CN1264988C - 应用聚合酶链反应对小麦真菌病原体的检测 - Google Patents

应用聚合酶链反应对小麦真菌病原体的检测 Download PDF

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Abstract

对于小麦真菌病原体的不同种和株，包括镰孢属的种和Microdochium nivale，描述了源自核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)DNA序列。源自这些序列内的特异性引物经确定认为可用于利用基于PCR的技术对真菌分离株的鉴定。

Description

应用聚合酶链反应对小麦真菌病原体的检测
本发明涉及种特异性引物在聚合酶链反应测定中对于小麦真菌病原体检测的应用。这些引物的应用使真菌病原体特定分离株的检测以及植物种群中疾病发展的监测成为可能。
确实需要发展能在感染过程早期对病原体真菌的特定种进行鉴定的技术。通过病症在作物群丛中变得明显之前鉴定病原体的特定种，农业工作者能估计病原体在作物品种中进一步发展的可能作用，如果作物中病原体已被鉴定，并且如果认为这种应用是必要的，能选择一种合适的杀真菌剂。
本发明涉及植物病原真菌不同致病型的鉴定方法。本发明提供了显示不同真菌致病型间变异性的内部转录间隔区(ITS)DNA序列。这些DNA序列在本发明的方法中是有用的，因为能用它们衍生引物，用于基于聚合酶链反应(PCR)的诊断性试验。在特定真菌致病型提供DNA模板的PCR反应中，这些引物产生独特的片段，从而能用来在病症发作之前鉴定特定致病型在宿主植物材料中的存在或不存在。
在一种优选实施方案中，本发明提供了关于病原体早熟禾镰孢(Fusarium poae)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)和Microdochiumnivale的ITS1和ITS2DNA序列。在另一种优选实施方案中，本发明提供了关于镰孢属的种和Microdochium nivale的检测的ITS衍生的诊断性引物。
本发明提供了估计特定作物品种-病原体菌株关系中的潜在损害的可能性，以及审慎地使用可获得的多种杀真菌剂库的可能性。此外，本发明能用来提供关于特定病原体种在扩大的地理区域中发育与扩散的详细信息。本发明提供了一种特别适用于具有长潜伏期的疾病的检测方法。
也提供了在本发明的实行中有用的试剂盒。这些试剂盒在真菌病原体镰孢属的种和Microdochium nivale的鉴定中特别有用。
本发明提供了可用于鉴定植物病原真菌不同致病型的独特的DNA序列。特别地，这些DNA序列能在基于PCR的分析中作为引物用于真菌致病型的鉴定。本发明的DNA序列包括特定真菌病原体核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)序列，以及来源于这些区能鉴定特定病原体的引物。这些来源于一种病原体种或属的不同致病型的ITSDNA序列，随该种或属的不同成员而不同，能用来鉴定特定的成员。
生物医学研究人员应用基于PCR的技术已经有一段时间，并且适度成功地检测了被感染的动物组织中的病原体。然而只是最近，才将该技术用于检测植物病原体。应用对病原体线粒体基因组特异的序列的PCR，检测了感染的小麦中Gaumannomyces graminis的存在(Schlesser等人，1991；应用与环境微生物学(Applied and Environ.Microbiol.)57：553-556)，而随机扩增多态DNA(即RAPD)标记能区别Gremeniella abietina的大量种，其为针叶树scleroderris canker的病因。美国专利号5,585,238(在此完全引入作为参考)描述了来源于壳针孢属(Septoria)、假尾孢属(Pseudocercosporella)和球腔菌属(Mycosphaerella)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。此外，WO 95/29260(在此完全引入作为参考)描述了来源于镰孢属(Fusarium)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。此外，欧洲专利申请号97810779.5(在此完全引入作为参考)描述了来源于尾孢属(Cercospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、球梗孢属(Kabatiella)和柄锈菌属(Puccinia)菌株核糖体RNA基因区ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离株中的应用。
核糖体基因由于其高拷贝数而适于用作分子探针靶。尽管成熟rRNA序列之间高度保守，但非转录及转录间隔区序列通常不保守，因而适于作为靶序列用于近代进化趋异的检测。真菌rRNA基因以单位组成，其每一个编码18S(小亚单位)、5.8S和28S(大亚单位)的三种成熟亚单位。这些亚单位被大约300bp的两种内部转录间隔区ITS1和ITS2隔开(White等人，1990；于：《PCR方案》；Innes等人编；315-322页)。此外，这些转录单位被非转录间隔序列(NTS)隔开。ITS和NTS序列尤其适用于不同真菌病原体的特定致病型的检测。
本发明的DNA序列来源于不同植物病原体核糖体RNA基因区的内部转录间隔区序列。来源于一种病原体种或属内不同致病型的ITSDNA序列随该种或属的不同成员而不同。一旦测定了一种病原体的ITS序列，即能将这些序列与其它ITS序列相对比。这样，可由ITS序列衍生引物。即，能根据含有真菌致病型间最大序列差异的ITS序列内的区域来设计引物。这些序列和基于这些序列的引物能用来鉴定特定的病原体。
特别的目的DNA序列包括早熟禾镰孢、Microdochium nivale和燕麦镰孢的ITS DNA序列。这些ITS DNA序列分别在SEQ ID NO：22-24中公开。由这些ITS序列衍生的典型寡核苷酸引物的序列在SEQ IDNO：7-18中公开。这些序列在目的致病型的基于PCR的鉴定中得到应用。
本发明包括含有一种内部转录间隔区序列的分离的DNA分子，该内部转录间隔区序列选自：早熟禾镰孢的ITS1、早熟禾镰孢的ITS2、Microdochium nivale的ITS1、Microdochium nivale的ITS2、燕麦镰孢的ITS1和燕麦镰孢的ITS2。更优选的是这样的分离的DNA分子，其中早熟禾镰孢的IST1包含SEQ ID NO：22的核苷酸31-180，早熟禾镰孢的IST2包含SEQ ID NO：22的核苷酸338-489，Microdochium nivale的ITS1包含SEQ ID NO：23的核苷酸31-175，Microdochium nivale的ITS2包含SEQ ID NO：23的核苷酸333-499，燕麦镰孢的ITS1包含SEQ IDNO：24的核苷酸31-181，燕麦镰孢的ITS2包含SEQ ID NO：24的核苷酸339-504。
在PCR分析中应用本发明的引物序列的方法在本领域中众所周知。例如，见美国专利号4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等人(1991)应用与环境微生物学57：553-556。参见，Nazar等人(1991；生理与分子植物病理学(Physiol.and Molec.Plant Pathol.)39：1-11)，其利用PCR扩增研究黑白轮枝孢(Verticillium albo-atrum)与大丽花轮枝孢(Verticillium dehliae)ITS区之间的差异，并因此区分这两个种；以及Johanson和Jeger(1993；霉菌学研究(Mycol.Res.)97：670-674)，他们利用相似的技术区分香蕉病原体Mycosphaerella fijiensis与Mycospharella musicola。
通过本领域所知的方法能从真菌病原体中克隆本发明的ITS DNA序列。通常，从真菌分离株中分离DNA的方法是已知的。见，Raeder和Broda(1985)应用微生物学信件(Letters in AppliedMicrobiology)2：17-20；Lee等人(1990)真菌遗传学通讯(FungalGenetics Newsletter)35：23-24；以及Lee和Taylor(1990)于：《PCR方案：方法与应用指南》，Innes等人(编)；282-287页。
此外，通过PCR扩增能测定目的ITS序列。在一种例举的实施方案中，根据White等人(1990；于：《PCR方案》；编：Innes等人；315-322页)设计扩增完整ITS区的引物，并将扩增的ITS序列亚克隆到pCR II克隆载体中。亚克隆的序列包括左侧ITS(ITS1)、右侧ITS(ITS2)以及位于中央的5.8S rRNA基因。对镰孢属的几个种包括早熟禾镰孢和燕麦镰孢以及Microdochium nivale均进行这一过程。
在每一病原体组内比较测定的ITS序列，以定位可用于PCR检测的差异，用来区别不同种和/或株。SEQ ID NO：19-24中显示测定的ITSDNA序列，图1中显示其比较性序列对比。根据差异的鉴定，合成了大量引物并在PCR扩增中检验。用于PCR扩增试验的模板最初是纯化的病原体DNA，随后是从感染的宿主植物组织中分离的DNA。因此，有可能鉴定诊断性的引物对，即，其鉴定一种特定的病原体种或株而不是相同病原体的另一个种或株。也针对种间的高度保守区设计了引物，以开发属特异性引物以及能鉴定引起特定疾病的任一几种真菌病原体的引物。例如，开发了引物来检测由多种真菌病原体包括镰孢属的种和Microdochium nivale引起的镰孢属的疾病。
优选的引物组合能够区别感染的宿主组织即以前已感染了一种特定病原体种或株的宿主组织中的不同种或株。本发明为镰孢属的种和Microdochium nivale提供了符合该标准的大量引物组合。本发明的引物是根据真菌ITS区之间的序列差异而设计的。序列间最少为一个碱基对的差异使辨别性引物的设计成为可能。针对特定真菌DNA ITS区设计的引物能与针对核糖体DNA编码区内保守序列制备的引物结合使用，以扩增种特异的PCR片段，一般而言，引物应具有约60℃到约70℃的理论解链温度，以达到良好的敏感度，并且在引物组合之间应没有明显的二级结构和3’重叠。引物一般与ITS1或ITS2的至少约5-10个连续核苷酸碱基、优选地与ITS1或ITS2的至少10个连续核苷酸碱基具有序列同一性。在优选的实施方案中，引物长度大约为5-30个核苷酸碱基。
在本发明范围内优选的是一种用于真菌病原体鉴定的寡核苷酸引物，其中该寡核苷酸引物选自SEQ ID NO：7-15。
本发明的另一种实施方案是一对寡核苷酸引物，其用于对真菌内部转录间隔区DNA序列的基于扩增的检测，其中至少该引物之一是根据本发明的寡核苷酸引物。优选的是一对寡核苷酸引物，其中该引物对选自如下的寡核苷酸引物：
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：16；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18；以及
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17。
本发明涉及用于真菌病原体检测的方法，其包括如下步骤
(a)从感染了一种病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用至少一种引物对该DNA施行聚合酶链反应扩增，其中所述引物为寡核苷酸引物，其用于对真菌内部转录间隔区DNA序列的基于扩增的检测，其中该引物与选自如下的内部转录间隔区序列的至少10个连续核苷酸具有同一性：早熟禾镰孢的IST1包含SEQ ID NO：22的核苷酸31-180，早熟禾镰孢的IST2包含SEQ ID NO：22的核苷酸338-489，Microdochium nivale的ITS1包含SEQ ID NO：23的核苷酸31-175，Microdochium nivale的ITS2包含SEQ ID NO：31-181，燕麦镰孢的ITS2包含SEQ ID NO：24的核苷酸339-504；以及
(c)通过显示该聚合酶链反应扩增的产物检测该真菌病原体。
优选的是用于真菌病原体检测的所述方法，其中该真菌病原体选自早熟禾镰孢和Microdochium nivale。
本发明进一步包括一种用于真菌病原体检测的方法，其包括下列步骤：
(a)从感染了一种病原体的植物叶中分离DNA；
(b)用该DNA作为模板在应用如下的一对引物的聚合酶链反应中扩增该病原体的一部分内部转录间隔区序列，其中所述引物用于对真菌内部转录间隔区DNA序列的基于扩增的检测，其中至少该对引物之一是上述方法步骤b)中的寡核苷酸引物；
(c)通过显示内部转录间隔区序列的扩增部分检测该真菌病原体。
优选的是用于真菌病原体检测的所述方法，其中该真菌病原体选自早熟禾镰孢和Microdochium nivale。
本发明使之易于制备含有实行该方法所必需成分的“试剂盒”。这种试剂盒可包含一种被区室化的载体，其被密封于一种或多种容器如试管或小瓶中。其中一种容器可含有未标记的或可检测地标记的DNA引物。标记的DNA引物可以以冻干的形式存在或者如必需时可存在于适当缓冲液中。一种或多种容器可含有在PCR反应中使用的一种或多种酶或试剂。这些酶可以单独或混合地以冻干形式存在，或者存在于适当缓冲液中。
最后，该试剂盒可含有实行本发明的技术所必需的所有附加成分，如缓冲液、抽提试剂、酶、移液管、平板、核酸、核苷三磷酸、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影用品，等等。
在本发明范围内优选的是一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其包含用于对真菌内部转录间隔区DNA序列进行基于扩增的检测的引物对，其中至少该引物之一是根据本发明的寡核苷酸引物。
下列实施例显示典型的实验方案，这些方案能用于ITS序列的分离、合适引物序列的筛选、对引物的选择性和诊断性效能的检验，以及这些引物对于疾病和真菌分离株检测的应用。提供这些实施例是作为说明而不是作为限制。
                        附图描述
图1/3、2/3、3/3黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、早熟禾镰孢、Microdochium nivale和串珠镰孢(Fusarium moniliforme)的ITS区的序列对比。
                    序列表中的序列简述
SEQ ID NO：1        寡核苷酸引物ITS1。
SEQ ID NO：2    寡核苷酸引物ITS2。
SEQ ID NO：3    寡核苷酸引物ITS3。
SEQ ID NO：4    寡核苷酸引物ITS4。
SEQ ID NO：5    M13通用-20引物。
SEQ ID NO：6    实施例2中使用的反向引物。
SEQ ID NO：7    寡核苷酸引物JB605。
SEQ ID NO：8    寡核苷酸引物JB606。
SEQ ID NO：9    寡核苷酸引物JB607。
SEQ ID NO：10   寡核苷酸引物JB609。
SEQ ID NO：11   寡核苷酸引物JB610。
SEQ ID NO：12   寡核苷酸引物JB611。
SEQ ID NO：13   寡核苷酸引物JB612。
SEQ ID NO：14   寡核苷酸引物JB613。
SEQ ID NO：15   寡核苷酸引物JB614。
SEQ ID NO：16   寡核苷酸引物JB578。
SEQ ID NO：17   寡核苷酸引物JB571。
SEQ ID NO：18   寡核苷酸引物JB572。
SEQ ID NO：19   从黄色镰孢分离株R-5106、R-5126和R-5146中PCR扩增的ITS区的共有DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO：20从禾谷镰孢分离株R-8417、R-8422和R-8546中PCR扩增的ITS区的共有DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO：21从串珠镰孢分离株4551中PCR扩增的ITS区的DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO：22从早熟禾镰孢分离株T-427、T-534和T-756中PCR扩增的ITS区的共有DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO：23从Microdochium nivale分离株72、520和18222中PCR扩增的ITS区的共有DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO：24从燕麦禾镰孢分离株64452和R-4045中PCR扩增的ITS区的共有DNA序列，从5’到3’方向包含：小亚单位rRNA基因的3’末端、内部转录间隔区1、5.8S rRNA基因、内部转录间隔区2和大亚单位rRNA基因的5’末端。
                        实施例
在此所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中众所周知，并由下列作者描述：J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等人，《(分子生物学常用方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。
         实验例1：真菌分离株和基因组真菌DNA提取
参见表1关于所用真菌分离株及其来源的列表。在用源自PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养物的菌丝体片段接种的150ml马铃薯葡萄糖培养液中培养真菌。将培养物在定轨摇床上28℃温育7-11天。离心沉淀菌丝体，然后在液氮中研磨，并用Lee和Taylor的方案(1990；于《PCR方案：方法与应用指南；编：Innes等人；282-287页》)提取总基因组DNA。
                    表1：所试验分离株的来源
  分离株   生物   来源地   来源
  69   Microdochium nivale   ---   Novartis-Basel1
  72   Microdochium nivale   ---   Novartis-Basel1
  92   Microdochium nivalevar.majus   ---   Novartis-Basel1
  93   Microdochium nivalevar.majus   ---   Novartis-Basel1
  520   Microdochium nivale   ---   Novartis-Basel1
  18222   Microdochium nivale   苏格兰   ATCC2
  T-0427   早熟禾镰孢   Lancaster County，PA美国   P.Nelson3
  T-0534   早熟禾镰孢   Rock Springs，PA美国   P.Nelson3
  T-0756   早熟禾镰孢   Unionville，PA美国   P.Nelson3
  36885   禾谷镰孢   芬兰   ATCC2
  R-8422   禾谷镰孢   加拿大   P.Nelson3
  R-8546   禾谷镰孢   Plevdiv，保加利亚   P.Nelson3
  R-8417   禾谷镰孢   意大利   P.Nelson3
  R-9367   禾谷镰孢   Mercer County，PA，美国   P.Nelson3
  R-9420   禾谷镰孢   华盛顿，美国   P.Nelson3
  R-8637   禾谷镰孢   Settat，摩洛哥   P.Nelson3
  4551   串珠镰孢   Indiana，美国   L.Castor4
  13379   粉红镰孢(Fusarium roseum)   ---   ATCC2
  64452   燕麦镰孢   波兰   ATCC2
  R-4045   燕麦镰孢   Dubbo，澳大利亚   P.Nelson3
  R-4941   燕麦镰孢   南部巴西   P.Nelson3
  R-8547   燕麦镰孢   Plevdiv，保加利亚   P.Nelson3
  R-6554   燕麦镰孢   Pullman，华盛顿美国   P.Nelson3
  62215   黄色镰孢   瑞士   ATCC2
  R-5391   黄色镰孢   德国   P.Nelson3
  R-5126   黄色镰孢   Minnesota，美国   P.Nelson3
  R-7770   黄色镰孢   波兰   P.Nelson3
  R-5106   黄色镰孢   Darling Downs，澳大利亚   P.Nelson3
表1(续)
  R-5146   黄色镰孢   芬兰   P.Nelson3
  44643   Pseudocercosporellaherpotrichoides-W型   德国   ATCC2
  308   Pseudocercosporellaherpotrichoides-R型   ---   Novartis-Basel1
  44234   Ceratobasidium cereale   荷兰   ATCC2
  11404   Drechslera sorokiniana   Minnesota，美国   ATCC2
  60531   草本枝孢(Cladosporiumherbarum)   新西兰   ATCC2
  38699   大豆壳针孢(Septoriaglycines)   Illinois，美国   ATCC2
  26517   小麦壳针孢(Septoriatritici)   Minnesota，美国   ATCC2
  52476   落花生尾孢(Cercosporaarachidicola)   Oklahoma，美国 ATCC2
  26380   Septoria avenae f.sp.triticea   Minnesota，美国   P.Ueng5
  24425   颖枯壳针孢(Septorianodorum)   Montana，美国   ATCC2
  ---   立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(鼠尾草)   Vero Beach，Florida美国   Novartis-US6
1Novartis作物保护有限公司，Basel，瑞士
2美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，美国
3Paul Nelson博士，Penn State University，美国
4Loral Castor博士，Novartis Seeds Research，Bloodmington，Illinois，美国
5Peter Ueng博士，USDA，Beltsville，Maryland，美国
6Novartis作物保护公司，Research Triangle Park，NC，美国
           实施例2：内部转录间隔区(ITS)的分离
使用50pmol引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；SEQID NO：1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；SEQ IDNO：4)，从分离自禾谷镰孢分离株R-8417、R-8422和R-8546、黄色镰孢分离株R-5106、R-5126和R-5146、串珠镰孢分离株#4551、早熟禾镰孢分离株T-0427、T-0534和T-0756、M.nivale分离株520、72和18222以及燕麦镰孢分离株64452和R-4045的10ng基因组DNA中分别经PCR扩增大约550bp长的内部转录间隔区片段。如实施例4所述进行PCR。用Promega的Wizard DNA Clean-up试剂盒(Madison，WI)纯化PCR产物。应用Applied Biosystems(Foster City，CA)自动化测序仪与引物IST1(SEQ ID NO：1)、ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；SEQ ID NO：2)、ITS4(SEQ ID NO：4)和M13通用-20(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’；SEQ ID NO：5)和反向(5’-AACAGCTATGACCATG-3’；SEQ ID NO：6)引物，通过双脱氧法测定ITS区的DNA序列。White等人(1990；于《PCR方案》；编：Innes等人；315-322页)详述了ITS引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4。用应用PCR2.1克隆载体的Invitrogen公司(San Diego，CA)TA克隆试剂盒(货号K2000-01)，克隆由扩增串珠镰孢分离株#4551，早熟禾镰孢分离株T-0427、T-0534和T-0756以及M.nivale分离株520、72和18222所获得的PCR产物。
                 实施例3：从小麦中提取DNA
用大块浸解法从小麦中提取DNA。大块浸解法用来从田间几种自然感染的小麦穗或茎中分离DNA，以对高流通量分析优化田间取样法。
大块浸解法：
(1)将适量的小麦穗或茎置于Bioreba(Reinach，瑞士)耐用塑料袋(目录#490100)中。称重植物组织，塑料袋与叶减去皮重(塑料袋的重量)。
(2)每一重量(g)小麦组织中加入等体积(mn)的Muller提取缓冲液(0.01％w/v吐温80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/vBSA-Pentex组分V；0.01％w/v叠氮钠；200mM EDTA)。用设置为70的Bioreba Homex匀浆器浸软组织。研磨叶子直到组织成纤维状。
 (3)如果使用的话，合并多个袋中的提取物，并充分地涡旋振荡。将提取液等分于置于冰上的eppendorf管中。
(a)将100μl浓缩的提取物煮沸5分钟。
(b)将煮沸的提取物置于冰上。
(c)通过将100μl煮沸、浓缩的提取物加入90μl无菌蒸馏水中进行1∶10稀释。
(d)将稀释的提取物贮存于冰上待用。
               实施例4：聚合酶链反应扩增
应用Perkin-Elmer/Cetus(Norwalk CT；货号N808-0009)的GeneAmp试剂盒进行聚合酶链反应，其中使用50mM KCl、2.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl，pH8.3，其中含有200μM每种dTTP、dATP、dCTP和dGTP、50pmol每种引物，2.5单位Taq聚合酶和10ng基因组DNA或1μl1：10稀释的植物提取物，终体积50μl。在Perkin-Elmer/Cetus9600型热循环仪中进行反应，94℃15秒、50-70℃15秒和72℃45秒，30-40次循环。通过将10μl每种PCR样品加样于1.0％琼脂糖凝胶中并电泳来分析产物。
               实施例5：寡核苷酸的合成与纯化
通过如整合DNA技术(Coralville，IA)或Midland Certified ReagentCompany(Midland，Texas)合成寡核苷酸(引物)。
               实施例6：种特异性引物的选择
图1显示黄色镰孢、禾谷镰孢、早熟禾镰孢、M.nivale和串珠镰孢ITS区的序列对比。根据对比序列的分析按照实施例5合成如以下表2所示的寡核苷酸引物。针对含有真菌种间最大序列差异的区设计引物。也针对种间高度保守区设计引物，以试图开发属特异性引物。此外，为了与对ITS区特异的引物联合试验，合成公开的核糖体基因特异的引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等人，1990；于《PCR方案》；编：Innes等人，315-322页)。WO 95/29260的针对镰孢属的种的引物也与新设计的引物结合应用，以检验新的特异性。
               表2：为真菌检测设计的引物
  引物模板   引物   引物序列
  Fusarium spp.1M.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivale镰孢属的种2禾谷镰孢+黄色镰孢3禾谷镰孢+黄色镰孢318SrDNA5.8SrDNA5.8SrDNA25SrDNA   JB605JB606JB607JB609JB610JB611JB612JB613JB614JB578JB571JB572ITS1ITS2ITS3ITS4   5’CAAACCATGTGAACTTACC3’(SEQ ID NO：7)5’GGACTACCTAAACTCTGTT3’(SEQ ID NO：8)5’AGGGATCATTACCGAGTTT3’(SEQ ID NO：9)5’TCCGGCTTGCAGAAGCGAG3’(SEQ ID NO：10)5’GAAGGGTGCGGTTTATGGCT3’(SEQ ID NO：11)5’GCCACCGCCGGTGGAC3’(SEQ ID NO：12)5’GGTGCTGTCTCTCGGGAC3’(SEQ ID NO：13)5’AGTCAATCTGAATCAAACTAAG3’(SEQ ID NO：14)5’CTAAACTCTGTTAATTTTTGTCAA3’(SEQ ID NO：15)5’CGCGACGATTACCAG3’(SEQ ID NO：16)5’TAACGATATGTAAATTACTACGCT3’(SEQ ID NO：17)5’AAGTTGGGGTTTAACGGC3’(SEQ ID NO：18)5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’(SEQ ID NO：1)5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC3’(SEQ ID NO：2)5’GCATCGATGAAGAACGCAGC3’(SEQ D NO：3)5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’(SEQ ID NO：4)
1镰孢属的种包括禾谷镰孢、黄色镰孢、燕麦镰孢、早熟禾镰孢和串珠镰孢。
2镰孢属的种包括禾谷镰孢、黄色镰孢、早熟禾镰孢、串珠镰孢和粉红镰孢。
3只对禾谷镰孢、黄色镰孢和M.nivale试验了引物组合。
    实施例7：对于纯化真菌基因组DNA特异的引物的测定
按照实施例4使用不同引物组合(表3)进行PCR以扩增单一的特异片段。由依每种目的真菌株18S和25S核糖体DNA亚单位间的ITS区设计的引物产生特异的PCR扩增产物。
                      表3：ITS衍生的诊断性PCR引物
  引物特异性   5’引物   3’引物扩   增片段的近似大小
  M.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivaleM.nivale镰孢属的种1+M.niv镰孢属的种2禾谷镰孢+黄色镰孢3禾谷镰孢+黄色镰孢3   JB612(SEQ ID NO：13)JB613(SEQ ID NO：14)JB614(SEQ ID NO：15)JB613(SEQ ID NO：14)JB614(SEQ ID NO：15)JB611(SEQ ID NO：12)JB611(SEQ ID NO：12)ITS1(SEQ ID NO：1)ITS1(SEQ ID NO：1)JB605(SEQ ID NO：7)JB606(SEQ ID NO：8)JB607(SEQ ID NO：9)JB605(SEQ ID NO：7)JB605(SEQ ID NO：7)JB605(SEQ ID NO：7)JB605(SEQ ID NO：7)   ITS4(SEQ ID NO：4)JB610(SEQ ID NO：11)JB610(SEQ ID NO：11)ITS4(SEQ ID NO：4)ITS4(SEQ ID NO：4)JB609(SEQ ID NO：10)ITS4(SEQ ID NO：4)JB609(SEQ ID NO：10)JB610(SEQ ID NO：11)JB610(SEQ ID NO：11)JB610(SEQ ID NO：11)JB610(SEQ ID NO：11)ITS4(SEQ ID NO：4)JB578(SEQ ID NO：16)JB572(SEQ ID NO：18)JB571(SEQ ID NO：17)   472bp337bp355bp413bp431bp346bp450bp452bp480bp433bp362bp460bp509bp417bp440bp400bp
 1镰孢属的种包括禾谷镰孢、黄色镰孢、燕麦镰孢、早熟禾镰孢和串珠镰孢。
 2镰孢属的种包括禾谷镰孢、黄色镰孢、早熟禾镰孢、串珠镰孢和粉红镰孢。
 3只对禾谷镰孢、黄色镰孢和M.nivale试验了引物组合。
实施例8：对于感染真菌的植物组织特异的引物以及
与其它谷类真菌病原体的交叉反应性的测定
如实施例3所述从健康小麦穗并从接种了M.nivale、禾谷镰孢、黄色镰孢或燕麦镰孢的小麦穗中分离总基因组DNA。如实施例4所述进行PCR，对小麦组织的DNA检验如表3所列的引物组合。如实施例1所述获得纯化的真菌基因组DNA，并如实施例4所述应用诊断性引物对其进行PCR试验。对其它真菌DNA种和分离株检验诊断性引物与之交叉反应的能力。代表性试验的结果如下：
M.nivale特异的引物组合JB612(SEQ ID NO：13)和ITS4(SEQID NO：4)能从表1所列所有M.nivale分离株的DNA中和M.nivale感染的小麦组织中扩增出472bp的片段。该引物组合不能从健康小麦组织中也不能从纯化的禾谷镰孢、黄色镰孢、燕麦镰孢、早熟禾镰孢或串珠镰孢基因组DNA中扩增出诊断片段。该引物组合也不能从自下列常见谷类病原体分离的纯化基因组DNA中扩增出诊断片段：P.herpotrichoides R-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆壳针孢、小麦壳针孢、落花生尾孢、颖枯壳针孢、立枯丝核菌和S.avenae f.sp.triticea。用M.nivale特异的引物组合JB613(SEQ IDNO：14)和JB610(SEQ ID NO：11)获得相似的诊断结果。
引物组合JB613(SEQ ID NO：14)和ITS4(SEQ ID NO：4)从M.nivale分离株#520的DNA和感染M.nivale的小麦中扩增出413bp的片段，而引物组合JB614(SEQ ID NO：15)和ITS4(SEQ ID NO：4)扩增出431bp的片段。这些引物组合不能从健康小麦组织中也不能从禾谷镰孢分离株#R-8422和黄色镰孢分离株#R-5391的DNA中扩增出任何片段。
表3所列的其它M.nivale特异的引物组合能从M.nivaIe分离株#520的DNA中而不能从禾谷镰孢分离株#R-8422或黄色镰孢分离株#R-5391的DNA中扩增出PCR片段。
引物组合JB605(SEQ ID NO：7)和ITS4(SEQ ID NO：4)从表1所列所有M.nivale分离株的DNA中扩增出509bp的片段。该引物组合也从表1所列全部禾谷镰孢、黄色镰孢、燕麦镰孢、早熟禾镰孢和串珠镰孢分离株的DNA中扩增509bp的片段。该引物组合不能从自下列谷类病原体分离的纯化基因组DNA中扩增出诊断片段：P.herpotrichoidesR-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆壳针孢、小麦壳针孢、落花生尾孢、颖枯壳针孢、立枯丝核菌和S.avenae f.sp.triticea。引物组合JB605(SEQ ID NO：7)和ITS4(SEQ ID NO：4)也能从感染了镰孢属的种的小麦中而不能从健康小麦中扩增出诊断片段。
引物组合JB605(SEQ ID NO：7)和JB571(SEQ ID NO：17)、JB605(SEQ ID NO：7)和JB572(SEQ ID NO：18)以及JB605(SEQID NO：7)和JB578(SEQ ID NO：16)从禾谷镰孢分离株#R-8422和黄色镰孢分离株#R-5391的DNA中分别扩增400bp、440bp和417bp的片段，而不能从M.nivale分离株#520的DNA中扩增。此外，引物组合JB605(SEQ ID NO：7)和JB578(SEQ ID NO：16)能从表1所列全部禾谷镰孢、串珠镰孢、粉红镰孢、早熟禾镰孢和黄色镰孢分离株中扩增出诊断片段；然而，该引物组合不能从表1所列任何燕麦镰孢分离株或M.nivale分离株中扩增。引物组合JB605(SEQ ID NO：7)和JB571(SEQID NO：17)、JB605(SEQ ID NO：7)和JB572(SEQ ID NO：18)以及JB605(SEQ ID NO：7)和JB578(SEQ ID NO：16)不能从健康小麦或自下列谷类病原体分离的纯化基因组DNA中扩增出诊断片段：P.herpotrichoides R-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆壳针孢、小麦壳针孢、落花生尾孢、颖枯壳针孢、立枯丝核菌和S.avenae f.sp.triticea。
尽管已参照特定实施方案描述了本发明，但应当理解，多种变化、修改和进一步的实施方案是可能的，因此，所有这些变化、修改和实施方案都被看作落在本发明的范围之内。
                          序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：Beck，James J.
  (ii)发明名称：应用聚合酶链反应对小麦真菌病原体的检测
  (iii)序列数目：24
  (iv)联系地址：
     (A)收件人：Novartis公司专利部
     (B)街道：3054 Cornwallis Road
     (C)城市：Research Triangle Park
     (D)州：NC
     (E)国家：美国
     (F)邮政编码：20779-2257
  (v)计算机可读形式：
     (A)介质类型：磁盘
     (B)计算机：IBM兼容机
     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
     (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version 1.30
  (vi)当前申请信息：
     (A)申请号：
     (B)递交日期：
     (C)分类：
  (viii)律师/代理机构信息：
     (A)名称：Meigs，J.Timothy
     (B)登记号：38,241
     (C)文献/案卷号：CGC 1944
  (ix)通讯信息：
     (A)电话：(919)541-8587
     (B)传真：(91)541-8689
(2)SEQ.ID.NO.1的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：19个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物ITS1”
  (xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述：
TCCGTAGGTG AACCTGCGG                                            19
(2)SEQ.ID.NO.2的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：20个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物ITS2”
  (xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述：
GCTGCGTTCT TCATCGATGC                                            20
(2)SEQ.ID.NO.3的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：20个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物ITS 3”
  (xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述：
GCATCGATGA AGAACGCAGC                                              20
(2)SEQ.ID.NO.4的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：20个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物ITS4”
  (xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述：
TCCTCCGCTT ATTGATATGC                                              20
(2)SEQ.ID.NO.5的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：17个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“M13通用-20引物”
  (xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述：
GTAAAACGAC GGCCAGT                                                 17
(2)SEQ.ID.NO.6的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：16个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“用于实施例2的逆转录引物”
  (xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述：
AACAGCTATG ACCATG                                            16
(2)SEQ.ID.NO.7的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：20个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB605”
  (xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述：
CCAAACCATG TGAACTTACC                                        20
(2)SEQ.ID.NO.8的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：19个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB606”
  (xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述：
GGACTACCTA AACTCTGTT                                         19
(2)SEQ.ID.NO.9的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：19个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB607”
  (xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述：
AGGGATCATT ACCGAGTTT                                           19
(2)SEQ.ID.NO.10的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：19个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB609”
  (xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述：
TCCGGCTTGC AGAAGCGAG                                           19
(2)SEQ.ID.NO.11的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：20个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB610”
  (xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述：
GAAGGGTGCG GTTTATGGCT                                          20
(2)SEQ.ID.NO.12的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：16个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB611”
  (xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述：
GCCACCGCCG GTGGAC                                              16
(2)SEQ.ID.NO.13的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：18个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物612”
  (xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述：
GGTGCTGTCT CTCGGGAC                                            18
(2)SEQ.ID.NO.14的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：22个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB613”
  (xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述：
AGTCAATCTG AATCAAACTA AG                                       22
(2)SEQ.ID.NO.15的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：24个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB614”
  (xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述：
CTAAACTCTG TTAATTTTTG TCAA                                     24
(2)SEQ.ID.NO.16的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：16个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB578”
  (xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述：
CCGCGACGAT TACCAG                                              16
(2)SEQ.ID.NO.17的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：24个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB571”
  (xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述：
TAACGATATG TAAATTACTA CGCT                                     24
(2)SEQ.ID.NO.18的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：18个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
     (A)描述：/desc＝“引物JB572”
  (xi)SEQ.ID.NO.18的序列描述：
AAGTTGGGGT TTAACGGC                                            18
(2)SEQ.ID.NO.19的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：504个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
     (A)描述：/desc＝“引物ITS1”
  (vi)初始来源：
     (A)生物：黄色镰孢
     (C)单独分离株：R-5106，R-5126和R-5146(共有序列)
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..12
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：13..161
     (D)其他信息：/注＝“ITS1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：162..318
     (D)其他信息：/注＝“5.8S rRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：319..472
     (D)其他信息：/注＝“ITS2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：473..504
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.19的序列描述：
GAGGGATCAT TACCGAGTTT ACTRACTCCC AAACCCCTGT GAACDTACCT TATGTTGCCT  60
CGGCGGATCA GCCCGCGCCC CGTAAAAAGG GACGGCCCGC CGCAGGAACC CTAAACTCTG    120
TTTTTAGTGG AACTTCTGAG TATAAAAAAC AAATAAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT    180
CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA    240
TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG    300
CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCAGCTTGGT GTTGGGAGCT GCAGTCCTGC    360
TGCACTCCCC AAATACATTG GCGGTCACGT CGRAGCTTCC ATAGCGTAGT AATTTACATA    420
TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCYACGCCG TTAAACCCCA ACTTCTGAAT GTTGACCTCG    480
GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAA                                           504
(2)SEQ.ID.NO.20的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：503个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (vi)初始来源：
     (A)生物：禾谷镰孢
     (C)单独分离株：R-8417，R-8422和R-8546(共有序列)
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..9
     (D)其他信息：/注＝“rRMA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：10..155
     (D)其他信息：/注＝“ITS1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：156..312
     (D)其他信息：/注＝“5.8S rRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：313..466
     (D)其他信息：/注＝“ITS2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：467..503
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.20的序列描述：
GGATCATTAC CGAGTTTACW SACTCCCAAA CCCCTGTGAA CATACCTTAT GTTGCCTCGG     60
CGGATCAGCC CGCGCCCCGA AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA    120
GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT    180
KCTGGCATCG ATGAAGAACG CASCRAAATG CGATAAGTAA TGTGWATTGC AGAATTCAGT    240
GAATCAWCGA ATCTTTGAAC GCWSATTGCK MCCRCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT    300
CGAGCGTCAT TTCAACCCTC AAGCCCAGVT TGGTGTKGGG GARYTGCAGK CCTRYTKCAC    360
TCCCCAAATA ARTTGGCGGT CACGTCGAAC TTCCATAGCG TAGTAAGTTA CACATCGTTA    420
CTGGTAATCG TCGCGGCTAC GCCGTTAAAC CCCAACTTCT GAATGTTGAC CTCGGATCAG    480
GTAGGAATAC CCGCTGAAGG TAA                                            503
(2)SEQ.ID.NO.21的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：545个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (vi)初始来源：
     (A)生物：串珠镰孢
     (C)单独分离株：4551
  (vi)直接来源：
     (B)克隆：pCRFMON1
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..30
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：31..178
     (D)其他信息：/注＝“ITS1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：179..335
     (D)其他信息：/注＝“5.8 SrRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：336..488
     (D)其他信息：/注＝“ITS2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：489..545
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.21的序列描述：
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA     60
CATACCTTAT GTTGCCTCGG CGGATCAGCC CGCGCCCCGT AAAAAGGGAC GGCCCGCCGC    120
AGGAACCCTA AACTCTGTTT TTAGTGGAAC TTCTGAGTAT AAAAAACAAA TAAATCAAAA    180
CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA ATGCGATAAG    240
TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA    300
GTATTCTGGC GGGCATGCCT GTTCGAGCGT CATTTCAACC CTCAAGCCCA GCTTGGTGTT    360
GGGAGCTGCA GTCCTGCTGC ACTCCCCAAA TACATTGGCG GTCACGTCGA GCTTCCATAG    420
CGTAGTAATT TACACATCGT TACTGGTAAT CGTCGCGGCC ACGCCGTTAA ACCCCAACTT    480
CTGAATGTTG ACCTCGGATC AGGTAGGAAT ACCCGCTGAA CTTAAGCATA TCAATAAGCG    540
GAGGA                                                                545
(2)SEQ.ID.NO.22的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：546个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (vi)初始来源：
     (A)生物：早熟禾镰孢
     (C)单独分离株：T-427，T-534和T-756(共有序列)
  (vi)直接来源：
     (B)克隆：pCRFpoaeT427(1-2)，pCRFpoaeT534(2-2)和pCRFpoaeT756(3-1)
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..30
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：31..180
     (D)其他信息：/注＝“ITS 1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：181..337
     (D)其他信息：/注＝“5.8 SrRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：338..489
     (D)其他信息：/注＝“ITS 2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：490..546
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.22的序列描述：
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA     60
CATACCTTTA TGTTGCCTCG GCGGATCAGC CCGCGCCCCG TAAAACGGGA CGGCCCGCCG    120
CAGGAAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AATAAATCAA    180
AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCA AAATGCGATA    240
AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCGC    300
CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTCAAGCC CAGCTTGGTG    360
TTGGGATCTG TGTGCAAACA CAGTCCCCAA ATTGATTGGC GGTCACGTCG AGCTTCCATA    420
GCGTAGTAAT TTACACATCG TTACTGGTAA TCGTCGCGGC CACGCCGTTA AACCCCAACT    480
TCTGAATGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGC    540
GGAGGA                                                   546
(2)SEQ.ID.NO.23的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：556个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (vi)初始来源：
     (A)生物：Microdochium nivale
     (C)单独分离株：72,520和18222(共有序列)
  (vi)直接来源：
     (B)克隆：pCRMniv72(5-2)，pCRMniv520(4-2)和pCRM18222(6-2)
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..30
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：31..175
     (D)其他信息：/注＝“ITS1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：176..332
     (D)其他信息：/注＝“5.8S rRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：333..499
     (D)其他信息：/注＝“ITS2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：500..556
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.23的序列描述：
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CTGAGTTTTT AACTCTCCAA ACCATGTGAA     60
CTTACCACTG TTGCCTCGGT GGATGGTGCT GTCTCTCGGG ACGGTGCCAC CGCCGGTGGA    120
CTACCTAAAC TCTGTTAATT TTTGTCAATC TGAATCAAAC TAAGAAATAA GTTAAAACTT    180
TCAACAACGG ATCTCTTGGT TCTGGCATCG ATGAAGAACG CAGCGAAATG CGATAAGTAA    240
TGTGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA ATCTTTGAAC GCACATTGCG CCCATTAGTA    300
TTCTAGTGGG CATGCCTGTT CGAGCGTCAT TTCAACCCTT AAGCCTAGCT TAGTGTTGGG    360
AGACTGCCTA ATACGCAGCT CCTCAAAACC AGTGGCGGAG TCGGTTCGTG CTCTGAGCGT    420
AGTAATTTTT TATCTCGCTT CTGCAAGCCG GACTGGCAAC AGCCATAAAC CGCACCCTTC    480
GGGGGCACTT TTTAATGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT    540
ATCAATAAGC GGAGGA                                                    556
(2)SEQ.ID.NO.24的信息：
  (i)序列特征：
     (A)长度：561个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：单链
     (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (vi)初始来源：
     (A)生物：燕麦镰孢
     (C)单独分离株：64452和R-4045(共有序列)
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：1..30
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因小亚基的3’端”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：31..181
     (D)其他信息：/注＝“ITS1”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：182..338
     (D)其他信息：/注＝“5.8SrRNA基因”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：339..504
     (D)其他信息：/注＝“ITS2”
  (ix)特征：
     (A)名称/关键词：misc_feature
     (B)位置：505..561
     (D)其他信息：/注＝“rRNA基因大亚基的5’端”
  (xi)SEQ.ID.NO.24的序列描述：
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA     60
CATACCTTAA TGTTGCCTCG GCGGATCAGC CCGCGCCCYG TAAAACGGGA CGGCCCGCCA    120
GAGGACCCAA ACTCTAATGT TTCTTATTGT AACTTCTGAG TAAAACAAAC AAATAAATCA    180
AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT    240
AAGTAATGTG AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG    300
CTGGTATTCC GGCGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCCCGGGTTT    360
GGTGTTGGGG ATCGGCTCTG CCTTMYGGCG GTGCCGCCCC CGAAATACAT TGGCGGTCTC    420
GCTGCAGCCT CCATTGCGTA GTAGCTAACA CCTCGCAACT GGAACGCGGC GCGGCCATGC    480
CGTAAAACCC CAACTTCTGA ATGTTGACCT CGGATCAGGT AGGAATACCC GCTGAACTTA    540
AGCATATCAA TAAGCGGAGG A                                              561

Claims (8)

1.一种用于一种或多种真菌病原体检测的方法，其包括下列步骤：
(a)从感染了病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用至少一种与如下序列的至少10个连续核苷酸具有序列相同性的引物对该DNA施行聚合酶链反应扩增：
i)由SEQ ID NO：22的核苷酸31-180组成的早熟禾镰孢的ITS1；
ii)由SEQ ID NO：22的核苷酸338-489组成的早熟禾镰孢的ITS2；
iii)由SEQ ID NO：23的核苷酸31-175组成的Microdochiumnivale的ITS1；
iv)由SEQ ID NO：23的核苷酸333-499组成的Microdochiumnivale的ITS2；
v)由SEQ ID NO：24的核苷酸31-181组成的燕麦镰孢的ITS1；或
vi)由SEQ ID NO：24的核苷酸339-504组成的燕麦镰孢的ITS2；以及
(c)通过显示该聚合酶链反应扩增的产物检测所述真菌病原体。
2.权利要求1的方法，其中真菌病原体选自早熟禾镰孢和Microdochium nivale。
3.权利要求1或2的方法，其中所述引物选自SEQ ID NO：7-15。
4.根据权利要求1的方法，其中使用引物对，其中所述引物对选自下列引物对：
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：16；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18；以及
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17。
5.根据权利要求4的方法，其中引物对用于检测Microdochiumnivale，并且该引物对选自下列引物对：
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11；以及
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。
6.根据权利要求4的方法，其中所述引物对用于检测Microdochium nivale、禾谷镰孢、黄色镰孢、燕麦镰孢、早熟禾镰孢和串珠镰孢，并且所述引物对为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：4。
7.根据权利要求4的方法，其中该引物对用于检测禾谷镰孢、串珠镰孢、粉红镰孢、早熟禾镰孢和黄色镰孢，并且该引物对为SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：16。
8.根据权利要求4的方法，其中该引物对用于检测禾谷镰孢和黄色镰孢，并且该引物对选自下列引物对：
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18；以及
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17。
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