记基因分型图;其中:FAM橙色(右下圆形)荧光显示该基因型为A;HEX蓝色荧光(左上方形)显示该基因型为G;绿色荧光(右侧三角形)则显示其在该位点为杂合型;黑色荧光(左下方形)为无模板DNA的空白对照;
图3为普通小麦KASP标记基因分型的POD活性分布直方图:橙色框显示基因型为A的小麦材料中POD分布情况;蓝色框显示基因型为G的小麦材料中POD分布情况;
图4为普通小麦KASP标记基因分型的POD活性分布箱线图:橙色显示该基因型为A,POD活性高;蓝色显示该基因型为G,POD活性低;**表示P< 0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前,就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
部分前期实验背景:
前期研究工作中,发明人构建了自然群体,在原阳(YY),商丘(SQ),开封(KF))三个环境下种植,按照正常管理模式播种、管理、收获后,基于此自然群体,发明人利用660K SNP芯片基因型数据初步筛选鉴定了自然群体中有效的SNPs,共获得224,706个标记位点。本申请中相关标记位点即在此筛选范围内。
进一步地,利用分光光度计法,发明人对207份自然群体小麦品种的POD活性表型进行了测定,基于这些测定结果和前述SNPs位点筛选结果,发明人采用“Q+K”混合线性模型对与小麦籽粒中POD活性相关的SNPs位点进行了全基因组关联分析,以期筛选获得与小麦过氧化物酶活性显著相关的潜在优良位点与基因。
实施例1
筛选过程中,采用STRUCTURE计算小麦品种的群体结构,并利用贝叶斯模型划分群体结构,采用TASSEL进行群体连锁不平衡分析。在阈值为-log10 P=3情况下,以在不同环境下均检测到的SNP位点作为显著性位点,部分研究结果汇总如图1、图2所示。
分析表明,在2A染色体短臂上获得一个与POD活性显著性相关的标记AX-111134186(89,486068bp),可解释表型变异率为7.00~10.16%。该标记序列的第36位碱基存在一个A/G的等位基因变异,具体核苷酸序列为:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGG[A/G]GCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT;
具体而言:
当第36位碱基为A时,为高POD活性的基因型,如SEQ ID No.1所示GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGAGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT
当第36位碱基为G时,为低POD活性的基因型,如SEQ ID No.2所示GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGGGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT。
实施例2
基于实施例1中筛选所确定的SNP位点AX-111134186标记的核苷酸序列,发明人进一步设计了KASP标记,结合发明人收集的部分普通小麦品种的基因分型分析结果,以及结合不同基因型小麦材料的POD活性,进行了进一步功能验证以及小麦品种的筛选,从而为小麦品质改良奠定一定基础。具体实验过程简介如下。
(一)引物设计
对该标记(AX-111134186)序列设计引物如下:
AX-111134186-F1:
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGA-3’,
AX-111134186-F2:
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-AACATTGACGCCGTCAAGAACACGGG-3’,
AX-111134186-R12:5’-TTACAGGGGTTCCAGCACATCGAACA-3’。
(二)基因分型检测
首先,将浓度均为10umol/L的3条引物与水按12(AX-111134186-F1):12(AX-111134186-F2):30(AX-111134186-R12):46(H2O)的体积比例,混合为Primer Mix;
然后,进行PCR反应,10µl反应体系设计如下:
2×KASP Master Mix,5ul;
Primer Mix,1.4ul;
MgCl2,0.08ul;
DNA(100ng/ul),1ul;
H2O,2.52ul;
反应程序为:95℃、15min;95℃、20s,65℃~55℃、1min,10个循环(每个循环降低1℃);95℃、20s,57℃、1min,30个循环;37℃ 1min;反应结束后进行基因分型分析。
利用上述KASP标记和反应体系、反应程序,对发明人所收集的141份普通小麦材料进行基因分型。具体每个材料基因分型和POD活性测定结果如图3及下表1所示。
表1,小麦材料AX-111134186 标记基因分型及POD活性分布
续表1:
对上表1结果进行进一步统计归类,结果如下表2所示。
表2,小麦材料中AX-111134186不同基因型间POD活性比较分析
结合图3可以看出,两种等位基因分型明显,这也说明该标记可有效分离不同小麦品种中的等位基因类型。即:
AX-111134186F1与AX-111134186R12联合时,可以用于鉴定基因型为A的高POD活性小麦;
AX-111134186F2与AX-111134186R12联合,可以用于鉴定基因型为G的低POD活性小麦。
进一步结合表1、表2统计结果,分析可以看出,基因型A的小麦材料较约占52.17%,15.94%的小麦材料中含有基因型G。基因型为A的小麦品种中POD活性多集中477.21~1301.3U·min-1·g-1在之间,而基因型为G的小麦品种中POD活性多集中在366.93~1077.33U·min-1·g-1之间。结合图4统计结果可知,该标记基因型为A的小麦材料中,其POD活性高;而基因型为G的小麦材料中POD活性低,两种基因型之间的POD活性达到显著性差异水平。
综合上述结果,可以认为:基因型为A的小麦品种POD活性显著性的高于基因型为G的小麦品种,基因型A是增加小麦籽粒POD活性的优异等位基因,可用于筛选高POD活性的小麦品种,可以用于改良小麦品质性状。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
河南农业大学
<120> 小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> Triticum aestivum L.
<400> 1
gccgctaccg aacattgacg ccgtcaagaa cacggagcca gaatggttgt tcgatgtgct 60
ggaacccctg t 71
<210> 2
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<212> DNA
<213> Triticum aestivum L.
<400> 2
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ggaacccctg t 71
Claims (5)
1.小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记,该遗传标记名称AX-111134186,位于小麦2A染色体短臂上,其核苷酸序列为:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGG[A/G]GCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT;
在该序列的第36位碱基存在一个A/G的等位基因的突变;当第36位碱基为A时,为高POD活性的基因型,碱基序列如SEQ ID No.1所示,具体如下:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGAGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT;
当第36位碱基为G时,为低POD活性的基因型,碱基序列如SEQ ID No.2所示,具体如下:
GCCGCTACCGAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGGGCCAGAATGGTTGTTCGATGTGCTGGAACCCCTGT。
2.权利要求1所述小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记在小麦新品种培育中的应用,其特征在于,AX-111134186标记的第36位碱基存在一个A/G的等位基因的突变;当第36位碱基为A时,为高POD活性的基因型;当第36位碱基为G时,为低POD活性的基因型。
3.针对权利要求1所述小麦籽粒过氧化物酶活性关联位点qPOD-2A标记的KASP标记,其特征在于,具体KASP标记引物序列设计为:
AX-111134186-F1:
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGA-3’,
AX-111134186-F2:
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAACATTGACGCCGTCAAGAACACGGG-3’,
AX-111134186-R12: 5’-TTACAGGGGTTCCAGCACATCGAACA-3’。
4.权利要求3所述KASP标记在小麦籽粒POD活性检测中的应用,其特征在于,AX-111134186-F1与AX-111134186-R12联合时,用于鉴定基因型为A的高POD活性小麦;AX-111134186-F2与AX-111134186-R12联合时,用于鉴定基因型为G的低POD活性小麦。
5.权利要求3所述KASP标记可应用于小麦新品种培育中应用。
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CN111733281A (zh) * | 2020-08-06 | 2020-10-02 | 新疆农业大学 | 一种用于鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的分子标记及其应用 |
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-
2021
- 2021-10-29 CN CN202111270692.8A patent/CN113930536B/zh active Active
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Also Published As
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