JP6514549B2 - 微生物叢解析システム、判定システム、微生物叢解析方法及び判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、水処理を行う活性汚泥に含まれる微生物叢を解析する微生物叢解析システム及び微生物叢解析方法、並びにそれらに関連する判定システム及び判定方法に関する。

化学や鉄鋼といった重化学工業等における排水は、ヒトや環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出することが望まれている。そのための排水処理として、複合微生物系である活性汚泥が用いられた生物処理が行われている。適切に排水処理を行うため、活性汚泥に含まれる微生物の集合である微生物叢の状態（健康状態）を管理することが必要となる。例えば、特許文献１には、微生物叢の状態を管理するため、Ｔ−ＲＦＬＰ法により微生物叢の遺伝子を解析して、多次元空間上に微生物叢の状態をプロットすることが示されている。

特許第３９２８４９２号明細書

特許文献１に記載された方法でプロットされた座標は、フラグメント化した遺伝子の電気泳動による解析に基づくものである。電気泳動による解析は、定量的にも定性的にも精度が必ずしも高くはない。従って、プロットされた微生物の状態を示す座標についても、必ずしも正確ではないというおそれがある。即ち、特許文献１に記載された方法は、十分に精度よく微生物叢を解析できているとはいえない。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、水処理を行う活性汚泥に含まれる微生物叢を精度よく解析することができる微生物叢解析システム及び微生物叢解析方法、並びにそれらに関連する判定システム及び判定方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係る微生物叢解析システムは、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を複数入力する入力手段と、入力手段によって入力されたデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、データ群間の類似度を算出する類似度算出手段と、類似度算出手段によって算出された類似度に基づいて、データ群それぞれの多次元空間上の座標を算出する座標算出手段と、を備える。

本発明に係る微生物叢解析システムでは、微生物叢を構成する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列に基づいて、多次元空間上の座標が算出される。塩基配列に基づく解析は、電気泳動による解析と比べて定量的にも定性的にも精度が高い。従って、本発明に係る微生物叢解析システムによって算出された座標は、電気泳動による解析を用いた場合と比べて、精度よく微生物叢の状態を表したものである。即ち、本発明に係る微生物叢解析システムによれば、微生物叢を精度よく解析することができる。

微生物叢解析システムは、座標算出手段によって算出された座標に基づいて、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する判定ルール生成手段を更に備える。この構成によれば、例えば、微生物叢が正常な状態（健康な状態）であるか否かを判定するための判定ルールを生成することができる。上記のように本発明に係る微生物叢解析システムによって算出された座標は精度よく微生物叢の状態を表したものであるため、この判定ルールによれば、精度よく判定を行うことができる。

入力手段は、複数の微生物それぞれの存在割合を示す情報も含むデータ群を入力し、類似度算出手段は、入力手段によって入力されたデータ群に含まれる存在割合を示す情報にも基づいて、データ群間の類似度を算出する、こととしてもよい。この構成によれば、更に座標を精度よく微生物叢の状態を表すことができる。

微生物叢解析システムは、活性汚泥中に存在する複数の微生物から遺伝子の塩基配列を読み取る読取手段と、読取手段によって読み取られた遺伝子の塩基配列に基づきデータ群を生成して入力手段に入力させるデータ生成手段と、を更に備えることとしてもよい。この構成によれば、塩基配列を示す情報を含むデータ群を確実に入力することができ、確実に本発明を実施することができる。

本発明に係る判定システムは、本発明に係る微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定する判定システムであって、判定対象となる複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を入力する入力手段と、入力手段によって入力された判定対象のデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、当該判定対象のデータ群と判定ルールの生成に用いられたデータ群との類似度を算出する類似度算出手段と、類似度算出手段によって算出された類似度に基づいて、判定対象のデータ群の多次元空間上の座標を算出する座標算出手段と、微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、座標算出手段によって算出された判定対象のデータ群の座標から複数の微生物の状態を判定する判定手段と、を備える。本発明に係る判定システムによれば、微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づいた判定を行うことができる。

ところで、本発明は、上記のように微生物叢解析システム及び判定システムの発明として記述できる他に、以下のように微生物叢解析方法及び判定方法の発明としても記述することができる。これはカテゴリが異なるだけで、実質的に同一の発明であり、同様の作用及び効果を奏する。

即ち、本発明に係る微生物叢解析方法は、微生物叢解析システムの動作方法である微生物叢解析方法であって、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を複数入力する入力ステップと、入力ステップにおいて入力されたデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、データ群間の類似度を算出する類似度算出ステップと、類似度算出ステップにおいて算出された類似度に基づいて、データ群それぞれの多次元空間上の座標を算出する座標算出ステップと、を含む。微生物叢解析方法は、座標算出ステップにおいて算出された座標に基づいて、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する判定ルール生成ステップを更に含む。

また、本発明に係る判定方法は、本発明に係る微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定する判定システムの動作方法である判定方法であって、判定対象となる複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を入力する入力ステップと、入力ステップにおいて入力された判定対象のデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、当該判定対象のデータ群と判定ルールの生成に用いられたデータ群との類似度を算出する類似度算出ステップと、類似度算出ステップにおいて算出された類似度に基づいて、判定対象のデータ群の多次元空間上の座標を算出する座標算出ステップと、微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、座標算出ステップにおいて算出された判定対象のデータ群の座標から複数の微生物の状態を判定する判定ステップと、を含む。

本発明では、微生物叢を構成する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列に基づいて、多次元空間上の座標が算出される。塩基配列に基づく解析は、電気泳動による解析と比べて定量的にも定性的にも精度が高い。従って、本発明に係る微生物叢解析システムによって算出された座標は、電気泳動による解析を用いた場合と比べて、精度よく微生物叢の状態を表したものである。即ち、本発明によれば、微生物叢を精度よく解析することができる。

本発明の実施形態に係る微生物叢解析システムの構成を示す図である。 算出された２次元空間上の座標の例を示すグラフである。 算出された３次元空間上の座標の例を示すグラフである。 本発明の実施形態に係る微生物叢解析システムで判定ルールの生成時に実行される処理（微生物叢解析方法）を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係る微生物叢解析システムで判定時に実行される処理（判定方法）を示すフローチャートである。

以下、図面と共に本発明に係る微生物叢解析システム、判定システム、微生物叢解析方法及び判定方法の実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

図１に、本実施形態に係る微生物叢解析システム１を示す。微生物叢解析システム１は、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物の集合である微生物叢（細菌叢）の状態を定量化して、管理するものである。本実施形態で対象とする水処理は、例えば、産業排水や公共の下水、汚水等の自然環境に対して害となる水を自然環境に対する影響を小さくするための処理である。また、当該水処理は、微生物叢を含む活性汚泥が用いられた水処理システムで行われるものである。活性汚泥に含まれる微生物の種類の数は、通常、数千〜数万以上である。また、当該活性汚泥は、通常、生物反応槽（バイオタンク、活性汚泥槽）に入れられており、処理対象の水を当該生物反応槽内に流入させることで水処理が行われる。生物反応槽には、通常、好気槽及び嫌気槽が含まれる。当該水処理は、例えば、工場の稼働に応じて継続的に行われるものである。なお、当該水処理自体は、従来から行われているものである。

微生物叢解析システム１は、微生物叢の状態の定量化として、微生物叢の状態を示す多次元空間上の座標を算出する。この座標は、複数の微生物叢の状態間での類似度（類似性、β−ダイバーシティー）に基づいて、相対的に決まるものである。２つの微生物叢の状態を示す座標が、互いに近ければそれらの状態は近いことを意味している。２つの微生物叢の状態を示す座標が、互いに遠ければそれらの状態は遠いことを意味している。本実施形態における微生物叢の状態は、少なくとも微生物叢における微生物の構成（どの微生物が微生物叢に含まれているか）が反映されたものである。

この座標によって微生物叢の状態を管理することができる。例えば、水処理が正常に行われている（即ち、水処理後の水の自然環境に対する影響が十分に小さくなっている）活性汚泥での微生物叢の状態、即ち、健康な状態である微生物叢の状態を示す座標を予め記憶しておく。状態が分からない微生物叢の状態を示す座標を算出して、健康な状態である微生物叢の状態を示す座標と比較することで、微生物叢の状態を判定することができる。

微生物叢解析システム１は、微生物叢の状態を示す座標を用いて、微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する。また、微生物叢解析システム１は、生成した判定ルールを用いて、判定も行う。

微生物叢解析システム１は、図１に示すようにコンピュータ１０と、シークエンサー２０とを含んで構成される。コンピュータ１０は、微生物叢解析システム１の主要な機能を担う装置であり、座標の算出、判定ルールの生成及び判定ルールを用いた判定を行う装置である。コンピュータ１０は、具体的には、ＣＰＵ（Central Processing Unit）やメモリ、通信モジュール等のハードウェアを備えている。これらの構成要素がプログラム等によって動作することによって、後述するコンピュータ１０の機能が発揮される。

シークエンサー２０は、活性汚泥中に存在する複数の微生物から遺伝子の塩基配列を読み取る（決定する）読取手段である。シークエンサー２０として、複数の微生物の遺伝子を同時に読み取る（解析）することができる、いわゆる次世代シークエンサーを用いることとしてもよい。シークエンサー２０としては、従来のシークエンサー、例えば、ロシュ社製ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ Ｓｙｓｔｅｍシークエンサー、ロシュ社製ＧＳ ＦＬＸ＋ Ｓｙｓｔｅｍシークエンサー、あるいはイルミナ社製ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍシークエンンサーを用いることとしてもよい。また、シークエンサー２０は、微生物の遺伝子の塩基配列として、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を読み取ることとしてもよい。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、微生物の種別毎に比較的、特徴的な配列であるからである。なお、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を読み取るため、活性汚泥から採取されてシークエンサー２０に入力されるシークエンス用サンプル（汚泥サンプル）は予め調製される。活性汚泥は、例えば、好気槽及び嫌気槽のそれぞれから採取される。シークエンス用サンプルの調製、及び塩基配列の読み取り（シークエンシング）は、例えば、以下のように行うことができる。

［微生物叢のＤＮＡの調製］
活性汚泥から約１．５ｍｌの微生物群を含む溶液を採取し、室温で遠心する（１３，０００ｒｐｍ×５分間）。上清を取り除いた後、滅菌生理食塩水を１ｍｌ加えて、５秒間ほど転倒混合した後、室温で遠心する（１３，０００ｒｐｍ×５分間）。上清を除いた後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（エイエムアール社製）を３００μｌ加え、よく混合した後、得られた懸濁液をビーズの入ったチューブ（イージーエクストラクト ｆｏｒ ＤＮＡ（エイエムアール社製））に添加後、ボルテックスミキサーで２分間撹拌破砕する。破砕液に３００μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ）を添加し、４℃で遠心する（１３，０００ｒｐｍ×５分間）。その後、上清液４５０μｌを新しいチューブに入れ、これに６００μｌのフェノール混合液（イージーエクストラクト ｆｏｒ ＤＮＡに付属（エイエムアール社製））を加え、１分間ボルテックスし攪拌した後、４℃で遠心する（１３，０００ｒｐｍ×５分間）。上清３００μｌを回収して新しいチューブ（１．５ｍｌ）に入れ、これに１２００μｌのエタノール（９９．５％）を加えて、４℃で遠心する（１３，０００ｒｐｍ×５分間）。上清を除いた後、１０００μｌの冷エタノール（７０％）を加えて、４℃で遠心し（１３，０００ｒｐｍ×５分間）、得られたＤＮＡペレットを真空乾燥し、ついで１５０μｌのＴＥを加えて、細菌叢ＤＮＡの溶液とする。

［１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域のＰＣＲ増幅］
細菌叢ＤＮＡの溶液中の二本鎖ＤＮＡ濃度を測定し、その測定値に基づいて５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として、ユニバーサルプライマーセット（フォワードプライマーｆｗ３５７Ｆ（配列番号１）とリバースプライマーＲＶ９２６ｒ（配列番号２））を用いて、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（以下、１６Ｓ遺伝子）のＶ３−Ｖ４領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲはタカラバイオ社製の「Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ」（登録商標）を用いて、各プライマーを５０ｐｍｏｌ含む反応液５０μｌを作成し、９４℃で２分間のプレヒーティングを行った後、変性、アニーリング、伸長をそれぞれ９８℃×１０秒間、５０℃×３０秒間、７２℃×８０秒間で行い２５サイクル繰り返す。

下記にフォワードプライマーＨＡ１３６２１−ｆｗ３５７Ｆの配列の構造を示す。このフォワードプライマーは、シークエンサー２０での配列決定に必要なアダプターＡ配列（大文字で表記）を５’末端側に含み、各検体に固有の１０塩基のバーコード配列をはさんで、全ての真正細菌の１６Ｓ遺伝子にアニーリングするユニバーサルプライマー配列ｆｗ３５７Ｆ（小文字で表記）を３’末端側に含む。上記バーコード配列はサンプル間の識別に利用するもので、同時にシークエンサー２０に供するサンプル数に対応した任意に設計した塩基配列である。
アダプターＡ配列（配列番号３）
５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’
ユニバーサルプライマー配列ｆｗ３５７Ｆ（配列番号１）
５’−ｃｃｔａｃｇｇｇａｇｇｃａｇｃａｇ−３’

上記バーコード配列の役割を説明する。例えば、１０検体を同時解析する場合は、１０通りの異なったバーコード配列をもったＨＡ１３６２１−ｆｗ３５７Ｆを作り、それぞれを各検体に対してＰＣＲ増幅すればよい。これらを混合してシークエンサー２０に供すると、１稼働で１００万データを得ることができるＧＳ ＦＬＸ＋ Ｓｙｓｔｅｍシークエンサーを利用した場合、１００検体に対応する１００通りのバーコード配列を用いることで、１回の稼働で１万データ／検体の配列データを得ることができる。

下記にリバースプライマーＨＡ１３６１９−ＲＶ９２６ｒの配列の構造を示す。このリバースプライマーは、シークエンサー２０での配列決定に必要なアダプターＢ配列（大文字で表記）を５’末端側に含み、全ての真正細菌の１６Ｓ遺伝子にアニーリングするユニバーサルプライマー配列ＲＶ９２６ｒ（小文字で表記）を３’末端側に含む。
ＨＡ１３６１９−ＲＶ９２６ｒの配列（配列番号４）
５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧｃｃｇｔｃａａｔｔｃｃｔｔｔｔｒａｇｔｔｔ−３’

上記のユニバーサルプライマーセットを用いたＰＣＲにより、細菌叢を構成する種々の細菌種の１６Ｓ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を含むＤＮＡ（約５７０塩基）が増幅され、それらの混合物をそのＰＣＲ産物ＤＮＡとして得ることができる。

［ＰＣＲ産物の生成及びシークエンス用サンプルの調製］
各々の細菌叢ＤＮＡから得られたＰＣＲ産物ＤＮＡ（その細菌叢を構成する種々の細菌種の１６Ｓ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を含むＤＮＡの混合物）を混合し、ＤＮＡクリーナー（和光純薬社製）にて処理して、過剰のプライマーや基質のヌクレオチド等を除去し、精製する。精製ＤＮＡは２００μｌのＴＥで溶出し回収する。ついで、回収した精製ＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン社製）にて抽出し、シークエンサー２０に供するＤＮＡを調製する。これを以下のシークエンスに用いるシークエンス用サンプルとする。

［１６Ｓ遺伝子のシークエンシングと配列データの精度評価］
上記シークエンス用サンプルを、シークエンサー２０であるロシュ社製ＧＳ ＦＬＸ＋ Ｓｙｓｔｅｍシークエンサーに供しシークエンスを行う。シークエンスの条件・工程等はメーカー所定のプロトコールに従う。なお、このシークエンサーでは、上記で調製したＰＣＲ産物ＤＮＡの１分子を１つのビーズに固定して、ついで、水（シークエンス用鋳型ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー、基質ヌクレオチド、ＤＮＡ合成酵素を含む）と油のエマルジョン中に独立して形成された微小水滴の１つ１つに１つ１つのビーズを捕獲して、その中でＰＣＲを行ってシークエンス用鋳型ＤＮＡを増幅して調製するようになっている。よって、この増幅した鋳型ＤＮＡが固定された各ビーズをタイタープレート上に区画した後に、その区画位置上でシークエンス反応のシグナルを読み取ることによって、上記シークエンス用サンプル中に含まれるＰＣＲ産物ＤＮＡ（その細菌叢を構成する種々の細菌種の１６Ｓ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を含むＤＮＡの混合物）の塩基配列を無作為に決定することができる。また、フォワードプライマーＨＡ１３６２１−ｆｗ３５７Ｆ中の上記バーコード配列を、各サンプルに由来する検体ごとに特徴的な任意の配列にしておけば、ＧＳ ＦＬＸ＋ Ｓｙｓｔｅｍシークエンサーを用いて約１００種類の細菌叢サンプルを同時解析でき、ある活性汚泥由来のサンプルにつき２，０００〜１０，０００の１６Ｓ遺伝子の配列データを、およそ１０〜２３時間で決定することができる。即ち、活性汚泥に含まれる細菌叢について菌種を限定せずに網羅的に解析することが可能となる。

以上が、シークエンス用サンプルの調製、及び塩基配列の読み取りを行う方法の一例である。なお、シークエンス用サンプルの調製、及び塩基配列の読み取りは、上記の方法以外で行われてもよい。シークエンサー２０と、コンピュータ１０とは、情報の送受信が行えるように接続されている。シークエンサー２０は、読み取った微生物毎の塩基配列を示す情報（配列情報）をコンピュータ１０に送信する。ここで、コンピュータに送信される配列情報は、シークエンサー２０にシークエンシングされたそのままの配列のデータ、いわゆる粗配列データである。

引き続いて、本実施形態に係るコンピュータ１０の機能について説明する。図１に示すようにコンピュータ１０は、データ生成部１１と、入力部１２と、類似度算出部１３と、座標算出部１４と、判定ルール生成部１５と、判定部１６とを備えて構成される。

データ生成部１１は、シークエンサー２０によって読み取られた活性汚泥中に存在する複数の微生物の塩基配列をシークエンサー２０から受信し、当該塩基配列に基づき座標を算出するためのデータを生成するデータ生成手段である。座標を算出するためのデータは、微生物の種別（微生物種、菌種）毎の、活性汚泥中に存在する微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群である。１つのデータ群は、１つの微生物叢に対応するものであり、同一の生物反応槽に入れられた活性汚泥について、同一のタイミングでの活性汚泥中に存在する微生物の全種別それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含む。但し、厳密にその全種別の塩基配列を把握することは困難である場合等には、厳密にその全種別の塩基配列を示す情報を含む必要はなく、座標の算出に必要な程度の塩基配列を含んでいればよい。

座標を算出するためのデータとしては、複数の上記のデータ群を必要とする。例えば、同一の生物反応槽に入れられた活性汚泥について、異なる複数のタイミングでの活性汚泥それぞれに係るデータ群を、座標を算出するための複数のデータ群とする。例えば、複数のデータ群は、１週間毎の複数週の微生物叢の塩基配列のデータである。即ち、１週間毎に活性汚泥から微生物群を含む溶液を採取し、データ群を生成する。あるいは、互いに異なる生物反応槽に入れられた活性汚泥それぞれに係るデータ群を、座標を算出するための複数のデータ群としてもよい。

各データ群には、微生物の種別毎の塩基配列のみが含まれていてよいが、微生物それぞれの存在割合（存在確率）のデータが含まれていてもよい。この存在割合は、微生物の種別（微生物種、菌種）毎の、活性汚泥に含まれる全微生物の数に対する、当該活性汚泥に含まれる当該種別の微生物の数の割合である。但し、厳密にその割合を把握することは困難である場合等には、厳密に全微生物の数に対する数の割合である必要である必要はなく、座標の算出に必要な程度に近似した割合であればよい。

例えば、データ生成部１１は、以下のように当該データの生成を行う。データ生成部１１は、シークエンサー２０から粗配列データを受信する。なお、シークエンサー２０から受信する粗配列データは、複数のデータ群に係るデータ、例えば、複数のタイミングの活性汚泥に係るデータであるものとする。即ち、そのようなデータが得られるようにシークエンサー２０によるシークエンシングを行う。

データ生成部１１は、得られた粗配列データ（例えば、上記の例では約５７０塩基／データ）について、配列データに含まれるサンプル固有のバーコード配列に基づき、各配列をそれぞれの固有のサンプル（複数のデータ群のそれぞれのデータ群に相当）に分配する。データ生成部１１は、当該配列データの配列長２００未満、１０００以上、ユニバーサルプライマー配列（ｆｗ３５７Ｆ）とのミスマッチ１以上、シークエンサーに付属のクオリティプログラムを用いて、配列決定した塩基配列の平均クオリティ値が２５以下の配列データを除去して、高精度データを抽出する。

データ生成部１１は、取得した高精度配列データを、クラスタリング（類似度９５％、９７％、又は９９％の閾値）によるＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ解析（以下、ＯＴＵ解析）に供する。ＯＴＵ解析においては、配列データの類似度を基準にして各配列データをグループ化する操作を行う。ここでは９５％以上の配列類似度を互いに有する配列データのクラスターグループ（以下、ＯＴＵ）を検出する。なお、配列データのクラスタリングは、従来技術、例えば、フリーウェアＵｃｌｕｓｔを用いて行うことができる。各ＯＴＵはほぼ同じ種の細菌（微生物）に由来すると推測できる。よって、クラスタリングによって得られるＯＴＵの総数（ＯＴＵ数）は、検出可能な範囲において、その細菌叢（微生物叢）を構成する細菌種（微生物種）の数と等価と考えることができる。データ生成部１１は、各クラスターグループを代表する塩基配列である代表配列データを決定する。代表配列データの決定は、従来から用いられている方法により行うことができる。

また、各ＯＴＵ中に含まれる配列データ数からは、配列データ数全体中の各ＯＴＵの割合、つまり菌種組成比、即ち、上記の存在割合を求めることができる。更に、各ＯＴＵの代表配列データについて上記した１６Ｓ遺伝子及び細菌ゲノムのデータベースへの相同性検索を行うことにより、最も高い配列類似度を有する既知菌種へ帰属、つまり、ＯＴＵの菌種を特定できる。なお、本実施形態では菌種の特定は必ずしも必要がないが、具体的にどの菌種の細菌が活性汚泥に含まれるか否かを把握できるため、判定結果の解析等において有益となる。なお、データ群に含まれる、配列データ数（配列数のカウント）が非常に少ない（例えば、１、２又は３）ＯＴＵ（クラスターグループ）については、有効な情報でない場合が多く、計算上のノイズとなる場合があるので、予めデータ群のデータから外すこととしてもよい。

データ生成部１１は、上記の各クラスターグループの代表配列データを、データ群を構成する塩基配列とする。また、データ生成部１１は、上記の細菌種（塩基配列）毎の存在割合を各データ群について算出し、データ群に微生物それぞれの存在割合（存在確率）のデータとして含めてもよい。データ生成部１１は、生成した複数のデータ群を入力部１２に出力する。

入力部１２は、上記のデータ群を複数、データ生成部１１から入力する入力手段である。入力部１２は、入力したデータ群を類似度算出部１３に出力する。

類似度算出部１３は、入力部１２によって入力されたデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、データ群間の類似度を算出する類似度算出手段である。また、データ群に微生物それぞれの存在割合のデータが含まれている場合には、類似度算出部１３は、当該存在割合を示す情報にも基づいて、データ群間の類似度を算出することとしてもよい。類似度は、例えば、データ群に含まれる微生物の塩基配列自体、及び微生物の塩基配列の構成（どのような塩基配列がどの存在割合で含まれているか）が互いに類似していると高くなる。類似度算出部１３は、２つのデータ群間の間での類似度を算出する。また、類似度算出部１３は、全てのデータ群の組み合わせについて類似度を算出する。

類似度の算出は、従来から用いられている方法、例えば、ＵｎｉＦｒａｃ解析により行うことができる。ＵｎｉＦｒａｃ解析は、塩基配列のデータ群から構成される任意の複数群ついて、各群に属する塩基配列（各ＯＴＵに属する代表塩基配列）同士の類似度と配列数から、各群間の類似度を数値化する手法である（Lozupone C and Knight R: UniFrac：a newphylogenetic method for comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol71：8228-8235（2005））。ＵｎｉＦｒａｃ解析は、例えば、コロラド大学から提供されているフリーウェアＵｎｉｆｒａｃを用いて行うことができる。

ＵｎｉＦｒａｎ解析によって得られる類似度は、系統樹上での系統距離(ＵｎｉＦｒａｃ Ｄｉｓｔａｎｃｅ)（以下、群間類似距離）として算出される。群間類似距離は、データ群間の類似度が高いほど、小さい値となる。類似度算出部１３は、算出したデータ群間の類似度である群間類似距離の値を座標算出部１４に出力する。また、類似度算出部１３は、判定ルールによる判定を行うため、類似度の算出に用いた情報を記憶しておく。なお、類似度の算出は、必ずしもＵｎｉＦｒａｃ解析によって行われる必要はなく、複数の塩基配列を含むデータ群間の類似度を算出できるものであれば、どのような手法によって行われてもよい。

座標算出部１４は、類似度算出部１３によって算出された類似度に基づいて、データ群それぞれの多次元空間上の座標を算出する座標算出手段である。ここで算出される座標は、それぞれのデータ群に対応する上述した微生物叢の状態を示す座標である。類似するデータ群の座標は近くなり、類似していないデータ群の座標は遠くなるように算出される。算出する座標の次元の数は、予め座標算出部１４に設定されて記憶されている。例えば、２次元、又は３次元の座標を算出する。２次元、又は３次元の座標とすることで、図示することが可能となり、微生物叢の状態を視覚的に確認することが可能となる。

座標の算出は、従来から用いられている方法、例えば、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）により行うことができる。多次元尺度構成法は、対象についての任意の基準の類似度を元にして、その対象を多次元空間上に座標として布置する手法である。多次元尺度構成法は、例えば、フリーウェア（Ｒ等）や市販のプログラムを用いて行うことができる。なお、座標の算出は、必ずしも多次元尺度構成法によって行われる必要はなく、類似度に基づいて座標を算出できるものであれば、どのような手法によって行われてもよい。

算出された座標を図示したグラフの例を図２（ａ）及び図３に示す。図２（ａ）は、２次元空間上に座標をプロットしたものである。図３は、３次元空間上に座標をプロットしたものである。図２における正方形及び三角形で示される個々の座標、及び図３における丸で示される個々の座標が、個々のデータ群、即ち、個々の微生物叢の状態に対応する。座標算出部１４は、算出した座標を示す情報を判定ルール生成部１５に出力する。また、類似度算出部１３は、判定ルールによる判定を行うため、座標の算出に用いた情報を記憶しておく。

判定ルール生成部１５は、座標算出部１４によって算出された座標に基づいて、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する判定ルール生成手段である。判定ルールは、例えば、当該複数の微生物、即ち、微生物叢が正常に水処理を行えるか否かを判定するものである。正常に水処理が行えるとは、例えば、処理後の水が、水処理後の水の自然環境に対する影響が十分に小さくなっているような一定の基準を満たすものである。更に具体的には、処理対象となっている特定の化学物質を一定以上の割合で処理（分解）できるものである。

判定ルールは、判定対象となる微生物叢を構成する微生物それぞれの遺伝子の塩基配列に基づく座標を用いて判定するものである。即ち、判定ルールは、上記の座標の算出に用いたデータ群と同様の形式のデータ群に基づく情報を用いて判定するものである。

判定ルール生成部１５が判定ルールを生成するにあたって、例えば、予め、座標算出部１４によって算出される座標に係る微生物叢を、正常に水処理が行えている微生物叢としておく。即ち、座標算出部１４によって算出される座標の集合は、正常に水処理が行えている微生物叢の集合に相当するものである。判定ルール生成部１５は、判定ルールとして、正常に水処理が行えている微生物叢に係る座標の集合から推定される、正常に水処理が行えている微生物叢に係る座標が含まれる範囲を決定する。判定は、判定対象となる微生物叢に係る座標が当該範囲に含まれているか否かを判断することで行うことができる。判定対象となる微生物叢に係る座標が当該範囲に含まれていれば、判定対象となる微生物叢は、正常に水処理が行える微生物叢であると判定される。一方、判定対象となる微生物叢に係る座標が当該範囲に含まれていなければ、判定対象となる微生物叢は、正常に水処理が行える微生物叢ではない可能性があると判定される。

判定ルール生成部１５は、正常に水処理が行えている微生物叢に係る複数の座標から、例えば、統計的に一定以上の確率（例えば、９５％）で当該複数が含まれると推定とされる範囲（例えば、信頼９５％区間）を、判定ルールとしての範囲として算出する。信頼９５％の算出は、従来から用いられている統計的な方法により行うことができる。信頼９５％の算出は、例えば、フリーウェア（Ｒ等）や市販のプログラムを用いて行うことができる。

あるいは、判定ルール生成部１５が判定ルールを生成するにあたって、例えば、予め、座標算出部１４によって算出される座標に係る微生物叢を、正常に水処理が行えている微生物叢及び正常に水処理が行えていない微生物叢の両方を含むものとし、コンピュータ１０においてそれらを区別できるようにしておく。判定ルール生成部１５は、判定ルールとして、正常に水処理が行えている微生物叢に係る座標が含まれる領域と、正常に水処理が行えていない微生物叢に係る座標が含まれる領域とを最もよく区分する境界を算出することとしてもよい。この判定ルールによれば、判定対象となる微生物叢に係る座標が何れの領域に含まれているかによって判定を行うことができる。当該境界の算出は、従来から用いられている統計的又は数理的な方法により行うことができる。

また、判定ルール生成部１５は、機械学習によって判定ルールを生成することとしてもよい。判定ルール生成部１５は、生成した判定ルールを示す情報を判定部１６に出力する。

判定部１６は、判定ルール生成部１５によって生成された判定ルールに基づき、判定対象の微生物叢の状態を判定する判定手段である。上記のように、判定ルールは、判定対象の微生物叢に係る座標から、当該判定対象の微生物叢の状態を判定するためのものである。即ち、判定部１６は、判定対象の微生物叢に係る座標を示す情報を入力し判定を行う。判定対象は、（判定を行いたいタイミングでの）水処理システムの活性汚泥に含まれる微生物叢である。判定対象の微生物叢は、判定ルールの生成に用いたデータ群を取得した水処理システムと同一の（かつ異なるタイミングでの）水処理システムの活性汚泥に含まれる微生物叢とすることができる。但し、判定対象の微生物叢は、判定ルールの生成に用いたデータ群を取得した水処理システム以外の水処理システムの活性汚泥に含まれる微生物叢であってもよい。

判定対象の微生物叢に係る座標は、判定ルールの生成時の個々のデータ群の座標と同様に求められる。即ち、座標の算出は、以下のように行われる。シークエンサー２０が、判定対象の微生物叢を構成する複数の微生物から遺伝子の塩基配列を読み取る。シークエンサー２０は、読み取った、判定対象となる複数の微生物毎の塩基配列を示す情報（配列情報）をコンピュータ１０に送信する。

コンピュータ１０では、データ生成部１１が、シークエンサー２０から配列情報を受信し、当該配列情報から、判定対象となる複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を生成する。

データ生成部１１は、生成した判定対象の微生物の塩基配列を示す情報を含むデータ群を入力部１２に出力する。入力部１２は、当該データ群を入力して、類似度算出部１３に出力する。類似度算出部１３は、当該データ群を入力して、当該データ群と、判定ルールの生成の際に用いられた個々のデータ群との間の類似度を算出する。類似度算出部１３は、算出した類似度を座標算出部１４に出力する。座標算出部１４は、類似度算出部１３から入力した情報によって示される類似度に基づいて、判定対象のデータ群の多次元空間上の座標を算出する。類似度の算出及び座標の算出は、判定ルールの生成時と同様に行われる。座標算出部１４は、判定対象のデータ群の座標を示す情報を判定部１６に出力する。

判定部１６は、判定ルールに基づいて、座標算出部１４から入力した情報によって示される座標を用いて判定を行う。例えば、判定部１６は、上記のように判定対象となる座標が信頼９５％区間に含まれているか否かを判断する。判定対象となる座標が信頼９５％区間に含まれていると判断された場合、判定部１６は、判定対象となる微生物叢は、正常に水処理が行える微生物叢であると判定する。判定対象となる座標が信頼９５％区間に含まれていないと判断された場合、判定部１６は、判定対象となる微生物叢は、正常に水処理が行える微生物叢ではない可能性があると判定する。

判定部１６は、判定結果を出力する。判定結果の出力は、例えば、コンピュータ１０が備えるディスプレイ等の表示装置で表示することで行われる。また、判定結果の出力は、例えば、他の装置やコンピュータ１０内の他のモジュールに送信することで行われてもよい。以上が、本実施形態に係るコンピュータ１０の機能である。

引き続いて、図４及び図５のフローチャートを用いて、本実施形態に係る微生物叢解析システム１で実行される処理（微生物叢解析システム１の動作方法）である微生物叢解析方法及び判定方法を説明する。まず、図４のフローチャートを用いて、判定ルールの生成時に実行される処理を説明する。本処理では、まず、シークエンサー２０によって、水処理システムで用いられる微生物叢を構成する微生物の遺伝子の塩基配列が読み取られる（Ｓ０１、読取ステップ）。ここでは、複数のタイミングでの、微生物叢を構成する微生物の遺伝子の塩基配列が読み取られる。読み取られた塩基配列のデータは、シークエンサー２０からコンピュータ１０に出力される。

コンピュータ１０では、データ生成部１１によって、シークエンサー２０から送信された塩基配列のデータが受信される。続いて、データ生成部１１によって、塩基配列のデータに基づき、複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群が複数生成される（Ｓ０２、データ生成ステップ）。続いて、生成された複数のデータ群やこれまでに生成されたデータ（以前に生成した複数のタイミングでの、微生物叢を構成する微生物の遺伝子の塩基配列塩基配列のデータに基づき、複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群）がデータ生成部１１から、入力部１２に入力される（Ｓ０３、入力ステップ）。

入力された複数のデータ群は、入力部１２から類似度算出部１３に出力される。続いて、類似度算出部１３によって、データ群間の類似度が算出される（Ｓ０４、類似度算出ステップ）。算出されたデータ群間の類似度を示す情報は、類似度算出部１３から座標算出部１４に出力される。

続いて、座標算出部１４によって、類似度算出部１３によって算出された類似度に基づいて、データ群それぞれの多次元空間上の座標が算出される（Ｓ０５、座標算出ステップ）。算出された座標を示す情報は、座標算出部１４から判定ルール生成部１５に出力される。続いて、判定ルール生成部１５によって、類似度算出部１３から入力された情報によって示される座標に基づいて、判定ルールが生成される（Ｓ０６、判定ルール生成ステップ）生成された判定ルールを示す情報は、判定ルール生成部１５から判定部１６に出力される。以上が、判定ルールの生成時に実行される処理である。

引き続いて、図５のフローチャートを用いて、判定時に実行される処理を説明する。本処理では、まず、シークエンサー２０によって、判定対象のタイミングでの、水処理システムで用いられる微生物叢を構成する微生物の遺伝子の塩基配列が読み取られる（Ｓ１１、読取ステップ）。読み取られた塩基配列のデータは、シークエンサー２０からコンピュータ１０に出力される。

コンピュータ１０では、データ生成部１１によって、シークエンサー２０から送信された塩基配列のデータが受信される。続いて、データ生成部１１によって、塩基配列のデータに基づき、塩基配列のデータに基づき、複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含む判定対象のデータ群が生成される（Ｓ１２、データ生成ステップ）。続いて、生成されたデータ群がデータ生成部１１から入力部１２に入力される（Ｓ１３、入力ステップ）。

入力された判定対象のデータ群は、入力部１２から類似度算出部１３に出力される。続いて、類似度算出部１３によって、判定対象のデータ群と、判定ルールの生成の際に用いられた個々のデータ群との間の類似度が算出される（Ｓ１４、類似度算出ステップ）。算出されたデータ群間の類似度を示す情報は、類似度算出部１３から座標算出部１４に出力される。

続いて、座標算出部１４によって、類似度算出部１３によって算出された類似度に基づいて、判定対象のデータ群の多次元空間上の座標が算出される（Ｓ１５、座標算出ステップ）。算出された判定対象の座標を示す情報は、座標算出部１４から判定部１６に出力される。

続いて、判定部１６によって、判定ルール生成部１５によって生成された判定ルールに基づき、座標算出部１４によって算出された座標から当該判定対象の微生物叢の状態の判定が行われる（Ｓ１６、判定ステップ）。判定結果を示す情報は、例えば、ユーザに認識できるように表示される。以上が、判定時に実行される処理である。

上述したように、本実施形態によれば、微生物叢を構成する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列に基づいて、多次元空間上の座標が算出される。塩基配列に基づく解析は、電気泳動による解析と比べて定量的にも定性的にも精度が高い。従って、本実施形態によって算出された座標は、電気泳動による解析を用いた場合と比べて、精度よく微生物叢の状態を表したものである。即ち、本実施形態によれば、微生物叢を精度よく解析することができる。

また、本実施形態のように、算出された座標から、微生物叢の状態を判定するための判定ルールを生成することとしてもよい。この構成によれば、例えば、上述したような微生物叢が正常な状態（健康な状態）であるか否かを判定するための判定ルールを生成することができる。本実施形態によって算出された座標は精度よく微生物叢の状態を表したものであるため、この判定ルールによれば、精度よく判定を行うことができる。

また、本実施形態のように生成した判定ルールを用いて判定を行う構成を有していてもよい。即ち、微生物叢解析システム１は、本実施形態のように判定システムを兼ねていてもよい。この構成によれば、生成された判定ルールに基づいた判定を行うことができる。但し、必ずしも判定ルールの生成又は判定が、微生物叢解析システム１において行われる必要はなく、微生物叢解析システム１以外の装置又はシステムによって行われてもよい。その場合、微生物叢解析システム１によって算出された座標、又は微生物叢解析システム１によって生成された判定ルールは、当該微生物叢解析システム１以外の判定システムに出力される。当該判定システムは、上述した微生物叢解析システム１の判定に係る機能を有している。

化学工場等の生物学的排水処理施設では、工場設備の定期修理期間中はメタノール等を生物学的排水処理施設に流入させ、活性汚泥を維持するが、定期修理期間後の排水処理には安定処理までに馴養期間が必要となり、処理に時間を要していた。これまで馴養期間の終点を計る管理方法がなく、安定的に処理可能な状態の見極めが困難であり、新しい管理手法が求められていた。上記のような本実施形態による微生物叢の状態の解析、判定を行うことで、安定的に処理可能な状態の見極めが容易になり、適切に水処理システムの微生物叢の管理を行うことができる。

また、本実施形態のように微生物の存在割合にも基づいて、データ群間の類似度を算出することとしてもよい。この構成によれば、更に座標を精度よく微生物叢の状態を表すことができる。但し、類似度の算出に必ずしも存在割合は必要なく、塩基配列のみから類似度の算出が行われてもよい。

また、本実施形態のように微生物の遺伝子の塩基配列を読み取るシークエンサー２０が、微生物叢解析システム１に含まれており、読み取られた塩基配列に基づきデータ群が生成されてもよい。この構成によれば、微生物の塩基配列のデータ群を確実に入力することができ、確実に本発明を実施することができる。但し、微生物叢解析システム１には、必ずしも、シークエンサー２０が含まれている必要はない。即ち、微生物叢解析システム１（のコンピュータ１０の入力部１２）は、外部からデータ群を入力することとしてもよい。

続いて、本実施形態の微生物叢解析システム１によって算出された微生物叢の状態を示す座標及び判定ルールの例を説明する。図２（ａ）に、２次元空間上に微生物叢の状態を示す座標をプロットしたグラフを示す。図２（ａ）において、四角で示される座標は、水処理が正常に行われている活性汚泥での微生物叢（正常細菌群）の状態を示す座標である。三角で示される座標は、微生物叢に対してメタノール馴養を８週間行って水処理の機能を低下させた活性汚泥での微生物叢（メタノール馴養８週目細菌群）の状態を示す座標である。図２（ｂ）に、それぞれの微生物叢の（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸の処理を開始してから４．７日目及び６日目の処理率（％）を示す。

図２（ａ）に示すように、正常細菌群に対応する座標が布置される座標領域と、メタノール馴養８週目細菌群が布置される座標領域とでは、それぞれ明確に異なる座標領域が形成された。このことから、正常細菌群とメタノール馴養８週目細菌群とでは、少なくともそれらを構成する細菌の種類とその存在量の多寡の菌叢構造において、有意に相違していることが明らかになった。

また、正常細菌群の座標の集合から、図２（ａ）に示すように、本実施形態の判定ルールである信頼９５％区間の領域Ａ１が算出される。微生物叢の状態を示す座標が、当該領域Ａ１に含まれるか否かを判断することで、微生物叢の状態が健康状態であるか否かを判定することができる。このように、正常細菌群に対する上記群間類似距離を指標にして、任意の検体から処理不良細菌群と評価される検体を検出できる。

図３に、３次元空間上に微生物叢の状態を示す座標をプロットしたグラフを示す。図３において、白抜きの丸で示される座標は、水処理が正常に行われている活性汚泥での微生物叢（正常細菌群）の状態を示す座標である。黒の丸で示される座標は、微生物叢に対してメタノール馴養を行って水処理の機能を低下させた活性汚泥での微生物叢の状態を示す座標である。黒の丸で示される座標の符号に含まれる数値は、何週間メタノール馴養を行ったかを示している。即ち、ＭＴＡ１２ｗは、１２週間メタノール馴養を行ったことを示している。

図３に示すようにメタノール馴養が１２週間行われた微生物叢に対応する座標は、正常細菌群に対応する座標から離れた位置となっている。この例においても、正常細菌群の座標の集合から、図３に示すように、本実施形態の判定ルールである領域Ａ２が算出される。

１…微生物叢解析システム、１０…コンピュータ、１１…データ生成部、１２…入力部、１３…類似度算出部、１４…座標算出部、１５…判定ルール生成部、１６…判定部、２０…シークエンサー。

Claims (6)

1. 水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を複数入力する入力手段と、
   前記入力手段によって入力されたデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、データ群間の類似度を算出する類似度算出手段と、
   前記類似度算出手段によって算出された類似度に基づいて、前記データ群それぞれの多次元空間上の座標を算出する座標算出手段と、
   前記座標算出手段によって算出された座標に基づいて、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する判定ルール生成手段と、
   を備える微生物叢解析システム。
2. 前記入力手段は、複数の微生物それぞれの存在割合を示す情報も含む前記データ群を入力し、
   前記類似度算出手段は、前記入力手段によって入力されたデータ群に含まれる存在割合を示す情報にも基づいて、データ群間の類似度を算出する、請求項１に記載の微生物叢解析システム。
3. 前記活性汚泥中に存在する複数の微生物から遺伝子の塩基配列を読み取る読取手段と、
   前記読取手段によって読み取られた遺伝子の塩基配列に基づき前記データ群を生成して入力手段に入力させるデータ生成手段と、
   を更に備える請求項１又は２に記載の微生物叢解析システム。
4. 請求項１に記載の微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定する判定システムであって、
   判定対象となる複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を入力する入力手段と、
   前記入力手段によって入力された前記判定対象のデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、当該判定対象のデータ群と前記判定ルールの生成に用いられたデータ群との類似度を算出する類似度算出手段と、
   前記類似度算出手段によって算出された類似度に基づいて、前記判定対象のデータ群の多次元空間上の座標を算出する座標算出手段と、
   前記微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、前記座標算出手段によって算出された前記判定対象のデータ群の座標から前記複数の微生物の状態を判定する判定手段と、
   を備える判定システム。
5. 微生物叢解析システムの動作方法である微生物叢解析方法であって、
   水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を複数入力する入力ステップと、
   前記入力ステップにおいて入力されたデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、データ群間の類似度を算出する類似度算出ステップと、
   前記類似度算出ステップにおいて算出された類似度に基づいて、前記データ群それぞれの多次元空間上の座標を算出する座標算出ステップと、
   前記座標算出ステップにおいて算出された座標に基づいて、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定するための判定ルールを生成する判定ルール生成ステップと、
   を含む微生物叢解析方法。
6. 請求項１に記載の微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列から、当該複数の微生物の状態を判定する判定システムの動作方法である判定方法であって、
   判定対象となる複数の微生物それぞれの遺伝子の塩基配列を示す情報を含むデータ群を入力する入力ステップと、
   前記入力ステップにおいて入力された前記判定対象のデータ群に含まれる塩基配列に基づいて、当該判定対象のデータ群と前記判定ルールの生成に用いられたデータ群との類似度を算出する類似度算出ステップと、
   前記類似度算出ステップにおいて算出された類似度に基づいて、前記判定対象のデータ群の多次元空間上の座標を算出する座標算出ステップと、
   前記微生物叢解析システムによって生成された判定ルールに基づき、前記座標算出ステップにおいて算出された前記判定対象のデータ群の座標から前記複数の微生物の状態を判定する判定ステップと、
   を含む判定方法。

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