CN105524929B - 水稻中胚轴延长基因OsMsc8及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻中胚轴延长基因OsMsc8及其应用；水稻中胚轴延长基因OsMsc8的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因功能在水稻中首次报道，mRNA表达分析表明该基因表达受光照抑制，长中胚轴水稻品种该基因表达量极显著高于短中胚轴品种。在短中胚轴水稻品种日本晴中过量表达该基因中胚轴延长长度极显著增加。因此，通过过量表达OsMsc8基因可以极显著增加水稻品种的中胚轴延长长度，提高旱直播水稻出苗率和整齐性。

Description

水稻中胚轴延长基因OsMsc8及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻中胚轴延长基因OsMsc8序列及其应用。
背景技术
随着旱直播在雨育田和缺水地区的推广应用，具有抗旱能力的水稻品种可以采用机械化旱直播、免耕直播等环保、节约生产成本的新型栽培方式(Bhushan2007)。由于直播用种量大，造成成本上升，尤其是杂交稻组合的种子价格较高，制约了机械化旱直播的进一步推广应用。旱直播水稻出苗是否快速整齐，是制约产量潜力和田间管理的因素之一，而机械化直播中覆土深度的控制有重要作用同时也有技术难度。水稻种子在黑暗条件下萌发时，除胚芽鞘延长外，中胚轴的延长是影响深直播水稻种子顶土出苗能力的主要因素之一(张光恒2005)。中胚轴是指胚根着生点到胚芽鞘节之间的部分，中胚轴长的材料，其中胚轴延长明显，出苗速度快，出苗率高。研究表明水稻中胚轴延长特性有助于种子从较深土层下快速、整齐地出面。水稻直播的技术方法都要求播种深度2～3cm以内，强调播种过深后会造成出苗率低、整齐性差。由于现有的绝大部分水稻品种或者杂交组合都是在水田移栽的栽培技术体系中选育出来的，这些品种很少具有中胚轴延长特性(Ju et al.,2007；Wu etal.,2013)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻中胚轴基因OsMsc8及其应用，该基因可作为目的基因在水稻中过量表达，可以极显著增加水稻中胚轴延长长度，进而提高水稻旱直播的出苗率和整齐性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种水稻中胚轴延长基因OsMsc8，所述基因OsMsc8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。共342个碱基。
所述的水稻中胚轴延长基因OsMsc8序列的克隆方法包括如下步骤：
S1、水稻组织总RNA的提取；
S2、利用NCBI网站的基因数据中检索到的水稻基因序列，设计引物从组织cDNA文库中钓出OsMsc8的全长序列；所述引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
S3、以所述水稻组织总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶进行PCR扩增，琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pEasy-Blunt Simple载体，测序正确后获得具有完整编码区的水稻中胚轴延长基因OsMsc8的全长序列。
第二方面，本发明涉及一种所述的基因OsMsc8表达的水稻中胚轴延长蛋白OsMsc8，所述蛋白OsMsc8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。共113个氨基酸。
第三方面，本发明涉及一种重组表达载体，包括原始载体和导入所述原始载体的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述原始载体为双元表达载体pCAMBIA1305.1。
第四方面，本发明涉及一种包含所述重组表达载体的转化子。
优选的，宿主菌为农杆菌。
第五方面，本发明涉及一种所述的基因OsMsc8在水稻中胚轴遗传改良中的应用。所述遗传改良指的是增加水稻中胚轴延长长度。过量表达该基因能够极显著增加水稻中胚轴延长长度。
优选的，构建OsMsc8基因过量表达载体，转化至水稻品种中。
优选的，所述水稻品种为短中胚轴水稻品种。
优选的，所述构建OsMsc8基因过量表达载体中，用于扩增所述OsMsc8基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述构建OsMsc8基因过量表达载体中，所述过表达载体是将OsMsc8基因插入双元表达载体pCAMBIA1305.1的SacI和PstI内切酶位点所得。
第六方面，本发明涉及一种所述水稻中胚轴延长蛋白OsMsc8在水稻中胚轴遗传改良中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明公开水稻中胚轴延长基因OsMsc8序列及其所编码的蛋白质；mRNA表达分析该基因表达受光照抑制(图2)，长中胚轴水稻的OsMsc8表达量显著高于短中胚轴品种(图3)。
2)本发明首次公开了水稻中胚轴延长基因OsMsc8的功能，该基因影响水稻的中胚轴延长，可应用于水稻中胚轴的遗传改良。
3)本发明首次获得OsMsc8基因过量表达的转基因植株，表现出中胚轴长度比野生型日本晴显著增长(图5)。
4)通过过量表达OsMsc8基因来增加短中胚轴水稻品种的中胚轴延长长度(图1、图5)，中胚轴延长能够使水稻快速、整齐的出苗，是水稻旱直播技术推广的重要前提。
附图说明
图1为过量表达OsMsc8转基因T1代株系表型图；
图2为光照对OsMsc8基因表达的影响示意图；
图3为OsMsc8基因在长中胚轴与短中胚轴水稻品种中表达特征示意图；
图4为转基因T1代株系OsMsc8基因表达量检测示意图；
图5为过量表达OsMsc8转基因T1代株系中胚轴延长长度示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例
一、水稻中胚轴延长基因OsMsc8序列的克隆
1)总RNA的提取
水稻扎西马(长中胚轴品种)种子经脱壳、消毒后接种在MS培养基上，黑暗条件下30度发芽7天，在微弱绿光下取中胚轴部位迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品置于2.0ml离心管中，用液氮研磨，磨细后加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen,USA)充分摇匀震荡后，抽提总RNA。
2)OsMsc8基因全长的克隆
利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据中检索到的水稻基因序列，设计引物(如下)从组织cDNA文库中钓出OsMsc8的全长序列。序列见SEQ ID NO.1。
CMsc8-F:5-ATGTCGACCGAGGGGTGCTCC-3(SEQ ID NO.3)
CMsc8-R:5-TCAAAAACGCCGGATCTGGTC-3(SEQ ID NO.4)
以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(PrimeStar HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃复性5s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。PCR产物为342bp。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pEasy-Blunt Simple载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，测序正确后获得具有完整编码区的水稻中胚轴延长基因OsMsc8的全长序列(SEQ ID NO.1)。
二、OsMsc8基因表达模式
1)光照对OsMsc8基因表达的影响
选取3个长中胚轴水稻品种(扎西马、云陆8号以及八月糯)，种子处理及培养方法与步骤一一致，培养到第6天时每个品种分两份，一份继续黑暗培养，另外一份进行光照处理24小时，同时取光照处理和黑暗处理中胚轴部位进行总RNA提取，获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行定量PCR检测(定量PCR引物如下)，PCR程序如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，40个循环后，溶解曲线，程序：95℃变性10s，65℃变性5s，95℃延伸5s，60个循环。结果表明OsMsc8基因在这三个品种中表达都受到光照强烈抑制(图2)。
Msc8–F:5-CCTCGTCTTCTGGACCGC-3(SEQ ID NO.5)
Msc8–R:5-GAGGAAAAGGGGAGGGAC-3(SEQ ID NO.6)
2)长与短中胚轴品种OsMsc8基因表达模式
选取3个长中胚轴水稻品种(扎西马、云陆8号以及八月糯)与3个短中胚轴水稻品种(日本晴、沪旱15以及台中65)，种子处理及培养方法与步骤一一致，培养到第7天时在微弱绿光下取中胚轴部位提取总RNA，RNA提取、定量引物以及方法与步骤一一致，结果表明OsMsc8基因在长中胚轴品种在表达量极显著高于短中胚轴水稻品种(图3)。
三、过量表达OsMsc8基因
1)过量表达载体的构建
根据水稻中胚轴延长基因OsMsc8的cDNA序列，见SEQ ID NO.1的全长编码序列，在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点SacI和PstI，设计引物为：
OeMsc8-F:5-AGAGCTCATGTCGACCGAGGGGTGCTCC-3(SEQ ID NO.7)
OeMsc8-R:5-TCTGCAGTCAAAAACGCCGGATCTGGTC-3(SEQ ID NO.8)
以上述步骤一中获得的cDNA克隆为模板，用高保真酶(Prime Star HS DNApolymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃复性5s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。PCR产物为342bp。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pEasy-Blunt Simple载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，测序正确后通过相应的酶切位点导入双元表达载体pCAMBIA1305.1，然后转化至EHA105(XuM,Zhu L,Shou H,Wu P.A PIN1family gene,OsPIN1,involved in auxin-dependentadventitious root emergence and tillering in rice.Plant Cell Physiol.2005，46:1674-81.)农杆菌中。
2)过量表达转基因植株的获得及表达量检测
获得的转有表达载体的农杆菌，进一步转化至短中胚轴水稻品种日本晴，对获得的转基因T0代植株进行定量PCR检测，定量PCR引物和方法与步骤二一致，获得两个(Oe-Msc8-2、Oe-Msc8-5)表达量极显著上调的转基因植株(图4)，移栽至转基因试验田、收种用于后代表型鉴定。
3)过量表达转基因T1代株系中胚轴延长长度测定
将获得的两个转基因(Oe-Msc8-2、Oe-Msc8-5)株系和野生型日本晴种子经消毒接种在MS培养基上，种子处理和培养方法与步骤一一致，30度黑暗条件下培养7天后测定中胚轴延长长度，结果表明两个转基因株系中胚轴延长长度显著长于野生型日本晴中胚轴延长长度(图1、图5)。因此，OsMsc8基因可以作为目的基因来改良短中胚轴水稻品种的中胚轴延长长度，提高旱直播水稻的出苗率、整齐性。

Claims (5)

1.一种水稻中胚轴延长基因OsMsc8在水稻中胚轴遗传改良中的应用，所述基因OsMsc8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，构建OsMsc8基因过量表达载体，转化至水稻品种中。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻品种为短中胚轴水稻品种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建OsMsc8基因过量表达载体中，用于扩增所述OsMsc8基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
5.一种水稻中胚轴延长基因OsMsc8表达的水稻中胚轴延长蛋白OsMsc8在水稻中胚轴遗传改良中的应用，所述蛋白OsMsc8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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