JP2001512695A - ポリメラーゼ連鎖反応を利用するコムギ真菌性病原体の検査 - Google Patents

ポリメラーゼ連鎖反応を利用するコムギ真菌性病原体の検査

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Abstract

(57)【要約】 フサリウム（Fusarium）種及びミクロドシウム・ニバレ（Microdochium nivale ）等の様々なコムギ病原体の種及び株についてのリボソームＲＮＡ遺伝子領域由来の内部転写型スペーサー（ＩＴＳ）ＤＮＡ配列を開示する。これらの配列内に由来する特異的なプライマーはＰＣＲ式技術を利用する真菌単離体の同定のために有用であることが同定された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はコムギの真菌病原体の検査のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイに
おける種特異性プライマーの利用に関する。このようなプライマーの利用は真菌
病原体の特異的な単離体の検査及び植物集団の中での発病の追跡を可能にする。
【０００２】 感染過程の早期にて病原性菌類の特定のレース（ｒａｃｅ）の同定を可能にす
る技術の開発の現実のニーズがある。病原体の特定のレースを病的徴候が作物に
おいて明確となり始める前に同定することにより、農業者はその同定された作物
品種における病原体の更なる発症の結果の傾向を評価でき、そして適当な殺真菌
剤をその適用が必要とされるなら選択できる。
【０００３】 本発明は植物病原体真菌の様々な表現型の同定方法に関する。本発明は様々な
真菌病原型間で変動を示す内部転写型スペーサー（ＩＴＳ）ＤＮＡ配列を提供す
る。かかるＤＮＡ配列が本発明の方法において有用であり、なぜならそれらはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）式診断アッセイに利用するためのプライマーを誘
導するのに利用できるからである。これらのプライマーは、ＤＮＡ鋳型が特定の
真菌病原型により用意されたものであるＰＣＲ反応において固有のフラグメント
を構築し、従って病的徴候の発症前に宿主植物材料における特定の病原型の有無
を同定するのに利用できる。
【０００４】 好適な態様において、本発明は病原体フサリウム・ポアエ、フサリウム・アベ
ナセウム及びミクロドシウム・ニバレについてのＩＴＳ１及びＩＴＳ２ ＤＮＡ
配列を提供する。別の好適な態様において、本発明はフサリウム種及びミクロド
シウム・ニバレの検査のためのＩＴＳ誘導診断用プライマーを提供する。
【０００５】 本発明は特定の作物品種−病原株関係における潜在的な損害の評価及び有用な
様々な殺真菌剤兵器の利用の可能性を提供する。更に、本発明は広い地理的領域
にかけての特定の病原レースの発生及び拡布についての詳細な情報を提供するの
に利用できる。本発明は長い潜伏期間を有する病気に極めて適当である検査方法
を提供する。
【０００６】 本発明の実施に有用なキットも提供する。これらのキットは真菌病原体フサリ
ウム種及びミクロドシウム・ニバレの同定に特に有効である。
【０００７】 本発明は様々な病原型の植物病原真菌を同定するのに有用な固有ＤＮＡ配列を
提供する。特に、このＤＮＡ配列は真菌病原型の同定のためのＰＣＲ式分析のプ
ライマーとして利用できる。本発明のＤＮＡ配列は特定の真菌病原体のリボソー
ムＲＮＡ遺伝子領域の内部転写型スペーサー（ＩＴＳ）配列及びこの特定の病原
体を同定できるこのような領域に由来するプライマーを含む。種又は属の種々の
構成員間で相違する、病原種又は属に属する様々な病原型に由来するこのような
ＩＴＳ ＤＮＡ配列はかかる特定の構成員を同定するのに利用できうる。
【０００８】 バイオメディカル研究者は時折りＰＣＲ式技術を利用しており、そして感染動
物組織における病原体の検査にある程度成功を収めている。しかしながら、よう
やく最近になって、この技術が植物病原体の検査に適用されるようになった。感
染したコムギのガウマンノマイセス・グラミニス（Gaumannomyces graminis）の
存在が病原体のミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを利用して検出で
き（Schlesser ら、1991; Applied and Environ.Microbiol. 57: 553-556）、そ
してランダム増幅した多形態ＤＮＡ（即ち、ＲＡＰＤ）マーカーが針葉樹の硬皮
癌腫の原因であるグレメニエラ・アビエチナ（Gremmeniella abietina ）の多種
多様なレースを区別することができる。米国特許第５，５８５，２３８号（引用
することで本明細書に組入れる）はセプトリア（Septoria）、シュードセルコス
ポレラ（Pseudocercosporella ）及びミコスフェレラ（Mycosphaerella）の株の
リボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマー、並びにＰＣＲ
式技術を利用してのこれらの真菌単離体の同定におけるその利用が記載されてい
る。更に、ヨーロッパ特許出願第９７８１０７７９．５（引用することで本明細
書に組入れる）にはセルコスポラ（Cercospora）、ヘルミンソスポリウム（Helm
inthosporium）、カバチエラ（Kabatiella）及びプシニア（Puccinia）の株のリ
ボソームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマー、並びにＰＣＲ式
技術を利用してのこれらの真菌単離体の同定におけるその利用が記載されている
。
【０００９】 リボソーム遺伝子はその高度なコピー数を理由に分子プローブ標的として利用
するのに適当である。成熟ｒＲＮＡ配列間での高度な保存性にもかかわらず、非
転写型及び転写型スペーサー配列の保存性は通常低く、それ故近年の発生学的相
違の検定のための標的配列として適当である。真菌ｒＲＮＡ遺伝子は単位でまと
まっており、各々は１８Ｓ（小サブユニット）、５．８Ｓ及び２８Ｓ（大サブユ
ニット）の３つの成熟サブユニットをコードする。これらのサブユニットは約３
００bpの２つの内部転写型スペーサーＩＴＳ１及びＩＴＳ２により分けられてい
る（White ら、1990; PCR Protocols; Innesら編；頁315 〜322 ）。更に、これ
らの転写ユニットは非転写型スペーサー配列（ＮＴＳ）により分けられている。
ＩＴＳ及びＮＴＳ配列は種々の真菌病原体の特定の病原型の検査のために極めて
適当である。
【００１０】 本発明のＤＮＡ配列は種々の植物病原体のリボソームＲＮＡ遺伝子の内部転写
型スペーサー配列に由来する。病原種又は属に属する種々の病原型に由来するこ
のＩＴＳ ＤＮＡ配列は種又は属の種々の構成員間で相違する。病原体のＩＴＳ
配列が決定できたら、これらの配列を他のＩＴＳ配列とアライニングする。この
ようにして、プライマーをＩＴＳ配列から誘導することができる。即ち、プライ
マーはこの真菌病原型間での配列において最大の相違を含むＩＴＳ配列内の領域
を基準にデザインできる。このような配列を基準とする配列及びプライマーが特
定の病原体の同定に利用できる。
【００１１】 特に注目のＤＮＡ配列にはフサリウム・ポアエ、ミクロドシウム・ニバレ及び
フサリウム・アベナセウム由来のＩＴＳ ＤＮＡ配列が挙げられる。かかるＩＴ
Ｓ ＤＮＡ配列はSEQ ID NO:２２〜２４にそれぞれ開示してある。このようなＩ
ＴＳ配列に由来する代表的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列がSEQ ID NO:
７〜１８に開示されている。かかる配列は注目の病原型のＰＣＲ式同定に有用で
ある。
【００１２】 本発明に包括されるのはフサリウム・ポアエのＩＴＳ１、フサリウム・ポアエ
のＩＴＳ２、ミクロドシウム・ニバレのＩＴＳ１、ミクロドシウム・ニバレのＩ
ＴＳ２、フサリウム・アベナセウムのＩＴＳ１、及びフサリウム・アベナセウム
のＩＴＳ２から選ばれる内部転写型スペーサー配列を含んで成る単離されたＤＮ
Ａ分子である。より好ましくは、フサリウム・ポアエのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２
２のヌクレオチド３１〜１８０を含んで成り、フサリウム・ポアエのＩＴＳ２が
SEQ ID NO:２２のヌクレオチド３３８〜４８９を含んで成り、ミクロドシウム・
ニバレのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２３のヌクレオチド３１〜１７５を含んで成り、
ミクロドシウム・ニバレのＩＴＳ２がSEQ ID NO:２３のヌクレオチド３３３〜４
９９を含んで成り、フサリウム・アベナセウムのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２４のヌ
クレオチド３１〜１８１を含んで成り、そしてフサリウム・アベナセウムのＩＴ
Ｓ２がSEQ ID NO:２４のヌクレオチド３３９〜５０４を含んで成る単離されたＤ
ＮＡ分子である。
【００１３】 ＰＣＲ分析における本発明のプライマー配列の利用についての方法は当業界に
おいて周知である。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３
，２０２号、並びにSchlesser ら（1991) Applied and Environ.Microbiol. 57:
553-556を参照のこと。更には、バーチシリウム・アルボ−アトラム（Verticil
lum albo-atrum）とバーチシリウム・ダリア（V. dahliae）とのＩＴＳ領域の差
を発見し、それ故これら２種を区別するためにＰＣＲ増幅を利用するNazar ら（
1991; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39: 1 〜11）；並びにバナナの病原
体ミコスファレラ・フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）とミコスファ
レラ・ムシコラ（M. musicola ）とを区別するための類似の技術を利用するJoha
nson and Jeger (1993; Mycol.Res. 97: 670-674）を参照のこと。
【００１４】 本発明のＩＴＳ ＤＮＡ配列は当業者に公知の方法より真菌病原体からクロー
ニングできる。一般に、真菌単離体からのＤＮＡの単離のための方法は公知であ
る。Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2: 17-20; Lee
ら（1990) Fungal Genetics Newsletter 35: 23-24; 及びLee and Taylor (1990
) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innes ら（編）；頁
282-287 を参照のこと。
【００１５】 他方、注目のＩＴＳ配列はＰＣＲ増幅により決定できる。典型的な態様におい
て、全ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーをWhite ら（1990; In: PCR Prot
ocols; Innesら編、頁315 〜322 ）に従って、デザインし、そして増幅ＩＴＳ配
列をｐＣＲIIクローニングベクターにサブクローニングする。このサブクローニ
ングした配列は左側ＩＴＳ（ＩＴＳ１）、右側ＩＴＳ（ＩＴＳ２）、及び中央に
位置する５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含んでいた。これはフサリウム・ポアエ及
びフサリウム・アベナセウム等のフサリウム属、並びにミクロドシウム・ニバレ
の様々な種について認められた。
【００１６】 決定したＩＴＳ配列を各病原体グループ内で比較し、様々な種及び／又は株を
区別するためにＰＣＲにおいて試験するのに有用でありうる相違を突きとめる。
決定されたＩＴＳ ＤＮＡ配列をSEQ ID NO:１９〜２４に示し、そして対比アラ
インメントを図１に示す。相違の同定から、数多くのプライマーが合成され、そ
してＰＣＲ増幅において試験した。ＰＣＲ増幅試験のために用いる鋳型はまず精
製病原体ＤＮＡとし、次に感染宿主植物組織から単離したＤＮＡとした。かくし
て、診断用である、即ち、一の特定の種又は株は同定するが、同じ病原体の別の
種又は株は同定しないプライマーペアーを同定することが可能となる。属特異性
プライマー及び特定の病気を惹起するいくつかの真菌病原体のいずれかを同定す
るプライマーを開発するため、種間で高度に保存性である領域に対するプライマ
ーもデザインした。例えば、フサリウム種及びミクロドシウム・ニバレ等の様々
な真菌病原体により惹起される病気を検査するためのプライマーを開発した。
【００１７】 好適なプライマーの組合せは感染宿主組織、即ち、特定の病原種又は株で既に
感染された宿主組織における様々な種又は株を区別できる。本発明は様々なフサ
リウム種及びミクロドシウム・ニバレについてこの基準を満たす様々なプライマ
ーの組合せを提供する。本発明のプライマーは真菌ＩＴＳ領域間の配列相違を基
準にデザインする。配列間での最小で一塩基対の相違が区別用プライマーのデザ
インを可能にする。特定の真菌ＤＮＡのＩＴＳ領域に対してデザインされたプラ
イマーは、リボソームコード領域内の保存配列領域に対して作製されたプライマ
ーとの組合せにおいて、種特異性ＰＣＲフラグメントを増幅するために利用でき
る。一般に、プライマーは良好な感度を達成せしめるために約６０〜７０℃の理
論上の融点を有すべきであり、そして有意な二次構造及びプライマー組合せ間で
の３′重複は有すべきでない。プライマーは一般にＩＴＳ１又はＩＴＳ２の約５
〜１０個の連なるヌクレオチド塩基、好ましくはＩＴＳ１又はＩＴＳ２の少なく
とも１０個の連なるヌクレオチド塩基と配列同一性を有する。好適な態様におい
て、プライマーは長さ約５〜３０個のヌクレオチド塩基のどこかからに由来する
。
【００１８】 本発明の範囲において好ましいとされるのは、SEQ ID NO:７〜１５から成る群
より選ばれる真菌病原体の同定において利用するためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーである。
【００１９】 本発明の更なる態様は真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に
利用するためのオリゴヌクレオチドプライマーペアーであり、ここで当該プライ
マーの少なくとも一方は本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーである。好
ましいのはオリゴヌクレオチドプライマーのペアーであり、ここで当該ペアーは
請求項８〜１２に係るオリゴヌクレオチドプライマーから選ばれる。
【００２０】 本発明は真菌病原体の検査のための方法であって、下記の工程： （ａ）病原体で感染された植物の葉からＤＮＡを単離し； （ｂ）当該ＤＮＡを少なくとも一の請求項４記載のプライマーを利用するポリ
メラーゼ連鎖反応増幅にかけ；そして （ｃ）当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の１又は複数種の生成物を目視化するこ
とにより前記真菌病原体を検査する； を含んで成る方法に関連する。
【００２１】 好ましくは、フサリウム・ポアエ及びミクロドシウム・ニバレから選ばれる真
菌病原体の検査方法である。
【００２２】 本発明により更に包括されるのは真菌病原体の検査方法であって、下記の工程
： （ａ）病原体で感染された植物の葉からＤＮＡを単離する； （ｂ）請求項５記載のプライマーペアーでのポリメラーゼ連鎖反応において鋳
型として当該ＤＮＡを利用して前記病原体の内部転写型スペーサー配列の一部を
増幅させる；そして （ｃ）当該内部転写型スペーサー配列の増幅部を目視化することにより前記真
菌病原体を検査する； を含んで成る方法である。
【００２３】 好ましくは、フサリウム・ポアエ及びミクロドシウム・ニバレから選ばれる真
菌病原体の検査方法である。
【００２４】 本発明は本方法を実施するために必要な要素を含む「キット」の製造にまで容
易に至る。かかるキットはチューブ又はバイアルの如き１又は複数の容器を中で
密接して受容するよう区分けされたキャリヤーを含んで成ってよい。これらの容
器の一つはラベル化されていない又は検査可能式にラベル化されたＤＮＡプライ
マーを含みうる。このラベル化ＤＮＡプライマーは凍結乾燥状態で、又は必要な
ら適当なバッファーの中に入って存在しうる。１又は複数の容器又はＰＣＲ反応
において利用する１もしくは複数種の酵素又は試薬を含みうる。これらの酵素は
そのまま、又は混合され、凍結乾燥状態で、又は適当なバッファーの中に入って
存在していてよい。
【００２５】 最後に、このキットは本発明の技術を実施するために必要な追加の要素全て、
例えばバッファー、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド
三リン酸、濾紙、ゲル材料、移動用材料、オートラジオグラフィーサプライ、等
を含みうる。
【００２６】 本発明の範囲において好適とされるのは真菌病原体の検査用診断キットであっ
て、真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利用するためのプラ
イマーペアーを含んで成り、ここで当該プライマーの少なくとも一方が本発明に
係るオリゴヌクレオチドプライマーであるキットである。
【００２７】 下記の実施例はＩＴＳ配列の単離、適当なプライマー配列の選択、特異的且つ
診断的な効果についてのプライマーの試験、並びに病気及び真菌単離体検査のた
めのかかるプライマーの利用に利用するための典型的な実験プロトコールを示す
。かかる実施例は例示にすぎず、本発明を限定するものではない。
【００２８】 配列表の配列の簡単な説明 SEQ ID NO:１ オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ１。 SEQ ID NO:２ オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ２。 SEQ ID NO:３ オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ３。 SEQ ID NO:４ オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ４。 SEQ ID NO:５ Ｍ１３万能２０プライマー。 SEQ ID NO:６ 実施例２に使用するリバースプライマー。 SEQ ID NO:７ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６０５。 SEQ ID NO:８ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６０６。 SEQ ID NO:９ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６０７。 SEQ ID NO:１０ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６０９。 SEQ ID NO:１１ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６１０。 SEQ ID NO:１２ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６１１。 SEQ ID NO:１３ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６１２。 SEQ ID NO:１４ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６１３。 SEQ ID NO:１５ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ６１４。 SEQ ID NO:１６ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ５７８。 SEQ ID NO:１７ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ５７１。 SEQ ID NO:１８ オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ５７２。
【００２９】 SEQ ID NO:１９ フサリウム・クルモルム単離体Ｒ−５１０６，Ｒ−５１２６及
びＲ−５１４６からＰＣＲ増幅したＩＴＳ領域の共通ＤＮＡ配列：５′から３′
方向にかけて、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペーサ
ー１、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写型スペーサー２、そして大サブユニ
ットｒＲＮＡ遺伝子の５′末端を含んで成る。
【００３０】 SEQ ID NO:２０ フサリウム・グラミネアルム単離体Ｒ−８４１７，Ｒ−８４２
２及びＲ−８５４６からＰＣＲ増幅したＩＴＳ領域の共通ＤＮＡ配列：５′から
３′方向にかけて、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペ
ーサー１、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写型スペーサー２、そして大サブ
ユニットｒＲＮＡ遺伝子の５′末端を含んで成る。
【００３１】 SEQ ID NO:２１ フサリウム・モニリフォルメ単離体Ｒ−４５５１からＰＣＲ増
幅したＩＴＳ領域のＤＮＡ配列：５′から３′方向にかけて、小サブユニットｒ
ＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペーサー１、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
、内部転写型スペーサー２、そして大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の５′末端を
含んで成る。
【００３２】 SEQ ID NO:２２ フサリウム・ポアエ単離体Ｔ−４２７，Ｔ−５３４及びＴ−７
５６からＰＣＲ増幅したＩＴＳ領域の共通ＤＮＡ配列：５′から３′方向にかけ
て、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペーサー１、５．
８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写型スペーサー２、そして大サブユニットｒＲＮ
Ａ遺伝子の５′末端を含んで成る。
【００３３】 SEQ ID NO:２３ ミクロドシウム・ニバレ単離体７２，５２０及び１８２２２か
らＰＣＲ増幅したＩＴＳ領域の共通ＤＮＡ配列：５′から３′方向にかけて、小
サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペーサー１、５．８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写型スペーサー２、そして大サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の５′末端を含んで成る。
【００３４】 SEQ ID NO:２４ フサリウム・アベナセウム単離体６４４５２及びＲ−４０４５
からＰＣＲ増幅したＩＴＳ領域の共通ＤＮＡ配列：５′から３′方向にかけて、
小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の３′末端、内部転写型スペーサー１、５．８Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子、内部転写型スペーサー２、そして大サブユニットｒＲＮＡ遺
伝子の５′末端を含んで成る。
【００３５】 実施例 ここで利用する標準の組換ＤＮＡ及び分子クローニング技術は当業界において
周知であり、そしてJ.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatis, Molecular Clon ing: A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har
bor, NY (1989)及びT.J.Silhavy, M.L.Berman, and L.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
Y (1984)及びAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology , pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)に記載さ
れている。
【００３６】 実施例１：真菌単離体及びゲノム真菌ＤＮＡ抽出 利用する真菌単離体及びその起源については表１を参照のこと。菌類をＰＤＡ
（ポテトデキストロースアガー）培養物由来の菌糸断片の接種した１５０mlのポ
テートデキストロース培養液の中で増殖させる。培養物をオービタルシェーカー
上で２８℃で７〜１１日インキュベーションする。菌糸体を遠心分離によりペレ
ットにし、そして液体窒素の中で粉砕し、そして総ゲノムＤＮＡをLee and Tayl
or (1990; In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Innes
ら編：頁282 〜287 ）のプロトコールを利用して抽出する。
【００３７】
【表１】
【００３８】1 Novartis Crop Protection Limited, Basel, Switzerland2 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA3 Dr. Paul Nelson, Penn State University, USA 4 Dr. Loral Castor, Novatis Seeds Research, Bloomington, Illinois, USA5 Dr. Peter Ueng, USDA, Beltsville, Maryland, USA 6 Novartis Crop Protection Inc., Research Triangle Park, NC, USA
【００３９】 実施例２：内部転写型スペーサー（ＩＴＳ）領域の単離 長さ約５５０bpの内部転写型スペーサー領域フラグメントをＦ．グラミネアル
ム単離体Ｒ−８４１７，Ｒ−８４２２及びＲ−８４５６、Ｆ．クルモルム単離体
Ｒ−５１０６，Ｒ−５１２６及びＲ−５１４６、Ｆ．モニリフォルメ単離体＃４
５５１、Ｆ．ポアエ単離体Ｔ−０４２７，Ｔ−０５３４及びＴ−０５７６、Ｍ．
ニバレ単離体５２０，７２及び１８２２２、並びにＦ．アベナセウム単離体６４
４５２及びＲ−４０４５由来の１０ngのゲノムＤＮＡから、５０pmolのプライマ
ーＩＴＳ１（５′−TCCGTAGGTGAACCTGCGG −３′；SEQ ID NO:１）及びＩＴＳ４
（５′−TCCTCCGCTTATTGATATGC−３′；SEQ ID NO:４）を利用してＰＣＲ増幅す
る。ＰＣＲは実施例４に記載の通りに実施する。ＰＣＲ生成物をPromega のWiza
rd DNA Clean-up キット（Madison, WI ）を利用して精製する。ＩＴＳ領域のＤ
ＮＡ配列をApplied Biosystems (Foster City, CA ）自動シーケンサーを利用し
てジデオキシ法によりプライマーＩＴＳ１（SEQ ID NO:１）、ＩＴＳ２（５′−
GCTGCGTTCTTCATCGATGC−３′；SEQ ID NO:２）、ＩＴＳ４（SEQ ID NO:４）及び
Ｍ１３万能−２０（５′−GTAAAACGACGGCCAGT −３′；SEQ ID NO:５）及びリバ
ース（５′−AACAGCTATGACCATG−３′；SEQ ID NO:６）プライマーを利用して決
定する。ＩＴＳプライマーＩＴＳ１，ＩＴＳ２，ＩＴＳ３及びＩＴＳ４はWhite
ら（1990; In: PCR Protocols; Innesら編、頁315-322 ）に詳細してある。Ｆ．
モニリフォルメ単離体＃４５５１、Ｆ．ポアエ単離体Ｔ−０４２７，Ｔ−０５３
４及びＴ−０７５６、並びにＭ．ニバレ単離体５２０，７２及び１８２２２によ
る増幅由来のＰＣＲ生成物をInvitrogen Corporation's (San Diego) TA クロー
ニングキット（パートNo. Ｋ２０００−０１）を利用し、ＰＣＲ２．１クローニ
ングベクターを用いてクローニングする。
【００４０】 実施例３：コムギからのＤＮＡ抽出 ＤＮＡをバルク離解法を利用してコムギから抽出する。バルク離解法は大量分
析のための農場標本採取法を最適化するため、農場由来のいくつかの自然感染し
たコムギの頭部又は茎由来の単離ＤＮＡを利用する。
【００４１】 バルク離解法： （１）適当な数のコムギの頭部又は茎をBioreba (Reinach, Switzerland ）強力
プラスチックバッグ（cat # 490100）の中に入れる。植物組織、風袋（プラスチ
ックバッグの重量）を差し引いた葉の入ったプラスチックバッグを秤量する。
【００４２】 （２）１ｇのコムギ組織につき等容量（ml）のＭｕｌｌｅｒ抽出バッファー（０
．１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ−８０；０．０４Ｍのトリス−Ｃｌ、pH７．７；０．
１５ＭのＮａＣｌ；０．１％ｗ／ｖのＢＳＡ−Ｐｅｎｔｅｘ画分Ｖ；０．０１％
ｗ／ｖのアジ化ナトリウム；２００mMのＥＤＴＡ）を加える。この組織をBioreb
a 6 Homex 6 ホモジナイザーを利用し、７０の設定値で離解する。葉を組織が線
維状となるまで粉砕する。
【００４３】 （３）もし利用したなら複数のバッグから抽出物をプールし、そして十分にボル
テックスにかける。抽出ジュースを氷上のエッペンドルフチューブに小分けする
。
【００４４】 （ａ）この濃厚抽出物１００μｌを５分間煮沸する。 （ｂ）この煮沸した抽出物を氷の上に載せる。 （ｃ）この煮沸した濃厚抽出物１０μｌを無菌ｄＨ2 Ｏに加えることにより１
：１０の希釈物を作る。 （ｄ）この希釈抽出物を氷の上に保存し、用意が整う。
【００４５】 実施例４：ポリメラーゼ連鎖反応増幅 ポリメラーゼ連鎖反応はPerkin-Elmer／Cetus (Norwalk, CT; パートNo. Ｎ８
０８−０００９）由来のＧｅｎｅ Ａｍｐキットにより、５０mMのＫＣｌ、２．
５mMのＭｇＣｌ2 、１０mMのトリス−ＨＣｌ、pH８．３（２００μＭづつのｄＴ
ＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ含有）、５０pmolづつのプライマー、２
．５単位のＴａｑポリメラーゼ及び１０ngのゲノムＤＮＡ又は１μｌの１：１０
の希釈植物抽出物を５０μｌの最終容量で用いることにより実施する。反応はPe
rkin-Elmer／Cetus モデル９６００サーマルサイクラーの中で９４℃で１５ｓ、
５０℃〜７０℃で１５ｓ及び７２℃で４５ｓのサイクルに３０〜４０サイクルか
けることで実施する。生成物は１０μｌづつのＰＣＲサンプルを１．０％のアガ
ロースゲルに載せ、そして電気泳動することにより分析する。
【００４６】 実施例５：オリゴヌクレオチドの合成及び精製 オリゴヌクレオチド（プライマー）は例えばIntegrated DNA Technologies (C
oralville, IA ）又はMidland Certified Reagent Company (Midland, Texas ）
のいずれかにより合成する。
【００４７】 実施例６：種特異的プライマーの選択 図１はＦ．クルモルム、Ｆ．グラミネアルム、Ｆ．ポアエ、Ｍ．ニバレ及びＦ
．モニリフォルメのＩＴＳ領域の配列のアラインメントを示す。オリゴヌクレオ
チドプライマー、例えば表２に示すものをアライニングした配列の分析に基づき
実施例５に従って合成する。プライマーは真菌種間での配列における最大の相違
を含む領域に対してデザインする。また、属−特異性プライマーを開発する試み
において、種間で高度に保存された領域に対してプライマーをデザインする。更
に、公開されたリボソーム遺伝子特異性プライマーＩＴＳ１，ＩＴＳ２，ＩＴＳ
３及びＩＴＳ４（White ら1990; In: PCR Protocols; Innesら編、頁315-322 ）
をＩＴＳ領域に特異的なプライマーとの組合せにおける試験のために合成する。
ＷＯ９５／２９２６０由来のフサリウム種を標的とするプライマーも新しい特異
性を試験するために新たにデザインしたプライマーと組合せて利用する。
【００４８】
【表２】
【００４９】 実施例７：精製真菌ゲノムＤＮＡに対するプライマー特異性の決定 ＰＣＲを実施例４に従い、単一の特定のフラグメントを増幅する試みにおいて
、様々なプライマーの組合せ（表３）を利用して実施する。特異的なＰＣＲ増幅
生成物を、注目の真菌株各々の１８Ｓと２５ＳリボソームＤＮＡサブユニットと
の間のＩＴＳ領域からデザインしたプライマーから作る。
【００５０】
【表３】
【００５１】 実施例８：真菌で感染した植物組織に対するプライマー特異性及びその他穀物
真菌病原体との交差反応性の決定 総ゲノムＤＮＡを実施例３に記載の通りにして、健康なコムギ頭部及びＭ．ニ
バレ、Ｆ．グラミネアルム、Ｆ．クルモルム又はＦ．アベナセウムの接種したコ
ムギ頭部から単離する。ＰＣＲを実施例４に記載の通りにして実施し、表３に記
載のものの如きプライマーの組合せをコムギ組織由来のＤＮＡに対して試験する
。精製真菌ゲノムＤＮＡは実施例１に記載の通りに獲得し、そして診断用プライ
マーを利用して実施例４に記載の通りにアッセイする。その他の真菌ＤＮＡ種及
び単離体を診断用プライマーのそれと交差反応する能力について試験する。代表
的な実験の結果は下記の通りである。
【００５２】 Ｎ．ニバレ特異性プライマーの組合せＪＢ６１２（SEQ ID NO:１３）及びＩＴ
Ｓ４（SEQ ID NO:４）は表１に記載のＭ．ニバレ単離体の全て及びＭ．ニバレ感
染したコムギ組織由来のＤＮＡから４７２bpのフラグメントを増幅させた。この
プライマーの組合せは健康なコムギ組織からも、Ｆ．グラミネアルム、Ｆ．クル
モルム、Ｆ．アベナセウム、Ｆ．ポアエもしくはＦ．モニリフォルメ由来の精製
ゲノムＤＮＡからも診断用フラグメントを増幅しなかった。このプライマーの組
合せは以下の一般的な穀物病原体から単離した精製ゲノムＤＮＡからも診断用フ
ラグメントを増幅しなかった：Ｗ型及びＲ型病原型のシュードセルコスポレラ・
ハーポトリコイデス（Pseudocercosporella herpotrichoides ）、セラトバシジ
ウム・セレアレ（Ceratobasidium cereale）、ドレヒスレラ・ソロキニアナ（Dr
echslera sorokiniana）、クラドスポリウム・ハーバルム（Cladosporium herba
rum ）、セプトリア・グリシネス（Septoria glycines ）、セプトリア・トリチ
シ（S. tritici）、セルコスポラ・アラチジコラ（Cercospora arachidicola ）
、セプトリア・ノドルム（S. nodorum）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia
solani）及びセプトリア・アベナ ｆ．ｓｐ．トリチセア（S. avenae f. sp. t
riticea ）。似たような診断結果がＭ．ニバレ特異性プライマーの組合せＪＢ６
１３（SEQ ID NO:１４）及びＪＢ６１０（SEQ ID NO:１１）で得られた。
【００５３】 Ｎ．ニバレ単離体＃５２０及びＭ．ニバレで感染したコムギ由来のＤＮＡから
、プライマーの組合せＪＢ６１３（SEQ ID NO:１４）及びＩＴＳ４（SEQ ID NO:
４）は４１３bpのフラグメントを増幅し、そしてプライマー組合せＪＢ６１４（
SEQ ID NO:１５）及びＩＴＳ４（SEQ ID NO:４）は４３１bpのフラグメントを増
幅した。これらのプライマーの組合せは健康なコムギ組織からも、Ｆ．グラミネ
アルム単離体＃Ｒ−８４２２及びＦ．クルモルム単離体＃Ｒ−５３９１からもフ
ラグメントを全く増幅しなかった。
【００５４】 表３に挙げる残りのＭ．ニバレ特異性プライマーの組合せはＭ．ニバレ単離体
＃５２０由来のＤＮＡからＰＣＲフラグメントを増幅させたが、Ｆ．グラミネア
ルム単離体＃Ｒ−８４２２又はＦ．クルモルム単離体＃Ｒ−５３９１由来のＤＮ
Ａからは増幅させなかった。
【００５５】 プライマー組合せＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＩＴＳ４（SEQ ID NO:４）
は表１に挙げるＭ．ニバレ単離体全てに由来するＤＮＡから５０９bpのフラグメ
ントを増幅させた。このプライマーの組合せは表１に記載のＦ．グラミネアルム
、Ｆ．クルモルム、Ｆ．アベナセウム、Ｆ．ポアエ及びＦ．モニリフォルメの全
てに由来するＤＮＡからも５０９bpのフラグメントを増幅させた。このプライマ
ーの組合せは下記の穀物病原体から単離した精製ゲノムＤＮＡからは診断用フラ
グメントを増幅しなかった：Ｗ型及びＲ型病原型Ｐ．ハーポトリコイデス、Ｃ．
セレアレ、Ｄ．ソロキニアナ、Ｃ．ハーバルム、Ｓ．グリシネス、Ｓ．トリチシ
、Ｃ．アラチジコラ、Ｓ．ノドルム、Ｒ．ソラニ及びＳ．アベナ ｆ．ｓｐ．ト
リチセア。プライマーの組合せＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＩＴＳ４（SEQ
ID NO:４）はフサリウム種で感染したコムギからは診断用フラグメントを増幅し
たが、健康なコムギからは増幅させなかった。
【００５６】 プライマーの組合せＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７１（SEQ ID NO:
１７）、ＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７２（SEQ ID NO:１８）、並び
にＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７８（SEQ ID NO:１６）はＦ．グラミ
ネアルム単離体＃Ｒ−８４２２及びＦ．クルモルム単離体＃Ｒ−５３９１からは
それぞれ４００bp，４４０bp及び４１７bpのフラグメントを増幅させたが、Ｍ．
ニバレ単離体＃５２０からは増幅しなかった。更に、プライマーの組合せＪＢ６
０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７８（SEQ ID NO:１６）は表１に挙げるＦ．グ
ラミネアルム、Ｆ．モニリフォルメ、Ｆ．ロゼウム、Ｆ．ポアエ及びＦ．クルモ
ルム単離体の全てから診断用フラグメントを増幅させた。しかしながら、このプ
ライマーの組合せは表１に挙げるＦ．アベナセウム単離体からも、Ｍ．ニバレ単
離体からも増幅させなかった。プライマーの組合せＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）
及びＪＢ５７１（SEQ ID NO:１７）、ＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７
２（SEQ ID NO:１８）、並びにＪＢ６０５（SEQ ID NO:７）及びＪＢ５７８（SE
Q ID NO:１６）は健康なコムギからも、穀物病原体Ｗ型及びＲ型病原型Ｐ．ハー
ポトリコイデス、Ｃ．セレアレ、Ｄ．ソロキニアナ、Ｃ．ハーバルム、Ｓ．グリ
シネス、Ｓ．トリチシ、Ｃ．アラチジコラ、Ｓ．ノドルム、Ｒ．ソラニ及びＳ．
アベナ ｆ．ｓｐ．トリチセア由来の精製ゲノムＤＮＡからも診断フラグメント
を増幅しなかった。
【００５７】 本発明は開示の態様に限定されず、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変
更、改良等を施すことができることが当業者に理解されるであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１／３，２／３，３／３】 フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・ポアエ
、ミクロドシウム・ニバレ及びフサリウム・モニリフォルメに由来するＩＴＳ領
域の配列アラインメント。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】 本発明は開示の態様に限定されず、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変
更、改良等を施すことができることが当業者に理解されるであろう。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：Beck, James J. （ii）発明の名称：DETECTION OF WHEAT FUNGAL PATHOGENS USING THE POLYME
RASE CHAIN REACTION (iii）配列の数：24 （iv）連絡先： （Ａ）あて先：Novartis Corporation Patent Department （Ｂ）通り：3054 Cornwallis Road （Ｃ）市：Research Triangle Park （Ｄ）州：NC （Ｅ）国：USA （Ｆ）郵便番号：20779-2257 （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible （Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release #1.0, Version #1.30 （vi）現出願データー： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： (viii）代理人情報： （Ａ）名称：Meigs, J. Timothy （Ｂ）登録番号：38,241 （Ｃ）参照／事件番号：CGC 1944 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（919）541-8587 （Ｂ）ファックス：（91）541-8689 （２）SEQ ID NO：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：19塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーITS1” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：
【化１】 （２）SEQ ID NO：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーITS2” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：２：
【化２】 （２）SEQ ID NO：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーITS3” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：３：
【化３】 （２）SEQ ID NO：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーITS4” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：４：
【化４】 （２）SEQ ID NO：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：17塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“M13万能−20プライマー” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：５：
【化５】 （２）SEQ ID NO：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：16塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“実施例２に使用したリバースプライマー” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：６：
【化６】 （２）SEQ ID NO：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB605” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：７：
【化７】 （２）SEQ ID NO：８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：19塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB606” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：８：
【化８】 （２）SEQ ID NO：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：19塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB607” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：９：
【化９】 （２）SEQ ID NO：10の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：19塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB609” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：10：
【化１０】 （２）SEQ ID NO：11の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB610” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：11：
【化１１】 （２）SEQ ID NO：12の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：16塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB611” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：12：
【化１２】 （２）SEQ ID NO：13の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：18塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB612” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：13：
【化１３】 （２）SEQ ID NO：14の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：22塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB613” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：14：
【化１４】 （２）SEQ ID NO：15の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：24塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB614” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：15：
【化１５】 （２）SEQ ID NO：16の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：16塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB578” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：16：
【化１６】 （２）SEQ ID NO：17の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：24塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB571” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：17：
【化１７】 （２）SEQ ID NO：18の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：18塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：他の核酸 （Ａ）記述：／desc＝“プライマーJB572” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：18：
【化１８】 （２）SEQ ID NO：19の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：504塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Fusarium culmorum （Ｃ）個単離物：R-5106，R-5126及びR-5146（共通配列） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..12 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNA遺伝子の３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：13..161 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：162..318 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：319..472 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：473..504 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNA遺伝子の５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：19：
【化１９】 （２）SEQ ID NO：20の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：503塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Fusarium graminearum （Ｃ）個単離物：R-8417，R-8422及びR-8546（共通配列） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..9 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNA遺伝子の３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：10..155 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：156..312 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：313..466 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：467..503 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNA遺伝子の５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：20：
【化２０】 （２）SEQ ID NO：21の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：545塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Fusarium moniliforme （Ｃ）個単離物：4551 (vii）直前の起源： （Ｂ）クローン：pCRFMON1 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNA遺伝子の３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：31..178 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：179..335 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：336..488 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：489..545 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNAの５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：21：
【化２１】 （２）SEQ ID NO：22の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：546塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Fusarium poae （Ｃ）個単離物：T-427，T-534及びT-756（共通配列） (vii）直前の起源： （Ｂ）クローン：pCRFpoaeT427（1-2)，pCRFpoaeT534（2-2）及びpCRFpoaeT
756（3-1） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNA遺伝子の３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：31..180 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：181..337 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：338..489 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：490..546 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNA遺伝子の５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：22：
【化２２】 （２）SEQ ID NO：23の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：556塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Microdochium nivale （Ｃ）個単離物：72，520及び18222（共通配列） (vii）直前の起源： （Ｂ）クローン：pCRMniv72（5-2)，pCRMniv520（4-2）及びpCRMniv18222（
6-2） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNAの３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：31..175 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：176..332 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：333..499 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：500..556 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNAの５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：23：
【化２３】 （２）SEQ ID NO：24の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：561塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム） （vi）起源： （Ａ）生物：Fusarium avenaceum （Ｃ）個単離物：64452及びR-4045（共通配列） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“小サブユニットrRNAの３′末端” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：31..181 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 1” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：182..338 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“5.8S rRNA遺伝子” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：339..504 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“ITS 2” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：misc feature （Ｂ）位置：505..561 （Ｄ）その他の情報：／備考＝“大サブユニットrRNA遺伝子の５′末端” （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：24：
【化２４】 （訂正理由１） 国際出願日における明細書の原文の第１８〜３５頁の翻訳が欠落していたので
、これを追加する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フサリウム・ポアエ（Fusarium poae ）のＩＴＳ１、フサリ
    ウム・ポアエのＩＴＳ２、ミクロドシウム・ニバレ（Microdochium nivale ）の
    ＩＴＳ１、ミクロドシウム・ニバレのＩＴＳ２、フサリウム・アベナセウム（F.
    avenaceum）のＩＴＳ１及びフサリウム・アベナセウムのＩＴＳ２から選ばれる
    内部転写型スペーサー配列を含んで成る単離されたＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 フサリウム・ポアエのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２２のヌクレオ
    チド３１〜１８０を含んで成り、フサリウム・ポアエのＩＴＳ２がSEQ ID NO:２
    ２のヌクレオチド３３８〜４８９を含んで成り、ミクロドシウム・ニバレのＩＴ
    Ｓ１がSEQ ID NO:２３のヌクレオチド３１〜１７５を含んで成り、ミクロドシウ
    ム・ニバレのＩＴＳ２がSEQ ID NO:２３のヌクレオチド３３３〜４９９を含んで
    成り、フサリウム・アベナセウムのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２４のヌクレオチド３
    １〜１８１を含んで成り、そしてフサリウム・アベナセウムのＩＴＳ２がSEQ ID
    NO:２４のヌクレオチド３３９〜５０４を含んで成る、請求項１記載の単離され
    たＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 真菌性内部転写型スペーサー配列の増幅式検査に利用するた
    めのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項２記載の内部転写型スペー
    サー配列の少なくとも約５〜１０個の連なるヌクレオチドと配列同一性を有する
    オリゴヌクレオチドプライマー。
  4. 【請求項４】 真菌性内部転写型スペーサー配列の増幅式検査に利用するた
    めのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項２記載の内部転写型スペー
    サー配列の少なくとも１０個の連なるヌクレオチドと配列同一性を有するオリゴ
    ヌクレオチドプライマー。
  5. 【請求項５】 真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利用
    するためのオリゴヌクレオチドプライマーペアーであって、当該プライマーの少
    なくとも一方が請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、オリゴヌ
    クレオチドプライマーペアー。
  6. 【請求項６】 真菌病原体の同定において利用するためのオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであって、SEQ ID NO:７〜１５から成る群から選ばれるオリゴヌク
    レオチドプライマー。
  7. 【請求項７】 真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利用
    するためのオリゴヌクレオチドプライマーペアーであって、当該プライマーの少
    なくとも一方が請求項６記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、オリゴヌ
    クレオチドプライマーペアー。
  8. 【請求項８】 前記ペアーが下記のプライマーペアーから選ばれる、請求項
    ７記載のオリゴヌクレオチドプライマーペアー： SEQ ID NO:１３及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１４及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:１５及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:１４及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１５及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１２及びSEQ ID NO:１０； SEQ ID NO:１２及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:１０； SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:８及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:９及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１６； SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１８；並びに SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１７。
  9. 【請求項９】 ミクロドシウム・ニバレを検査するために利用され、且つ下
    記のプライマーペアーから選ばれる請求項８記載のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーペアー： SEQ ID NO:１３及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１４及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:１５及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:１４及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１５及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１２及びSEQ ID NO:１０； SEQ ID NO:１２及びSEQ ID NO:４； SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:１０； SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１１； SEQ ID NO:８及びSEQ ID NO:１１；並びに SEQ ID NO:９及びSEQ ID NO:１１。
  10. 【請求項１０】 ミクロドシウム・ニバレ、フサリウム・グラミネアヌム（
    F. graminearum）、フサリウム・クルモルム（F. culmorum ）、フサリウム・ア
    ベナセウム、フサリウム・ポアエ及びフサリウム・モニリフォルメ（F. monilif
    orme）を検査するために利用され、且つSEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:４を含んで
    成る、請求項８記載のオリゴヌクレオチドプライマーペアー。
  11. 【請求項１１】 Ｆ．グラミネアルム、Ｆ．モニリフォルメ、フサリウム・
    ロゼウム（F. roseum ）、Ｆ．ポアエ及びＦ．クルモルムを検査するために利用
    され、且つSEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:８を含んで成る、請求項８記載のオリゴ
    ヌクレオチドプライマーペアー。
  12. 【請求項１２】 Ｆ．グラミネアルム及びＦ．クルモルムを検査するために
    利用され、且つ下記のプライマーペアーから選ばれる、請求項８記載のオリゴヌ
    クレオチドプライマーペアー： SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:８；並びに SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:１７。
  13. 【請求項１３】 真菌病原体の検査のための方法であって、下記の工程： （ａ）病原体で感染された植物の葉からＤＮＡを単離し； （ｂ）当該ＤＮＡを少なくとも一の請求項４記載のプライマーを利用するポリ
    メラーゼ連鎖反応増幅にかけ；そして （ｃ）当該ポリメラーゼ連鎖反応増幅の１又は複数種の生成物を目視化するこ
    とにより前記真菌病原体を検査する； を含んで成る方法。
  14. 【請求項１４】 前記真菌病原体がフサリウム・ポアエ及びミクロドシウム
    ・ニバレから選ばれる、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 真菌病原体の検査のための方法であって、下記の工程： （ａ）病原体で感染された植物の葉からＤＮＡを単離する； （ｂ）請求項５記載のプライマーペアーでのポリメラーゼ連鎖反応において鋳
    型として当該ＤＮＡを利用して前記病原体の内部転写型スペーサー配列の一部を
    増幅させる；そして （ｃ）当該内部転写型スペーサー配列の増幅部を目視化することにより前記真
    菌病原体を検査する； を含んで成る方法。
  16. 【請求項１６】 前記真菌病原体がフサリウム・ポアエ及びミクロドシウム
    ・ニバレから選ばれる、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項４記載のプライマーを含んで成る、真菌病原体を検
    査するのに利用する診断キット。
  18. 【請求項１８】 請求項５記載のプライマーペアーを含んで成る、真菌病原
    体を検査するのに利用する診断キット。
  19. 【請求項１９】 前記内部転写型スペーサー配列がフサリウム・ポアエのＩ
    ＴＳ１及びＩＴＳ２から選ばれる、請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子。
  20. 【請求項２０】 フサリウム・ポアエのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２２のヌクレ
    オチド３１〜１８０を含んで成り、そしてフサリウム・ポアエのＩＴＳ２がSEQ
    ID NO:２２のヌクレオチド３３８〜４８９を含んで成る、請求項１９記載の単離
    されたＤＮＡ分子。
  21. 【請求項２１】 真菌内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利用
    するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項２０記載の内部転写
    型スペーサー配列の少なくとも１０個の連なるヌクレオチドと配列同一性を有す
    るオリゴヌクレオチドプライマー。
  22. 【請求項２２】 前記内部転写型スペーサー配列がミクロドシウム・ニバレ
    のＩＴＳ１及びＩＴＳ２から選ばれる、請求項１記載の単離ＤＮＡ分子。
  23. 【請求項２３】 ミクロドシウム・ニバレのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２３のヌ
    クレオチド３１〜１７５を含んで成り、そしてミクロドシウム・ニバレのＩＴＳ
    ２がSEQ ID NO:２３のヌクレオチド３３３〜４９９を含んで成る、請求項２２記
    載の単離されたＤＮＡ分子。
  24. 【請求項２４】 真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利
    用するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項２３記載の内部転
    写型スペーサー配列の少なくとも１０個の連なるヌクレオチドと配列同一性を有
    するオリゴヌクレオチドプライマー。
  25. 【請求項２５】 前記内部転写型スペーサー配列がフサリウム・アベナセウ
    ムのＩＴＳ１及びＩＴＳ２から選ばれる、請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子
    。
  26. 【請求項２６】 フサリウム・アベナセウムのＩＴＳ１がSEQ ID NO:２４の
    ヌクレオチド３１〜１８１を含んで成り、そしてフサリウム・アベナセウムのＩ
    ＴＳ２がSEQ ID NO:２４のヌクレオチド３３９〜５０４を含んで成る、請求項２
    ５記載の単離されたＤＮＡ分子。
  27. 【請求項２７】 真菌性内部転写型スペーサーＤＮＡ配列の増幅式検査に利
    用するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項２６記載の内部転
    写型スペーサー配列の少なくとも１０個の連なるヌクレオチドと配列同一性を有
    するオリゴヌクレオチドプライマー。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6358680B1 (en) * 1998-02-20 2002-03-19 Syngenta Participations Ag Detection of wheat and barley fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6518020B1 (en) * 1998-09-18 2003-02-11 Heska Corporation Haemobartonella PCR methods and materials
EP1185702B1 (en) * 1999-05-28 2017-02-08 Fujirebio Europe N.V. Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens
US6872523B1 (en) * 2000-05-30 2005-03-29 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Materials and methods for molecular detection of clinically relevant pathogenic fungal species
US6645720B2 (en) * 2001-03-09 2003-11-11 Syngenta Participations Ag Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6846631B2 (en) * 2001-09-24 2005-01-25 Syngenta Participations Ag Detection of Fusarium species infecting corn using the polymerase chain reaction
WO2003085378A2 (en) * 2002-04-03 2003-10-16 Syngenta Participations Ag Detection of wheat and barley fungal pathogens which are resistant to certain fungicides using the polymerase chain reaction
CA2484744C (en) * 2002-05-17 2015-09-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Molecular identification of aspergillus species
EP1766083B1 (en) 2004-07-15 2011-05-04 Technische Universität Wien Method for the detection of fusarium graminearum
BRPI0709282B8 (pt) 2006-03-29 2021-05-25 Merial Ltd vacina contra estreptococos
CN104630369B (zh) * 2015-02-13 2016-02-24 湖南农业大学 水稻恶苗病菌的pcr检测方法
CN108384834A (zh) * 2018-05-04 2018-08-10 甘肃省农业科学院植物保护研究所 一种青稞茎基腐病燕麦镰孢菌环介导等温扩增检测方法及其应用
CN111471795A (zh) * 2020-05-06 2020-07-31 兰州百源基因技术有限公司 燕麦镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
WO2024043830A1 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Denka Life Innovation Research Pte. Ltd. Methods for the detection and identification of fungal species

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5126239A (en) * 1990-03-14 1992-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences
US5585238A (en) * 1994-04-25 1996-12-17 Ciba-Geigy Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5707802A (en) * 1995-01-13 1998-01-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi

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