CN113355452A - 检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用 - Google Patents

检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，提出了一种检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用，引物组合第一引物组，所述第一引物组在引物组1和引物组3中任取一至二种，第二引物组，所述第二引物组在引物组2和引物组4中任取一至二种；其中，引物组1和引物组3用于扩增AhFAD2A，引物组2和引物组4用于扩增AhAFD2B；引物组1包括特异性引物组1，引物组2包括特异性引物组2；特异性引物组1包括引物1、引物2和引物3；特异性引物组2包括引物4、引物5和引物6；引物组3包括引物7、引物8和引物3；引物组4包括引物9、引物10和引物6。具有高通量、低成本、准确性高、适合多平台灵活操作的优点。

Description

检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体的，涉及一种检测高油酸花生基因型变异的引物组合、方法及应用。
背景技术
花生是我国主要油料作物和经济作物之一。近年来全国花生种植面积在大宗油料作物当中仅次于油菜居第二位，总产量占国内油料总产量的一半以上，花生已成为我国总产量最大的油料作物。在大宗油料作物中，花生是产油效率最高的油料作物，花生总产量的一半用于榨油，年产花生油占国产植物油产量的四分之一以上，且占比稳定提高，居国产植物油第二位。花生油脂的营养价值和理化性质主要取决于油脂的脂肪酸成分和比例。因花生油中含有对人体健康有利的不饱和脂肪酸，主要是油酸和亚油酸，约占脂肪酸总量的80％，其营养价值高，是一种优质食用油。亚油酸属多不饱和脂肪酸，虽对降低血液中胆固醇水平有一定作用，但其化学稳定性差，使油脂的耐储性降低，暴露于空气中或高温烹调易被氧化。相反，作为单不饱和脂肪酸的油酸稳定性高，增加油酸含量可提高油脂耐储存性和延长花生制品的货架寿命，对人类健康也有多种积极作用，油酸可以选择性降低人体有害胆固醇并维持有益胆固醇的水平，并具有抗炎与抗氧化作用，还能降低血压和血糖、抑制癌细胞增殖和促进伤口愈合等。因此，培育高油酸(低亚油酸)花生品种是花生油脂品质改良的重要目标。
近年来国际上花生脂肪酸成分改良研究已经取得了长足进展。美国于1987年发现了第一个高油酸花生自然突变体F435，随后又利用EMS(Ethyl MethaneSulfonate)诱变产生了高油酸化学突变体C485(Mycogen-Flavorunner或Flavorunner 458)和采用DES(Diethyl Sulfate)诱变获得了M2-225以上3个突变体的油酸含量均超过80％，亚油酸含量降低到2％，油酸与亚油酸之比高达40:1。利用突变体开展了高油酸花生品种选育工作，University of Florida于上世纪90年代释放了第一个高油酸花生品种SunOleic 95R。目前，美国花生品种45％左右为高油酸品种，澳大利亚已全面实现了花生生产的高油酸化。
据统计，目前我国生产中大面积推广种植的花生品种仍以普通油酸含量品种占主导，油酸含量平均仅为45％，亚油酸含量高达35％左右。虽然高油酸花生育种研究逐渐受到重视，到目前也已登记了各种类型的高油酸花生品种多达80个以上，但是多数品种仍是采用常传统交手段选育，常规表型选择结果稳定性差，育种周期长，效率不高，未能实现油酸含量的高效定向育种。因此，建立一种对高油酸性状准确选择的高效技术已经成为高油酸花生新品种选育和种质创新的迫切需求。
众多遗传研究已揭示，花生高油酸性状由两个同源非等位隐性基因控制，即FAD2A和FAD2B，编码的脂肪酸脱氢酶负责催化油酸脱氢后引入第二个双键生成亚油酸。这两个基因同时突变引起脂肪酸脱氢酶活性丧失，导致了高油酸表型的产生。
目前，国内外高油酸花生育种大多使用自然突变体F435作为高油酸基因的供体亲本，FAD2A基因编码区序列的第448bp位置由碱基A替换原来的碱基G，发生错义突变(G448A)，使其编码氨基酸链的第150位天冬酰胺变为天冬氨酸(D150N)，该位点是酶活性的保守关键位点，突变引起酶活性降低；而FAD2B基因编码区的第441与442位插入一个碱基A(441_442insA)，导致移码突变，使其编码的蛋白质氨基酸肽链提前终止，形成失去活性的短肽。
针对上述基因突变已开发了CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)、AS-PCR(Allele-Specific PCR)、TaqMan探针、基因测序法、qRT-PCR法、KASP(kompetitiveallele specific PCR)等分子标记，并应用于高油酸花生的辅助选育。利用这些功能标记检测不同花生材料(品种或种质)的高油酸等位基因型，给育种家选择高油酸品种提供了帮助，并取得了阶段性成果。但是，CAPS、AS-PCR、基因测序、TaqMan探针和qRT-PCR技术等操作繁琐复杂，需要酶切、电泳、测序等，且存在通量小、检测成本高等不足；KASP技术虽是一种高通量的等位基因变异分型技术，但是KASP需要PCR扩增专用的Master Mix试剂，而且需要专用的SNP分型检测仪，价格昂贵，另外在对复杂靶向序列位点进行分型时也存在精确度不高的缺陷，还存在只能使用荧光检测的局限。因此，高油酸花生育种亲本筛选中迫切需要建立一种价格低廉、准确性高、适合多平台灵活操作的FAD2基因分型技术。
发明内容
本发明提出了一种检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用，具有高通量、低成本、准确性高、适合多平台灵活操作的优点。
本发明的技术方案如下：
一种检测高油酸花生基因型的引物组合，包括：
第一引物组，所述第一引物组在引物组1和引物组3中任取一至二种，
第二引物组，所述第二引物组在引物组2和引物组4中任取一至二种；其中，
引物组1和引物组3用于扩增AhFAD2A，引物组2和引物组4用于扩增AhAFD2B；
引物组1包括特异性引物组1，引物组2包括特异性引物组2；
特异性引物组1包括引物1、引物2和引物3；
特异性引物组2包括引物4、引物5和引物6；
引物组3包括引物7、引物8和引物3；
引物组4包括引物9、引物10和引物6。
进一步，引物组1和引物组2均还包括加荧光修饰的通用引物PEA1和PEA2。
一种检测高油酸花生基因型的方法，包括以下步骤：
S110：提取待检测花生样品的基因组DNA；
S120：以待测花生的基因组DNA为PCR扩增模板，使用上述的引物组合进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物；
S130：分离和纯化扩增产物片段，采用荧光检测仪或非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析；
S140：根据上述测试结果，获得待测花生的基因型。
进一步，所述步骤S120中，使用引物组1和/或引物组2时进行PCR扩增：
PCR反应体系为5μL，包括，0.5μL 10×NH4+buffer、0.8μL浓度为5M的Betaine、0.2μL 1％(w/v)牛血清蛋白BSA、0.15μL浓度为50mM的MgCl2、0.1μL浓度为2.5mM的dNTP、0.05μL浓度为10μM反向引物水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA1水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA2水溶液、0.01μL浓度为10μM AMAS1引物、0.01μL浓度为10μM AMAS2引物、0.05μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板和2.08μL的ddH2O；其中，反向引物为引物组1中的引物3或引物组2中的引物6，AMAS1引物为引物组1中的引物1或引物组2中的引物4，AMAS2引物为引物组1中的引物2或引物组2中的引物5；
PCR的扩增程序为，94℃预变性3min；94℃变性20s、复性2min——56℃→50℃，每个循环降低1℃，6个循环；94℃变性20s、60℃复性1min，36个循环；62℃延伸2min；4℃保存。
进一步，所述步骤S120中，使用引物组3和/或引物组4时进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μL，包括，5μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板、0.5μL浓度为2μM AS1引物、0.5μL浓度为2μM AS2引物、1.0μL浓度为2μM反向引物和2μLddH2O；其中，反向引物为引物组3中的引物3或引物组4中的引物6，AS1引物为引物组3中的引物7或引物组2中的引物9，AS2引物为引物组3中的引物8或引物组4中的引物10；
PCR的扩增程序为，94℃预变性3min；94℃变性30s、复性30s——68℃→58℃，每个循环降低1℃，10个循环；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
进一步，所述步骤S130中，对于引物组1和/或引物组2的扩增产物，使用荧光检测仪对扩增产物进行分析。
上述PCR扩增产物的荧光信号方法中，检测待测花生每个STARP标记的基因型的方法可包括如下步骤：以待测花生的基因组DNA为模板，采用引物组1和引物组2进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物，采用酶标仪检测每个PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色判断待测花生STARP标记的基因型，若采用引物组1扩增，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为GG型，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为AA型，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为GA杂合型；若采用引物组2扩增，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现蓝色，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为Del型，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现红色，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为Ins型，待测花生的PCR扩增产物的荧光信号呈现绿色，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为杂合型。
进一步，所述步骤S130中，引物组3和/或引物组4的扩增产物，使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分析。
上述PCR扩增产物的凝胶分离片段大小方法中，检测待测花生每个STARP标记的基因型的方法可包括如下步骤：以待测花生的基因组DNA为模板，采用引物组3和引物组4进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据扩增产物的片段大小判断待测花生STARP标记的基因型，若采用引物组3扩增，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为206bp，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为GG型，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为216bp，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为AA型，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为206bp和216bp的双条带，则待测花生AhFAD2Asnp的基因型为GA杂合型；若采用引物组4扩增，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为194bp，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为Del型，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为204bp，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为Ins型，待测花生的PCR扩增产物的片段大小为194bp和204bp的双条带，则待测花生AhFAD2Bindel的基因型为杂合型。
引物组合的应用，包括：
在花生育种中的应用；
在鉴定或辅助鉴定高油酸花生中的应用；
在筛选或辅助筛选高油酸花生中的应用；
制备用于检测待测花生的基于STARP标记的基因型的试剂盒。
一种鉴定花生高油酸性状的方法，使用上述的引物组合检测待测花生的基因型，
使用引物组1和引物组2时，AhFAD2Asnp基因型为GG和AhFAD2Bindel基因型为Del的待测花生材料为普通油酸花生，AhFAD2Asnp基因型为AA和AhFAD2Bindel基因型为Ins的待测花生材料为高油酸花生；
使用引物组3和引物组4时，AhFAD2Asnp基因型为206bp和AhFAD2Bindel基因型为194bp的待测花生材料为普通油酸花生，AhFAD2Asnp基因型为216bp和AhFAD2Bindel基因型为204bp的待测花生材料为高油酸花生。
一种高油酸花生育种方法，使用上述的引物组合检测待测花生的基因型，选择AA和Ins纯合型的花生作为亲本进行高油酸花生育种。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明基于优化的PCR引物设计和PCR反应条件分别建立花生AhFAD2A和AhFAD2B的等位基因变异检测STARP标记平台。在等位基因SNP或InDel变异检测方面，STARP标记技术比传统的凝胶分型技术更能满足检测高通量的需求，又比基于荧光标记的系列分型技术成本更低。该技术可使用自行设计的通用引物探针、基因特异性引物和常规的Taq酶。
2、本发明建立的STARP技术是一种创新的SNPs和InDels基因分型技术，在检测样品可视化方面是一个兼容性高的平台。可以满足大多数实验室的要求，终产物既可以通过无凝胶荧光信号检测，也可以采用基于产物大小差异的凝胶技术来分型，还能兼容KASP技术自动高通量的技术平台。
3、本发明用于检测等位基因SNPs或InDel变异具有灵敏度高、准确度高的优点。STARP技术两个通用引物PEA低温形成发夹结构，有效提高了Touchdown PCR的扩增效率和反应特异性；两个等位基因特异性引物3′端碱基引入人工错配，大大提高了等位基因初始扩增的特异性。
4、本发明所提供的花生STARP标记可用于花生高油酸分子育种和花生种质资源筛选与鉴定研究，其具有价格低廉、准确性高、通量灵活、平台兼容性好等技术优势，是用于花生高油酸育种的理想工具。本发明提供的基因特异性STARP标记及其检测方法，可以为加快花生高油酸育种进程，提高育种效率提供更加有力的技术支撑。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为采用STARP标记引物组1对0607-5、皖花7号及RIL群体家系的AhFAD2A基因分型图。接近X轴的样品基因型为AhFAD2A的GG等位基因型；接近Y轴的样品基因型为AhFAD2A的AA等位基因型；靠近原点的样品为空白对照NTC。
图2为采用STARP标记引物组2对0607-5、皖花7号及RIL群体家系的AhFAD2B基因分型图。接近X轴的样品基因型为AhFAD2B的Del等位基因型；接近Y轴的样品基因型为AhFAD2B的Ins等位基因型；靠近原点的样品为空白对照NTC。
图3为采用STARP标记引物组3对0607-5、皖花7号及RIL群体家系的AhFAD2A基因进行PCR扩增得到的扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图及基因测序验证结果。扩增片段长度为216bp的样品为AhFAD2A基因型与0607-5的基因型相同的家系，即基因型为AA等位基因型；扩增片段长度为206bp的样品为AhFAD2A基因型与皖花7号的基因型相同的家系，即基因型为GG等位基因型；下方显示AA和GG为扩增产物测序获得的等位基因变异位点结果。
图4为采用STARP标记引物组4对0607-5、皖花7号及RIL群体家系的AhFAD2B基因进行PCR扩增得到的扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图及基因测序验证结果。扩增片段长度为204bp的样品为AhFAD2B基因型与0607-5的基因型相同的家系，即基因型为Ins等位基因型；扩增片段长度为2194bp的样品为AhFAD2B基因型与皖花7号的基因型相同的家系，即基因型为Del等位基因型；下方显示Ins和Del为扩增产物测序获得的等位基因变异位点结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
所述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
所述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
所述实施例中所使用的引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
所述实施例中所使用的花生种质、品种均由河北科技大学花生种质资源创新与分子育种研究组提供，公众可以从河北科技大学花生种质资源创新与分子育种研究组获得。
一种检测高油酸花生基因型的引物组合，包括：
第一引物组，所述第一引物组在引物组1和引物组3中任取一至二种，
第二引物组，所述第二引物组在引物组2和引物组4中任取一至二种；其中，
引物组1和引物组3用于扩增AhFAD2A，引物组2和引物组4用于扩增AhAFD2B；
引物组1包括特异性引物组1，引物组2包括特异性引物组2；
特异性引物组1包括引物1、引物2和引物3；
特异性引物组2包括引物4、引物5和引物6；
引物组3包括引物7、引物8和引物3；
引物组4包括引物9、引物10和引物6。
AhFAD2Asnp为基于花生AhFAD2A基因开发的STARP标记，引物组1和引物组3用于扩增AhFAD2A。
AhFAD2Bindel为基于花生AhFAD2B基因开发的STARP标记，引物组2和引物组4用于扩增AhAFD2B。
引物1，如序列1所示，由FAM荧光标签序列和AhFAD2A等位基因特异性序列组成，FAM荧光标签序列由序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2A等位基因特异性序列由序列1自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；
引物2，如序列2所示，由HEX荧光标签序列和AhFAD2A等位基因特异性序列组成，HEX荧光标签序列由序列2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2A等位基因特异性序列由序列2自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；
引物3，如序列3所示，由AhFAD2A等位基因特异性序列组成，AhFAD2A等位基因特异性序列由序列3所示的单链DNA组成；
引物4，如序列4所示，由FAM荧光标签序列和AhFAD2B等位基因特异性序列组成，FAM荧光标签序列由序列4自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2B等位基因特异性序列由序列1自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列组成；
引物5，如序列5所示，由HEX荧光标签序列和AhFAD2B等位基因特异性序列组成，HEX荧光标签序列由序列5自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2B等位基因特异性序列由序列5自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列组成；
引物6，如序列6所示，由AhFAD2B等位基因特异性序列组成，AhFAD2B等位基因特异性序列由序列6所示的单链DNA组成。
引物7，如序列7所示，由AhFAD2A等位基因特异性序列组成，AhFAD2A等位基因特异性序列由序列7所示的单链DNA组成；
引物8，如序列8所示，由长度为10bp核苷酸序列与AhFAD2A等位基因特异性序列组成。10bp核苷酸序列为由序列8自5′末端起第1至10位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2A等位基因特异性序列由序列8自5′末端起第11至31位所示的核苷酸序列组成；
引物9，如序列9所示，由AhFAD2B等位基因特异性序列组成，AhFAD2B等位基因特异性序列由序列9所示的单链DNA组成；
引物10，如序列10所示，由长度为10bp核苷酸序列与AhFAD2B等位基因特异性序列组成。10bp核苷酸序列为由序列10自5′末端起第1至10位所示的核苷酸序列组成；AhFAD2B等位基因特异性序列由序列10自5′末端起第11至25位所示的核苷酸序列组成。
引物组1和引物组2均还包括加荧光修饰的通用引物PEA1和PEA2。
引物PEA1序列：5′-FAM-AGCTGGTT-Sp9-GCAACAGGAACCAGC-T(Dabsyl)-ATGAC-3′，其中5′末端具有FAM荧光标记，Dabsyl为猝灭基团修饰，Sp9为PCR blocker，Sp9下游核苷酸序列与Tial1标签序列相同，即SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4自5′末端起第1至21位所示；
引物PEA2序列：5′-HEX-ACTGCTCAAGAG-Sp9-GACGCAAGTGAGCAG-T(Dabsyl)-ATGAC-3′，其中5′末端具有HEX荧光标记，Dabsyl为猝灭基团修饰，Sp9为PCR blocker，Sp9下游核苷酸序列与Tial2标签序列相同，即SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5自5′末端起第1至21位所示。
引物组1和引物组2中，每条单链DNA引物可单独包装，各单链DNA的摩尔数可相等。
引物组3和引物组4中，引物7、引物8和引物3可按各单链DNA以1：1：2的摩尔数混合包装，也可按每条单链DNA单独包装；引物9、引物10和引物6可按各单链DNA以1：1：2的摩尔数混合包装，也可按每条单链DNA单独包装。
实施例1、花生高油酸性状的功能基因标记STARP引物的设计
涉及的高油酸花生油酸含量相关基因为AhFAD2A和AhFAD2B及其突变等位基因AhFAD2Asnp和AhFAD2Bindel。
1、高油酸花生功能基因AhFAD2A和AhFAD2B等位变异序列的获得
从文献“Expressed variants ofΔ12-fatty acid desaturase for the higholeate trait in spanish market-type peanut lines.López Y,Nadaf HL,Smith OD,Simpson C,Fritz A.(2004)Molecular Breeding,9:183-192.”中获得AhFAD2A和AhFAD2B及其突变等位基因AhFAD2Asnp和AhFAD2Bindel。
2、确定AhFAD2A和AhFAD2B基因等位变异的突变位点
使用MEGA-X软件比对获得的AhFAD2A和AhFAD2Asnp基因的编码区核苷酸序列，AhFAD2A基因第448位碱基为G，而AhFAD2Asnp基因第448位碱基为A，导致其各自所在的三联体密码由GAC变为AAC，发生错译突变，使其编码氨基酸链的第150位天冬酰胺变为天冬氨酸(D150N)。对比AhFAD2B和AhFAD2Bsnp基因的编码区核苷酸序列，发现AhFAD2B基因第441位与第442位之间存在碱基缺失，而AhFAD2Bindel基因第441位与第442位之间插入一个碱基A，导致编码区第493位的TAA成为终止密码子，使其编码的蛋白质氨基酸肽链提前终止，即发生移码突变。本发明针对以上2个突变位点分别设计等位基因变异检测的特异性引物。
3、用于荧光信号检测AhFAD2A和AhFAD2B基因等位变异的STARP标记设计
用于荧光信号检测等位基因变异位点的STARP标记包含5条引物，即2条加荧光修饰的通用引物PEA1和PEA2，3条等位基因特异引物AMAS1、AMAS2和共用反向引物CommonR。通用引物PEA1和PEA2在所有STARP标记反应体系中均可使用，参照文献“An innovative SNPgenotyping method adapting to multiple platforms and throughputs.Long YM,ChaoWS,Ma GJ,Xu SS,Qi LL.(2017)Theor Appl Genet.130(3):597-607”中的序列设计，即PAE1序列为(5′FAM)AGCTGGTT(Sp9)GCAACAGGAACCAGCT(Dabcyl)ATGAC-3′，PEA2序列为(5′HEX)ACTGCTCAAGAG(Sp9)GACGCAAGTGAGCAGT(Dabcyl)ATGAC-3′，其中FAM和HEX为荧光标记修饰，Dabsyl为猝灭基团修饰，Sp9为PCR blocker。
针对等位基因非同义突变位点(SNP或InDel)设计3条等位基因特异性的STARP标记引物，包括上游引物2条即AMAS1和AMAS2，下游共用反向引物1条即CommonR。上游引物的序列由特异标签序列(Tial，位于5′端)和等位基因特异性序列(AS，位于3′端)组成，AS序列的3′末端第1个碱基设计为等位变异碱基，其序列根据变异位点前后的序列设计，另外在3′末端的第3位或第4位碱基进行碱基替换，替换原则为：A替换为C，T替换为C，G替换为A，C替换为T；在AMAS序列的5′端添加通用标签序列Tail，其中一条添加FAM标签序列Tail1：5′-GCAACAGGAACCAGClATGAC-3′，另外一条添加HEX标签序列Tail2：5′-GACGCAAGTGAGCAGTATGAC-3′。下游引物的3′端选择在能保证不扩增出非目标序列的位置设计，即设计在基因组特异的SNPs位点，并使扩增产物的长度在450bp以内。采用NCBI引物设计工具Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)计算引物的Tm值和发夹结构等参数，使AS1和AS2引物(不含Tail1和Tail2标签序列)长度在14-21bp，Tm值限定在54-58℃；反向引物CommonR的序列长度在24bp以内，Tm值限定在58-62℃，同时引物自身互补性参数self-complementarity的值最好不超过5.0。
具体的，针对AhFAD2A和AhFAD2Asnp等位变异设计等位基因特异性引物组1，可包含上游引物1、引物2和下游共用反向引物3：引物1的核苷酸序列由标签序列Tial1(SEQ IDNO：1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列)和SEQ ID NO：1自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成；引物2的核苷酸序列由标签序列Tail2(SEQ ID NO：2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列)和SEQ ID NO：2自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列组成，引物1和引物2的3′末端第1个碱基分别设计为C和T，为AhFAD2A和AhFAD2Asnp基因的等位变异碱基，并将引物1的3′端第4个碱基C和引物2的3′端第3个碱基G分别替换为T和A；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其3′末端第1个碱基为A基因组特异的T。
具体的，针对AhFAD2B和AhFAD2Bindel等位变异设计等位基因特异性引物组2，可包含上游引物4、引物5和下游共用反向引物6：引物4的核苷酸序列由标签序列Tial1(SEQID NO：4自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列)和SEQ ID NO：4自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列组成；引物5的核苷酸序列由标签序列Tail2(SEQ ID NO：5自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列)和SEQ ID NO：5自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列组成，引物4和引物5的3′末端第1个碱基分别设计为G和T，为AhFAD2B和AhFAD2Aindel基因的等位变异碱基，并将引物4的3′端第4个碱基G和引物2的3′端第3个碱基T分别替换为A和C；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，其3′末端第1个碱基为B基因组特异的C。
4、用于凝胶电泳检测AhFAD2A和AhFAD2B基因等位变异的STARP标记设计
对于不具备荧光检测平台的实验室，可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳条带位置差异即带型(扩增产物大小的变异)进行等位基因变异位点检测。引物设计时基于进一步降低引物成本考虑，本发明设计三引物扩增的STARP标记体系，每个STARP标记包含3条引物，即2条等位基因特异引物AS1和AS2，1条共用反向引物CommonR，其中AS1和AS2于上述等位基因特异性序列AS相同，并可在AS2的序列的5′末端连接的5′-TGCTGACGAC-3′，两者在PCR扩增产物的长度上产生10bp的差异。
具体的，针对AhFAD2A和AhFAD2Asnp等位变异设计等位基因特异性引物组3，可包含上游引物7、引物8和下游共用反向引物3，引物7的核苷酸序列为SEQ ID NO：1自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列；引物8的核苷酸序列由SEQ ID NO：2自5′末端起第22至42位所示的核苷酸序列和其5′末端连接的5′-TGCTGACGAC-3′组成。下游共用反向引物3可为SEQID NO：3所示。
具体的，针对AhFAD2B和AhFAD2Bindel等位变异设计等位基因特异性引物组4，可包含上游引物9、引物10和下游共用反向引物6，引物9的核苷酸序列为SEQ ID NO：4自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列组成；引物10的核苷酸序列由SEQ ID NO：5自5′末端起第22至36位所示的核苷酸序列和其5′末端连接的5′-TGCTGACGAC-3′组成。下游共用反向引物6可为SEQ ID NO：6所示。
实施例2、STARP标记用于高油酸花生基因型检测的方法的建立
1、供试花生材料及其基因组DNA的提取
(1)供试花生材料选取
本发明供试花生材料为高油酸花生新品系201731-1933和普通油酸含量花生品系201521-2612，其中201731-1933的AhFAD2A基因存在G448A替换，基因型为AA纯合型，AhFAD2B基因存在441_442InsA突变，基因型为InsA纯合型；201521-2612的AhFAD2A基因448G和AhFAD2B基因441_442均未发生突变，基因型分别为GG纯合型和Del型。
(2)基因组DNA的提取
A、取少量幼嫩花生叶片(约1g)置于研钵中，用液氮研磨至粉状，加入已经在65℃水浴中预热的700μL 2％CTAB和0.2β-巯基乙醇抽提缓冲液中，轻轻混匀；
B、置于65℃的水浴槽中，每隔10min轻轻摇动混匀一次，40min后取出；
C、置于室温冷却5min后，加入300μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，剧烈振荡充分混匀2-3min；
D、放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600μL的4℃预冷的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
E、移液器轻轻吸取离心管上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，-20℃放置30min；
F、在离心机上10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出；
G、用70％的乙醇洗涤沉淀2-3次，将离心管倒立于铺开的纸巾上，室温下风干；
H、加入50μL 0.5×TE(含0.5μL RNase 10mg/mL)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱1h，使RNA消解；
I、取0.5μL样品用紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度，结果显示提取的样品DNA A260/A280比值介于1.8-2.0，表明所提取的DNA纯度较高，根据测定的浓度值将样品浓度统一调整为50ng/μL。
J、置于-20℃保存，备用。
2、用实施例1的引物组1和引物组2检测花生AhFAD2A和AhFAD2B的基因型
以步骤1提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测花生AhFAD2A和AhFAD2B等位基因变异的STARP标记引物(基于荧光信号检测)进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
(1)采用所述引物组1和引物组2时，PCR反应体系为5μL，可包括：0.5μL 10×NH4+buffer、0.8μL浓度为5M的Betaine、0.2μL 1％(w/v)牛血清蛋白BSA、0.15μL浓度为50mM的MgCl2、0.1μL浓度为2.5mM的dNTP、0.05μL浓度为10μM反向引物水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA1水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA2水溶液、0.01μL浓度为10μM AMAS1引物、0.01μL浓度为10μM AMAS2引物、0.05μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板和2.08μL的ddH2O。其中反向引物可为引物组1中的引物3或引物组2中的引物6，AMAS1引物可为引物组1中的引物1或引物组2中的引物4，AMAS2引物可为引物组1中的引物2或引物组2中的引物5。以水代替基因组DNA模板的反应体系设置为空白对照。
采用所述引物组1和引物组2时，PCR的扩增程序可为：94℃预变性3min；94℃变性20s、复性2min(56℃→50℃，每个循环降低1℃)，6个循环；94℃变性20s、60℃复性1min，36个循环；62℃延伸2min；4℃保存。PCR反应在BioRad的MyCycler PCR仪上进行。
(2)荧光信号扫描可使用微孔板阅读器BioTek的Synergy2酶标仪扫描PCR扩增产物，FAM荧光基团在激发光495nm，发射光521nm波长下观察读值；HEX荧光基团在激发光535nm，发射光556nm波长下观察读值；系统参比荧光ROX在激发光575nm，发射光602nm波长下观察读值。
(3)用Kluster Caller分型软件对扫描读值数据进行分析，根据分析结果确定待测花生AhFAD2A和AhFAD2B的基因型。若待检测花生材料扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller分析在所得的分型聚类图中呈蓝色，则扩增产物为连接FAM荧光标签序列Tail1的基因，则所述待检测花生AhFAD2A的基因型为GG纯合型，AhFAD2B的基因型为Del纯合型；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller分析在所得的分型聚类图中呈现红色，则扩增产物为连接HEX荧光标签序列Tail2的基因，则所述待检测花生AhFAD2A的基因型为AA基因型，AhFAD2B的基因型为InsA纯合型；若所述待检测花生材料的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller分析在所得的分型聚类图中呈现绿色，则所述待检测花生AhFAD2A的基因型为GA杂合型，AhFAD2B的基因型为InDel纯合型。分型聚类图中出现粉色可能是因DNA质量较差或者浓度较低，扩增产物无信号或信号弱，紫色为有信号但无明显分型，黑色(位于左下角)为空白对照NTC。
3、用实施例1的引物组3和引物组4检测花生AhFAD2A和AhFAD2B的基因型
以步骤1提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测花生AhFAD2A和AhFAD2B等位基因变异的STARP标记引物(基于凝胶片段大小差异检测)进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
(1)采用所述引物组3和引物组4时，PCR扩增可采用10μL反应体系：5μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板、0.5μL浓度为2μM AS1引物、0.5μL浓度为2μM AS2引物、1.0μL浓度为2μM反向引物和2μLddH2O。其中反向引物可为引物组1中的引物3或引物组2中的引物6，AS1引物可为引物组3中的引物7或引物组2中的引物9，AS2引物可为引物组1中的引物8或引物组2中的引物10。
采用所述引物组3和引物组4时，PCR的扩增程序可为：94℃预变性3min；94℃变性30s、复性30s(68℃→58℃，每个循环降低1℃)，10个循环；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(2)PCR扩增产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色、显影后，对条带大小进行判断，根据不同的带型将检测的花生材料等位基因进行分型。
(3)以AhFAD2A为目的基因的PCR扩增产物大小为206bp和以AhFAD2B为目的基因的PCR扩增产物大小为194bp的待测花生材料为AhFAD2A为GG纯合基因型和AhFAD2B为Del纯合基因型，即待测花生材料为普通油酸含量花生；以AhFAD2A为目的基因的PCR扩增产物大小为216bp和以AhFAD2B为目的基因的PCR扩增产物大小为204bp的待测花生材料为AhFAD2A为AA纯合基因型和AhFAD2B为InsA纯合基因型，即待测花生材料为高油酸花生。
实施例3、STARP标记鉴定FAD2基因型的方法在高油酸花生育种中的应用
利用本发明开发的STARP标记检测高油酸花生与普通花生杂交组合后代RIL群体家系的基因型，采用基因测序结果对分型结果进行验证，气相色谱法测试RIL群体家系的脂肪酸含量，分析花生油酸含量与基因型的关系。
1、供试花生材料的选取
供试的花生材料为“0607-5×皖花7号”杂交组合后代RIL群体家系218个，该群体经自交和单粒传已形成F7代家系，家系内部遗传稳定、性状整齐一致。
2、基因组DNA的提取
花生品种叶片基因组DNA的提取参见实施例2步骤1。
3、PCR扩增反应和PCR扩增产物检测
采用实施例1开发的引物组1、引物组2、引物组3和引物组4，对RIL群体的218个株系及其亲本材料的AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型进行检测，等位基因PCR扩增方法和产物检测方法参见实施例2步骤2和步骤3，获得220份花生材料的AhFAD2A和AhFAD2B基因型。
4、应用STARP标记对RIL群体家系进行AhFAD2A和AhFAD2B基因分型分析
采用引物组1和引物组2扩增的等位基因PCR产物根据荧光信号差异判断待测RIL家系的基因型，采用引物组3和引物组4扩增的等位基因PCR产物根据凝胶片段大小差异判断待测RIL家系的基因型。理论上，RIL群体中家系纯合，若有2对隐性主基因差异(A-a、B-b)，则存在4种不同的基因型，即AABB、AAbb、aaBB和aabb，各基因型的家系比例分别为1：1：1：1。采用实施例2步骤2和步骤3确定待测家系的基因型，结果如表1所示。通过比较，引物组1和引物组2联合判断某一家系的AhFAD2A和AhFAD2B基因型结果，与引物组3和引物组4联合判断该家系的AhFAD2A和AhFAD2B基因型结果完全相同，说明两种STARP标记具有完全一致的检测效果。
表1 RIL群体家系STRAP标记检测基因型和油酸含量结果
Figure BDA0003188273770000131
Figure BDA0003188273770000141
Figure BDA0003188273770000151
Figure BDA0003188273770000161
注：F代表RIL群体杂交组合母本0607-5，M代表RIL群体杂交组合父本。
5、测序法验证STARP标记检测AhFAD2A和AhFAD2B等位基因变异的准确性
从218个家系中，随机抽取28个家系和亲本0607-5、皖花7号的PCR扩增产物，采用基因测序的方法获得扩增产物的核苷酸序列，与步骤4判断的结果相比对，结果完全一致，说明本发明设计的STARP标记引物组可用于检测待测花生样品的基因型。
6、花生油酸含量与基因型的关系
表2 RIL群体家系基因型与油酸含量的关系
Figure BDA0003188273770000162
Figure BDA0003188273770000171
注：*RIL群体家系基于AhFAD2A和AhFAD2B的4种纯合基因型。**不同字母代表不同基因型间油酸含量均值差异显著(p<0.05)。
采用国标法(GB/T 5510-2011)处理220份花生材料种子样品，用Agilent 7890B型气相色谱仪分析花生脂肪酸甲脂，各家系油酸含量见表1。按照基因型将220份花生材料归类，即分为4种基因型材料：AA/Ins、GG/Ins、AA/Del和GG/Del。根据测得的花生油酸含量数据，分别计算各类型的油酸含量平均值列于表2。经各基因型油酸含量平均值的方差分析判断，不同基因型的花生材料间油酸含量差异显著(p<0.05)。其中，AhFAD2A和AhFAD2B纯合突变基因型(AA/Ins)材料油酸含量平均值最高，属于高油酸花生，其显著高于其他三种基因型的油酸含量平均值。而GG/Del基因型的油酸含量平均值最低，属于普通油酸花生。以上结果表明，可以利用本发明的STARP标记引物组及其配套的基因型检测方法鉴定和筛选高油酸花生材料。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 检测高油酸花生基因型的引物组合、方法及应用
<130> 20210720
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcaacaggaa ccagctatga cttttgggac aaacactttg tc 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gacgcaagtg agcagtatga cttttgggac aaacacttca tt 42
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tccaaggctg cattctcact 20
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcaacaggaa ccagctatga cacttcgtcg cgatcg 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gacgcaagtg agcagtatga cacttcgtcg cggcct 36
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atccaaggct gcattctcac c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttttgggaca aacactttgt c 21
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tgctgacgac ttttgggaca aacacttcat t 31
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
acttcgtcgc gatcg 15
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tgctgacgac acttcgtcgc ggcct 25

Claims (10)

1.一种检测高油酸花生基因型的引物组合，其特征在于，包括：
第一引物组，所述第一引物组在引物组1和引物组3中任取一至二种，
第二引物组，所述第二引物组在引物组2和引物组4中任取一至二种；其中，
引物组1和引物组3用于扩增AhFAD2A，引物组2和引物组4用于扩增AhAFD2B；
引物组1包括特异性引物组1，引物组2包括特异性引物组2；
特异性引物组1包括引物1、引物2和引物3；
特异性引物组2包括引物4、引物5和引物6；
引物组3包括引物7、引物8和引物3；
引物组4包括引物9、引物10和引物6。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，
引物组1和引物组2均还包括加荧光修饰的通用引物PEA1和PEA2。
3.一种检测高油酸花生基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S110：提取待检测花生样品的基因组DNA；
S120：以待测花生的基因组DNA为PCR扩增模板，使用权利要求1-2中任一项所述的引物组合进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物；
S130：分离和纯化扩增产物片段，采用荧光检测仪或非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析；
S140：根据上述测试结果，获得待测花生的基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S120中，使用引物组1和/或引物组2进行PCR扩增时：
PCR反应体系为5μL，包括，0.5μL 10×NH4+buffer、0.8μL浓度为5M的Betaine、0.2μL1％(w/v)牛血清蛋白BSA、0.15μL浓度为50mM的MgCl2、0.1μL浓度为2.5mM的dNTP、0.05μL浓度为10μM反向引物水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA1水溶液、0.025μL浓度为10μM的引物PEA2水溶液、0.01μL浓度为10μM AMAS1引物、0.01μL浓度为10μM AMAS2引物、0.05μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板和2.08μL的ddH2O；其中，反向引物为引物组1中的引物3或引物组2中的引物6，AMAS1引物为引物组1中的引物1或引物组2中的引物4，AMAS2引物为引物组1中的引物2或引物组2中的引物5；
PCR的扩增程序为，94℃预变性3min；94℃变性20s、复性2min——56℃→50℃，每个循环降低1℃，6个循环；94℃变性20s、60℃复性1min，36个循环；62℃延伸2min；4℃保存。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S120中，使用引物组3和/或引物组4进行PCR扩增时：
PCR反应体系为10μL，包括，5μL浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶、1.0μL浓度为50ng/μL的基因组DNA模板、0.5μL浓度为2μM AS1引物、0.5μL浓度为2μM AS2引物、1.0μL浓度为2μM反向引物和2μLddH2O；其中，反向引物为引物组3中的引物3或引物组4中的引物6，AS1引物为引物组3中的引物7或引物组2中的引物9，AS2引物为引物组3中的引物8或引物组4中的引物10；
PCR的扩增程序为，94℃预变性3min；94℃变性30s、复性30s——68℃→58℃，每个循环降低1℃，10个循环；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S130中，对于引物组1和/或引物组2的扩增产物，使用荧光检测仪对扩增产物进行分析。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S130中，引物组3和/或引物组4的扩增产物，使用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分析。
8.权利要求1-2中任一项所述引物组合的应用，其特征在于，包括：
在花生育种中的应用；
在鉴定或辅助鉴定高油酸花生中的应用；
在筛选或辅助筛选高油酸花生中的应用；
制备用于检测待测花生的基于STARP标记的基因型的试剂盒。
9.一种鉴定花生高油酸性状的方法，使用权利要求1-2中任一项所述的引物组合检测待测花生的基因型，
使用引物组1和引物组2时，AhFAD2Asnp基因型为GG和AhFAD2Bindel基因型为Del的待测花生材料为普通油酸花生，AhFAD2Asnp基因型为AA和AhFAD2Bindel基因型为Ins的待测花生材料为高油酸花生；
使用引物组3和引物组4时，AhFAD2Asnp基因型为206bp和AhFAD2Bindel基因型为194bp的待测花生材料为普通油酸花生，AhFAD2Asnp基因型为216bp和AhFAD2Bindel基因型为204bp的待测花生材料为高油酸花生。
10.一种高油酸花生育种方法，其特征在于，使用权利要求1-2中任一项所述的引物组合检测待测花生的基因型，选择AA和Ins纯合型的花生作为亲本进行高油酸花生育种。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328198A (zh) * 2014-11-14 2015-02-04 河南省农业科学院 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法
CN108588272A (zh) * 2018-08-01 2018-09-28 中国农业大学 一种与小麦株高和穗长性状主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用
CN109593876A (zh) * 2019-01-25 2019-04-09 河北省农林科学院粮油作物研究所 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
CN111411168A (zh) * 2020-05-07 2020-07-14 中国农业科学院作物科学研究所 一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328198A (zh) * 2014-11-14 2015-02-04 河南省农业科学院 检测高油酸花生fad2a和fad2b基因位点突变基因型的引物及其pcr检测方法
CN108588272A (zh) * 2018-08-01 2018-09-28 中国农业大学 一种与小麦株高和穗长性状主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用
CN109593876A (zh) * 2019-01-25 2019-04-09 河北省农林科学院粮油作物研究所 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用
CN111411168A (zh) * 2020-05-07 2020-07-14 中国农业科学院作物科学研究所 一种用于培育优质小麦的亲本品种的筛选方法及其使用的引物组组合

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LONG YM等: "An innovative SNP genotyping method adapting to multiple platforms and throughputs", 《THEOR APPL GENET》, vol. 130, no. 3, 9 December 2016 (2016-12-09), pages 597 - 607, XP036161129, DOI: 10.1007/s00122-016-2838-4 *
柴岭岭: "普通小麦2D染色体株高和穗长QTL的精细定位与图位克隆", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 农业科技辑》, no. 02, 15 February 2019 (2019-02-15), pages 24 *

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