CN105123505A

CN105123505A - 一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法

Info

Publication number: CN105123505A
Application number: CN201510546578.1A
Authority: CN
Inventors: 陈庆全; 申世界; 邓瑞宁; 方潇; 冯飞翀; 阮清廉
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明提供一种特异耐热性水稻重叠片段代换系(CSSLs)的培育方法，以综合性状优良但热敏感的杂交稻恢复系9311为受体亲本，以具有特异耐热性品种N22为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，连续4代回交、再连续自交4代，并用SSR标记鉴别染色体代换片段特征，同时对代换系的耐热性进行选择，最终获得具有特异耐热性水稻重叠片段代换系。

Description

一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法

技术领域

本发明涉及一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

高温热害已成为水稻等粮食作物的主要自然灾害之一，其不仅影响水稻正常的生长发育，还会导致产量的损失和品质的下降。当前生产上推广的绝大多数水稻品种耐热性均较差，频繁的高温热害已对水稻安全生产构成很大的威胁。因此挖掘和利用水稻特异耐热基因，开展水稻耐热性种质资源的创新及其遗传基础研究，选育水稻耐热品种，对改良水稻品种的耐热性、减轻高温热害造成的损失，保证粮食安全，具有重要的理论和现实意义。

水稻的数量性状位点(QTL)的研究已有大量的文献报道，而早期的研究所用的作图群体大多是初级作图群体如F2、BC、RIL以及DH等，虽然能够检测到某些与数量性状有关的QTL，但是由于这些作图群体的遗传背景较复杂，影响对QTL的定位结果，特别是一些微效QTL很难被检测出来，定位效率低，结果可重复性差，难以应用到生产实践中。因此，使用如CSSLs这样的高级作图群体是进行QTL定位的必然趋势。

重叠片段代换系是导入片段能够相互衔接或重叠，并最大程度覆盖供体基因组的“特殊”代换系群体，其具有其他作图群体所不能具有的优点：如代换片段的可分割性，提高QTL精细定位的准确度；覆盖基因组的完整性，重叠片段代换系可最大程度的衔接或重叠供体的全部基因组，减少代换片段的遗漏或缺失；鉴定QTL的高效性，重叠片段代换系代换的目标片段比较明确，对QTL鉴别效率非常高。因此，重叠片段代换系是研究基因遗传效应的重要材料。

培育重叠片段代换系方法对于一些特质基因(如特异耐热基因等)种质的利用及创新也具有独特的优越性，鉴于此，通过有针对性地将代换片段导入当地优良品种，获得特质基因并加以利用，从而避免因远缘杂交的不利基因的累赘以及过长的培育年限等缺陷，提高特质基因种质的利用及新的种质资源的创新效率，是本发明亟待解决的问题。

发明内容

因此，为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法，该方法培育出的具有特异耐热性的水稻重叠片段代换系CSSL27、CSSL44和CSSL97，可以作为水稻杂交品种的优良亲本，解决了现有水稻品种的耐热性差的不足。

本发明提供一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法，包括：

以综合性状优良但热敏感的杂交稻恢复系9311为受体亲本，以具有特异耐热性品种N22为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，连续4代回交、再连续4代自交并用SSR标记鉴别染色体代换片段特征，同时对代换系的耐热性进行选择，最终获得特异耐热性水稻重叠片段代换系CSSL27、CSSL44和CSSL97。

这种特异耐热性水稻重叠片段代换系CSSL27、CSSL44和CSSL97的培育方法，是以9311与N22杂交获得F₁，进行真假杂种鉴定，将鉴定的真杂种单株与9311回交得BC₁F₁；种植BC₁F₁世代的98个含有目标片段的单株，并对导入的N22片段进行初步的SSR分子标记的检测，获得BC₂F₁；种植BC₂F₁，根据表型选择与9311相似的单株与受体亲本回交获得BC₃F1；回交获得129个BC₄F₁单株；种植BC₄F₁，对2580个单株进行导入片段的检测，选择目标单株自交，获得BC₄F₂；种植BC₄F₂，继续对3580个单株进行导入片段的检测和表型选择，自交获得BC₄F₃；种植127个目标株系；并对少数缺失的目标片段进行筛选，获得113个能够基本覆盖N22全基因组的重叠片段代换系(BC₄F₄)。同时对代换系的耐热性进行选择，最终获得既保持9311的优良综合性状、又具有特异耐热性的水稻重叠片段代换系CSSL27、CSSL44和CSSL97。3个耐热代换系导入的N22片段SSR分子标记的基因型分别为：

代换系CSSL27：导入了N22第3染色体的RM489-RM157-RM251片段，长度为18.8CM。

代换系CSSL44：导入了N22第4染色体的RM6314-RM5586-RM273片段，长度为19.3CM。

代换系CSSL97：导入了N22第10染色体的RM7300-RM5352-RM5666片段，长度为13.6CM。

CSSL27、CSSL44和CSSL97的遗传背景回复率分别为：96.3％、97.1％和95.4％。

所述的SSR标记的特异性引物序列各如下所示：

RM157正向引物CCTCCTCCTCACGAATCCCGCC

反向引物GGGCTTCTTCTCCGCCGGCTTC

RM5586正向引物GCACCATGGAGCACCAAAC

反向引物GAATACAAACCCATGTGGGC

RM5352正向引物GGAACTAAACATGGTGCAAG

反向引物ACCAGATCACATGAAGAGGA。

CSSL27、CSSL44和CSSL97的耐热性表现为：热敏指数(相对电导率)均值分别为2.17％、1.88％和1.82％，与N22的热敏指数(相对电导率)1.53％没有显著性差异。所以CSSL27、CSSL44和CSSL97的耐热性与具有特异耐热性的N22基本相似，即CSSL27、CSSL44和CSSL97的耐热性已得到改良。

CSSL27、CSSL44和CSSL97的主要农艺性状与对照9311的8个主要农艺性状的表现见表1中。

表13个耐热片段代换系的主要农艺性状表现

由表1结果可知，CSSL27、CSSL44和CSSL97在株高、全生育期、单株有效穗数、千粒重、单株产量、结实率、每穗粒数和粒型(长宽比)共8个性状上，与对照9311没有显著性差异。

附图说明

图1是本发明的技术路线图。

图2重叠片段代换系图示基因型，其中纵列代表代换系家系，横行代表染色体1-12上的标记区段，黑色代表纯合导入片段，灰色代表杂合片段，白色条框代表轮回亲本9311背景。

图3代换片段长度分布图

图4CSSLs背景回复率分布图

图5一期相对电导率分布图

图6二期相对电导率分布图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1重叠片段代换系的构建

1)多态性标记的筛选

利用均匀分布在水稻12条染色体上的356个SSR分子标记，对亲本9311与N22之间的遗传差异性进行分析，共筛选到143个具有PCR扩增稳定、多态性明显、条带清晰等特征良好的多态性标记，SSR标记间平均距离为11.3cM。每条染色体上多态性标记数为9～18个，平均为11.9个，这些标记基本能够覆盖水稻整个基因组，多态性比例为40.17％；其中第3号染色体的多态性比例最高达到52.94％，第12号染色体多态性比例较低为32.14％，其余染色体多态性比例在33.33％～48.39％之间，说明两个亲本间的多态性较好。尽管不同染色体间的多态性比例不同，但是总体差异不大。如表2所示。

表2双亲染色体上多态性标记分布

这与两亲本间的亲缘关系远近有关，轮回亲本9311是国际水稻研究基因组计划测序的品种，是推广面积广、高产、多抗杂交稻以及部分超级杂交稻的优良恢复系，供体亲本N22则是原产于印度和巴基斯坦交界处的籼稻品种，两者属于不同生态类型品种，亲缘关系较远，遗传差异大，多态性比例高。

2)代换系导入片段分析

利用9311为轮回亲本、具有特异耐热性的N22为供体亲本，经过杂交、回交和自交，并结合SSR分子标记检测分析和表型选择，最终确定了一套由113个株系组构成的、导入片段能够相互重叠最大程度覆盖供体N22全基因组的CSSLs，使用GGT软件对其基因型分析，得到的图示基因型如图2所示。

3)代换片段在染色体上的分布

构建的113个CSSLs群体，共包括175个代换片段，平均每个家系携带1.6个导入片段。绝大多数导入片段为纯合片段，共有166个，占片段总数的94.9％。第3号染色体上代换片段最多，第1、11和12号染色体上最少，如表3所示，其中纯合和杂合导入片段分别占水稻整个基因组的3.3％和0.3％。

表3代换片段在染色体上的分布

4)代换片段长度分析

代换片段长度大小为0.5cM～59.0cM，片段总长度为2682.9cM，平均长度为15.3cM。各个代换系的代换片段长度有所不同，绝大多数导入片段长度在0～20cM之间。其中，长度小于10cM的片段数为64个占36.6％，片段长度在10～20cM之间有60个占34.3％，长度20-30cM为35个占20.0％，长度在30～40cM为10个所占比例为9.1％，长度在40-50cM之间片段有5个占2.9％，长度在50cM以上的只有1个片段，占比例仅为0.6％。如图3所示。

5)代换系背景回复率

用143个SSR标记对该套CSSLs群体共113个家系进行基因型分析，其平均背景回复率为96.5％，最高为99.7％，最低为91.0％，如图4所示。其中77个家系背景回复率在94.0％～97.9％之间，占群体比例为68.1％；23个家系背景回复率高于98.0％，占20.4％；13个家系背景回复率在91.0％～93.9％之间。由此可见，该套CSSLs的遗传背景能够很好地保持与轮回亲本一致的水平。

实施例2代换系耐热性

1)亲本耐热性表现

在幼苗两叶一心期，对N22和9311进行耐热处理(40℃)，并以25℃为对照，测定热敏指数(相对电导率)，其耐热表现如表4所示，对其热敏指数的差异性做比较，9311与N22之间热敏指数达到极显著的差异水平(P＝0.0001)。N22属于国际上公认的特异耐热品种，本研究测定的N22热敏指数比对热敏感品种9311的热敏指数明显小很多，差异极显著性。说明在高温胁迫后，耐热品种伤害程度小，相对电导率小，热敏感品种伤害程度大，热敏指数大。

表4N22和9311两亲本间差异显著性比较

2)代换系耐热性表现

以热敏指数(相对电导率)作为水稻高温胁迫反应的评价指标。分别于2014年11月份和2015年3月份分两次对113个CSSLs以及两个亲本，幼苗两叶一心期，在高温(40℃)胁迫下，并以25℃为对照，对热敏指数进行重复测定，结果表明两次重复试验测定数据变化趋势基本一致，如图5与图6所示。热敏指数变化范围分别为1.72％～5.55％和1.65％～5.53％，多数株系热敏指数集中在4.61％～5.10％之间。第一次和第二次试验分别有72个和51个株系和9311的热敏指数(4.98％和4.91％)分布在相同范围内，这说明大部分株系热敏指数的总体分布趋向于受体9311，表现为对热敏感。

同时发现，CSSL27、CSSL44和CSSL97共3个片段代换系在两次重复耐热实验中，其热敏指数与N22非常接近，以P＝0.0001，进行差异性测验，表现为差异不显著，如表5所示，说明该3个株系均导入了N22的耐热基因片段，获得了耐热性。

表53个耐热片段代换系与N22的耐热性比较

对该3个具有特异耐热性代换系基因型的分析表明，CSSL27、CSSL44和CSSL97的遗传背景回复率分别达到了96.3％、97.1％和95.4％。同时，对该3个耐热代换系以及受体亲本9311的田间植株生长时期和成熟期的农艺性状调查，结果表明(表6)，在株高、抽穗期、单株有效穗数、千粒重和单株产量共5个主要农艺性状上，3个耐热代换系中除了CSSL97的单株产量(89.97g)比9311(100.97g)略低外，其余性状均与9311没有显著性差异或优于9311。

表63个耐热代换系的主要农艺性状与9311的比较

代换系CSSL27、CSSL44和CSSL97的表现说明，本研究通过构建重叠片段代换系导入特异耐热基因，可以实现特异耐热种质资源的创新，在改良优良恢复系9311的耐热性同时，仍保持其原有的优良综合性状。

显然，上述实施例中采用的具体种类仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种特异耐热性水稻重叠片段代换系的培育方法，其特征在于，以综合性状优良但热敏感的杂交稻恢复系9311为受体亲本，以具有特异耐热性品种N22为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，连续4代回交、再连续4代自交，并用SSR标记鉴别染色体代换片段特征，同时对代换系的耐热性进行选择，最终获得特异耐热性水稻重叠片段代换系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SSR标记是RM157、RM5586和RM5352。