CN1292652C - 抗菌剂的选定方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的抗菌剂选定方法包括根据样本的DNA碱基序列分析样本的微生物相的微生物分析步骤；对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤，在抗菌处理方法、抗菌效果的监测方法、造纸过程的腐浆控制方法、造纸过程中的微生物控制方法等中，通过利用该选定方法作为选定抗菌剂(腐浆控制剂)时的选定方法，可以简单、而且在短时间内，准确地选定最适合于处理的抗菌剂，同时能够在短时间内，简单而且准确地掌握抗菌剂的效果是否发挥，从而能够事先防止因微生物的增殖而引起的问题。

Description

抗菌剂的选定方法及其使用方法

技术领域

本发明涉及抗菌剂的选定方法及其使用方法。更具体地说，是涉及根据DNA碱基序列，分析对象系统的微生物相，从数据库选择最适用于该微生物相的工业用抗菌剂(以下有时只称为抗菌剂)并使用的抗菌处理方法和抗菌效果监测方法。此外，本发明还涉及确定对以白水循环系统腐浆控制为目的而正在使用的腐浆控制剂(スライムコントロ一ル剂)显示抗性的微生物种类及其发生源，通过在发生源加入该确定的微生物易感性的其他腐浆控制剂，使白水循环系统的腐浆控制效果更稳定，此外，以小的药剂使用量即能达到抑制造纸过程中的腐浆的方法。本发明也涉及用DNA碱基序列为指标，对在纸制品中形成疵点、斑点等附着物的微生物的微生物相或占优势的微生物进行确定的造纸过程中制品附着物的分析方法；由该分析结果，能够查明附着原因和发生场所的附着原因探索方法；以及根据该附着原因，可使附着物减少的微生物控制方法。

背景技术

使用腐浆控制剂或防腐剂等工业用抗菌剂的对象系统，无论从微生物学的基质条件来看还是从环境条件来看范围都非常广，因此，一般认为，出现的微生物涉及的种类非常多。例如，造纸过程中白水系统的pH条件从酸性的抄纸机至弱碱性的条件，此外，温度条件也是在冬季15℃左右，到因加温而升温至50℃左右。防腐剂的对象系统pH也是从酸性至碱性，温度条件为20～70℃的宽范围。

像这样使用抗菌剂的对象系统的环境条件在很大范围内各自不同，因此，其中出现的微生物种类也是各自不同的。由于对象系统的环境条件对抗菌剂效力有影响，对各个对象系统选定适用的抗菌剂时，必须要选定适合于对象系统中存在的微生物的种类和量(微生物相)，以及环境条件的抗菌剂。如果抗菌剂的选定有错误，不仅不能达到预期的抗菌效果，而且使大量的抗菌剂随意地流至自然环境中，导致预料之外的对环境的破坏。

为了满足这样的广泛的对象系统(应用领域)的需要，要求准备性质不同的多种类的抗菌剂，要下功夫对每个对象系统选定最适合的抗菌剂。但是，如果准备的抗菌剂种类增加，在每种不同条件下选择最适合的抗菌剂的技术就变得重要了。

以前，将抗菌剂应用于某种对象系统时，大多数方法是由对象系统采集微生物样本，取回至实验室后，用尽可能多的种类的抗菌剂，通过杀菌试验、增殖抑制试验和菌数测定等对其效力进行比较，根据该试验结果决定抗菌剂的种类。

但是，对于这样的以往的方法，要在短时间内对全部的抗菌剂进行试验，由于受到人手和时间的制约，是不可能的，通常存在的问题是，不得不根据从对有限的抗菌剂以有限的试验浓度试验的结果来选定抗菌剂。

此外，以往的方法中，还存在着只根据可培养的微生物的试验结果选择抗菌剂的问题。亦即，已知应用抗菌剂的对象系统中存在很多不能用培养基分离培养的微生物(所谓的non-culturablemicroorganisims)，所以在这样的不能分离培养的微生物为占优势种的对象系统中，基于包含培养操作的试验结果而选定的抗菌剂未必是最适的抗菌剂。

这样以前的方法中，由于对象系统的微生物相不清楚，不一定清楚是否选择了最适的抗菌剂，实际上，抗菌剂的选定及其使用方法的确定处于不得不依赖于大量的经验的现状。

但是，作为微生物相的分析方法，有按照形态学-生理学的特征对微生物进行分类的经典鉴定方法，但这种方法，不是熟练的微生物鉴定专家很难得到正确的结果，即使是熟练人员专门实施，1个对象体系的微生物相分析也需要1个月以上的长时间，除非是为特别的研究目的否则不进行。因此，将微生物相的经典鉴定方法用于日常的抗菌剂选定实际上是不可能的。

另一方面，市场上有售能在7～15天的短期间内鉴定微生物相的快速鉴定试剂盒。但是，这种鉴定试剂盒主要是为医疗用而开发的，将其用于使用工业用抗菌剂的对象系统时，存在很难能对微生物作出正确鉴定的问题。而且，这种鉴定试剂盒只适用于可培养的微生物，对象系统中的占优势微生物是用培养基不能分离培养的微生物时，存在会得到错误见解的问题。

根据以上所述的情况，进行抗菌处理时，有必要在短的时间而且正确地掌握对象系统的微生物相，选定适合微生物相和对象系统的环境条件的抗菌剂。

对于微生物相的分析技术，最近，开发了利用编码微生物的核糖体RNA(以下称为rRNA)的DNA(以下称为rDNA)碱基序列差别的各种方法，在短时间内能够搞清楚包括不能形成菌落的细菌类(non-culturable bacteria)在内的微生物相。但是，至今尚未有将这样研究的微生物相与各种抗菌剂的效力、对象系统的营养条件、环境条件等多种信息结合起来，选定最适合于每个对象系统的抗菌剂的方法。

另外，对于使用的抗菌剂的效果，已知，如果长期连续使用同一种抗菌剂，环境条件的微小变化或微生物获得抗药剂性等，会产生抗菌效果急剧变化的现象。因此，有必要定期监视使用抗菌剂后是否继续发挥所预期的效果。为此，以前采用的方法是，关闭机器后立即观察系统内部的污染状况，并用琼脂平板法进行对象系统中的活菌数测定等来判断。

但是，用上述以前的监视方法，分不清抗菌剂效力的变化的原因是由于抗药剂性的菌的出现，还是只因为药剂量的不足。因此，需要一种在使用抗菌剂后，可从监测微生物相变化的方面监视工业用抗菌剂效果的监视方法。

此外，对于即使使用抗菌剂也产生问题的场合、或长期使用同一种抗菌剂效果迅速下降的场合等，必须立即查明其原因，以求迅速解决问题。但是，以前没有迅速而准确地检测问题发生原因的方法，除了通过尝试法谋求对策之外，别无他法。

因此，要求一种即使在这样的紧急场合也能对应的科学地查明原因和恰当地处理的方法的决定方法。

造纸工厂的造纸过程包括将纸浆分散悬浮在水中，调制成所要求的大小和纸浆浓度后，加入各种造纸药品，在抄纸机中进行抄纸的过程；由纸浆原料制备系统、碎纸系统、造纸药品制备系统、纸浆制备系统、白水循环系统和白水回收系统等构成。在抄纸机分离的水称为白水，再用于纸浆的分散悬浮、浓度调制其他用途中。白水中含有作为造纸药品添加的淀粉或其他有机物，水温通常为30～40℃，因此是微生物生存的好条件，因此，在对腐浆未进行任何控制的场合，白水中含有10⁵～10⁷个/ml左右的微生物。

这些微生物在抄纸机白水循环系统的水中壁面上附着增殖，进一步与白水中的非生物固形物一起形成称为腐浆的附着物。这样的腐浆在抄纸机运转过程中一旦剥离，会带来在纸制品上形成斑点、鱼眼(目玉)，制品品质降低，并因纸破裂而使抄纸机的连续操作停止等各种问题。

为了防止这种腐浆问题的发生，现在广泛实行在白水循环系统中添加腐浆控制剂抑制腐浆发生的方法，在市场上出现了各种腐浆控制剂。

在造纸过程中生存的微生物，由原料纸浆、各种造纸药品、工业用水或空气中等带入，在各造纸过程中增殖而形成适合于各种环境条件的微生物相。由于这些微生物随着过程的流动而全都集中至抄纸原料中，所以白水循环系统中含有全部的造纸过程中增殖的微生物。其中适合于白水循环系统环境的、易于附着并增殖在壁面上的微生物成为腐浆的主要构成菌。

由以上情况可想像，白水循环系统的微生物相是复杂的，因此存在优选抗菌谱广的腐浆控制剂的倾向。但是，另一方面抗菌谱广的、效力高的腐浆控制剂毒性高、操作有危险，实际上不存在具有如此理想效果的腐浆控制剂，普遍实行的是将多种腐浆控制剂成分配合的方法。

假定，白水或腐浆的微生物相容易分析，而且知道以各微生物为主在某处增殖的所谓发生源的话，即使抗菌谱广度不是很理想，也能设计合理的使用方法而有可能抑制腐浆，通过在白水循环系统中添加对占优势菌种有效的腐浆控制剂，只在对该腐浆控制剂有抗性的微生物的发生源，添加对该微生物有效的其它腐浆控制剂，由此应能达到稳定的控制腐浆的效果。

上述这种想法以前就有，也试过在碎纸箱等微生物增殖严重的场所也添加腐浆控制剂的方法。但是，这些以前的方法中，确定微生物发生源的方法是：从造纸过程的各个场所采集样本，然后用琼脂平板法等进行活菌数测定，活菌数量大的场所即为微生物发生源的方法。

由于以前的活菌数测定方法不清楚微生物的种类，所以按以前的方法，不能判断对白水循环系统中正在使用的腐浆控制剂(白水处理剂)有抗性的微生物在增殖还是易感性的微生物。因此，必须重新在活菌数高的多个场所采集样本，用各种腐浆控制剂进行抗菌试验，选定适用于发生源的腐浆控制剂(发生源处理剂)。

在发生源增殖的微生物相中，对白水处理剂有抗性的微生物为占优势菌种的场合，若能忍受操作的繁琐，用上述以前的方法，可以选定合适的发生源处理剂。但是，在对白水处理剂易感性菌种为占优势菌种，而抗性菌种也同时在增殖的场合，用上述以前的方法就难以确定或不可能确定合适的发生源处理剂。

此外，由于最近的节水政策，造纸过程的白水再利用有进展，所有步骤都进行反复循环使用。在这样的加强白水再利用的造纸过程中，各场所的活菌数和白水活菌数变得没有差别，不可能根据活菌数的测定来确定微生物的发生源。另一方面，一般来说，在加强白水再利用的系统中，腐浆的危害性也高，因此，迫切需要更合理的腐浆抑制方法。

还有，由上述那样的造纸过程构成的造纸工厂中，质量管理上最大的问题是，某些异物在抄纸时附着在纸上，该附着物造成制品中产生称为疵点(亦称为孔、斑点、鱼眼)的不良部分。疵点不仅大幅度降低制品的质量，而且还成为印刷时各种问题的原因。此外，这种疵点也是纸断裂的原因，使造纸机的运转变得困难，生产能力明显降低。

已知引起疵点的附着物的本身是腐浆(微生物及其产生的粘质物)、树脂、结垢水锈、浆料、夹杂物及这些的复合物。造纸过程中，由于抄纸过程是在微生物容易生长的环境下进行，人们对来源于微生物的腐浆给与了很大的注意，为了抑制其发生，通常进行腐浆控制处理。

对于制品上产生的疵点是否来源于微生物腐浆，可以通过显微镜观察，或茚三酮反应等化学分析进行检查。如果确定了疵点来源于腐浆，有必要改进腐浆控制处理，防止疵点的产生。

但是，纸制品在高温下变干，疵点中的微生物已死亡，因此，很难从疵点分离培养微生物、对其名称进行特定、研究这些微生物的组成比，即很难研究微生物相、或占优势微生物。因此，不能确定引起疵点的微生物(以下有时称为原因微生物)是什么，以及该原因微生物的发生场所是抄纸机、水系统或原料中的哪里。

以前，有过将形成牢固的孢子或芽孢的微生物的一部分从纸分离的例子(Vaisanen等，Journal of Applied Bacteriology，71卷，130～133页，1991年)，但由于微生物几乎完全死亡，因此仍然不能查清楚形成疵点的原因微生物以及发生的场所。

因此，不可能实行对原因微生物及其发生场所进行确定，按照对该微生物最有效的方法进行微生物控制处理那样科学而且合理的相应措施。因此，在目前，只采取根据经验和对状况的判断，增加抄纸机周围的腐浆控制量、对菌数比较高的箱等进行杀菌等对症疗法，难以可靠地减少因微生物引起的疵点。

本发明的目的是提供抗菌剂的选定方法及其使用方法，该方法根据DNA碱基序列分析样本的微生物相，利用数据库可以简单而且在短时间内准确选定最适于该微生物相的工业用抗菌剂。

本发明的其他目的是提供能够根据对象系统的微生物相，在短时间内选定最合适的工业用抗菌剂，并有效地进行抗菌处理的抗菌处理方法。

本发明的其它目的是提供能够在短时间内简单且准确地掌握抗菌剂的效果是否发挥的抗菌效果监测方法。

本发明的其他目的是根据基于微生物DNA碱基序列的微生物相分析及其存在的比率，确定对白水处理剂有抗性的微生物的种类及发生源，以取代以前活菌数测定法；并将通过预先积累的药剂检索数据库选定的发生源处理剂加到发生源中，从而建立一种合理的来腐浆抑制的方法，同时使其在白水循环系统中的腐浆抑制效果达到稳定。此外，选择对白水中占优势的微生物有效的腐浆控制剂，作为流量最高、因而腐浆控制剂使用量也高的白水循环系统的白水处理剂，对于抗性微生物确定其发生源，选定对其有效的其他腐浆控制剂作为发生源处理剂，只将其用于发生源，从而减少腐浆控制剂的使用总量。

本发明的其他目的是提供造纸过程中制品附着物的分析方法，其能够简单而且可靠地确定引起纸制品疵点的微生物。

本发明的其他目的是提供造纸过程中制品附着物的附着原因的探索方法，该方法能够简单而可靠地确定引起纸制品疵点的微生物的发生场所。

本发明还有一个目的是提供造纸过程中控制微生物的方法，该方法能够简单而可靠地确定引起纸制品疵点的微生物的发生场所，据此能简单而可靠地减少纸制品疵点的产生。

附图简单说明

图1是发明实施方案中使用本发明抗菌处理方法的造纸装置系统图。

图2是发明实施方案中，表示本发明的抗菌处理方法的微生物相的分析和抗菌剂选定方法的1个例子的流程图。

图3是发明实施方案中，使用本发明的腐浆抑制方法的造纸装置系统图。

图4是表示实施例10中进行的电泳结果图。

图5是表示实施例11中分析的DNA用TRFLP法分析的片段模式的图。所有的图中，纵轴为荧光强度，横轴为TRF(末端限制片段(TerminalRestriction Fragment))的长度(碱基数(bases))。

发明内容

按照以前经典的微生物鉴定方法，不能对使用抗菌剂的对象系统的微生物相进行分析，因此，选定对应于对象系统的微生物相的抗菌剂事实上是不可能的。作为取代经验主义的以前的方法的方法，本发明者们从能在短时间内根据DNA碱基序列进行微生物相的分析，而且对用培养基不能分离培养的微生物也能进行分析方面考虑，将此与对各种微生物进行的抗菌试验效果，以及抗菌剂处理的对象系统实际处理数据有机地结合起来，从而完成了能够根据微生物相选定合适的抗菌剂的抗菌处理方法。此外，还建立了将抗菌剂用于某种对象系统后，通过监视系统内的微生物相的变化来监测抗菌剂的效果，并根据需要变更抗菌剂的种类的方法。

发明者们将根据微生物DNA碱基序列的微生物相的分析与以前的经典方法比较，发现在准确性和迅速性方面前者远远优于后者，而且在造纸过程中的微生物相的比较、或抗性微生物的发生源的确定方面有效，经过努力研究的结果，完成了本发明。

此外，本发明者发现，从纸制品的疵点提取微生物来源的DNA，以该DNA的遗传信息为基础可以对构成附着物的微生物的种类、名称、组成比、占优势微生物等进行分析，从而完成本发明。

即，本发明是下述的抗菌剂选定方法及其利用方法。

(1)抗菌剂的选定方法，它包括：

根据DNA碱基序列分析样本的微生物相的微生物分析步骤；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述的微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤。

(2)抗菌处理方法，其为使用工业用抗菌剂的抗菌处理方法，它包括：

从使用工业用抗菌剂的对象系统采集含微生物的样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相的微生物分析步骤；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述的微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤，以及，

将上述抗菌剂选定步骤中选定的工业用抗菌剂加入对象系统中的抗菌剂添加步骤。

(3)抗菌效果的监测方法，是在进行抗菌处理的抗菌处理系统中，

定期或在任意的时刻进行上述的样本采集步骤和微生物分析步骤，将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化，监视工业用抗菌剂效果的变化，

其中抗菌处理系统中所进行的抗菌处理包括：

从使用工业用抗菌剂的对象系统采集含微生物的样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相的微生物分析步骤；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述的微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤，以及

将上述抗菌剂选定步骤中选定的工业用抗菌剂加入对象系统中的抗菌剂添加步骤。

(4)造纸过程中的腐浆抑制的方法，其为用腐浆抑制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，它包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2个以上场所采集样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析各样本的微生物相的微生物分析步骤；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的腐浆控制剂，从中选定腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；和

将上述腐浆控制剂选定步骤中选定的腐浆控制剂加入对象系统的腐浆控制剂添加步骤；

该方法进一步包括：判定上述微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；和

将上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物存在比率高的样本采集场所，判定为抗性微生物的发生源的发生源判定步骤；

其中，在上述腐浆控制剂选定步骤中，将上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索关键词，从数据库中检索，挑选腐浆控制剂。

(5)造纸过程中的微生物抑制方法，其为用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的造成纸制品附着物的腐浆的方法，它包括：

将纸制品上附着的附着物和造纸过程中产生的腐浆作为样本采集的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析各样本的微生物相的微生物分析步骤；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的腐浆控制剂，从中选定腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

将上述腐浆控制剂选定步骤选定的腐浆控制剂加入对象系统的腐浆控制剂添加步骤；

该方法进一步包括：通过附着物的微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物的比较，确定造成附着物的腐浆的发生场所的腐浆发生源确定步骤，

其中，在上述腐浆控制剂选定步骤中，将造成附着物的腐浆中的占优势微生物作为检索关键词，从数据库中检索，挑选腐浆控制剂，

上述的腐浆控制剂的添加步骤中，将腐浆控制剂添加到上述腐浆发生源确定步骤中确定的场所。

(6)抗菌处理方法，它是使用工业用抗菌剂进行抗菌处理的方法，其中：

从使用工业用抗菌剂的对象系统中采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物已输入有效浓度的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂并使用。

(7)抗菌处理方法，它是使用工业用抗菌剂进行抗菌处理的方法，其中：

从使用工业用抗菌剂的对象系统定期或在任意的时刻采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化监视工业用抗菌剂效果的变化，确认有对工业用抗菌剂有抗性的微生物出现的倾向时，对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对确认上述出现倾向的微生物输入了有效浓度的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂并使用。

(8)上述(6)或(7)所述的抗菌处理方法，其中储存在数据库中的针对微生物的工业用抗菌剂的有效浓度数据，是从每种微生物的培养试验所得的有效浓度、从实际处理结果所得的有效浓度、或从文献获得的有效浓度。

(9)上述(6)～(8)中任何一项所述的抗菌处理方法，其中的数据库储存了在每种影响微生物生长的环境条件下，对微生物的工业用抗菌剂的有效浓度数据，并从指定的环境条件中挑选工业用抗菌剂。

(10)上述(9)所述的抗菌处理方法，其中影响微生物生长的环境条件是pH、温度或对象系统的种类。

(11)上述(6)～(10)中任何一项所述的抗菌处理方法，其中的数据库可以添加、储存和修正微生物的种类、工业用抗菌剂的种类和有效浓度、影响微生物生长的环境条件、以及实际处理的结果。

(12)上述(6)～(11)中任何一项所述的抗菌处理方法，其中的数据库在一旦输入对象系统使用的工业用抗菌剂的浓度、和工业用抗菌剂使用前后的微生物相的分析结果、以及实际处理的结果后，可以计算并记录工业用抗菌剂使用前后的微生物相的各微生物量之差，根据该计算结果判定对各微生物的工业用抗菌剂浓度是否有效并进行添加、储存和修改。

(13)上述(6)～(12)中任何一项所述的抗菌处理方法，其中的数据库在一旦输入对象系统使用的工业用抗菌剂的浓度和工业用抗菌剂使用前后的微生物相的分析结果以及实际处理的结果后，可以计算并记录工业用抗菌剂使用前后微生物相各微生物量之差，根据该计算结果判定对各微生物的工业用抗菌剂的浓度是否有效，比较由该实际处理所得的判定结果与由对象系统含有的可培养微生物的培养试验结果所得的判定结果，判定实际处理中的工业用抗菌剂的效力比培养试验中的效力是过大、在正常范围或是过小，并进行添加、储存和修改。

(14)抗菌效果的监测方法，它包括：

在使用工业用抗菌剂的对象系统中，定期或在任意的时刻从对象系统采集含微生物的样本；

根据DNA的碱基序列分析该样本的微生物相；

将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化监视工业用抗菌剂效果的变化。

(15)抗菌效果的监测方法，它包括：

在使用工业用抗菌剂的对象系统中，定期或在任意的时刻从对象系统采集含微生物的样本；

根据DNA的碱基序列分析该样本的微生物相；

将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化监视工业用抗菌剂效果的变化，在确认有对工业用抗菌剂有抗性的微生物的出现倾向时，作出再选定工业用抗菌剂的判断。

(16)造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2处以上采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本的微生物相的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

将在抗性判定步骤判定为有抗性的抗性微生物的存在比率高的样本采集场所判定为抗性微生物的发生源的发生源判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索的关键词，对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；和

在发生源判定步骤中判定的抗性微生物发生源，添加在腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

(17)造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2处以上采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本中的微生物的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

对于每个前述样本分别求出在抗性判定步骤判定为有抗性的抗性微生物的存在比率，将抗性微生物存在比率高的样本采集场所判定为抗性微生物的发生源的发生源判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索的关键词，对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

在发生源判定步骤中判定为抗性微生物发生源处，添加在腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

(18)造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2处以上采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本的微生物相的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否

判定微生物分析步骤检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索的关键词，对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；和

在抗性判定步骤判定为有抗性的微生物的存在比率高的样本采集场所添加在腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

(19)上述(16)～(18)中任何一项所述的腐浆抑制方法，其中在抗性判定步骤中，将微生物分析步骤中检出的微生物或现在使用的腐浆控制剂作为检索关键词，对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，在对检索对象微生物记录了现在使用的腐浆控制剂的有效浓度时，判定检索对象微生物对现在使用的腐浆控制剂无抗性、未记录有效浓度时，判定为有抗性。

(20)上述(16)～(19)中任何一项所述的腐浆抑制方法，其中微生物分析步骤中采集样本的场所，为选自纸浆原料制备系统、碎纸系统、造纸药品制备系统、纸浆制备系统、白水循环系统和白水回放系统中的2个场所以上。

(21)造纸过程中的微生物控制方法，它包括：

从在造纸过程中附着在产品上的附着物提取来源于微生物的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势的微生物，

用储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，和

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中。

(22)造纸过程中的微生物控制方法，它包括：

从造纸过程中附着在产品上的附着物提取微生物来源的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，

将此微生物相或占优势微生物，与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，由此而确定引起附着物的腐浆，

对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，和

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中。

(23)造纸过程中的微生物控制方法，该方法包括：

从造纸过程中附着在产品上的附着物提取微生物来源的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，

将此微生物相或占优势微生物，与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，由此确定引起附着物的腐浆的发生场所，

对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中，和

对确定的腐浆发生场所进行杀菌·防腐处理。

(24)上述(21)～(23)中任何一项所述的方法，其中为了分析微生物相或占优势微生物所用的DNA是编码核糖体RNA的DNA。

本说明书中，“微生物”包含细菌、酵母、丝状菌(霉菌)、藻类和ア-キア(古细菌)等。

另外，“抗菌剂”是指对上述微生物有杀生物作用和/或抑制增殖作用的药剂，一般包括称为抗菌剂、杀菌剂、静菌剂、抑制剂、腐浆控制剂、防腐剂等的药剂。

还有，“抗菌”是指使上述微生物死亡和/或抑制增殖。

此外，“微生物相”使用时所表示的含意是，对象系统或样本中每个微生物的种类和组成比，以及含量(微生物数量或微生物量的比例)，但有时也表示占优势微生物的种类和组成比以及含量，或特定微生物的种类和组成比以及含量的含意。

“实际处理的结果”和“处理效果”都是指对象系统中使用抗菌剂时的效果。该效果，例如在造纸过程中使用腐浆控制剂的场合，可以用在一定时间内腐浆生成量(微生物量或腐浆厚度都可以)的差来表示。也可以用达到一定生成量的时间来表示。此外。还包括用在对象系统中生成腐浆引起的危害内容的程度来表示。

“白水处理剂”是指在白水循环系统中使用的腐浆控制剂，“发生源处理剂”是指在抗性微生物的发生源添加的腐浆控制剂。

“附着物”是指纸制品中出现的、造纸领域中称为疵点(亦称为孔、斑点、鱼眼(目玉)等)的不良部分。

“抗菌剂检索数据库”和“药剂检索数据库”按同样的含意使用。

●抗菌剂的选定方法

本发明的抗菌剂选定方法包括：根据DNA的碱基序列分析样本的微生物相的微生物分析步骤；对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤。这种抗菌剂的选定方法可以在上述的抗菌处理方法、抗菌效果监测方法、造纸过程的腐浆抑制时的选定方法。

本发明的抗菌剂选定方法中，作为微生物分析步骤是根据DNA的碱基序列分析微生物相，作为该微生物相的分析方法可使用已知方法而不受限制。还有，微生物相的分析中，不一定必须由微生物的DNA碱基序列决定(鉴定)微生物的名称，也可以单独给与能与其他微生物区别的号码(以下称为微生物号码)，用此微生物号码代替微生物名称。例如，在微生物检索数据库中未检索到有高的同源性的微生物时，可以给与该微生物单独的微生物号码而与其他微生物区别。但是在向他人说明微生物相的场合，用微生物名(学名)方便，所以优选根据碱基序列鉴定微生物的名称。

例如，微生物的鉴定(判定)中，可以利用储存了DNA碱基序列和微生物的关系的已知的微生物系统分类数据库(微生物检索数据库)，通过用个人电脑等计算机检索该微生物检索数据库，可以对微生物进行鉴定。通过互联网可以进入下面叙述的具体的微生物检索数据库中，所以能迅速地检索数据。下述的微生物检索数据库中，储存了编码核糖体RNA(rRNA)的DNA(rDNA)的碱基序列数据，所以在微生物鉴定中，可以使用由样本分离的rDNA碱基序列。rDNA根据微生物的种类、亚基的大小分成数种(16S rDNA、18S rDNA等)，用哪种分子都可以。此外，本发明不只限定于rDNA，利用rRNA的间隔序列或gyrE等其他DNA级分的方法也可以。因此，使用哪个微生物检索数据库都可以，也可以统一为单一的数据库使用。或者，还可以将多个微生物检索数据库并用。

作为上述的微生物检索数据库可列举GenBank、EMBL、DDBJ等公共的DNA数据库，或Michigan大学设置的Ribosomal DatabaseProject等。用FASTA、BLAST等已有的程序，可以在短时间内有效地进行检索操作。此外，也可以用Microseq Analysis Software(PEバイオシステムズ社，商标)等市售软件检索Microseq 16S rDNASequense Database(PEバイオシステムズ社)等商用微生物检索数据库。此外，也可以自己构建微生物检索数据库。例如，也可以由碱基序列数据，用已知的数据库软件等构建能检索与此对应的微生物名或用作区别微生物的微生物号码的数据库，也可与其他微生物检索数据库并用。

由对象系统采集的样本分离微生物菌落，测定分离株的相应DNA碱基序列，将得到的结果与微生物检索数据库对照，即可对微生物进行鉴定。rDNA也可以用大肠杆菌等宿主载体，通过经典的克隆操作进行分离·扩增，但通过PCR法(聚合酶链反应)等试管内DNA扩增方法使其扩增简便。

此外，也可以不培养分离微生物群，在混合状态下提取微生物DNA，采用由与大多数成为对象的微生物共同性高的碱基序列构成的引物，用PCR法等试管内DNA扩增方法只扩增各微生物的rDNA，进一步通过凝胶电泳等，分离各个微生物来源的rDNA，所得的结果与微生物检索数据库对照，对微生物进行鉴定。

鉴定多个微生物的场合，也可以在确定碱基序列之前，通过RFLP法(Restriction Fragment length polymorphism：Moyer等，Appliedand Environmental Microbiology，62卷，2501～2507页，1996年)粗略地了解其差别。亦即，可将各微生物的rDNA用各种限制酶完全消化，用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳分离，由DNA染色后的模式的不同进行区别。

由微生物群分离菌落后进行研究的方法中，不能用培养基分离培养(non-culturable)的微生物存在时，不能检出该微生物。此外，即使是可以培养的微生物，仅用1种培养基或培养条件，也不能保证将可以分离培养的微生物全部检出。另一方面，将微生物群不经分离而从微生物混合物提取微生物DNA进行研究的方法中，其优点是即使是存在不能用培养基分离培养的微生物的体系也能将其检测出来，由于不同微生物之间存在DNA提取率的差别、每种细胞相应的基因拷贝数差别、PCR反应时扩增率的差别、因选择引物方法的不同而引起的不同的检出微生物群的灵敏度的差别等，但只要理解这些特性和对象系统中出现的微生物的特性，上述方法可以单独使用，也可以适当地并用。

从混合rDNA中分离每个微生物的rDNA的方法一般是采用电泳法，对此，提出了几种方案。例如DGGE法(Denatured Gradient GelElectrophoresis：Muyzer等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，59卷，695～700页，1993年)、TGGE法(TemperatureGradient Gel Electrophoresis：Eichner等，Applied andEnvironmental Microbiology，65卷，102-109页，1999年)、SSCP法(Single Strand Comformational Polymorhism：Schwieger等、Applied and Environmental Microbiology，64卷，4870-4876页，1998年)、TRFLP法(Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism：Liu等，Applied and Environmental Microbiology，63卷，4516-4522页，1997年)，或随机克隆法(Dunbar等，Appliedand Environmental Microbiology，65卷，1662-1669页，1999年)等，本发明的抗菌剂的选定方法不限于这些方法。

此外，根据目的要求，检测混合微生物系统内特定微生物的实时PCR法(Wittwer等，BioTechnique，22卷，130～138，1997年)、FISH法(Fluorescence In Situ Hybridization：Amman等，Appliedand Environmental Microbiology，58卷，614-623页，1992年)经典的杂交法(William等，Microbiology，141卷，2793-2800页1995年)等也可以用于本发明的抗菌剂选定方法中。这些方法中所使用的限制酶或引物有各种，可使用已知的任何一种

分离·扩增的rDNA可以通过实验操作直接测定其碱基序列。对于该一系列的操作，可以使用市售的各种试剂盒，例如AutoReadSequencing Kit(アマシヤム·フアルマシア·バイオテク株式会社，商标)或Microseq 500 16S rDNA Kit(PEバイオシステムズ社，商标)等。当然，DNA聚合酶等试剂自己配制，用双脱氧法等方法进行操作也可以。此外，作为分析仪器，市场上有售的碱基序列分析装置，例如，ALFexpressII DNA Analysis System(アマシヤムフアルマシアバイオテク株式会社，商标)或ABI PRISM 310(PEバイオシステムズ社，商标)也可以使用。当然，也可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影等，读出条带(测序梯)的位置。用混合rDNA作为样本时，可以将电泳所得的条带染色后，将条带相应的胶分别切下，由胶提取·纯化DNA后再进行PCR，扩增的DNA可用于碱基序列的测定。

用现有的微生物检索数据库检索时，对于所使用的试验方法，由于已公开了指定在各个数据库范围内使用的方法，可以照此使用。

比较由样本采集的微生物DNA的碱基序列与微生物检索数据库中登记的碱基序列，数据库中有最高同源性碱基序列的微生物可判断为最近缘的微生物。

如果是完全相同的微生物，除了某种例外之外(例如基因组上多拷贝的多型性)，作为指标的基因的碱基序列确认为100％的同源性。此外，同属同种的近缘微生物的场合，虽然也取决于基因的种类，但也认为有接近100％的同源性，例如，在16S rDNA的场合，同源性大约有98％以上。因此，比较相应的碱基序列，确认有98％以上，优选99％以上的同源性时，通常可判断为同属同种的微生物。同源性不足98％的场合，不判断为同属同种的微生物，可给与单独的微生物号码，将此号码代替微生物名称使用。

此外，鉴定的微生物的组成比，可由菌落的比例、DNA的比例等进行定量。如果是对菌落分离进行检测的方法，随机选择统计上可信数量的菌落，通过对这些菌落全部进行鉴定，可以算出样本中各种微生物的组成比。此外，在由微生物群直接评价DNA的方法中，用DGGE法或TGGE法观察的DNA条带的量可解释为反映原始的微生物量，所以，由每种DNA条带的浓度对DNA条带的累积浓度的比可以做为组成比得到。为了测定这样的条带的浓度，可以采用市售的光密度计或与扫描仪连动的图象分析装置(例如，ImageMaster(アマシヤムフアルマシアバイオテク株式会社制，商标)等)。还有，使用结合荧光试剂的DNA引物，或电泳后用荧光物质染色的场合，也可以用FluorImager(アマシヤムフアルマシアバイオテク株式会社制，商标)等荧光显象分析仪直接测定其荧光量。如果是FISH法，可以在显微镜下直接计算相对于全部微生物数的染色的微生物数，从而算出组成比。

微生物的绝对量可以用已知的方法，例如，用平板培养基的菌落计数法，MPN(Most probable Number)法，或在显微镜下对用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)、吖啶橙或CFDA(羧基荧光素二乙酸酯)等荧光物质染色后的微生物细胞定量计数等方法，算出单位容量或单位重量的微生物数。通过累计各种微生物的组成比和绝对量，可以算出样本中的相应微生物的含量。在采用实时PCR法或经典的杂交法时，用预先已知浓度的微生物细胞或DNA作为标准物质，在与样本同样的条件下使其反应，由此可以推测样本中初始的细胞数或DNA量。

本发明的抗菌剂选定方法中，抗菌剂选定步骤所用的数据库(以下，有时称为抗菌剂检索数据库)为任何形式都可以，只要至少储存了微生物及与其各自对应的各种抗菌剂的有效浓度，用微生物作为成为检索关键词，能够检索并挑选记录了有效浓度的抗菌剂即可。作为检索关键词的微生物，可以利用由微生物检索数据库得到的微生物名称，登记号(アクセツシヨンナンバ一)或微生物号码等。微生物名称可以用学名表示(例如， Escherichia  coli HB101等)，用登记号表示也可以。此外，对于不能确定学名的微生物或碱基序列，可以用单独给与的微生物号码来表示。检索关键词可通过键盘等输入装置输入。有效浓度数据可以是每种微生物培养试验所得的有效浓度、由实际处理所得的有效浓度、或从文献所得的有效浓度中的任何一种。

输入有效浓度的含意是在该浓度下对检索对象微生物有抗菌作用，但也可以设置多个抗菌剂的浓度，输入在该浓度下抗菌作用的有无或程度。在这种情况下，挑选确认为有抗菌作用的浓度的抗菌剂。

抗菌剂检索数据库优选每次出现未登记的微生物或碱基序列时，可以追加登记、储存与这些微生物对应的各种抗菌剂的有效浓度等的数据的抗菌剂检索数据库。

抗菌剂检索数据库优选为，储存了在每种影响微生物生长的环境条件下，对微生物的抗菌剂的有效浓度数据，一旦指定环境条件，即可以从指定的环境条件中挑选出抗菌剂。环境条件具体是指pH、温度、对象系统的种类和分类、基质的种类和浓度，以及影响抗菌剂效力的物质，例如，还原物质的浓度等。作为上述对象系统的种类和分类，如果对象系统的种类是造纸过程，有抄纸的种类、抄制条件、上胶剂、成品率提高剂、纸强度提高剂等各种内添加剂的种类和添加浓度、过去使用的抗菌剂的种类等；如果是冷却水系统，有补给水的种类、水质、混入的大气中气体成份、冷却水的滞留时间、其他使用药剂等；如果是防腐对象，有对象的基质、要求防腐的期间等。还有，输入抗菌剂检索数据库的抗菌剂有效浓度是由培养试验所得的数据时，上述的pH、温度等相当于培养条件；由实际处理所得的数据时，上述pH、温度等相当于对象系统的环境条件。

环境条件为pH的场合，优选储存多个pH条件下的有效浓度的，例如优选储存在pH5、pH6、pH7...下的数据的。温度等的场合，也和pH的场合一样，优选储存多个条件下的有效浓度的。如上述那样储存了在每种环境条件下的关于有效浓度的数据的场合下，例如，以pH为6且温度为20℃为选定条件，以此为检索关键词，可以对抗菌剂进行检索。

此外，优选输入对象系统使用的抗菌剂浓度和抗菌剂使用前后的微生物相分析结果、以及实际处理的结果，即可计算并记录微生物相的各微生物量在抗菌剂使用前后之差，由此计算结果判定对各微生物的抗菌剂的浓度是否有效，并可追加、储存及修正的抗菌剂检索数据库。通过使用这样的抗菌剂检索数据库，能够选定更合适的抗菌剂。

对抗菌剂检索数据库，优选输入对象系统使用的抗菌剂浓度和抗菌剂使用前后的微生物相的分析结果，以及实际处理的结果，即可计算微生物相的各微生物量在使用抗菌剂前后的差，由此计算结果判定抗菌剂浓度对各微生物是否有效，比较由该实际处理所得的判定结果与由对象系统(样本)中含有的可培养微生物的培养试验结果所得的判定结果，判定实际处理中抗菌剂的效力是比培养试验的效力过大、在正常范围内、或过小，并可追加、储存和修正的。通过利用这样的抗菌剂检索数据库，可以正确评价在实际的对象系统的环境下抗菌剂的效果，因此能够选定更合适的抗菌剂，所以优选。

此外，优选输入了文献记载的抗菌剂的特性或抗菌效力、抗菌剂的价格等数据的抗菌剂检索数据库。还进一步优选能追加、储存实际处理的数据、试验结果的数据、文献数据等新的数据的抗菌剂检索数据库。

上述的储存了更多数据的抗菌剂检索数据库能够选定更合适的抗菌剂。

不可能用纯的菌株在室内试验中测定抗菌剂对用培养基不能分离培养的微生物的抗菌谱，所以对应这样的微生物的有效浓度等数据有必要储存实际的数据。

例如，制成将某种抗菌剂用于某种对象系统时，可将使用前后的微生物相的分析结果及当时的抗菌处理效果、以及抗菌剂在系统内的维持浓度(由添加浓度计算求得的维持浓度也可以)、其他最好还有影响微生物的生长和抗菌剂效力的对象系统的环境条件依次追加输入、记录的抗菌剂检索数据库的格式。使用前存在、使用抗菌剂后消失的微生物，看作是由使用的抗菌剂驱走的，在抗菌剂检索数据库内设置栏将抗菌剂使用前的微生物相和抗菌剂使用后的微生物相之差作为计算结果储存。这样可知消失的微生物对使用的抗菌剂的系统内的维持浓度是易感性的，反之，可区分占有率不变或增大的微生物对使用的抗菌剂的维持浓度是非易感性的，或有抗性的。

作为用来评价这样求得的对微生物的一系列的抗菌剂效力的妥当性的方法，例如有以下的方法。即，由于从对象系统采集的样本中至少存在1～2种可以培养的微生物，从抗菌剂检索数据库读取通过室内试验求得的对该微生物的抗菌活性，通过对照判断该抗菌剂维持浓度是否在微生物的易感性范围，如果与实验室内试验结果在容许范围内(可任意设定)无矛盾，则判断用该使用例通过计算求得的对微生物群的一系列抗菌效力数据在正常范围内。然后，在抗菌剂检索数据库中提供能表示该判断效果的栏，将该判断输入其中。如果没有实验室内试验数据，此时用分离的微生物追加实验室试验即可。

在使用对象系统中含有还原性物质等抑制抗菌效力的物质时，上述求得的抗菌效力数据应比由实验室内试验测定的抗菌效力差。亦即，求得的抗菌效力的值受到系统内共存的物质的影响而被过低的评价，这样判断的1群数据，以过低评价在上述的栏中表示。此外，在使用对象系统之前的步骤中使用，抗菌剂残留在现在的对象系统的场合，可能对使用的抗菌剂效力作出过高的评价。这种情况下，同样在上述的栏中以过高评价表示。

设计以上那样的具有记入栏的抗菌剂检索数据库格式，如果储存了大量使用例子的数据，对某种用培养基不能分离培养的微生物检索抗菌剂时，可以由正常范围的数据群中选定有效的抗菌剂。

另外，要重新对某种对象系统选定使用的抗菌剂时，在抑制或增大对象系统的抗菌效力的物质共存的场合，上述抗菌剂检索数据库中储存的判定为过高评价或过低评价的数据群可成为抗菌剂选定的重要因素，所以优选不将其删除而储存起来。

构建本发明的抗菌剂选定方法中使用的抗菌剂检索数据库的计算机软件，可使用Microsoft公司生产的Microsoft Exel或MicrosoftAccess(两种都是商标)等市售的软件，但不限于这些软件，只要能满足要求，任何一种都可使用。上述软件一般都附带根据相应的微生物名或登记号检索各种抗菌剂的效力、对象系统的环境条件等为目的的内容的功能，因此可以加以利用，缺少程序时也可以组合已知方法并添加。

按上述方法选定抗菌剂，能够简单地且在短时间内准确选定最适用于使用抗菌剂的对象系统的抗菌剂。

●抗菌处理方法

代替以前依赖于通过杀菌试验、增殖抑制试验或琼脂平板法等菌数测定等的经验主义的抗菌剂选定方法，本发明的抗菌处理方法，是通过DNA的碱基序列对对象系统的微生物相进行微生物相分析，将所得的微生物相与可检索抗菌剂的抗菌剂检索数据库对照，选定最适的抗菌剂并使用的抗菌处理方法。

对可使用本发明的抗菌处理方法的对象系统，如果是使用抗菌剂进行抗菌处理的处理系统，无特别的限制。例如可例举，造纸过程水、冷却水、超纯水生产过程等使用工业用腐浆控制剂的系统；造纸用的淀粉浆液或糊液、金属加工用水溶性切削油等使用防腐剂的系统等。

本发明的抗菌处理方法中，首先从对象系统采集含微生物的样本。通常认为该样本中存在多种微生物。然后根据DNA碱基序列分析采集的样本的微生物相，从数据库选定抗菌剂。该微生物相的分析和抗菌剂的选定可以直接利用上述抗菌剂选定方法中说明的微生物分析步骤和抗菌剂选定步骤的方法进行。

本发明的抗菌处理方法首先从对象系统采集腐浆、白水、循环冷却水、防腐对象物质等含微生物的样本，通过根据DNA碱基序列的微生物相分析，确定样本中含有的构成微生物相的每种微生物的微生物名称或登记号(与微生物名称相当)。通常这一系列的试验操作在2～7天完成。

随后，以通过上述分析鉴定的微生物作为检索关键词，对抗菌剂检索数据库进行检索，检索并挑选出抗菌剂。这种情况下，可以将环境条件等作为检索关键词输入，可进一步检索抗菌剂。挑选的结果可以在显示器等输出装置中输出。挑出的抗菌剂为1种时，即选定该抗菌剂，挑选出多个时，在其中选定。从挑选出的抗菌剂中选定用于实际的抗菌剂的方法是任意的，可以人为选定，也可以用计算机自动进行。作为具体的选定方法，可例举以下的方法等。

1)选定针对全部微生物或占优势微生物有效浓度最低、最小的抗菌剂。

2)预先指定特定的微生物，对其选定最有效的抗菌剂。

3)某种抗菌剂的抗性微生物的占有率为任意设定的小比率时，可忽略其存在，高于该比率时，只针对该微生物的抗菌性进行选定。

4)选定对占优势微生物或特定微生物的“最小有效浓度×价格”为最小的抗菌剂。这种场合，可以将处理成本考虑在内进行选定。

这些选定方法也可以作为功能的一部分组合到抗菌剂检索数据库中。

选定的标准，可以根据长期以来积累的经验来设定，但是初期阶段，抗菌剂检索数据库的数据累积数少的时候，要求每次积累数据时以处理成功率为标准进行修正。

按上述方法选定抗菌剂，能够在短时间内而且准确地选定最适合于对象系统的微生物相的抗菌剂。

本发明的抗菌处理方法是用上述那样选定的抗菌剂，对对象系统进行抗菌处理的抗菌处理方法，可以定期或在任意的时刻反复进行抗菌剂的选定。

例如，在定期的或任意的时刻，从对象系统采集含微生物的样本，按上述的方法根据DNA碱基序列分析样本的微生物相，将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化，监视抗菌剂效果的变化。未见微生物相明显改变，认为抗菌剂有效果时，继续使用该抗菌剂。另一方面，看到对抗菌剂有抗性的微生物的出现倾向时，对上述抗菌剂检索数据库进行检索，挑选出对有上述出现倾向的微生物有效的抗菌剂，并选定。例如在连续使用某抗菌剂的对象系统中，在附着物明显增多的同时也确认某种特异的微生物(或DNA)增加时，如果在抗菌剂检索数据库中，该微生物(或DNA)是作为对相应的抗菌剂具有有意的抗性的微生物而记录下来的场合，或进行试验的结果也搞清楚了对相应的抗菌剂有抗性的场合，如果确认微生物相的变化与增大的微生物的抗菌剂抗性的因果关系，则可以判断为看到对抗菌剂有抗性的微生物出现的倾向。这样，通过反复进行微生物相的分析和抗菌剂的选定，能够使用在该时刻最适的抗菌剂进行抗菌处理。

此外，在本发明的抗菌处理方法中，在使用抗菌剂的对象系统中，发生起因于微生物的增殖的问题时，由于可以在短时间内判断其原因是否因为抗药性微生物的出现，因此，如果是因为抗性微生物的出现，可以相应地改变抗菌剂的种类；如果不是此原因，则是因为抗菌剂的使用方法(添加浓度、添加方法等)或对象系统的环境条件变化的原因，则可以对其重新评价，迅速采取解决的对策。

还有，本发明的抗菌处理方法，可将未输入抗菌剂检索数据库中的杀菌试验、增殖控制试验或菌数测定等结果组合用于抗菌剂的选定。

●抗菌效果的监测方法

本发明的抗菌效果的监测方法是在使用抗菌剂的对象系统中，根据DNA碱基序列，定期或在任意时刻监视系统内微生物相的变化，从而监测抗菌剂的效果的方法。

即，从对象系统使用抗菌剂开始，定期或在隔适当期间的任意时刻，从对象系统采集含微生物的样本，按上述的方法，根据DNA碱基序列分析样本的微生物相，将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化监视抗菌剂效果的变化。未见微生物相有明显的变化而认为抗菌剂有效果时，则继续使用该抗菌剂。另一方面，新出现上一次微生物相分析中不存在的微生物时，则通过抗菌剂检索数据库进行对照，判断该微生物对现在使用的抗菌剂是否是非易感性微生物或是否有抗药性。如果是易感性菌则判定抗菌剂是有效的，可以继续照原样监视。另一方面，如果是非易感性微生物或抗药性微生物时，用上述的方法，通过检索抗菌剂数据库选定对该微生物有效的抗菌剂，能够容易、而且准确防止微生物的障害。

通过上述对抗菌效果的监测，在对象系统的抗菌效果降低或发生问题之前即可以采取对策。因此，上述本发明的监测方法中，微生物相分析为监测手段，抗菌剂检索数据库提供变更抗菌剂的判定标准。

●造纸过程的腐浆的抑制方法

本发明的造纸过程的腐浆的抑制方法(以下有时只称为腐浆的抑制方法)的适用对象是制造纸的造纸过程，对纸的种类、制造方法无限制。在造纸工厂，广泛以2，2-二溴3-次氮基丙酰胺(以下有时缩写为DBNPA)为主要成分的腐浆控制剂作为白水处理剂使用，对腐浆进行抑制处理，本发明的腐浆抑制方法可适用于这样的造纸工厂的造纸过程。

对本发明的腐浆抑制方法中所用的腐浆控制剂无特别的限制，可以使用已知的腐浆控制剂、也可以对每个造纸过程选定适合的药剂，用作白水处理剂和发生源处理剂。白水处理剂和发生源处理剂的药剂成分可以由无机化合物组成，也可以由有机化合组成。此外，这些腐浆控制剂的成分可以由单一药剂制成，也可以是由多种药剂成分配合的所谓复合剂。还有，对腐浆控制剂的剂型也无限制，液体制剂、流动剂、水合剂等都可使用。对白水处理剂和发生源处理剂的组合也无限制，不是呈现出协同效果的组合也可。

具体的腐浆控制剂举例来说有以下列举的无机系化合物和有机系腐浆控制剂：

(1)无机系的腐浆控制剂

例如，氯、次氯酸盐，二氧化氯、氯化氰尿酸、氯化乙内酰脲、溴、溴离子和次氯酸盐的反应产物等。

(2)有机系的腐浆控制剂

1)季铵盐类表面活性剂：例如，氯化二癸基二甲铵(以下有时缩写为DDAC)等。

2)异噻唑啉酮(イソチアソロン)类：例如，5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-正辛基异噻唑啉-3-酮、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮，以及它们的金属络合物盐。

3)硫氰酸酯类：例如，亚甲基双硫氰酸酯等。

4)溴乙酸酯类：例如，1，4-双(溴乙酰氧基)-2-丁烯、1，2-双(溴乙酰氧基)乙烷、双(溴乙酰氧基)丙烷等。

5)溴氰基化合物：例如，2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺、1，2-二溴-2，4-二氰基丁烷等。

6)溴硝基化合物：例如，2，2-二溴-2-硝基-1-乙醇、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、β-溴硝基苯乙烯、2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)等。

7)肟类：例如，一氯乙二肟、二氯乙二肟、2-(对羟基苯基)乙醛羟肟酰氯化物(2-(p-ヒドロキシフェニル)ゲリオキシヒドロキンモイルクロライド)、α-氯苯甲醛肟和α-氯苯甲醛肟乙酸酯等。

8)醛类：例如，邻苯二甲醛、戊二醛和甲醛等。

9)其他：例如，2，2-二氯-1，2-二噻茂-3-酮、2，4，56-四氯间苯二腈、3，3，4，4-四氯羟基噻吩-1，1-二氧化物等。

对于存在多个抗性微生物发生源的造纸过程，优选对每个发生源选定合适的发生源处理剂，然后使用。此外，存在多个对白水处理剂有抗性的抗性微生物时，优选对每种抗性微生物选定有抗菌作用的发生源处理剂，然后使用。还有，即使在淀粉制备系统或染料系统等中，作为造纸药品，为了防腐的目的或为了防止变质，已经使用了腐浆控制剂的场合，如果这些系统还是白水处理剂的抗性微生物的发生源时，优选选定发生源处理剂，并追加添加。

在本发明的腐浆抑制方法中，根据DNA的碱基序列对样本的微生物相进行分析，然后从数据库中选定对分析的微生物最合适的腐浆控制剂。该微生物相的分析和腐浆控制剂的选定，可以直接利用在前面所述的抗菌剂选定方法中说明的微生物分析步骤和抗菌剂选定步骤中的方法进行。此外，在腐浆控制方法的说明中，将抗菌剂选定方法中的抗菌剂检索数据库称为药剂检索数据库。

按照本发明的腐浆抑制方法，首先作为微生物分析步骤，从使用腐浆控制剂(白水处理剂)抑制腐浆的造纸过程中采集样本。然后通过根据DNA碱基序列的微生物相分析，对每个样本的微生物相进行分析。在这种情况下，用上述的方法，确定构成微生物相的每种微生物的微生物名称或登记号(相当于微生物名称)。通常，这种一系列的试验操作在2～7天内完成。还有，微生物分析步骤中，对样本中含有的微生物的种类进行鉴定，而对含量的定量可以省略。

对采集样本的场所无限制，从造纸过程的任意场所采集样本都可以，但对2个以上，优选5～20个场所采集样本。采集样本的场所越多，就越能正确判定抗性微生物的发生源。

具体地说，可以从下述系统采集腐浆、白水、槽内液体等作为样本，这些系统有：CGP(Chemical Ground Pulp)浆粕机、CGP箱、LBKP(Laubholz Bleached Kraft Pulp)浆粕机、LBKP箱等构成的纸浆原料制备系统；湿碎纸浆粕机、湿碎纸箱、于碎纸浆粕机、干碎纸箱等构成的碎纸系统；上胶剂槽、硫酸铝槽、染料槽、腐浆控制剂槽、内添淀粉糊液槽等构成的造纸药物制备系统；由混合箱、机械箱、原料箱等构成的纸浆制备系统；抄纸机、筛滤装置、入口、白水回收装置、白水槽等组成的白水循环系统；脱水机、清洁的白水槽等组成的白水回收系统等。

然后，作为抗性判定步骤，是判定在上述微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂(白水处理剂)是否有抗性。例如，以上述微生物分析步骤中检测出的微生物或现在使用的腐浆控制剂作为检索关键词，对上述药剂检索数据库进行检索，当现在使用的腐浆控制剂对检索对象的微生物的有效浓度被记录时，可以判定为检索对象的微生物对现在使用的腐浆控制剂无抗性；而未记录有效浓度时，可以判定有抗性。此外，也可以从已知文献，或培养试验结果等，来判定有无抗性。虽然在使用白水处理剂，但与前一次的分析结果比较，确认有特定的微生物增殖的倾向时，可以判定该微生物有抗性。

随后，作为发生源判定步骤，是将在上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物存在比率高的取样场所，判定为抗性微生物的发生源。有时也会有存在多个发生源的场合。在上述微生物分析步骤中对样本的微生物相进行分析时，已经判明了各微生物的组成比或含量，因此，不必重新计算抗性微生物的存在比率，可以根据微生物分析步骤中判明的存在比率来判定发生源。另一方面微生物分析步骤中只分析了微生物的种类时，对检测出抗性微生物的样本，可用上述方法求出其存在比率，根据该结果判定发生源。

接着是腐浆控制剂的选定步骤，以上述抗性判定步骤中判定的抗性微生物作为检索关键词，对上述药剂检索数据库进行检索，挑选出对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂。在这种场合，可以将环境条件等作为检索关键词输入，进一步对腐浆控制剂进行检索。挑选的结果可以在显示器等输出装置上输出。挑选出的腐浆控制剂为1种时，该腐浆控制剂选定为发生源处理剂，挑选出多种时，从中选定。从挑选出的腐浆控制剂中选定实际作为发生源处理剂使用的腐浆控制剂的方法是任意的，可以由人进行选定，也可以用计算机自动进行选定。具体的选定方法例如，有以下所列举的方法

1)选定对抗性微生物有效浓度最低最小的腐浆控制剂。

2)选定对抗性微生物的“最小有效浓度×价格”为最小的腐浆控制剂。在这种情况下，可以将处理成本考虑在内进行选定。

这些选定方法也可以作为功能的一部分编入药剂检索数据库中。

选定的标准可以先根据以前长期以来积累的经验设定，但在药剂检索数据库的数据积累数较少的初期阶段，最好每次储存数据时参照处理成功率进行修正。

然后，作为添加发生源处理剂的步骤，是在上述发生源判定步骤中判定的抗性微生物的发生源，添加上述腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂，即添加与现在使用的白水处理剂不同的发生源处理剂。

还有，本发明的腐浆抑制方法中，也可以省略发生源判定步骤，在这种场合，也可以在抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物的存在比率高的取样场所，添加腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂(发生源处理剂)。

按照以上所述的方法，能够在短时间内，而且准确地选定对抗性微生物最合适的腐浆控制剂，而且，由于可以添加在发生源处，所以添加量可以达到最小的限度。

本发明的腐浆抑制方法可以在定期或任意的时刻，反复进行微生物分析步骤等一系列步骤。

例如，定期或在任意的时刻，从造纸过程中采集样本，按照上述的方法，根据DNA碱基序列分析样本的微生物相，将此分析结果与前一次的分析结果比较，由微生物相的变化监视腐浆控制剂效果的变化。微生物相未见有明显变化，确认腐浆控制剂有效果时，则该腐浆控制剂作为白水处理剂继续使用。此外，抗性微生物的存在比率减少时，则中止添加发生源处理剂。进一步检测出新的抗性微生物时，选定对该微生物的新的发生源处理剂，并添加。

这样，通过反复进行微生物相的分析和发生源处理剂的选定，能够使用在该时刻最适合的腐浆控制剂进行腐浆抑制处理。

此外，在本发明的腐浆抑制方法中，使用腐浆控制剂的造纸过程中起因于微生物的增殖的问题发生时，因能够在短时间内判断该原因是否是因为抗药性微生物的出现，如果是因为抗性微生物的出现，可以通过改变腐浆控制剂的种类来对付；如果不是，则是因为腐浆控制剂的使用方法(添加浓度、添加方法等)或环境变化的原因，则可以通过对其重新评价，迅速采取解决的策略。

还有，本发明的腐浆抑制方法中，选定白水处理剂时也可以利用上述的药剂检索数据库。例如，可以将造纸过程中成为占优势微生物的微生物作为检索关键词，对药剂检索数据库进行检索，从挑选出的腐浆控制剂中选定作为白水处理剂使用的腐浆控制剂。

此外，本发明的腐浆抑制方法中，在选定腐浆控制剂时，可以将未输入药剂检索数据库的杀菌试验、增殖抑制试验或菌数测定等结果组合起来使用。

●造纸工程中制品上附着物的分析方法。

本发明的造纸过程中制品附着物的分析方法(以下有时只称为分析方法)的适用对象为制造纸的造纸过程中制造的纸制品，对纸的种类、制造方法等无限制。造纸过程一般还可分为将填料或药品添加到纸浆中制备纸原料的纸浆制备工序、用抄纸机抄制纸的抄纸工序、以及在纸的表面涂覆涂料等以改进其适应印刷的性能的涂覆工序等工序，本发明的方法可以对经过这样的工序制成的纸制品进行分析。

对于本发明的从附着在制品上附着物提取微生物来源DNA的方法无限定，例如，可以采用从纸制品切下附着物(疵点)或含附着物的部分，将其切断，在缓冲液等提取液中充分浸渍后，单独或组合地进行机械破碎等物理处理、或界面活性剂处理或酶处理等化学处理，由附着物中的微生物细胞提取DNA的方法。这种场合下即使微生物死亡也能提取DNA。

作为上述物理处理的具体方法可列举超声波破碎或冻结熔融法、用微细的玻璃珠或矿物性珠等的匀浆等。此外，作为化学处理的具体方法可列举用溶菌酶等的溶菌酶、纤维素酶、藻酸裂解酶等多糖类分解酶、蛋白酶、肽酶等蛋白质分解酶进行酶处理；用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂、Triton-X100等非离子表面活性剂等处理。通过这样的物理或化学的处理，DNA作为溶解物得到，优选进一步精制。从溶解物精制DNA可以利用通过乙醇、异丙醇等有机溶剂沉淀回收、利用玻璃珠或树脂的吸附的方法等已知方法。

为了由提取的DNA分析微生物的性状、组成比，通过测定能够确定微生物的碱基序列的相对含量进行。或者，可以把在上述方法中测定的相对含量多的微生物作为占优势微生物来确定占优势微生物。这样的微生物相的分析中，可以直接利用在上述抗菌剂选定方法中说明的微生物分析步骤中的方法进行。即，作为能鉴定微生物的DNA，只要是作为分析对象的全部微生物都具有的DNA即可。但优选16S rDNA、18S rDNA、23S rDNA等编码核糖体RNA(rRNA)的DNA、或它们的间隔序列、 gyrE等由碱基序列可鉴定微生物的数据库已经构建好的DNA。

也可以通过点杂交或使用DNA芯片的有效的杂交方法，将提取出的DNA直接作为靶，测定DNA的种类和相对的量，但一般是使用聚合酶链反应(PCR)等试管内DNA扩增的方法，使对象DNA扩增后进行测定。例如，对16S rDNA，可以采用设计了大多数微生物共同存在的序列的通用引物，以提取出的全部DNA作为模板，将16S Rdna作为混合物扩增。

由于提取出来的16S rDNA是来源于1种以上引起附着物的微生物的1种以上的混合物，使该16S rDNA的混合物扩增，在确定扩增的DNA的组成比的同时，通过由这些DNA确定微生物的名称，可以确定附着物的微生物相或占优势微生物。DNA的组成比可以利用已知的方法求得，例如可以用DGGE法(Denatured Gradient Gel Electrophoresis：Muyzer等，Applied and Environmental Microbiology，59卷，695～700页，1993年)、TGGE法(Temperature Gradient GelElectrophoresis：Eichner等，Appliedand EnvironmentalMicrobiology，65卷，102-109页，1999年)、SSCP法(SingleStrand Conformational Polymorphism：Schwieger等，Applied andEnvironmental Microbiology，64卷，4870～4876页，1998年)等电泳法或TRFLP法(Terminal Restriction Fragment LengthPolymorphism：Liu等，Applied and Environmental Microbiology，63卷，4516～4522页，1997年)等分离方法。确定微生物固有的扩增产物量，作为对全部扩增产物量的比率，即可粗略算出微生物的组成比。采用上述的电泳法或TRFLP法时，扩增产物量可以根据DNA条带的强度或TRF中相应的荧光强度获得，由这些强度比可以得到微生物的组成比。

此外，采用大肠杆菌等已建立的宿主载体系统，将扩增产物随机克隆(Dunbar等，Applied and Environmental Microbiology，65卷，1662～1669页，1999年)，由所得克隆的基因分析及其组成比，也可以确定微生物相。

对于由DNA确定微生物，通过用DNA测序仪等测定DNA碱基序列，将此序列与下述的数据库比较，可以知道具有该DNA的微生物在分类上的位置和名称。如果是单一种DNA分子占全部的90％左右的样本，可以直接测定扩增产物的碱基序列来决定占优势微生物的碱基序列。用电泳法等将多种DNA分子分离时，可以从凝胶回收相应的条带(DNA)，再进行PCR扩增后，用DNA测序仪测定每种DNA的碱基序列。

作为上述的数据库可列举GenBank、EMBL、DDBJ等公用的数据库或Michigan州立大学设置的Ribosomal Database Project等。检索方法可以用FASTA、BLAST等已有的程序在短时间内有效地进行。此外，也可以用Microseq Analysis Software(アプライドバイオシステムズジヤパン社)等市售软件对Microseq 16S rDNA SequenceDatabase(アプライドバイオシステムズジヤパン社)等商用的检索数据库进行检索。或者，也可以自己构建这样的数据库并使用。此外，由数据库不能确定微生物的名称时，可以判断为同源性最高的近缘微生物或新种微生物。

通过上述那样对附着物的微生物相或者占优微生物的分析，不必培养微生物，以DNA碱基序列为指标，可简单而且准确地确定原因微生物的名称、组成比或占优势微生物等。

●附着原因的探索方法

本发明的附着原因的探索方法为将在上述分析方法中确定的附着物的微生物相或占优势微生物，与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，含有与附着物的微生物相或占优势微生物一致或类似的微生物相或占优势微生物的腐浆，确定为引起附着物的腐浆的方法。腐浆的微生物相或占优势微生物可以以DNA的碱基序列为指标，采用与上述确定附着物的微生物相或占优势微生物相同的方法来确定。

对腐浆取样的场所无限定，可以从造纸过程的任意场所取样，但要从2个以上、优选从5～20个场所采集样本。采集腐浆的场所越多，越能正确地判定引起附着物的腐浆。

具体地说，可以从以下系统采集腐浆：CGP(Chemical GroundPulp)浆粕机、CGP箱、LBKP(Laubholz Bleached Kraft Pulp)浆粕机、LBKP箱等组成的纸浆原料制备系统；由湿碎纸浆粕机、湿碎纸箱、干碎纸浆粕机、干碎纸箱等组成的碎纸系统；由上胶剂槽、硫酸铝槽、染料槽、腐浆控制剂槽、内添加淀粉糊液槽等组成的造纸药剂制备系统；由混合箱、机械箱、原料箱等组成的纸浆制备系统；由抄纸机、筛滤装置、入口、流浆箱、白水回收装置、白水槽等组成的白水循环系统；由脱水机、清洁的白水槽、CP(Consistency Profiling ControlSystem)管等组成的白水回收系统；管路、机轮等组成的抄纸机周围机器等。通过采集白水、槽内液等，用上述的分析方法分析这些样本的微生物相或占优势微生物，由此可在一定程度上预测腐浆的发生场所，从该场所重点采集腐浆。

由于本发明的附着原因探索方法是通过将上述分析方法中确定的附着物的微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，来确定引起附着物的腐浆，所以能够简单、而且可靠地确定存在高浓度的造成纸制品疵点的微生物的场所或发生源。

●微生物的控制方法

本发明的微生物控制方法是将在上述探索方法中确定的腐浆的附着场所判定为引起附着物的腐浆的发生场所，针对这样确定的腐浆的发生场所，进行杀菌·防腐处理的微生物控制方法。杀菌·防腐处理可采用添加对构成腐浆的微生物，特别是占优势微生物有杀菌·防腐效果的腐浆控制剂等方法进行。腐浆控制剂可以由抗菌试验等决定。此外，原因微生物的名称已确定的场合，也可以使用已知对该微生物有杀菌·防腐效果的药物。此外，也可以利用上述抗菌剂选定方法中说明的抗菌剂选定步骤的方法，从抗菌剂检索数据库选定腐浆控制剂。

这样的微生物控制方法，由于能够准确地选择对原因微生物有效的药物，对存在高浓度的原因微生物的场所或繁殖旺盛的场所重点地、而且以必需的最小限量的药剂进行杀菌、防腐处理，所以不必依赖于经验和状况来判断，从而能有效、合理而且低成本地防止疵点的产生。

根据以上所述，本发明的抗菌剂选定方法是根据DNA的碱基序列对样本的微生物相进行分析，利用数据库选定最适用于该微生物相的工业用抗菌剂，所以能够简单、并在短时间内准确地选定最适合的抗菌剂。

本发明的抗菌处理方法是根据DNA碱基序列分析对象系统的微生物相，从数据库选定最适合于该微生物相的工业用抗菌剂并使用，所以能够在短时间内根据对象系统的微生物相选定最适的工业用抗菌剂，并有效地进行抗菌处理。

本发明的抗菌效果监测方法是根据DNA的碱基序列分析对象系统的微生物相，根据微生物相的变化监视抗菌剂的效果，所以，能够在短时间内简单而且准确地掌握抗菌剂的效果是否发挥，从而能够事先防止因微生物的增殖而引起的问题。

本发明的腐浆抑制方法是根据DNA的碱基序列分析对象系统的微生物相，在观察到有对腐浆控制剂的抗性微生物时，由数据库选定对该抗性微生物最适的腐浆控制剂，并添加在该发生源，所以，能够在短时间内而且准确地选定对抗性微生物最适的腐浆控制剂，而且，以最小限量的添加量能够有效地对腐浆进行抑制。

本发明的造纸过程的制品附着物的分析方法是从附着物提取微生物来源的DNA，将所得的DNA的碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，所以能够简单而且可靠地确定引起纸制品疵点的微生物。

本发明的造纸过程的制品的附着物的附着原因探索方法是由附着物提取微生物来源的DNA，以所得的DNA碱基序列为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，通过将此微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，确定引起附着物的腐浆，所以能够简单而且可靠地确定引起纸制品疵点的微生物的发生场所。

本发明的造纸过程的微生物控制方法是由附着物提取微生物来源的DNA，以所得的DNA碱基序列为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，通过将该微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，确定引起附着物的腐浆的发生场所，然后对确定的腐浆发生场所进行杀菌·防腐处理，所以能够简单而且可靠地确定引起纸制品疵点的微生物的发生场所，从而能简单而且可靠地减少纸制品疵点的产生。

以下用附图说明本发明的抗菌处理方法。

图1是使用本发明的抗菌处理方法的造纸装置系统图，是对白水系统进行抗菌处理的例子。

图1的装置中，1、抄纸机，2、原料箱，3、白水槽，4微生物相分析系统，5、抗菌剂选定系统，6、控制系统，7a、7b......抗菌剂贮存槽，针对每种抗菌剂贮存槽设计为多个。

用图1的装置按以下方式造纸。即：纸浆浆料在原料箱2的流量控制下由管路11导入，由泵12通过管路13。14输送至筛滤装置15，除去夹杂物后，从管路17送至入口18。该纸浆浆料由入口18供给抄纸机1的金属网部分21。通过金属网部分21的白水收集在白水回收装置22后，从管路23集中至白水槽3中。白水槽3的白水一部分在管路14中与纸浆浆料混合，循环使用。剩余部分从排水管路24排出。在金属网部分21上形成的纸层经过干燥步骤(图中未表示)等后工序即成为纸制品。

对上述那样的造纸装置进行抗菌处理时，例如从白水槽3采集含微生物的样本、在微生物相分析系统4进行微生物相的分析、然后根据该结果在抗菌剂选定系统5选定抗菌剂。在微生物相分析系统4的微生物相的分析，和在抗菌剂选定系统5中的抗菌剂的选定，例如，如图2所示流程进行。

将抗菌剂选定系统5的结果输入控制系统6中，选定的抗菌剂按照指定的浓度，从抗菌剂贮槽7a、7b...通过药剂注入管路27a、27b...加入原料箱2中。

这样添加的抗菌剂溶解在纸浆浆料和白水中，通过在造纸装置中的循环，对全部装置进行抗菌处理。使达到目的浓度，可将信号从控制系统6送至泵28a、28b...，通过控制添加量可以自动地进行抗菌剂浓度的调整。

由白水槽3采集样本可以定期进行，或在任意时刻进行，接着进行微生物相分析、抗菌剂的选定。由此，可以选定在该时刻最适合的抗菌剂、最有效地进行抗菌处理。

在图1中，样本从白水槽3采集，但也可以从筛滤装置15、入口18或白水回收装置22等采集。在图1中设置了3个抗菌剂槽7a、7b...，但也可以为2个或4个以上。

图2是表示图1的微生物相分析系统4和抗菌剂选定系统5中处理过程的流程图，是一个使用抗菌剂检索数据库的例子，该数据库储存了在每种影响微生物生长的环境条件下，对微生物的抗菌剂有效浓度数据，并能从指定的环境条件中检索抗菌剂。

图2的流程图中，步骤31从对象系统采集含微生物的样本、在步骤32测定样本的菌落数和总的微生物数。总微生物数，例如样本中的细胞，可以用吖啶橙或DAPI等染色后，在荧光显微镜下通过直接计数等已知方法进行测定。此外，对于已经进行多次测定的对象系统，能够从环境条件推测结果时，可以省略步骤32。

接着在步骤33中，将菌落数和总微生物数比较，大致相等的场合下，在步骤34中对形成菌落的微生物的rDNA进行分析。另一方面，在不相等的场合下，在步骤35中，对包括不能形成菌落的微生物在内的全部微生物的rDNA进行分析。

随后在步骤36中，根据上述分析的碱基序列，对微生物检索数据库进行检索。在这种情况下，也可以对多个微生物检索数据库进行检索。根据该检索结果，在步骤37中，对微生物进行鉴定(微生物相的确定)。在这种场合，如不能确定微生物的名称时，也可以对其单独给与微生物号码。

接着在步骤38中，以步骤37中鉴定的微生物名称、登记号或单独给与的微生物号码中的任何一个作为检索关键词，对抗菌剂检索数据库进行检索。在步骤39挑选出抗菌剂的情况下，在步骤40中，以环境条件作为检索关键词检索抗菌剂，有成功的例子时，在步骤41中，选定该抗菌剂为用于抗菌处理的药物。此时还确定抗菌剂浓度。挑选出多个抗菌剂时，可以按上述那样从成本等考虑来进行选定。

另一方面，在步骤39中，用抗菌剂检索数据库不能挑选出抗菌剂时，去往步骤42，通过回过头来看步骤33的结果来判定是否是形成菌落的微生物，如果是形成菌落的微生物，在步骤43中，在实验室内针对各种抗菌剂进行培养试验，由此结果选定抗菌剂(步骤44)。或者，在步骤42判定为非形成菌落的微生物时，在步骤45中，根据过去的经验等选定抗菌剂。

用上述那样选定的抗菌剂，在步骤46中进行抗菌处理。

然后，在步骤47中判定处理效果，在抗菌效果不好的场合，将该结果输入抗菌剂检索数据库中(步骤48)，再回到步骤31重复进行从样本采集开始的操作。鉴定的微生物相同的场合，从在步骤40中挑选出的抗菌剂中，选定与上一次不同的抗菌剂。此外，步骤34或步骤35中的DNA分析结果与上一次相同时，也可以省去步骤36的微生物检索数据库的检索。

另一方面，步骤47中判定为处理效果良好的场合，将该结果输入抗菌剂检索库(步骤49)，间隔任意的时间后(步骤50)，从步骤31重复操作。

此外，在图2的流程中，在步骤39中未挑选出抗菌剂的场合，对形成菌落的微生物进行培养试验，选定抗菌剂，但也可以根据过去的经验等进行选定。

按照上述的方法，随着处理的不断进行，其结果逐渐在抗菌剂检索数据库中积累，步骤39和40中判定为“NO”的比例逐渐减少，最后可以只检索抗菌剂检索数据库，即可以选择合适的抗菌剂。

以下用附图说明本发明的腐浆抑制方法

图3是使用本发明的腐浆抑制方法的造纸装置的系统图。

在图3的装置中，51是CGP浆粕机，52是CGP箱，53是LBKP浆粕机，54是LBKP箱，由这些部件组成原料制备系统。

56是湿碎浆粕机，57是湿碎纸箱，58是干碎浆粕机，59是干碎纸箱，由这些部件组成碎纸系统。

61是上浆剂槽，62是硫酸铝槽，63是染料槽，64是白水处理剂槽，65是内添加淀粉糊液槽，由这些部件组成造纸药物制备系统。

67是混合箱，68是机械箱，69是原料箱，由这些部件组成纸浆制备系统。

71是抄纸机，72是筛滤装置，73是入口，74是白水回收装置，75是白水槽，由这些部件组成白水循环系统。

77是分离浓缩装置，78是清洁的白水槽，由这些部件组成白水回收系统。81是工业用水槽，82是外添加淀粉糊液槽。

用图3的装置按下述方法造纸。即，将原料纸浆导入CGP浆粕机51、LBKP浆粕机53、湿碎纸浆粕机56、干碎纸浆粕机58并分解，经过各个箱52、54、57、59导入混合箱67。上浆剂91和硫酸铝92在这里加入并混合，再在机械箱68添加内添淀粉糊液93，制成纸浆浆料94。将此浆料94导入原料箱69，添加染料95、白水处理剂96，调整流量通过泵101送至筛滤装置72，除去夹杂物后。送至入口73。

上述的纸浆浆料94从入口73供给抄纸机71的金属网部分102上。通过金属网部分102的白水收集在白水回收装置74后，汇集在白水槽75。白水槽75的白水103的一部分在连接管路104中与浆料94混合、循环使用。剩余部分送至分离浓缩装置77脱水、回收的原料返回混合箱67中再利用，滤液收集在清洁白水槽78中，在各工序中再利用。金属网部分102上形成的纸层经过压制部分105、干燥部分(图中未示)等后工序加工成纸制品。压制部分105、干燥部分产生的碎纸分别作为湿碎纸、干碎纸送至湿碎纸箱56、干碎纸箱58再利用。

上述那样制造纸的造纸过程中，由白水处理剂槽64添加的白水处理剂96，例如，2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)溶于浆料94和白水103中，通过白水循环系统循环，对白水循环系统中的腐浆进行抑制。此外，通过对清洁白水槽78中收集的清洁白水106的再利用，也可以抑制再利用处的腐浆。

这样进行腐浆控制的造纸过程中，从任意的2个以上场所采取样本，根据DNA碱基序列，用上述的方法分析每种样本的微生物相(微生物分析步骤)。例如：从CGP箱51、LBKP箱53、湿碎纸箱56、干碎纸箱58、上浆剂槽61、染料槽63、内添淀粉糊液槽65、混合箱67、机械箱68、白水槽75、清洁白水槽78、工业用水槽81、外添淀粉糊液槽82等采集样本。

接下来的抗性判定步骤是判定上述微生物分析步骤中检测出的微生物对现在使用的白水处理剂96是否有抗性。例如，以上述微生物分析步骤中检测出的微生物，或现在使用的白水处理剂96作为检索关键词，对上述药剂检索数据库进行检索，在现在使用的白水处理剂96对检索对象微生物的有效浓度被记录的场合，可判定检索对象的微生物对现在使用的白水处理剂96无抗性；未记录有效浓度的场合，可判定为有抗性。

随后是发生源判定步骤，将上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物存在率高的取样场所判定为抗性微生物的发生源。例如，对DBNPA抗性的微生物在湿碎纸箱56的存在比率最高时，可以判定该抗性微生物的发生源是湿碎纸箱56。也有存在多个发生源的场合。

作为接下来的腐浆控制剂选定步骤，以上述抗性判定步骤中判定的抗性微生物作为检索关键词，对上述药剂检索数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂。在这种情况下，优选以环境条件等作为检索关键词输入，对腐浆控制剂进一步检索。挑选出多个腐浆控制剂的场合，选择对抗性微生物最低最小有效浓度的腐浆控制剂，或通过选择“最小有效浓度×价格”为最小的腐浆控制剂，选定用作发生源处理剂的腐浆控制剂。

在随后的发生源处理剂添加步骤中，在上述发生源判定步骤判定的抗性微生物的发生源，添加上述腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂，亦即，添加与现在使用的白水处理剂不同的发生源处理剂。例如，在湿碎纸箱56中，添加作为对抗性微生物有效而选定的HPGHC(2-(对羟基苯基)乙醛酰羟肟氯化物)。由此对该发生源的抗性微生物进行了有效的抗菌处理，从而抑制腐浆。

样本的采集可以定期或在任意的时刻反复进行。在确认发生源处理剂有效果的场合，中止使用发生源处理剂，用白水处理剂进行通常的处理。另一方面，确定无效果的场合，用另一种发生源处理剂代替，或重新评价发生源处理剂的使用方法(添加浓度、添加方法等)或环境条件。进一步检测出新的抗性微生物的场合，选定对该微生物的新的发生源处理剂并添加。

这样，通过反复进行微生物相的分析和发生源处理剂的选定，能够在短时间内，而且准确地选定该时刻最适的腐浆控制剂，而且因为能够添加至发生源，所以能够用最小限度的添加量对腐浆进行抑制。

实施发明的最佳方式

以下就本发明的实施例进行说明。

实施例1

《利用实验室腐浆试验装置的实验例》

使用特开平9-75065号中所述的转矩式腐浆试验装置，即包括静止的外部圆筒和在该外部圆筒内同轴设置的内部圆筒，使水在外部圆筒和内部圆筒之间流通的同时，使内部圆筒旋转，从而在内部圆筒的表面形成腐浆的腐浆试验装置。在30℃连续供给该装置人工白水(组成：可溶性淀粉142mg/L、硫酸铵11.6mg/L、pH 7.0)，使滞留时间为20分钟，并以2.5mg/L的接触浓度间歇地添加DBNPA(二溴次氮基丙酰胺)为主剂的腐浆控制剂，每天三次，每次15分钟。运转12天后，产生厚度119μm的腐浆，取样后用PY琼脂培养基(组成：聚胨1g/L、酵母提取物1g/L、NaCl 0.5g/L、琼脂1.5％，pH7.0)培养，从最大稀释度的平板上随机分离出24株细菌。用白金环挑取每株分离菌株，悬浮于分别注入到1.5ml容量的微量离心管的0.4ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)中。

将0.8g 0.1mm的氧化锆/二氧化硅珠(Bio Spec Products，Inc公司)加入该悬浮液中，用细胞破碎机(BeatBeater：Bio SpecProducts，Inc公司)以最大输出匀浆1分钟。8,000×g、5分钟离心分离后，用上清作为模板DNA溶液进行PCR反应。试剂用PyroBestDNA聚合酶(宝酒造株式会社，商标)，反应装置采用GeneAmp 2400(PEバイオシステムズ社，商标引物用5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和5’-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR的反应条件为：将94℃0.2分钟、55℃0.3分钟、72℃2分钟的反应重复30个循环，最后在72℃下反应7分钟。反应物通过MicroSpinS-300 HR 柱(アマシヤム·フアルマシア·バイオテク株式会社制，商标)除去未反应的引物后，取其一部分用BigDye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(PEバイオシステムズ社，商标)进行测序反应。测序所用的引物为5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和5’-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3’。

反应物通过Autoseq G-50柱(アマシヤム·フアルマシア·バイオテク株式会社制，商标)将未反应的核苷酸除去后，加热使其变性，供给ABIPRISM 3000测序仪，测定由5’末端起约500个碱基的序列，进入GenBank数据库，对全部分离株所得的碱基序列的数据，对每个细菌进行鉴定，发现24株分离株中含有5个种类的细菌，其中具有与数据库中作为登记号AB004728登记的Microbacterium属的一种的碱基序列有98.1％的同源性的16S rDNA的细菌(亦即，该细菌鉴定为微杆菌属)占全部细菌的75％，是占优势微生物。

进一步对该分离的占优势微生物的碱基序列、通过单独构建的微生物检索数据库(将过去检索的结果单独集积起来的数据库)进行检索，结果发现完全相同碱基序列的细菌过去分离到过，作为微生物号6354被登记。以该微生物号码作为检索关键词，对抗菌剂检索数据库检索的结果，明确了上述的微杆菌属是对DBNPA抗药性的菌，其他的分离菌都是DBNPA易感性菌。此外，为了慎重起见，随后用DBNPA对各分离株进行杀菌，确认使用的抗菌剂检索数据库的结果所显示的值是正确的。

此外，在抗菌剂检索数据库中，针对微杆菌属，检索根据“最小有效浓度×价格”判断以最低成本可得到效果的抗菌剂，结果挑选出HPGHC(2-(对羟基苯基)乙醛酰羟肟氯化物，并判明其最小有效浓度为0.2mg/L。其他分离的菌株对HPGHC全部是易感性的。

基于以上的结果，腐浆试验装置的操作条件不变，采用只将腐浆控制剂改变为维持HPGHC在系统内的浓度为0.3mg/L的方法。结果，腐浆附着量显著减少，相同时间内的腐浆形成的厚度为3μm。用上述同样的方法，对此时采集的HPGHC处理腐浆的微生物相进行分析，未检测出微杆菌属。

在该实施例中，从采集腐浆至搞清楚微杆菌属为占优势微生物所需要的天数为5天。

实施例1中所用的上述抗菌剂检索数据库是利用Microsoft公司的Microsoft Access(商标)作成的，针对从各种水系统和造纸工厂的淀粉浆料、淀粉糊液、涂料中分离的细菌，在pH3水准、温度3水准的条件下，用各种抗菌剂(腐浆控制剂、防腐剂、和它们的原材料)进行杀菌试验和增殖抑制试验，并将该试验结果输入。还是可以收集并输入将各种抗菌剂用于各种对象系统而得到的以往的实际处理数据的抗菌剂检索数据库。

此外，该抗菌剂检索数据库的检索，只利用组合在MicrosoftAccess中的“分类”、“自动筛选”和“检索”的功能进行，将检出结果在计算机的显示屏上表示并进行判断。

实施例2

《D造纸的腐浆控制剂的选定例》

在抄造中等质量纸的长网造纸机的腐浆控制中，用以DBNPA为主剂的抗菌剂长期处理时，白水循环过程中产生粉红色的细菌腐浆。因此，用与实施例1同样的方法，用琼脂培养基从多个附着场所的腐浆中分离细菌各24菌株，进行微生物相的分析。其结果是分离株含有5个种类的细菌，其中，具有与GeneBank数据库的登记号AJ000002的地热异常球菌(Deinococcus geothermalis)有99.5％同源性的16SrDNA的细菌(即鉴定为地热异常球菌)占全部细菌的46％。

用地热异常球菌作为检索关键词，用和实施例1相同的抗菌剂检索数据库检索时，表明该细菌属于对DBNPA有抗性的组。为了慎重起见，随后进行分离菌对DBNPA的杀菌试验，证实的确是DBNPA抗性菌。从抗菌剂检索数据库挑选对该菌有效的抗菌剂的结果，得到的结果是，在本系统的pH和温度条件下，某种无机溴类化物是合适的。此外，以其他的分离菌检索的结果，对该无机溴类化合物有抗性的腐浆构成菌不存在。因此，将其直接用于实际的腐浆控制中，结果，粉红色的腐浆比原来总的腐浆的发生明显减少。25天连续操作后，对采集的白水槽内的附着物用上述同样的方法分析微生物相，结果地热异常球菌在全部微生物相占有的占有率减少至4％。此外，从采集腐浆样本至上述各种试验结束，确定新的处理方法所需的时间为6天。

实施例3

《D造纸的监测例》

在D造纸厂，与实施例2的抄造制品相同，机器形式、抄造条件类似的另一台机器在其邻近。但是，即使在实施例2的机器产生粉红色的腐浆时，该机器未见其发生。因此，用与实施例1同样的方法，用琼脂培养基从白水样本分离细菌36菌株，进行微生物相的分析。由于试验菌株数多，用3种限制酶( BstU I、 Rsa I， Hha I)分别消化由各菌株制备的16S rDNA，进行TRFLP分析，将模式一致的作为相同的菌预先分组后，以碱基序列为指标进行鉴定。结果，本机器的分离36株菌中，地热异常球菌占有的占有率不超过2.7％(1株菌)。

由于机器的环境条件是类似的，这台机器经过一段时间也可能会产生同样的粉红色腐浆，因此，用以前的方法加强效果监视的同时，通过上述同样的试验方法(分离菌株增至48株菌)，对白水样本的微生物相反复进行分析，间隔为7～14天。此外，在该机器设置了与实施例1的试验装置基本构造相同的3连式腐浆监测器，如下那样使用。

亦即，为了将1台(以下用1号机表示)作为本来的腐浆监测器，连续供给机器白水。其余2台用作模拟机器条件的模拟试验装置，设定供给白水的流量，使白水的滞留时间与机器的条件相同，在与DBNPA的添加时间带相隔的时间带，将机器白水取至贮存槽中，供给不含DBNPA的白水。然后，为了确认在实际机器的条件下，DBNPA制剂和无机溴类化合物的抗菌力，使用与机器处理条件相同的各自独立的注入系统，在1台(以下用2号机表示)中添加DBNPA制剂，另一台(以下用3号机表示)中添加无机溴类化物。

直到第4次的微生物相的分析结果，地热异常球菌的占有率在2～4％(48株菌中1～2株菌)的范围变化，但从初次试验数起47天后进行的第5次的结果增加至6菌株(12.5％)。与此同时实施的对白水样本的杀菌效力试验中，DBNPA制剂的效力仍旧良好，在通常的偏差范围之内。另一方面，3连式腐浆监测器的3号机中，没有形成腐浆的迹象，1号机和2号机附着了厚度相当于数μm的微量腐浆，但认为有形成腐浆的迹象。

综合上述多个结果，可以判定该变化是该机器开始产生粉红色腐浆的征兆，并将机器所使用的抗菌剂由DBNPA制剂变更为无机溴类化合物(试验日起5天后)。

更换抗菌剂后第7天进行机器白水的微生物相的分析，结果是分离菌48菌株中的1株菌(占有率2％)为地热异常球菌，几乎恢复至原来的状态。此外，3连式腐浆监测器的1号机的附着量低至检出限以下。另一方面，2号机的腐浆附着量逐渐增加，抗菌剂更换后第14天，产生肉眼也能判别的粉红色腐浆。由此结果判断，如果抗菌剂的变更晚1～2周，该机器也发生腐浆障碍的可能性大。

由此结果可知，利用DNA碱基序列的本发明的抗菌效果监测方法，作为监测使用抗菌剂的机器中的效力的手段是有效的。

实施例4

《O造纸中选定腐浆控制剂的例子》

长期将氯处理与以DBNPA为主剂的抗菌剂并用进行抄造中性的中等质量纸的长网造纸机的腐浆控制时，白水循环系统中产生黄色的腐浆。因此，用实施例1同样的方法，从腐浆中分离出24菌株，根据16SrDNA进行微生物相的分析。由结果可知，具有在GenBank数据库中特定为登记号AB027702的属于Microbacterium属的一微生物的16SrDNA碱基序列有98.0％同源性的基因的细菌占90％。

此外，用单独构建的上述微生物检索数据库检索分离的占优势菌的碱基序列时，有99.1％相同的碱基序列的细菌以微生物号码2401登记。因此，以该微生物号码作为检索关键词，对抗菌剂检索库进行检索，由其结果可知其是属于对DBNPA呈现出抗性的群的细菌。根据“最小有效浓度×价格”判断在该机器的环境条件下对其有效的抗菌剂时，所得结果是无机溴类化合物为主剂的抗菌剂。因此，从随后的操作期间起，单独使用选定的无机溴类抗菌剂进行腐浆控制。结果，14天的连续操作期间，未产生用肉眼能识别的腐浆。

实施例5

《A造纸厂淀粉浆料的防腐剂选定例》

在A造纸厂造纸用的淀粉糊液(pH9，温度60℃)中，发生糊液粘度在短时间内降低的现象。在该系统中，按浓度10mg/L(按异噻唑啉酮的浓度计)连续添加异噻唑啉酮抗菌剂。测定菌数发现产生了1.7×10E+8CFU/ml的菌，推定为腐败初期状况。用实施例3同样的方法进行微生物相的分析，由结果可知，具有与 Paenibacillus属的一种微生物(GenBank数据库：AJ288158)有94.8％同源性的16S rDNA的细菌占全部细菌的96％。

进一步用单独构建的上述微生物检索数据库检索分离的占优势细菌的碱基序列时，有完全相同的碱基序列的细菌以微生物号码2675登记。因此，以此微生物号码作为检索关键词，对抗菌剂检索数据库进行检索，由结果可知，该细菌以前从同一工厂分离，该细菌的营养细胞对异噻唑啉酮是易感性的。因为占优势种是易感性的菌，所以推定原因不是抗菌剂不合适，而是使用方法存在问题，对抗菌剂注入系统重新查看，结果判明注入泵的输送量降低至约1/5，注入浓度不足。从防腐剂贮存槽内的残留量也证实了注入量的降低，所以判断这是原因，因此，将淀粉糊槽洗净后，更换新的注入泵，再开始运转时，上述现象停止，菌数也恢复到原状。

实施例6

《S造纸中对丝状真菌的腐浆控制剂的选定例》

抄造酸性新闻纸的长网造纸机中，长期并用DBNPA和BBAB(1，4-双(溴乙酰氧基)-2-丁烯)为主剂的抗菌剂进行腐浆控制处理时，整个机器产生以霉菌为主体的腐浆。因此，用PYD培养基进行丝状菌和酵母的选择性分离。培养4天后，出现菌落全部是带有浅橙色菌丝的直径为5mm的丝状菌。用实施例1同样的方法分离出8株丝状菌，根据18S rDNA进行微生物相的分析。PCR引物和测序用引物采用5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’。由结果可知，8株全部是含有与高大毛壳( Chaetomium  elatum)(GenBank数据库，登记号M83257)有99.2％同源性的18S rDNA的丝状菌。

以高大毛壳为检索关键词，对抗菌剂检索数据库进行检索时，由结果可知，属于对DBNPA和BBAB非易感性的丝状菌群。因此，在该机器的环境条件下，根据“最小有效浓度×价格”判断对上述丝状菌有效的抗菌剂时，所得的结果是以4，5-二氯-1.2-二硫戊环-3-酮(以下称为二噻茂)为主剂的抗菌剂。因此，在随后的操作期间，用选定的BBAB和二噻茂为主剂的抗菌剂进行腐浆控制。结果，在14大的连续操作期间，未产生用肉眼能辨别的腐浆。

实施例7

《空调冷却水系统中腐浆控制剂的选定例》

通过将包合异噻唑啉酮的片剂化的固体抗菌剂浸入冷却水中进行腐浆控制的N(株)管理大楼的空调用冷却水系统中，看到了明显的细菌腐浆的产生。由于是有机物浓度低的系统，所以判断不能用培养基分离培养的微生物占大部分。因此，从腐浆中提取完整DNA后，立即用提取的完整DNA作为模板，进行PCR。

用2ml容量的带螺旋盖微量离心管，将一耳勺左右的腐浆悬浮于1ml DNA提取用缓冲液(100mM Tris-HCl、100mM EDTA、100mMNa₂HPO4+NaH₂PO4、1.5M NaCl、pH8.0)中，加入2g的0.1mm氧化锆/二氧化硅珠，用Beatbeater，以最大的输出功率匀浆2分钟。进一步反复冻结融解3次后，立即添加10mg/ml浓度的蛋白酶K(生化学工业)0.01ml，在37℃下反应15分钟，再添加0.2ml的10％SDS，混合后在65℃下放置30分钟。

用Beatbeater再匀浆后，用离心分离(10,000×g，10分钟)回收上清液。加入等量的氯仿充分悬浮后，进行离心分离(10,000×g，10分钟)，回收上清液。加入0.6倍容量的异丙醇混合后，在室温下放置30分钟，离心分离(10,000×g，10分钟)回收DNA。用70％乙醇洗涤DNA后，干燥，悬浮于TE缓冲液中。PCR与实施例1同样的方法进行。引物用5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和5’-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3’，后者采用5’末端磷酸化的，扩增约500碱基对。所得的PCR产物用λ外切核酸酶处理，成为单链DNA后，用SSCP法进行分析。即用10％的聚丙烯酰胺凝胶在200V、20℃的低温条件下进行8小时的电泳。凝胶用Gelstar(宝酒造株式会社制，商标)染色后紫外灯照射，确认DNA条带，大约看到10条独立的条带，但未检测出浓度明显高的(即量多的)条带。

有时对发生问题以前采集的冷冻保存的本冷却水系统的腐浆进行同样的分析比较，结果表明在条带数和位置以及浓度比方面未观察到大的差别，问题发生的前后，未见微生物相的变化。在检测出的条带中，从浓度最浓的条带回收DNA，确定碱基序列，其结果是与Rubrivivax属的近缘种(GenBank数据库，登记号X89910)有95.8％同源性的16S rDNA，和与 Sphingomonas sp.(GenBank数据库，登记号AB023290)有99.5％同源性的16S rDNA。

与实施例1同样对单独地构建的微生物检索数据库进行检索时，发现这些16S rDNA以前也常常从同冷却水系统中分离出来，没有用异噻唑啉酮处理引起显著问题的事例。此外，对与实施例1同样的抗菌剂检索数据库进行检索，由结果可知， Sphingomonas sp.是对异噻唑啉酮的易感性菌，根据此结果推定，不是抗菌剂的种类不合适，而是使用方法上有问题。对每天的操作报告进行检查的结果，发现操作者提高了喷放水量的设定值。由此判定，腐浆产生的原因是由于冷却水系统的滞留时间变得比设定值短，降低了异噻唑啉酮在水中的维持浓度。因此，恢复原来的喷放水量状态后，腐浆即停止产生。

实施例8

《超纯水生产过程的RO浓缩水侧的抗菌剂处理例》

在H电子的超纯水生产工序的RO浓缩水侧产生了腐浆，并出现流通量降低的倾向。将腐浆悬浮于DNA提取用缓冲液后，加入玻璃珠进行匀浆。以下用与实施例7同样的方法提取DNA，进一步通过PCR制备所有的16S rDNA。16S rDNA单链化后，用SSCP法进行分析。结果，观察到5条独立的条带，其中的一条占总浓度的80％。测定该条带的碱基序列后，由结果可知，与 Ralstonia  eutropha(GenBank：登记号D88000)有99.9％的同源性。

与实施例1同样，抗菌剂检索数据库中登记了多个 Ralstonia eutropha，与本次分离的16S rDNA比较，有99.2-99.7％的同源性。对这些全部检索最有效的抗菌剂，结果是次氯酸钠。但是，已知氯对RO膜有不良影响，所以不能使用。因此，从抗菌剂检索数据库再检索对RO无影响，而且对上述微生物有效的抗菌剂，由结果发现异噻唑啉酮类抗菌剂在实际使用中，其浓度按异噻唑啉酮计为1.2-1.5mg/L时有效。因此，将RO膜内部洗净后，注入上述异噻唑啉酮制剂使其变为1.5mg/L。结果，腐浆不再产生。

参考例1

连续操作期间约2周的中性抄纸的造纸过程中，在抄纸机的白水循环系统产生了腐浆，所以采用将DBNPA(二溴次氮基丙酰胺)为有效成分的腐浆控制剂间歇地加入了原料箱中的方法(按DBNPA在系统内的浓度为20mg/L，维持20分钟的要求，设定注入量，将此注入量1天4次用定量泵自动注入)进行腐浆控制。该造纸过程中，其他清洁白水管路也产生了腐浆，所以，同样采用将DBNPA为有效成分的腐浆控制剂间歇地加入清洁白水槽中的方法进行腐浆控制。

实施例9

自参考例1的处理开始2个月后，在抄纸机金属网部分下的吸收箱内观察到以细菌为主体的腐浆的产生。因此，将此腐浆作为样本，用琼脂平板法分离培养细菌，针对获得的48菌株，以16S rDNA为指标，进行微生物相的分析。由各菌株提取的DNA作为模板，通过PCR合成16S rDNA，用3种限制酶( BstU I、 Rsa I、 Hha I)分别消化，进行RFLP分析。电泳模式一致的为同一种菌进行预先分组后，以从5’末端起的500bp前后的部分碱基序列为指标，进入GenBank数据库，对每个细菌进行鉴定。结果，48菌株中，25菌株为地热异常球菌，10菌株为中等食酸菌，8菌株为立默氏菌属近缘的革兰氏阴性菌，4菌株为 Shingomonas，余下1菌株为根瘤菌属。

以各菌株的16S rDNA的碱基序列为指标，对药剂检索数据库进行检索，由结果可知，中等食酸菌、主默氏属近缘的革兰氏阴性菌、Shingomonas和根瘤菌属是对DBNPA的易感性菌，而地热异常球菌是对DBPNA的抗性菌。

过后为了确认上述结果，对代表的分离菌珠进行DBNPA的杀菌试验，中等食酸菌、立默氏近缘的革兰氏阴性菌、 Shingomonas和根瘤菌属与2mg/L以下的DBNPA接触30分钟后，活菌数的99％死亡，但地热异常球菌与30mg/L的DBNPA接触30分钟也完全没有杀菌。

随后从造纸过程的各个场所采集样本，用DAPI染色直接镜检法测定总菌数，同时用琼脂平板法将各48菌株分离，根据16S rDNA的碱基序列，检查地热异常球菌在48菌株中所占的存在比率。试验结果如表1所示。

                                表1

样本名称或样本采集场所	总菌数(细胞/mL)	地热异常球菌菌株数(48株中的菌落数)	比例(％)*1
				白水槽的白水清洁白水槽中的清洁白水工业用水LBKP箱CGP箱干碎纸箱湿碎纸箱混合箱机械箱染料槽上浆剂槽外添淀粉糊液槽内添淀粉糊液槽	5.1×1073.0×1075.7×1036.0×1084.8×1048.3×1076.7×1074.8×1075.2×1071.1×1038.7×1021.5×1044.6×103	98013244670000	1917020159213150000

*1(地热异常球菌菌落数/48)×100

地热异常球菌主要存在于湿碎纸箱中，其存在比率达到91.7％。LBKP箱或干碎纸箱中也检出，但这是通过制备纸浆时使用的回收白水带入的。此外，各种纸浆原料集中的混合箱、机械箱中总菌数增加，但地热异常球菌的比率低，所以可知地热异常球菌在此没有增殖。由以上的试验结果可以判定，DBNPA抗性菌的地热异常球菌在湿碎纸箱中增殖，供给白水循环系统。

在药剂检索数据库中，以地热异常球菌为检索关键词，检索腐浆控制剂，在中性域内杀菌效力高的腐浆控制剂中挑选时，挑选出HPGHC(2-(对羟基苯基)乙醛酰羟肟氯化物)。也知道通过与系统内浓度20mg/L的HPGHC接触20分钟，可将地热异常球菌杀灭。湿碎纸箱的流量与白水循环系统流入量相比约为1/20，要达到相同的系统内浓度20mg/L，向湿碎纸箱添加，药物使用量少。而且，由于该箱内的滞留时间长，一次添加的药物能与微生物长时间接触，所以不必连续注入也能维持接触时间，因此具有的优点是：使用少于按流量比计算量的药剂也能解决问题。

此外，实施例中使用的上述药剂检索数据库是利用Microsoft公司的Microsoft Access(商标)作成的，该数据库中输入了对从各种水系统和造纸工厂的淀粉浆料、淀粉糊液、涂料颜料分离的细菌，在pH 3水平、温度3水平的条件下，用腐浆控制剂或其原料进行杀菌试验和增殖抑制试验所得的试验结果。该数据库还收集并输入了过去将各种腐浆控制剂用于各种对象系统所得的实际数据。此外，该药物检索数据库的检索只利用组合到Microsoft Access中的“分类”、“自动筛选”和“检索”的功能进行，将检出的结果在计算机的显示装置上显示，并进行判断。

由腐浆控制剂检索的结果，将处理方法变更为按照以往的要领将HPGHC为有效成分的腐浆控制剂作为发生源处理剂，按单位保有水量(箱的容量)为25mg/L每天3次而加入湿碎纸箱，将DBNPA为有效成分的腐浆控制剂加入白水循环系统的方法。

这时HPGHC的使用量相当于假定将其加入白水循环系统时的约1/30的使用量。

结果，在关机时，观察到的腐浆附着量显著减少，吸收箱附着物由所谓的腐浆变为少量的以纸浆纤维为主体的附着物。

在变更处理方法后第二次关机时和关机之前，从造纸过程的各部采集样本，用上一次同样的方法测定总菌数和地热异常球菌的存在比率。结果，总菌数在通常的波动范围内，未发现变化，但未检出地热异常球菌。结果如表2所示。

表2

样本名称或样本采集场所	总菌数(细胞/mL)	地热异常球菌菌株数(48株中的菌落数)
			白水槽的白水清洁白水槽中的清洁白水干碎纸箱湿碎纸箱	4.8×1073.1×1076.0×1075.3×107	0000

由以上结果可知，仅追加使用少量的腐浆控制剂，将DBNPA抗性的地热异常球菌从其发生源的湿碎纸箱中驱走。而且知道在白水循环系统中的腐浆控制效果是可靠的。

还有，同时采集的吸收箱的附着物的总菌数为3.5×10⁹个细胞/g干物质，其中也未检出地热异常球菌。

实施例10

A工厂的Z抄纸机(日产290吨，优质纸，pH7.3)中，操作刚开始后，频频产生直径1～1.5mm的褐色疵点。将纸片的疵点部分切下，将此30个疵点(约7.5mg)放入2mL容量的塑料制微量离心管中。加入1ml DNA提取液(100mM Tris-Cl，100mM EDTA-Na，100mM Na₂HPO4，1.5M NaCl(pH8.0))，室温下放置30分钟，使纸片充分浸渍。

接着，加入2g 0.1mm氧化锆/二氧化硅珠(Bio Spec Products，Inc公司)，在细胞破碎机(Beatbeater：BioSpec Products，Inc公司)中匀浆2分钟。然后加入10mg/ml浓度的蛋白酶K(生化学工业株式会社)水溶液10μl，37℃下反应15分钟。加入10％SDS水溶液250μl，用Beatbeater匀浆1分钟后，在60℃下放置30分钟。12000rpm，25℃下离心分离10分钟后，将600μl上清移至新的塑料管中，加入600μl的氯仿。充分混合后，在12000rpm，25℃下离心分离10分钟。将上层液体550μl移至新的管中，加入330μl异丙醇，缓慢混合后在室温下静置30分钟。离心分离后(12000rpm，25℃，10分钟)，弃去上清，用70％乙醇洗涤管内后，将沉淀物减压干燥。干燥的沉淀物悬浮于50μl的TE水溶液(10mM Tris-Cl，1mMEDTA(pH8.0))中，得到DNA悬浮液。此外，在纸片的正常部分切下相当于7.5mg的30等分，用上述同样的方法提取DNA。为了证实全部提取操作的重现性，每个样本进行两次。

用上述方法从疵点和正常部分提取的各种DNA悬浮液作为模板，通过PCR反应，用细菌特异的引物(Bact 27f：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’、Bact519R：5’-GWATTACCGCGGCKGCTG-3’)，和真菌特异的引物(NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’、NS2：5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’)，扩增ss rDNA。试剂用PyroBestDNA聚合酶(宝酒造株式会社)，反应装置用GeneAmp2400(アプライドバイオシステムズ日本公司)。PCR反应如下进行：在30μl的反应液中，将温度条件为94℃0.2分钟、55℃0.3分钟、72℃1分钟的反应反复30个循环，最后在72℃下反应7分钟。

取2μl扩增产物供给2％浓度的琼脂糖凝胶电泳，在100mv，电泳45分钟后，用溴乙锭染色将DNA染色，在紫外线照射下观察。其结果如图4所示，用细菌特异的引物时，疵点部分和正常部分都可看到ss rDNA条带，但用真菌特异的引物时，疵点部分看到有18S rDNA的条带，而正常部分未见条带。由此结果可知，疵点部分的细菌量与正常部分的水平相同，但疵点部分含有明显量的真菌。

将25μl扩增的18S rDNA水溶液供给MicroSpin S-300HR柱(アマシヤムフアルマシアバイオテク公司)，除去未反应的引物后，其中一部分用BigDye Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(アプライドバイオシステムズ日本公司)进行测序反应。测序引物用上述的NS1、NS2，测序仪采用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ日本公司)。结果得到序列表中序列号6所示的碱基序列。

在数据库中检索序列号6的碱基序列。亦即，进入GenBank数据库，用BLAST与数据库上的18S rDNA序列比较，发现与束霉(Sarcinomyces)属的丝状菌的18S rDNA的序列最一致，显示94％的同源性。

上述方法鉴定的束霉属丝状菌的发生场所由下述方法确定。亦即，以在PDA平板培养基上形成的菌落数为指标，检查白水和各原料管道的霉菌数。进一步以菌落形态为指标进行分组，根据上述的DNA序列，以菌落的18S rDNA的碱基序列为指标，对每个霉菌进行鉴定。结果如表3所示，白水和LBKP浆料中作为占优势微生物观察到的红褐色霉菌的DNA碱基序列与从疵点部分分离的DNA的碱基序列完全一致。

由以上结果可知，该红褐色的霉菌是产生疵点的原因，同时也知道这些霉菌大多数来源于LBKP浆料。

                                            表3

		霉菌数(CFU/ml)
							总菌数	红褐色2～3mm毡状菌丝	白色10～15mm棉花状	白色中心部绿色15～20mm棉花状	其他
		样本	白水	2.1×101	1.9×101	1.0×100						未检出	1.0×100
原料箱浆料	4.1×101						3.6×101	2.0×100	1.0×100	2.0×100
			LBKP浆料	1.0×102	1.0×102	未检出					未检出	未检出
NBKP浆料	未检出						未检出	未检出	来检出	来检出
			碎纸浆料	4.0×100	2.0×100	来检出					1.0×100	1.0×100

根据以上结果，为了防止疵点的产生，采取以下的对策。首先，对LBKP的制造过程进行检查，清楚在增稠器的滤液管道中产生了红褐色的腐浆，检测该腐浆的霉菌数结果，每1g腐浆(湿重)发现5×10⁶CFU的霉菌。全部是与白水中的占优势微生物相同的红褐色霉菌，碱基序列也一致。从显微镜观察结果也知道是以霉菌为主体的腐浆。因此，用NaOH将该管道洗涤后，间歇地注入对从滤液管道中的腐浆分离的霉菌最有效的以4，5-二氯-1，2-二硫戊环-3-酮为主要成分的腐浆控制剂，进行杀菌·防腐处理。结果，完全没有了疵点的产生。

实施例11

B工厂的Y抄纸机(日产410吨，有薄涂层的纸，pH7.5)中，操作开始后第11天起，直径约5mm的浅褐色疵点频繁产生，最终停止运转。从纸片切下疵点部分，将其中的3个(约8.1mg)裁成2mm的正方形后，放入2ml容量的塑料制微量离心管内。加入1ml DNA提取液(100mM Tris-Cl、100mM EDTA-Na、100mM Na₂HPO4、1.5MNaCl(pH8.0))，室温下放置30分钟，使纸片充分浸渍。

随后，加入2g的0.1mm氧化锆/二氧化硅珠，用Beatbeater匀浆2分钟。然后，加入10mg/ml浓度的蛋白酶K水溶液10μl，37℃下反应15分钟。加入10％SDS水溶液250μl，用Beatbeater匀浆1分钟后，60℃下放置30分钟。12000rpm，25℃下离心分离10分钟后，将上清600μl移至新的塑料管内，加入600μl的氯仿。充分混合后，在12000rpm，25℃下，离心分离10分钟。将550μl上层移至新的管内，加入330μl异丙醇，缓慢混合，室温下静置30分钟。离心分离后(12000rpm，25℃，10分钟)，弃去上清，用70％的乙醇洗涤管内后，沉淀物减压干燥。干燥后的沉淀物悬浮于50μl TE水溶液(10mMTris-HCl，1mM EDTA(pH8.0))中，得到DNA悬浮液。此外，在纸片的正常部分取相当于8.1mg的纸，切成25等分，用上述同样的方法提取DNA。为了证实重现性，各样本的全部提取操作进行二次。

用上述方法由疵点部分和正常部分提取的各DNA悬浮液作为模板，通过PCR反应，与实施例10同样，用细菌特异的引物(Bact27f、Bact519R)和真菌特异的引物(NS1、NS2)PCR扩增ssrDNA。试剂用PyroBest DNA聚合酶，反应装置用GeneAmp 2400。PCR反应条件是94℃0.2分钟、55℃0.3分钟、72℃1分钟的反应，反复30个循环，最后1次在72℃反应7分钟。

取2μl扩增产物供给2％浓度的琼脂糖凝胶电泳，100mV下，电泳45分钟后，用溴乙锭染色将DNA染色，在紫外线照射下进行观察。结果，用细菌特异的引物时，疵点部分可看到明了的ss rDNA条带，而正常部分看到很浅的条带。用真菌特异的引物时，疵点部分和正常部分都未看到条带。

由以上结果可知，疵点部分与正常部分相比较含有明显量的细菌。

在疵点频繁产生时期，系统内全部污染，无法目视观察确定造成疵点的污染场所。因此，采集系统内的腐浆，比较腐浆的微生物相和疵点部分的微生物相。样本从以下的场所采集。

1)流浆箱内的腐浆

2)机轮下面的腐浆

3)白水槽壁上的腐浆

4)原料箱内的腐浆

5)CP(Consistency Profiling Control System)管道的腐浆

6)白水

按照上述的方法，由湿重50mg相当的腐浆、2ml白水在10000rpm4℃离心分离10分钟所得的沉淀物，提取DNA。干燥后的沉淀物悬浮于50μl的TE水溶液中。

微生物相的比较用TRFLP法。从上述腐浆和白水提取的DNA悬浮液，以及由疵点提取的DNA悬浮液作为模板，在与上述相同的条件下进行PCR反应。采用的引物是5’端基侧用4，4，2’4’，5’，7’-六氯-6-羧基荧光剂(6-HEX)标记的引物。将25μl扩增的16S rDNA水溶液供给MicroSpin S-400HR柱(アマシヤムフアルマシアバイオテク株式会社)，除去未反应的引物后，取0.5μl与含有2单位限制酶BstU1(ニユ-インゲランドバイオラボ社)的NE2缓冲液2μl混合，在65℃下反应2小时。反应物中依次混合12μl甲酰胺，0.5μl Gene-Scan500 Rox Size Standard(アプライドバイオシステムズジヤパン社)，并充分搅拌。混合物在94℃反应2分钟后，在冰水中迅速冷却，用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer，用GeneScan程序(アプライドバイオシステムズジヤパン社)对片段进行分析。分析的结果如图5所示。

除了因持有多个拷贝的多形性或限制酶识别序列的重叠等例外之外，一株细菌应显示固有的峰。如果作为比较对象的二个样本间，以峰的位置和量作为指标的片段模式相似的话，则判断二者的微生物相大致相同。如由图5可知，来源于疵点的片段模式是以201 base的TRF(末端限制性片段)为主体的片段，因此与CP管道腐浆来源的模式非常相似，但与以223 base的TRF为主体的来源于白水、以及其他腐浆的模式明显不同。

由以上的分析结果推测，疵点是因CP管道中产生的腐浆脱落等混入造纸过程中而产生的。CP管道中所利用的虽然是白水经多盘滤机处理后的清洁白水，但未经腐浆控制处理。因此，清洁白水槽中每天间歇加入2次以2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺为主要成分的腐浆控制剂。结果，在以后的操作中CP管道的腐浆显著减少，也没有了疵点的产生。

产业上的应用可能性

本发明的抗菌剂选定方法能够简单而且在短时间内选定最适的抗菌剂，所以可以在抗菌剂处理方法、抗菌效果的监测方法、造纸过程中腐浆抑制方法、造纸过程中微生物抑制方法等中，作为选定抗菌剂(腐浆控制剂)时的选定方法使用。

本发明的抗菌处理方法可以根据对象系统的微生物相，在短时间内选定最适的工业用抗菌剂，并有效地进行抗菌处理。

本发明的抗菌效果监测方法能够在短时间内简单而且准确地掌握抗菌剂的效果是否发挥，能够事先防止因微生物的增殖所引起的问题。

本发明的腐浆抑制方法能够在短时间内而且准确地选定对抗性微生物最适合的腐浆控制剂，而且能够使添加量达最小限而有效地进行腐浆控制。

本发明的造纸过程中制品附着物的分析方法能够简单而可靠地确定造成纸制品疵点的微生物。

本发明的造纸过程中制品附着物的附着原因的探索方法能够简单而可靠地确定造成纸制品疵点的微生物的发生场所。

本发明的造纸过程中的微生物控制方法能够简单而可靠地确定造成纸制品疵点的微生物的发生场所，据此能简单而可靠地减少纸制品疵点的产生。

                                 序列表

<110>栗田工业株式会社

<120>抗菌剂的选择方法及其使用方法

<130>KWI00-095

<150>JP 2001-1427

<151>2001-1-9

<150>JP 2001-365004

<151>2001-11-29

<160>8

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(19)

<223>引物

<400>1

gagtttgatc mtggctcag                                                   19

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(21)

<223>引物

<400>2

acggytacct tgttacgact t                                                21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(18)

<223>引物

<400>3

cagcmgccgc ggtaatwc                                                    18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(19)

<223>引物

<400>4

gtagtcatat gcttgtctc                                                   19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(21)

<223>引物

<400>5

ggctgctggc accagacttg c                                                21

<210>6

<211>501

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>由造纸过程得到的丝状真菌18s rDNA部分核苷酸序列

<400>6

taagccatgc atgtctaagt ataagcaagt atactgtgaa actgcgaatg gctcattaaa   60

tcagttatcg tttatttgat agtgcccttt actacatgga taaccgtggt aattctagag  120

ctaatacatg catcaagccc cgaccagggg tgtatttatt agataaaaaa ccaatgccct  180

tttgggctgt ttggtgagtc atgataacgc aacgaatcgc atggccttgc gccggcgatg  240

gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt cgattgtagt ttagtggact acaatggttt  300

caacgggtaa cggggaatta gggttcgact ccggagaggg agcctgagaa acggctacca  360

catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc gacacgggga ggtagtgaca  420

ataaatactg atacagggct cttttgggtc ttgtaattgg aatgagtaca atttaaatcc  480

cttaacgagg aacaattgga g                                            501

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(20)

<223>引物

<400>7

agagtttgat cmtggctcag                                                  20

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<222>(1)...(18)

<223>引物

<400>8

gwattaccgc ggckgctg                                                    18

Claims (24)

1.抗菌剂的选定方法，该方法包括：

根据DNA碱基序列分析样本微生物相的微生物分析步骤；以及

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤。

2.抗菌处理方法，它是使用工业用抗菌剂进行抗菌处理的方法，该方法包括：

从使用工业用抗菌剂的对象系统中采集含微生物的样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相的微生物分析步骤；

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂、从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤；以及

将上述抗菌剂选定步骤中选定的工业用抗菌剂加入对象系统中的抗菌剂添加步骤。

3.抗菌效果的监测方法，该方法包括：

在进行抗菌处理的抗菌处理系统中，定期或者在任意的时刻进行下述的样本采集步骤和微生物分析步骤，将此分析结果与前一次的分析结果比较，根据微生物相的变化监视工业用抗菌剂效果的变化；

其中所说的抗菌处理系统所进行的抗菌处理包括：从使用工业用抗菌剂的对象系统中采集含微生物的样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相的微生物分析步骤；

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的工业用抗菌剂、从中选定工业用抗菌剂的抗菌剂选定步骤；以及

将上述抗菌剂选定步骤中选定的工业用抗菌剂加入对象系统中的抗菌剂添加步骤。

4.造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2个以上场所采集样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析每个样本的微生物相的微生物分析步骤；

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的腐浆控制剂、从中选定腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

将上述腐浆控制剂选定步骤中选定的腐浆控制剂加入对象系统中的腐浆控制剂添加步骤；

该方法还进一步包括：判定上述微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；以及

将上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物存在比率高的样本采集场所，判定为抗性微生物的发生源的发生源判定步骤；

其中，在上述的腐浆控制剂选定步骤中，以上述抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索关键词检索数据库，挑选出腐浆控制剂。

5.造纸过程中的微生物抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的、引起纸制品附着物的腐浆的方法，其包括：

采集纸制品上附着的附着物和造纸过程中产生的腐浆作为样本的样本采集步骤；

根据DNA碱基序列分析每个样本的微生物相的微生物分析步骤；

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述微生物分析步骤中分析的样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物有效的腐浆控制剂、从中选定腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

将上述腐浆控制剂选定步骤中选定的腐浆控制剂加入对象系统中的腐浆控制剂添加步骤；

该方法还进一步包括：通过附着物的微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物的比较，确定引起附着物的腐浆的发生场所的腐浆发生源确定步骤；

其中，在上述腐浆控制剂选定步骤中，以引起附着物的腐浆中的占优势微生物作为检索关键词检索数据库，挑选出腐浆控制剂；并且，

在上述腐浆控制剂添加步骤中，将腐浆控制剂在上述腐浆发生源确定步骤中确定的场所处加入。

6.抗菌处理方法，它是使用工业用抗菌剂进行抗菌处理的方法，其中：

从使用工业用抗菌剂的对象系统中采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对上述样本的微生物相、占优势微生物或特定微生物输入了有效浓度的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂并使用。

7.抗菌处理方法，它是使用工业用抗菌剂进行抗菌处理的方法，其中：

从使用工业用抗菌剂的对象系统中，定期或者在任意的时刻采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

将该分析结果与前一次的分析结果相比较，根据微生物相的变化监视工业用抗菌剂效果的变化，确认有对工业用抗菌剂有抗性的微生物出现的倾向时，通过对储存了针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选出对确认上述出现倾向的微生物输入了有效浓度的工业用抗菌剂，从中选定工业用抗菌剂，并使用。

8.权利要求6或7所述的抗菌处理方法，其中数据库中储存的针对微生物的工业用抗菌剂有效浓度数据是由每种微生物的培养试验所得的有效浓度、实际处理所得的有效浓度、或从文献所得的有效浓度。

9.权利要求6-8中任何一项所述的抗菌处理方法，其中数据库储存了在影响微生物生长的每种环境条件下，工业用抗菌剂对微生物的有效浓度数据，从指定的环境条件中挑选出工业用抗菌剂。

10.权利要求9所述的抗菌处理方法，其中影响微生物生长的环境条件是pH、温度或对象系统的种类。

11.权利要求6-10中任何一项所述的抗菌处理方法，其中数据库能够追加、储存和修正微生物的种类、工业用抗菌剂的种类和有效浓度、影响微生物生长的环境条件、以及实际处理的结果。

12.权利要求6-11中任何一项所述的抗菌处理方法，其中数据库，在输入对象系统使用的工业用抗菌剂浓度和工业用抗菌剂使用前后的微生物相的分析结果、以及实际处理的结果时，能够计算工业用抗菌剂使用前后的微生物相的各微生物量的差，并记录，由此计算结果，判定对于各微生物而言，工业用抗菌剂的浓度是否有效，并进行追加、储存和修正。

13.权利要求6-12中任何一项所述的抗菌处理方法，其中数据库，在输入对象系统使用的工业用抗菌剂浓度和工业用抗菌剂使用前后的微生物相的分析结果、以及实际处理的结果时，能够计算工业用抗菌剂使用前后的微生物相的各微生物量的差，由此计算结果，判定对于各微生物而言，工业用抗菌剂的浓度是否有效，将此由实际处理所得的判定结果，与由对象系统中含有的可培养微生物的培养试验结果所得的判定结果比较，判定工业用抗菌剂在实际处理中的效力是比培养试验中的效力过高、还是在正常范围、或是过低，并进行追加、储存和修正。

14.监测抗菌效果的方法，该方法包括：

在使用工业用抗菌剂的对象系统中，定期或在任意时刻，从对象系统采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

将此分析结果与前一次的分析结果比较，由微生物相的变化，监视工业用抗菌剂效果的变化。

15.监测抗菌效果的方法，该方法包括：

在使用工业用抗菌剂的对象系统中，定期或在任意时刻从对象系统采集含微生物的样本；

根据DNA碱基序列分析该样本的微生物相；

将此分析结果与前一次的分析结果比较，由微生物相的变化，监视工业用抗菌剂效果的变化，确认有对工业用抗菌剂具有抗性的微生物的出现倾向时，作出再选定工业用抗菌剂的判断。

16.造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2个以上场所采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本中的微生物相的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

将上述抗性判定步骤中判定为有抗性的微生物存在比率高的样本采集场所，判定为抗性微生物的发生源的发生源判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索关键词，通过对储存了针对微生物的腐浆控制剂的有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

在发生源判定步骤中判定的抗性微生物的发生源，加入腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

17.造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，该方法包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2个以上场所采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本中的微生物的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

求出上述每个样本中在抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物的存在比率，将抗性微生物的存在比率高的样本采集场所判定为抗性微生物发生源的发生源判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索关键词，通过对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

在发生源判定步骤中判定的抗性微生物的发生源中，加入腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

18.造纸过程的腐浆抑制方法，它是用腐浆控制剂抑制造纸过程中产生的腐浆的方法，其包括：

从使用腐浆控制剂抑制腐浆的造纸过程的2个以上场所采集样本，根据DNA碱基序列分析每个样本中的微生物相的微生物分析步骤；

判定微生物分析步骤中检出的微生物对现在使用的腐浆控制剂是否有抗性的抗性判定步骤；

以抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物作为检索关键词，通过对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，挑选对抗性微生物输入了有效浓度的腐浆控制剂，从中选定新的腐浆控制剂的腐浆控制剂选定步骤；以及

在抗性判定步骤中判定为有抗性的抗性微生物的存在比率高的样本采集场所中，加入腐浆控制剂选定步骤中选定的新的腐浆控制剂的发生源处理剂添加步骤。

19.权利要求16-18中任何一项所述的腐浆抑制方法，其中抗性判定步骤中，以微生物分析步骤中检出的微生物或现在使用的腐浆控制剂作为检索关键词，通过对储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，在现在使用的腐浆控制剂对检索对象微生物的有效浓度被记录的场合，判定为检索对象微生物对现在使用的腐浆控制剂无抗性，未记录有效浓度的场合，判定为有抗性。

20.权利要求16-19中任何一项所述的腐浆抑制方法，其中微生物分析步骤中采集样本的场所为选自纸浆原料制备系统、碎纸系统、造纸药剂制备系统、纸浆制备系统、白水循环系统和白水回收系统中的2个以上场所。

21.造纸过程中的微生物控制方法，它包括：

从在造纸过程中附着在产品上的附着物提取来源于微生物的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，

用储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，和

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中。

22.造纸过程中的微生物控制方法，它包括：

从造纸过程中附着在产品上的附着物提取微生物来源的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，

将此微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，由此而确定引起附着物的腐浆，

用储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，和

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中。

23.造纸过程中的微生物控制方法，该方法包括：

从造纸过程中附着在产品上的附着物提取微生物来源的DNA，

用所得的DNA碱基序列作为指标，分析附着物的微生物相或占优势微生物，

将此微生物相或占优势微生物与造纸过程中产生的腐浆的微生物相或占优势微生物比较，由此确定引起附着物的腐浆的发生场所，

用储存了针对微生物的腐浆控制剂有效浓度数据的数据库进行检索，

挑选对所述微生物相或占优势微生物有效的腐浆控制剂，

从中选定腐浆控制剂，

将该选定的腐浆控制剂加入到对象系统中，和

对如此确定的腐浆发生场所进行杀菌·防腐处理。

24.权利要求21-23中任何一项所述的方法，其中用于分析微生物相或占优势微生物的DNA是编码核糖体RNA的DNA。

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