CN104004749B - 黄瓜黑色果刺基因b连锁的ssr标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“黄瓜黑色果刺基因B连锁的SSR标记引物及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜黑色果刺基因B紧密连锁的SSR标记引物，其特征在于：SSR07209-F/SSR07209-R:CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA；所述SSR标记引物扩增的与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带为192bp，核苷酸序列如Seq？IDNo.1；所述SSR标记引物扩增的与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带为178bp，核苷酸序列如和Seq？ID？No.2所示；采用本发明获得的SSR标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行嫩果黑色果刺材料的剔除，具有高效、限制少的优点，为选育白色果刺黄瓜提高了效率，缩短了育种周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别是黄瓜黑色果刺基因B连锁的SSR标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
背景技术
黄瓜（CucumissativusL.）是世界十大蔬菜之一，因其风味清香、口感脆爽，深受各国消费者的喜爱。随着消费水平的提高，人们对黄瓜品质的重视程度与日俱增。品质育种已成为黄瓜育种的重点之一。黄瓜果实品质包括外观品质和内在品质。通常说的品质性状主要指商品性即外观品质，包括瓜色、瓜长、果刺多少、果刺颜色、果瘤大小、果色均匀度、光泽度等。果刺颜色作为重要的商品性状之一，对商品销售影响很大。一般来说，市场上需求白色果刺的黄瓜。研究黄瓜果刺颜色的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的黄瓜新品种具有重要意义。
关于控制黄瓜果刺颜色的基因，已报道的有四个黑刺基因，分别为B、B-2、B-3、B-4。前人对于果刺颜色的遗传规律进行了多项研究。本世纪初Wellington首次报道了了控制黄瓜黑色果刺的基因（B），黑刺（B）对白刺（b）为显性。Strong（1931）和Tkachenko（1935）的研究也表明，黄瓜黑刺或棕刺对白刺为显性。1971年，Shanmugasundarum等（1971a）报道了不同于B基因的第二个黑色果刺基因B-2，该基因与B互作，F2后代分离比为15（黑）：1（白）。CowenandHelsel（1983）利用LJ90430和MSU41为试材，证实了存在于野生黄瓜LJ90430两个黑色果刺基因B-3和B-4，且两基因存在互作，F2后代分离比为9（黑）：7（白）。
目前，有关黄瓜果刺颜色分子水平的研究，所见报道不多。Kennard等（1994）利用黄瓜栽培种与野生种杂交获得F2群体，构建了一个70位点的分子连锁图，包括61个RFLP标记，5个同工酶标记(Mpi-1、ldh、pgm-1、pep-pap和per)、2个形态标记(F和B)和2个抗病标记(dm和Ccu)，获得了与黑色果刺基因B连锁的RFLP标记Csp130，遗传距离为5cM。Heang等（2008）获得了一个与B基因连锁距离为14.5cM的AFLP标记ECACMCTC150。苗晗等（2011）将果刺颜色作为数量性状来研究，并在Chr4和Chr5上均检测到主效QTL位点，并将B定位在了Chr4上SSR02697-SSR19256内和Chr.5上SSR15818-SSR06003内。可见，到目前为止，与质量性状基因B紧密连锁的SSR标记尚未见报道。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了与黄瓜黑色果刺基因B紧密连锁的SSR标记，并提供了其在选择黄瓜果刺颜色种质资源上的应用。
本发明的技术方案如下：
黄瓜黑色果刺基因B紧密连锁的SSR标记引物，其特征在于：
SSR07209-F/SSR07209-R:
CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA；
所述SSR标记引物扩增的与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带为192bp，核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；
所述SSR标记引物扩增的与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带为178bp，核苷酸序列如和SeqIDNo.2所示。
上述SSR标记引物在筛选具有白色果刺基因b的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：
（1）采用上述SSR标记引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
（2）对扩增结果进行凝胶电泳检测；
（3）从检测结果中选出出现与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带的材料，去掉出现与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带的材料。
所述PCR反应体系为:7.5ngDNA模板，正向和反向引物各50ng，5μLGoTaqGreenMasterMix，加双蒸水至10ul。
所述PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
所述凝胶电泳检测：指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
本试验以白色果刺自交系Gy14和黑色果刺自交系NC76为亲本构建F1、F2群体，对黄瓜黑色果刺基因B进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR技术，实现B基因的染色体定位，并获得紧密连锁标记SSR标记引物SSR07209，与B的遗传距离为2.2cM。所述SSR标记引物扩增的与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带为192bp，核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；所述SSR标记引物扩增的与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带为178bp，核苷酸序列如和SeqIDNo.2所示。
本发明通过利用重组自交系（RIL）群体156个株系验证，SSR07209用于分子标记辅助选择的正确率为95.5%。
本试验不仅为黄瓜黑色果刺基因B的精细定位和分子克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育白色果刺黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于选出的SSR标记引物提供用于辅助筛选具有白色果刺基因的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用SSR07209标记引物扩增待测品种的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条192bp条带，这种为隐型纯合材料；另一种是192bp条带和178bp条带都出现，这种是隐型杂合材料，第三种是仅仅出现178bp条带，选出第一种条带对应的材料，去掉第二种和第三种情况对应的材料。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行黑色果刺的筛选剔除，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
图1.是SSR标记SSR07209对黄瓜亲本材料Gy14（P1），NC76（P2），F1世代单株及F2群体随机单株的检测结果：
第一至三泳道分别为Gy14（白色果刺）、NC76（黑色果刺）、F1世代单株。第4～15泳道为F2群体随机单株。
图2.利用PI183967×931RIL群体对与黄瓜黑色果刺基因B连锁的SSR标记验证。
具体实施方式
材料与方法
本研究所用的试验材料为Gy14（P1），NC76（P2）。
Gy14是美国加工类型黄瓜自交系，生长势较强，叶片深绿色，果皮深绿和白色相间，刺瘤稀少，白色果刺，果瘤中等大小。为现有已知品种。在YiRen等于2009年《PLOSONE》第四期发表的文章《AnIntegratedGeneticandCytogeneticMapoftheCucumberGenome》一文中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
NC76是美国加工类型黄瓜自交系，生长势中等，叶片黄绿色，果皮绿色，黑色果刺，刺中等密度，瘤极小。现有已知品种，在ToddC.Wehner等于2008年《J.AMER.SOC.HORT.SCI.》第2期发表的文章《ASingleDominantGeneChforChillingResistanceinCucumberSeedlings》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
SSR引物来自国际黄瓜基因组计划（CUGI），共2112对（Renetal.，2009）。详细结果可以参见Ren等在PloSOne2009年第4期在线发表的文章《AninteGratedGeneticandCytoeneticmapofthecucumberGenome》。PCR实验使用ShanghaiPromeGa公司的GoTaqGreenMasterMix；凝胶电泳使用盈信阳光公司的40%非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6%后使用。
实施例1.黄瓜黑色果刺基因B连锁的SSR标记筛选
步骤1.黄瓜果刺颜色性状鉴定
试验于2012年春季和秋季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地进行，以Gy14（P1）和NC76（P2）为父母本进行正反交、自交，获得F1、F2群体。秋季利用实验大棚种植P1、P2和F1、F1’各10株，三次重复，随机区组排列。种植F2群体201株。株距25cm，行距55cm，按常规田间管理。在开花结果期，调查群体各单株上商品瓜（开花后7～10d）的果刺颜色。计算分离比，使用MicrosoftExcel2003软件进行数据统计分析，使用SAS8.0对结果进行卡方测验。
结果显示：无论正反交后代F1果刺均表现为黑色；在F2群体中，黑色果刺与白色果刺植株的分离比例为152:49，经卡方测验符合3:1。由此可知，黑色果刺性状是由1对核基因控制的，黑色果刺（B）对白色果刺（b）为显性。
步骤2.DNA提取和SSR分析
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。
PCR反应体系为:总反应体系10μL,3μLDNA（2.5ng·μL-1），正向和反向引物（50ng·μL-1）各1μL，5μLGoTaqGreenMasterMix（Promega公司产品）。
引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物（Renetal.，2009；Cavagnaroetal.，2010）。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。
扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。
步骤3.SSR标记筛选、数据统计及连锁图构建
主要包括4步：（1）筛选在父母本间表现多态的SSR标记；（2）在F2群体中选取黑色果刺、白色果刺单株的DNA各7个，根据BSA法构建黑色果刺和白色果刺2个基因池，用池筛选多态性引物；（3）利用获得的多态性引物分析F2群体各单株基因型；（4）利用JoinMap4.0软件进行连锁图的绘制。
共显性标记的统计方法：与母本（Gy14）一致的带型记为a，与父本（NC76）一致的带型记为b，杂合的带型记为h。
显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。
结果显示：
用2112对SSR引物对P1(Gy14)和P2(NC76)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有359对，多态率17.0%。
结合BSA法建池，进一步筛选得到了12个SSR多态性标记。
利用筛选出的多态性标记对Gy14×NC76组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果12个标记和B被定位在同一连锁群上（LOD=10），其中SSR07209与B的遗传距离为2.3cM。
将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱（Renetal.，2009；Miaoetal，2011）比较，发现本连锁群与第4染色体上共有9个共有标记，据此将B基因定位在第4染色体上。
步骤4.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序
（1）目的片段的回收
采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。
（2）目的片段的纯化
用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
（3）目的片段与载体的连接
反应体系为10μL：PMD18-TVector1.0μL；LigationbufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。
在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。
（4）连接产物的转化
1）取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
2）感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水；
3）用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；
4）42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
5）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3～5min；
6）加入500μLLB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；
7）将菌液涂布到含有100μg·mL-1Amp、25μg·mL-1IPTG和40μg·mL-1X-GAL的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
8）倒置平板，37℃培养12～16h。
（5）重组质粒的蓝白斑筛选
经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。
（6）菌落PCR的检测
吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μLPCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，与PCRMarker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
（7）克隆后载体的测序与分析
取3个阳性克隆菌液在甘油（330μL甘油中加入1000μL菌液）中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。
其中SSR标记引物SSR07209扩增出的与黄瓜果实白色果刺b连锁的片段的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；与黄瓜果实黑色果刺B连锁的片段的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。
实施例2.B基因连锁标记的验证
利用本课题构建的PI183967×931的F10代RIL群体156个不同果刺颜色类型的黄瓜材料，对实施例1获得的与B基因连锁的标记SSR07209进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：这156个株系中有黑色果刺株系35个，白色果刺株系121个。经和所选材料的田间表现型相比，标记在156个株系中共有,149个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为95.5%。其中35个黑色果刺株系均扩增出黑色果刺特征条带，部分株系的电泳图见图2。
本研究中构建了黄瓜黑色果刺基因的SSR连锁图，所获得的SSR标记（SSR07209）与B的遗传距离2.3cM，这个与黄瓜黑色果刺基因连锁的SSR标记为分子标记辅助选择育种筛选白色果刺新品种奠定了良好的基础。为建立一套快速准确鉴定黄瓜白色果刺的方法提供了理论依据。
Claims (5)
1.黄瓜黑色果刺基因B紧密连锁的SSR标记引物，其特征在于：
SSR07209-F/SSR07209-R：
CTGTCTGCAGAGCCATCTGA/CCATCAAGTTGAGGAGCAAA；
所述SSR标记引物扩增的与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带为192bp，核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；
所述SSR标记引物扩增的与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带为178bp，核苷酸序列如和SeqIDNo.2所示。
2.权利要求1所述SSR标记引物在筛选具有白色果刺基因b的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：
（1）采用上述SSR标记引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
（2）对扩增结果进行凝胶电泳检测；
（3）从检测结果中选出出现与黄瓜白色果刺基因b连锁的特征条带的材料，去掉出现与黄瓜黑色果刺基因B连锁的特征条带的材料。
3.根据权利要求2所述的应用，所述PCR反应体系为:7.5ngDNA模板，正向和反向引物各50ng，5μLGoTaqGreenMasterMix，加双蒸水至10ul。
4.根据权利要求2所述的应用，所述PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
5.根据权利要求2～4任一所述的应用：所述凝胶电泳检测：指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
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