CN104673917B - 稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记Pi35‑dCAPS及其方法与应用。通过比对和分析多个水稻品种中Pi35等位基因序列，得到有别于Pi35感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi35功能特异性位点1处（3780T）；通过设计引物，分别得到SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2；利用该引物扩增水稻总DNA,并对扩增产物进行特异性酶切及电泳检测后获得Pi35的功能性分子标记Pi35‑dCAPS。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定稻瘟病抗性基因Pi35，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中应用。

Description

稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用。
背景技术
稻瘟病是危害最严重、分布最广泛的稻作病害之一，严重影响了水稻的产量和质量。全球每年因稻瘟病危害造成的水稻产量损失达到水稻总产量的10％～30％。在我国，稻瘟病年发病面积达300～600万hm2，严重年份可达800万hm2，损失稻谷数亿公斤，严重威胁着我国的粮食安全。培育和推广种植抗病品种是控制稻瘟病最安全、经济而有效的措施。
水稻对稻瘟病的抗性分为质量抗性和数量抗性。质量抗性一般由单个或少数几个主效基因控制，能够抑制稻瘟病菌的侵入和繁殖，因而呈现高水平的完全抗性。其缺点是对稻瘟病小种菌具有很强的专化性，致使具有这类抗性的水稻品种往往大面积推广3～5后就丧失抗性，给水稻生产造成新的损失。数量抗性基因，又称田间抗性或部分抗性，通常受多个微效基因或数量抗性位点(QTL)控制。这类抗性不能完全抑制稻瘟病菌的侵入，但可以限制稻瘟病菌的繁殖及病斑的扩展，进而减轻水稻发病的程度。数量抗性对稻瘟病菌小种无专化性或专化性很弱，具有广谱和持久抗病的特点是具有这类抗性的水稻在生产上往往具有持久抗病的优点。因此，数量抗性基因的发掘和利用对于培育广谱持久抗稻瘟病品种尤为重要。
传统的水稻抗病育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者具有丰富的经验和敏锐的洞察力，而且鉴定结果极易受环境条件和人为因素的影响，从而降低了目标基因的选择效率。另外，由于受可鉴别不同基因的鉴别菌系的限制，单纯地依赖表型鉴定很难实现多个抗性基因的聚合。随着分子标记辅助选择技术的产生和发展，它便捷、直接、不受环境影响的优点使其应用价值及前景越来越受到关注。开发并应用与抗性基因紧密连锁的分子标记，特别是基于基因自身序列的功能性分子标记进行辅助选择，不仅可以大大提高抗源筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率,而且使得通过基因聚合手段培育持久、广谱抗病良种成为可能。
迄今，国内外利用分子标记技术已鉴定和定位了70多个水稻稻瘟病抗性基因，克隆了Pia、Pib、Pita、Pi1、Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik-m、Pik-p、Pik-h、Pi5、Pi54、Pit、Pish、Pi64等20个主效抗性基因，以及pi21、Pb1、Pi63和Pi35等4个数量抗性基因；并开发了针对Pita、Pib、Pik、Pikm、Pikp、Pi1、Pit、Pi5、Pi25和Pi64等10个主效抗性基因的功能性标记。但是，迄今尚无关于数量抗性基因功能性标记开发的报道。
在已克隆的4个数量抗性基因中，Pb1基因编码一个非典型的NBS-LRR蛋白，它源自籼稻品种Modan，对穗瘟具有较强的抗性，对叶瘟也有部分抗性，在田间表现较好的持久抗病性，从而使得含有该基因的品种在日本不同地区种植了30年仍然未丧失抗性(Hayashi等2010；Fuji等2005)。pi21基因是一个隐性的部分抗性基因，编码一个含有重金属结合结构域和假定的蛋白-蛋白互作结构域的富含脯氨酸的蛋白，它源自粳稻品种Owarihatamochi(Fukuoka等，2009)。pi21基因具有非小种专化性，它对防卫反应的一些特殊机制可能赋予其持久抗病性，从而使得含有该基因的品种可以在日本种植几十年而不丧失抗性。Pi63基因编码一个典型的NBS-LRR蛋白，它源自日本水稻品种Kahei，该品种含有多个QTL抗性位点，对稻瘟病表现出较强的田间抗性，Pi63基因是其中贡献率最大的QTL,基因克隆表明Pi63的抗性水平与基因本身的表达水平有关，表现出剂量效应依赖的抗性模式(Xu等2014)。Pi35基因也编码一个NBS-LRR家族蛋白，它源自日本粳稻品种Hokkai188(Nguyen等，2006)。Pi35是最近被鉴定和克隆的一个新的稻瘟病部分抗性基因，该基因是Pish的等位变异基因，其多个功能性碱基多态性(multiple functional polymorphisms)的共同作用对稻瘟病菌提供了高水平的持久抗性(Fukuoka等，2014)。携带Pi35基因的2个粳稻品种北海188(Hokkai 188)和藤系138(Fukei 138)在日本自育成至今近半个世纪以来一直表现稳定且高水平的叶瘟抗性，是日本水稻育种的骨干抗源(Mikami等，1990；Nguyen等，2006；Fukuoka等，2014)。Pi35基因的克隆为在育种上有效利用该基因奠定了基础，但迄今尚未见其功能性标记开发的报道。为了加快Pi35基因在育种中的应用进程，提高后代的选择效率，降低育种成本，开发出可以准确有效的鉴定数量抗性基因的功能性分子标记，对通过分子育种手段快速、高效培育持久、广谱抗稻瘟病品种具有特别重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS。
本发明的另一个目的是提供利用上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的方法。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案是：一种稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记，利用所述分子标记扩增的PCR产物序列如SEQ ID NO.9所示，并且通过特异限制性内切酶TaiI酶切后成为2个片段，大小分别为244bp和28bp。
所述分子标记与从特定水稻品种中扩增出来的稻瘟病抗性基因Pi35呈现一致带型。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pi35的等位基因序列与Pi35(基因登录号FW369319)序列做比对的方法，分析得到能区分其他等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pi35功能特异性的一处单碱基差异(3780T)，再通过设计引物得到SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2引物序列，对水稻总DNA扩增、酶切以及琼脂糖凝胶电泳检测，得到可以特异鉴定Pi35基因的功能性分子标记Pi35-dCAPS，具体步骤如下：
(1)通过水稻数据库(http://www.gramene.org/)及常规PCR法扩增并测序获得多个水稻品种的Pi35等位基因的编码区DNA序列；
所用引物对的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO.3：CCTTCATCCCTCAACGTTTTTGTCTCCAAG
SEQ ID NO.4：ATCGGTATGGAACACTCCAATCCAACTTGT
(2)利用多序列比对软件工具Clustal W，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白序列后进行比对，得到Pi35抗性基因所特异的1个多态性位点，即Pi35编码区的3780T位点，对应氨基酸位点为1260Cys；
(3)根据步骤(2)得到的1个多态性位点分别设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；并用这1对引物分别对不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物，然后对扩增产物进行酶切、电泳检测，得到与稻瘟病抗性基因Pi35呈特异性带型的核苷酸片段；
(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，确定Pi35的功能性分子标记Pi35-dCAPS。
上述的方法，步骤(1)中所述的水稻品种为藤系138、日本晴和丽江新团黑谷(LTH)；所述的PCR扩增，其中扩增PCR反应体系如下：2×PCR Buffer for KOD FX 25μl，dNTPs(2mM each)10μl，引物(10pmol,SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4)2μl，KOD FX酶(1U/μl,TOYOBO)1μl，DNA模板(100ng/μl)2μl，加ddH2O至50μl，扩增反应条件：94℃2min；98℃10s→59℃15s→68℃7min，35个循环；68℃5min，10℃保存；PCR产物大小为6941bp。
步骤(3)中所述的常规PCR扩增，其中扩增PCR反应体系如下：2×PCR Buffer forKOD FX 10μl，dNTPs(2mM each)4μl，引物(10pmol,SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.2)1μl，KOD FX酶(1U/μl,TOYOBO)0.4μl，DNA模板(100ng/μl)2μl，加ddH2O至20μl；扩增反应条件：94℃2min；98℃10s→59℃15s→68℃30s，35个循环；68℃5min，10℃保存；
步骤(3)中所述的扩增产物的大小为272bp，经TaiI酶切，酶切体系和条件为PCR产物15μl，10×Buffer 2μl，TaiI酶1μl，ddH2O22μl，于65℃酶切3h后；酶切后成为2个片段，大小分别为28bp和244bp，取适量酶切产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，得到与稻瘟病抗性基因Pi35呈特异性带型的核苷酸片段，则待测水稻植株或品种含有稻瘟病抗性基因Pi35。
本发明提供一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的方法，该方法是：以待测水稻植株或品种的总DNA为模板，采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物对进行PCR扩增，如果得到的扩增产物大小为272bp，并经特异限制性内切酶TaiI酶切后成为2个片段，大小分别为244bp和28bp，则待测水稻植株或品种含有稻瘟病抗性基因Pi35；否则待测水稻植株或品种不含有稻瘟病抗性基因Pi35。
所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物对进行PCR扩增，其扩增的PCR反应体系如下：2×PCR Buffer for KOD FX 10μl，dNTPs(2mMeach)4μl，引物(10pmol,F+R)1μl，KOD FX酶(1U/μl,TOYOBO)0.4μl，DNA模板(100ng/μl)2μl，加ddH2O至20μl，扩增反应条件：94℃2min；98℃10s→59℃15s→68℃30s，35个循环；68℃5min，10℃保存。
所述的方法，采用特异的限制性内切酶TaiI酶切所述的PCR扩增产物，其酶切体系和条件如下：PCR产物15μl，10×Buffer 2μl，TaiI酶1μl，ddHO22μl，65℃酶切3h后经2％琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明还提供一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的引物对，所述引物对由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的两条引物组成，具体序列如下。
SEQ ID NO.1：GCCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATACG(倒数第二个碱基C为人为引入的突变碱基位点)
SEQ ID NO.2：GGTGTCTGCAAAACAAAGGAAACGTGAAG
本发明还提供一种含有所述的引物对的鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的试剂盒。
本发明还提供一种所述的引物对，所述的试剂盒，或所述的分子标记的应用，将其用于培育水稻抗稻瘟病品种的分子标记辅助育种、基因聚合育种或转基因育种中，还可用于在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定所述功能抗性基因Pi35。
本发明具有如下明显的有益效果：
Pi35基因是一个数量抗性基因，具有稳定、持久的田间抗性，在水稻育种中具有广泛的应用价值。
本发明通过比较不同水稻品种Pi35等位基因编码区序列，基于Pi35基因特有的DNA序列位点开发出一套功能性分子标记Pi35-dCAPS。应用这套标记，以常规的PCR技术为基础辅助以限制性酶切，不仅能够区分不同水稻品种资源的Pi35基因型，而且能够快捷有效地从育种群体中筛选到携带Pi35基因的个体。这套分子标记遗传稳定，不受环境因素的影响，可以100％的鉴定出Pi35基因。
应用本发明的功能性分子标记Pi35-dCAPS对目标基因进行常规杂交或回交转育，以及与其他基因聚合，其育种选择目标明确，可以大大节约时间和成本，提高抗稻瘟病育种效果。本发明的分子标记由于源自基因内部功能性位点之多态性，不存在不良性状的遗传重组问题。因此，本发明提供的分子标记，对于加速水稻稻瘟病抗性基因Pi35在水稻育种中的应用具有重要意义。
附图说明
图1为藤系138及其衍生品种系谱图。
图2为Pi35/Pish位点等位基因氨基酸序列比对，其中，箭头表示Pi35蛋白中第1260位特异的半胱氨酸。
图3为藤系138、日本晴和LTH对2个稻瘟病菌株的反应型(A)和3个等位基因Pi35、pi35-LTH和Pish的RT-PCR分析(B)。
图4为DNA序列多态性和标记Pi35-dCAPS引物位置。
图5为Pi35-dCAPS标记在3个水稻品种中的检测结果，其中，A为酶切前PCR产物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。
图6为Pi35-dCAPS标记对10份藤系138衍生品种的检测，其中，A为酶切前PCR产物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-11分别为藤系138、垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号、龙粳34、垦稻12号、垦稻16号、龙花00-835、龙粳10号和龙粳13号。
图7为Pi35-dCAPS标记在部分水稻种质资源中的检测结果，其中，A为为酶切前PCR产物检测；B为Tail酶切后PCR产物检测；M:DNA ladder Trans2K。泳道1-17分别为:藤系138、抚宁紫皮粳子、细麻线、龙化毛葫芦、高阳淀稻大红芒、水原300粒、叶里藏花、中楼1号、卫国、丹东陆稻、兴国、老光头83、白毛稻、木樨球、老虎种、有芒早粳和黄壳早廿日。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法(例如：山崎义人、高坂淖尔编著.稻瘟病与抗病育种(凌忠专、孙昌其译).农业出版社，1990；凌忠专著.稻瘟病研究论文集.中国农业出版社.2005；路铁钢等编著.分子遗传学.高等教育出版社，2008)。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：品种藤系138中Pi35基因的确认
日本水稻品种北海188是Pi35基因克隆的供体亲本(Fukuoka等,2014.Multiplefunctional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhancedurable resistance to blast.Scientific Reports,4:4550DOI:10.1038/srep04550)，其衍生品种藤系138(图1)保持了北海188的高水平部分抗性，且经遗传分析证实藤系138的部分抗性受单个的主效基因控制(Mikami等,Estimation of resistance genes andfield resistance to leaf blast of a rice cultivar“Fukei 138”，Rep.Tohoku Br.,Crop Sci.Soc.Japan 33:87–88)。为确认藤系138携带Pi35基因，我们利用引物对SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4对藤系138的基因组DNA进行PCR扩增，获得了Pi35的等位基因并命名为Pi35-Fukei138。对Pi35-Fukei138测序、拼接和序列比对，发现Pi35-Fukei138的DNA和氨基酸序列与数据库中公布的Pi35的完全一致(图2)。综合前人及本发明研究结果，我们确信藤系138携带部分抗性基因Pi35。
实施例2：Pi35/Pish位点基因序列比对分析
在日本晴中，Pish基因位点包含4个串联的NBS-LRR基因(Os01g0781100、Os01g0781200、Os01g0781700和Pish)，而Pi35是Pish的一个等位变异基因。为了设计和开发特异性鉴定Pi35基因的功能性标记，我们首先从水稻数据库中获得日本晴Pish基因位点4个基因的编码区DNA序列，经序列比对发现第一个基因Os01g0781100与后面3个基因相似性较低(氨基酸序列一致性分别为65.7％、65.6％和65.53％.)，而后面3个基因之间则具有很高的序列相似性(表1)。同时利用引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对国内外稻瘟病菌普遍高度感病水稻品种LTH进行基因组DNA扩增，经对扩增产物测序获得了LTH中Pi35/Pish的等位基因序列并命名为pi35-LTH(图2)。随后，利用Clustal W软件对5个基因(Pi35、pi35-LTH、Pish、Os01g0781200和Os01g0781700)编码的蛋白质序列进行了多序列比对分析(图2)，结果发现，Pi35与pi35-LTH仅在LRR区(位置589-1289)存在一个氨基酸的差异(C1260W)；与Pish蛋白在NBS结构域(位置169-588)存在一个氨基酸的替换(S503P)和一个氨基酸的缺失(510G)，在LRR结构域存在5个氨基酸的差异(1053D/1054E，1055S/1056R，1072P/1073Q，1082W/1083N和1260C/1261W)；与Os01g0781200和Os01g0782100相比，则分别存在10.93和2.02％的氨基酸序列差异(图2)。在上述所有蛋白的变异氨基酸中，第1260位的半胱氨酸为Pi35蛋白所特有，是Pi35与pi35-LTH蛋白之间差异氨基酸(图2)。鉴于Pi35基因对日本稻瘟病菌株Ken54-20和Ken53-33表现高水平的部分抗性，而LTH对这2个菌株表现高度感病(图3A)，我们推测该氨基酸的差异可能决定着Pi35与pi35-LTH对鉴别菌株的抗、感病差异。进一步，我们分析了pi35-LTH基因的启动子区和下游区序列，发现pi35-LTH基因的启动子区2041bp和下游1885bp序列与Pi35基因对应的序列完全一致；同时利用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对藤系138中的Pi35、LTH中的pi35-LTH及日本晴的Pish基因进行了RT-PCR分析，PCR反应体系如下：2×PCR Buffer for KOD FX 10μl，dNTPs(2mM each)4μl，引物(10pmol,SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6)1μl，KOD FX酶(1U/μl,TOYOBO)0.4μl，cDNA模板(100ng/μl)2μl，加ddH2O至20μl，扩增反应条件：94℃2min；98℃10s→59℃15s→68℃1min，33个循环；68℃5min，10℃保存；以水稻OsActin基因作为对照，所用引物对为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8；结果表明Pi35、Pish及pi35-LTH等3个基因在各自的背景品种中均能正常表达(图3B)。综合以上分析，我们推断藤系138和LTH对鉴别菌株的抗与感差异应该与基因的表达无关，而与基因序列本身的差异(G3780T)有关；第1260位的半胱氨酸是Pi35蛋白的功能氨基酸，该单个氨基酸的差异区分了Pi35的抗病和感病等位基因。
表1 Pi35/Pish基因位点氨基酸序列一致性分析
实施例3：Pi35基因特异性分子标记开发及验证
基于Pi35与pi35-LTH编码区DNA序列仅存在单个核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms，SNP)(T3780G)导致一个氨基酸的差异(C1260W)。根据该差异位点，我们根据CAPS标记设计原理，利用在线软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计、开发了一个从水稻基因组中特异性扩增Pish/Pi35等位基因的标记(allele-specific marker)Pi35-dCAPS，其序列差异及引物位置列示于图4。Pi35-dCAPS的PCR扩增反应体系为：2×PCR Buffer for KODFX 10μl，dNTPs(2mM each)4μl，引物(10pmol,F+R)1μl，KOD FX酶(1U/μl,TOYOBO)0.4μl，DNA模板(100ng/μl)2μl，加ddH2O至20μl。扩增反应条件：94℃2min；98℃10s→59℃15s→68℃30s，35个循环；68℃5min，10℃保存。利用该标记在水稻品种藤系138(Pi35供体)、LTH和日本晴(Pish供体)中均能扩增出一条长度为272bp的目标片段(图5A)，再经限制性内切酶TaiI酶切后，酶切反应体系为：PCR产物15μl，10×Buffer 2μl，TaiI酶1μl，ddH2O22μl，于65℃酶切3h。藤系138的目标片段被切成两段(241bp和31bp)，LTH和日本晴的目标片段均不能被切开，从而显示出序列多态性(图5B)。由此可见，Pi35-dCAPS标记可以特异的区分Pi35基因与Pish和pi35-LTH基因，该标记可以作为一个功能性分子标记。
实施例4：藤系138衍生水稻品种的Pi35基因鉴定
1984年我国从日本青森县引入藤系138，此后黑龙江省、吉林省等有关单位以该品种为直接或间接亲本培育出一些优良粳稻品种。为了解Pi35基因在藤系138衍生品种中的分布，我们利用Pi35-dCAPS标记对10份藤系138衍生粳稻品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、垦稻12号、垦稻16号、绥粳3号、龙花00-835、龙粳10号、龙粳13号和龙粳34号)(http://www.ricedata.cn/variety)进行了分子鉴定，结果发现垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34号等的扩增片段可以被特异切开而出现与藤系138一致的带型，表明这5个品种中应该含有Pi35基因(图6)。进一步，我们利用引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对这10个品种中Pi35的等位基因序列进行了扩增并测序，经序列比对发现扩增片段可以被特异切开的这5个品种均含有与Pi35基因一致的序列，而其余5个品种均含有与Pish基因一致的序列，表明垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34号等5个品种确实含有Pi35基因，而其余5个品种均含有Pish基因。上述结果证实，Pi35-dCAPS标记可以特异地鉴定不同水稻品种中Pi35基因的存在。
实施例5：Pi35基因在不同水稻种质中的分布
为了进一步明确Pi35基因在种资资源中的分布情况，利用Pi35-dCAPS标记进行实施例3中描述的检测过程对67份水稻栽培品种(20份粳稻和47份籼稻)及204份水稻微核心种质(表2)进行PCR检测，所有供试材料均可特异地扩增出一条272bp的目标片段，再用限制性内切酶TaiI酶切这些扩增产物，仅有2份微核心种质材料(抚宁紫皮粳子和细麻线)的PCR片段可以被特异地切开，呈现与藤系138一致的带型，而其他所有265份材料的PCR片段均不能被切开，呈现与LTH和日本晴相同的带型(图7)。因此，我们推断在所有供试材料中，只有1份粳稻材料抚宁紫皮粳子和1份籼稻材料细麻线携带Pi35基因。进一步，我们也利用引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对这2份品种的Pi35等位基因编码区进行了扩增，经测序拼接发现这2份品种的基因编码区序列与Pi35基因完全一致，进而证明这2份品种确实携带Pi35基因。这些结果表明本发明所提供的特异鉴定Pi35基因的功能性分子标记Pi35-dCAPS可以准确鉴定Pi35基因。
表2 Pi35-dCAPS标记对271个水稻品种的分析结果
“I”:籼稻indica；“J”:粳稻japonica；“+”:含有Pi35基因；“-”:不含有Pi35基因.
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例中品种的限制，其他的任何未违背本发明精神实质及原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本和发明的保护范围之内。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 稻瘟病抗性基因Pi35的功能性分子标记及其方法与应用
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1
<400> 1
gccgtcctcc ctccagcata tatgtatacg 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2
<400> 2
ggtgtctgca aaacaaagga aacgtgaag 29
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3
<400> 3
ccttcatccc tcaacgtttt tgtctccaag 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4
<400> 4
atcggtatgg aacactccaa tccaacttgt 30
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5
<400> 5
catctctacc agatctgccg tc 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6
<400> 6
gacaaacact tgtacagtag cat 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7
<400> 7
tccatcttgg catctctcag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8
<400> 8
ggtaccctca tcaggcatct 20
<210> 9
<211> 272
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa L.）
<220>
<223> 9
<400> 9
gccgtcctcc ctccagcata tatgtatatg tggttgtgag cttttgaaga agagctgcag 60
ggcacctgat ggagaaagct ggccaaagat tgcgcatatc cgctggaagg aattcagatg 120
aattgtgctt cagaatcact actacggaga agcgcaaagg tgaaggtccc atcaatgcat 180
tatcagaagt actctatgta atatttattt cattcgctca tgatcttacg aacacatcat 240
taacttcacg tttcctttgt tttgcagaca cc 272

Claims (7)

1.一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的方法，其特征在于：
以待测水稻植株或品种的总DNA为模板，采用如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2所示序列的引物对进行PCR扩增，如果得到的扩增产物大小为272 bp，并经特异限制性内切酶TaiI酶切后成为2个片段，大小分别为244 bp和 28 bp，则待测水稻植株或品种含有稻瘟病抗性基因Pi35；否则待测水稻植株或品种不含有稻瘟病抗性基因Pi35。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列的引物对进行PCR扩增，其扩增的PCR反应体系如下：2 × PCR Buffer for KOD FX 10μl，每种 2 mM 的dNTPs 4 μl，10 pmol 上下游引物 1 μl，1 U/μl KOD FX酶 0.4 μl，100ng/μl DNA模板 2 μl，加ddH2O至20 μl，扩增反应条件：94℃ 2 min；98℃ 10 s → 59℃15 s → 68℃30 s，35个循环； 68℃ 5 min，10℃保存。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：采用特异的限制性内切酶TaiI酶切所述的PCR扩增产物，其酶切体系和条件如下：PCR产物15μl，10 × Buffer 2 μl， TaiI 酶1 μl，ddHO2 2 μl， 65℃酶切3 h后经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
4.一种鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2所示序列的两条引物组成。
5.一种含有权利要求4所述的引物对的鉴别或筛选含有稻瘟病抗性基因Pi35的水稻品种的试剂盒。
6.一种如权利要求4所述的引物对的应用，其特征在于：将其用于培育水稻抗稻瘟病品种的分子标记辅助育种、基因聚合育种或转基因育种中。
7.一种如权利要求5所述的试剂盒的应用，其特征在于：将其用于培育水稻抗稻瘟病品种的分子标记辅助育种、基因聚合育种或转基因育种中。
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