TWI706040B - 微生物相解析系統、判定複數種微生物之狀態之判定系統、微生物相解析方法及判定複數種微生物之狀態之判定方法 - Google Patents

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Abstract

根據本發明，可高精度地對進行水處理之活性污泥中所包含之微生物相進行解析。
微生物相解析系統1之電腦10具備：輸入部12，其輸入複數個包含表示進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出部13，其基於所輸入之資料群中所包含之鹼基序列，算出資料群間之相似度；及座標算出部14，其基於所算出之相似度，算出資料群各自之多維空間上之座標。

Description

微生物相解析系統、判定複數種微生物之狀態之判定系統、微生物相解析方法及判定複數種微生物之狀態之判定方法
本發明係關於一種對進行水處理之活性污泥中所包含之微生物相進行解析之微生物相解析系統及微生物相解析方法、以及與其等相關之判定系統及判定方法。
業界期望化學或鋼鐵之重化學工業等之排水於使對人類或環境生物之影響充分地降低之狀態下排出至自然環境中。作為為此而進行之排水處理，進行有使用作為複合微生物系之活性污泥之生物處理。為了適當地進行排水處理，必須對作為活性污泥中所包含之微生物之集合之微生物相之狀態(健康狀態)進行管理。例如，專利文獻1中揭示有如下方法：為了對微生物相之狀態進行管理，藉由T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism，末端限制性片段長度多態性分析)法對微生物相之基因進行解析，於多維空間上對微生物相之狀態進行繪圖。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第3928492號說明書
藉由專利文獻1中所記載之方法所繪製之座標係基於片段化之基因之藉由電泳所進行之解析者。藉由電泳所進行之解析無論於定量上 抑或定性上精度均未必高。因此，對於所繪製之表示微生物之狀態之座標，亦有未必準確之虞。即，難言專利文獻1中所記載之方法可充分高精度地對微生物相進行解析。
本發明係鑒於上述情況而完成者，其目的在於提供一種可高精度地對進行水處理之活性污泥中所包含之微生物相進行解析之微生物相解析系統及微生物相解析方法、以及與其等相關之判定系統及判定方法。
為了達成上述目的，本發明之一實施形態之微生物相解析系統具備：輸入機構，其輸入複數個包含表示進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出機構，其基於利用輸入機構所輸入之資料群中所包含之鹼基序列，算出資料群間之相似度；及座標算出機構，其基於利用相似度算出機構所算出之相似度，算出資料群各自之多維空間上之座標。
本發明之一實施形態之微生物相解析系統中，基於構成微生物相之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，算出多維空間上之座標。關於基於鹼基序列所進行之解析，與藉由電泳所進行之解析相比，無論於定量上抑或定性上精度均較高。因此，利用本發明之一實施形態之微生物相解析系統所算出之座標係與使用藉由電泳所進行之解析之情形相比高精度地表現微生物相之狀態者。即，根據本發明之一實施形態之微生物相解析系統，可高精度地對微生物相進行解析。
微生物相解析系統亦可進而具備判定規則生成機構，該判定規則生成機構基於利用座標算出機構所算出之座標，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，生成用以判定該複數種微生物之狀態之判定規則。根據該構成，例如可生成用以判定微生物相是否處於正常之狀態(健康之狀態)之判定規則。如上所 述，利用本發明之一實施形態之微生物相解析系統所算出之座標係高精度地表現微生物相之狀態者，因此根據該判定規則，可高精度地進行判定。
亦可為如下方式，即，輸入機構輸入亦包含表示複數種微生物各自之存在比例之資訊的資料群，相似度算出機構亦基於利用輸入機構所輸入之資料群中所包含之表示存在比例之資訊，而算出資料群間之相似度。根據該構成，可使座標精度更高地表現微生物相之狀態。
微生物相解析系統亦可進而具備：讀取機構，其自活性污泥中存在之複數種微生物讀取基因之鹼基序列；及資料生成機構，其基於利用讀取機構所讀取之基因之鹼基序列生成資料群而供輸入機構進行輸入。根據該構成，可確實地輸入包含表示鹼基序列之資訊的資料群，可確實地實施本發明之一實施形態。
本發明之一實施形態之判定系統係基於利用本發明之一實施形態之微生物相解析系統所生成之判定規則，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列判定該複數種微生物之狀態之判定系統，其具備：輸入機構，其輸入包含表示成為判定對象之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出機構，其基於利用輸入機構所輸入之判定對象之資料群中所包含之鹼基序列，算出該判定對象之資料群與用於生成判定規則之資料群之相似度；座標算出機構，其基於利用相似度算出機構所算出之相似度，算出判定對象之資料群之多維空間上之座標；及判定機構，其基於利用微生物相解析系統所生成之判定規則，根據利用座標算出機構所算出之判定對象之資料群之座標判定複數種微生物之狀態。根據本發明之一實施形態之判定系統，可進行基於利用微生物相解析系統所生成之判定規則之判定。
且說，本發明除了可如上所述般記述為微生物相解析系統及判 定系統之發明以外，亦可以如下方式記述為微生物相解析方法及判定方法之發明。該等僅係範疇不同，實質上為同一發明，發揮同樣之作用及效果。
即，本發明之一實施形態之微生物相解析方法係作為微生物相解析系統之運作方法之微生物相解析方法，其包括：輸入步驟，其係輸入複數個包含表示進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出步驟，其係基於輸入步驟中所輸入之資料群中所包含之鹼基序列，算出資料群間之相似度；及座標算出步驟，其係基於相似度算出步驟中所算出之相似度，算出資料群各自之多維空間上之座標。
又，本發明之一實施形態之判定方法係基於利用本發明之一實施形態之微生物相解析系統所生成之判定規則，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列判定該複數種微生物之狀態之判定系統之運作方法之判定方法，其包括：輸入步驟，其係輸入包含表示成為判定對象之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出步驟，其係基於輸入步驟中所輸入之判定對象之資料群中所包含之鹼基序列，算出該判定對象之資料群與用於生成判定規則之資料群之相似度；座標算出步驟，其係基於相似度算出步驟中所算出之相似度，算出判定對象之資料群之多維空間上之座標；及判定步驟，其係基於利用微生物相解析系統所生成之判定規則，根據座標算出步驟中所算出之判定對象之資料群之座標判定複數種微生物之狀態。
本發明之一實施形態中，基於構成微生物相之複數種微生物各自之基因之鹼基序列算出多維空間上之座標。關於基於鹼基序列所進行之解析，與藉由電泳所進行之解析相比，無論於定量上抑或定性上 精度均較高。因此，利用本發明之一實施形態之微生物相解析系統所算出之座標係與使用藉由電泳所進行之解析之情形相比高精度地表現微生物相之狀態者。即，根據本發明之一實施形態，可高精度地對微生物相進行解析。
1‧‧‧微生物相解析系統
10‧‧‧電腦
11‧‧‧資料生成部
12‧‧‧輸入部
13‧‧‧相似度算出部
14‧‧‧座標算出部
15‧‧‧判定規則生成部
16‧‧‧判定部
20‧‧‧定序儀
S01~S06、S11~S16‧‧‧步驟
圖1係表示本發明之實施形態之微生物相解析系統之構成的圖。
圖2(a)、(b)係表示所算出之二維空間上之座標之例的圖表。
圖3係表示所算出之三維空間上之座標之例的圖表。
圖4係表示本發明之實施形態之微生物相解析系統中於生成判定規則時所執行之處理(微生物相解析方法)的流程圖。
圖5係表示本發明之實施形態之微生物相解析系統中於判定時所執行之處理(判定方法)的流程圖。
以下，與圖式一併詳細地對本發明之微生物相解析系統、判定系統、微生物相解析方法及判定方法之實施形態進行說明。再者，於圖式之說明中，對相同要素標註相同符號，並省略重複之說明。
圖1中表示本實施形態之微生物相解析系統1。微生物相解析系統1係對作為進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物之集合之微生物相(細菌相)之狀態進行定量化而進行管理者。本實施形態中作為對象之水處理例如為用以減小工業排水或公共生活排水、污水等對自然環境有害之水對自然環境之影響的處理。又，該水處理係利用使用包含微生物相之活性污泥之水處理系統進行者。活性污泥中所包含之微生物之種類之數量通常為數千~數萬以上。又，該活性污泥通常被加入生物反應槽(生物處理槽、活性污泥槽)中，藉由使處理對象之水流入該生物反應槽內而進行水處理。生物反應槽中，通常包括好氧槽及厭氧槽。該水處理係根據例如工廠之運轉而持續進行者。再者， 該水處理本身係自先前開始一直進行者。
微生物相解析系統1算出表示微生物相之狀態之多維空間上之座標作為微生物相之狀態之定量化。該座標係基於複數種微生物相之狀態間之相似度(相似性、β-多樣性)而相對地決定者。若2個表示微生物相之狀態之座標相互靠近，則意指其等之狀態相近。若2個表示微生物相之狀態之座標相互遠離，則意指其等之狀態相差較大。本實施形態中之微生物相之狀態係至少反映微生物相中之微生物之構成(微生物相中包含何種微生物)者。
可利用該座標對微生物相之狀態進行管理。例如，預先記憶表示正常地進行有水處理(即，水處理後之水對自然環境之影響充分減小)之活性污泥中之微生物相之狀態、即處於健康之狀態之微生物相之狀態之座標。藉由算出表示狀態不明之微生物相之狀態之座標，並與表示處於健康之狀態之微生物相之狀態之座標進行比較，可判定微生物相之狀態。
微生物相解析系統1係使用表示微生物相之狀態之座標，而生成用以判定微生物之狀態之判定規則。又，微生物相解析系統1亦使用所生成之判定規則進行判定。
如圖1所示，微生物相解析系統1係包含電腦10、與定序儀20而構成。電腦10係承擔微生物相解析系統1之主要功能之裝置，係進行座標之算出、判定規則之生成及使用判定規則之判定之裝置。具體而言，電腦10具備CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)或記憶體、通訊模組等硬體。藉由使該等構成要素利用程式等進行運作，而發揮下述之電腦10之功能。
定序儀20係自活性污泥中存在之複數種微生物讀取(確定)基因之鹼基序列之讀取機構。作為定序儀20，亦可使用同時讀取(解析)複數種微生物之基因之所謂下一代定序儀。作為定序儀20，亦可使用先前 之定序儀、例如Roche公司製造之GS Junior System定序儀、Roche公司製造之GS FLX+System定序儀、或Illumina公司製造之MiSeq System定序儀。又，定序儀20亦可讀取16S核糖體RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)基因之鹼基序列作為微生物之基因之鹼基序列。其原因在於：16S核糖體RNA基因之鹼基序列對於微生物之每種類別而言為相對特徵性之序列。再者，為了讀取16S核糖體RNA基因之鹼基序列，預先製備自活性污泥採取並輸入定序儀20之定序用樣品(污泥樣品)。活性污泥例如分別自好氧槽及厭氧槽採取。定序用樣品之製備、及鹼基序列之讀取(定序)例如可藉由如下方式進行。
[微生物相之DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)之製備]
自活性污泥採取約1.5ml之包含微生物群之溶液，於室溫下進行離心(13,000rpm×5分鐘)。將上清液去除後，添加殺菌生理鹽水1ml，倒置混合5秒左右後，於室溫下進行離心(13,000rpm×5分鐘)。將上清液去除後，添加Lysis buffer(裂解緩衝液)(AMR公司製造)300μl，充分進行混合後，將所獲得之懸浮液添加至放入有珠粒之試管(EZ-EXTRACT for DNA(AMR公司製造))，其後，利用旋渦混合器攪拌破碎2分鐘。向破碎液添加300μl之TE(Tris-EDTA)溶液(10mM之Tris(Trishydroxymethyl aminomethane，三羥甲基胺基甲烷)、1mM之EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)、pH值8.0)(以下，TE)，於4℃下進行離心(13,000rpm×5分鐘)。其後，將上清液450μl加入新的試管中，並向其添加600μl之苯酚混合液(EZ-EXTRACT for DNA所附屬(AMR公司製造))，旋渦攪拌1分鐘後，於4℃下進行離心(13,000rpm×5分鐘)。將上清液300μl回收並加入至新的試管(1.5ml)中，並向其添加1200μl之乙醇(99.5%)，於4℃下進行離心(13,000rpm×5分鐘)。將上清液去除後，添加1000μl之冷乙醇(70%)，於4℃下進行離心(13,000rpm×5分鐘)，將所獲得之DNA顆粒 真空乾燥，繼而添加150μl之TE，製成細菌相DNA之溶液。
[16S核糖體RNA基因之V3-V4區域之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈鎖反應)擴增]
測定細菌相DNA之溶液中之雙螺旋DNA濃度，基於其測定值將50ng之DNA作為模板，使用通用引子組(正向引子fw357F(序列編號1)與反向引子RV926r(序列編號2))，將16S核糖體RNA基因(以下，16S基因)之V3-V4區域進行PCR擴增。PCR係使用Takara Bio公司製造之「Premix Ex Taq Hot Start Version」(註冊商標)，製作包含50pmol之各引子之反應液50μl，於94℃下進行2分鐘之預熱後，分別以98℃×10秒、50℃×30秒、72℃×80秒之條件進行改性、退火、伸長，並重複進行25個循環。
下文示出正向引子HA13621-fw357F之序列之結構。該正向引子於5'末端側包含利用定序儀20進行之序列確定所需之銜接子A序列(以大寫字母記載)，隔著各檢體固有之10個鹼基之條碼序列，於3'末端側包含對全部真細菌之16S基因進行退火之通用引子序列fw357F(以小寫記載)。上述條碼序列係用於樣品間之識別，同時與供於定序儀20之樣品數量對應之任意設計之鹼基序列。
銜接子A序列(序列編號3)
5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'
通用引子序列fw357F(序列編號1)
5'-cctacgggaggcagcag-3'
對上述條碼序列之作用進行說明。例如，於同時解析10個檢體之情形時，只要製作10組具有不同之條碼序列之HA13621-fw357F，使用各者對各檢體進行PCR擴增即可。若將該等混合並供於定序儀20，則於利用可藉由1次運轉獲得100萬資料之GS FLX+System定序儀之情形時，可藉由使用與100個檢體對應之100組條碼序列，而藉由 1次運轉獲得1萬資料/檢體之序列資料。
下文示出反向引子HA13619-RV926r之序列之結構。該反向引子於5'末端側包含利用定序儀20進行之序列確定所需之銜接子B序列(以大寫字母記載)，於3'末端側包含對全部真細菌之16S基因進行退火之通用引子序列RV926r(以小寫記載)。
HA13619-RV926r之序列(序列編號4)
5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGccgtcaattccttttragttt-3'
可藉由使用上述通用引子組進行之PCR，使包含構成細菌相之各種細菌種之16S基因之V3-V4區域之DNA(約570個鹼基)擴增，而獲得其等之混合物作為其PCR產物DNA。
[PCR產物之生成及定序用樣品之製備]
將自各細菌相DNA獲得之PCR產物DNA(包含構成該細菌相之各種細菌種之16S基因之V3-V4區域的DNA之混合物)混合，利用DNA清除劑(和光純藥公司製造)進行處理，將過剩之引子或受質之核苷酸等去除而進行純化。純化DNA係利用200μl之TE進行洗脫而回收。繼而，將所回收之純化DNA溶液供於瓊脂糖凝膠電泳，切出約570bp之DNA片段，利用MinElute凝膠提取套組(Qiagen公司製造)進行提取，而製備供於定序儀20之DNA。將其作為用於以下之定序之定序用樣品。
[16S基因之定序與序列資料之精度評價]
將上述定序用樣品供於作為定序儀20之Roche公司製造之GS FLX+System定序儀進行定序。定序之條件、步驟等依照製造商規定之操作流程。再者，於該定序儀中，將上述所製備之PCR產物DNA之1分子固定於1個珠粒，繼而，對水(包含用於定序用模板DNA之擴增之PCR引子、受質核苷酸、DNA合成酵素)與油之乳化液中獨立地形成 之一個個微小水滴逐個捕獲珠粒，於其中進行PCR使定序用模板DNA擴增而進行製備。因此，將固定有該經擴增之模板DNA之各珠粒劃分於滴定盤上後，於其劃分位置上讀取定序反應之訊息，藉此可隨機地確定上述定序用樣品中所包含之PCR產物DNA(包含構成該細菌相之各種細菌種之16S基因之V3-V4區域的DNA之混合物)之鹼基序列。又，若預先將正向引子HA13621-fw357F中之上述條碼序列設為對於每個源自各樣品之檢體而言具有特徵性之任意之序列，則可使用GS FLX+System定序儀同時解析約100種細菌相樣品，可對於來自某一活性污泥之樣品花費約10~23小時確定2,000~10,000之16S基因之序列資料。即，可不限定菌種地全面地對活性污泥中所包含之細菌相進行解析。
以上係進行定序用樣品之製備、及鹼基序列之讀取之方法之一例。再者，亦可利用上述方法以外之方法進行定序用樣品之製備、及鹼基序列之讀取。定序儀20與電腦10係以可進行資訊之收發之方式連接。定序儀20將所讀取之表示每種微生物之鹼基序列之資訊(序列資訊)發送至電腦10。此處，發送至電腦之序列資訊直接為定序儀20所定序之序列之資料、即所謂初步序列資料。
繼而，對本實施形態之電腦10之功能進行說明。如圖1所示，電腦10係具備資料生成部11、輸入部12、相似度算出部13、座標算出部14、判定規則生成部15、及判定部16而構成。
資料生成部11係自定序儀20接收利用定序儀20所讀取之活性污泥中存在之複數種微生物之鹼基序列，基於該鹼基序列生成用以算出座標之資料之資料生成機構。用以算出座標之資料係包含表示每種微生物之類別(微生物種、菌種)之活性污泥中存在之微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群。1個資料群對應1個微生物相，對於被放入同一生物反應槽之活性污泥而言，包含表示同一時點之活性污泥中存 在之微生物之全部類別各自之基因之鹼基序列的資訊。但是，於難以嚴密地掌握其全部類別之鹼基序列之情形等時，無需嚴密地包含表示其全部類別之鹼基序列之資訊，只要包含算出座標所需之程度之鹼基序列即可。
作為用以算出座標之資料，需要複數個上述資料群。例如，對於被放入同一生物反應槽之活性污泥而言，將複數個不同時點之活性污泥各自之資料群作為用以算出座標之複數個資料群。例如，複數個資料群係每週1份之複數週之微生物相之鹼基序列之資料。即，每週自活性污泥採取包含微生物群之溶液，生成資料群。或者，亦可將被放入互不相同之生物反應槽之活性污泥各自之資料群作為用以算出座標之複數個資料群。
各資料群中，可僅包含每種微生物之類別之鹼基序列，亦可包含微生物各自之存在比例(存在機率)之資料。該存在比例係每種微生物之類別(微生物種、菌種)之活性污泥中所包含之該類別之微生物之數量相對於該活性污泥中所包含之全部微生物之數量之比例。但是，於難以嚴密地掌握其比例之情形等時，無需嚴密地為數量相對於全部微生物之數量之比例，只要為與算出座標所需之程度近似之比例即可。
例如，資料生成部11以如下方式進行該資料之生成。資料生成部11自定序儀20接收初步序列資料。再者，自定序儀20接收之初步序列資料係複數個資料群之資料、例如複數個時點之活性污泥之資料。即，以獲得此種資料之方式利用定序儀20進行定序。
資料生成部11對於所獲得之初步序列資料(例如，上述例中為約570個鹼基/資料)，基於序列資料中所包含之樣品固有之條碼序列，將各序列分配至各固有之樣品(相當於複數個資料群各自之資料群)。資料生成部11將該序列資料之序列長度未達200、1000以上、與通用 引子序列(fw357F)之錯配為1以上、使用附屬於定序儀之質量程式進行序列確定之鹼基序列之平均質量值為25以下之序列資料去除，擷取高精度資料。
資料生成部11將所取得之高精度序列資料供於利用叢聚(相似度95%、97%、或99%之閾值)進行之運算分類單位(Operational Taxonomic Unit)解析(以下，稱為OTU解析)。於OTU解析中，以序列資料之相似度為基準進行使各序列資料群組化之操作。此處，檢測相互具有95%以上之序列相似度之序列資料之叢集群組(以下，稱為OTU)。再者，序列資料之叢聚可藉由先前技術、例如免費軟體Uclust而進行。可推測各OTU來自大致相同之種類之細菌(微生物)。因此，可認為藉由叢聚而獲得之OTU之總數(OTU數)於可檢測出之範圍內與構成其細菌相(微生物相)之細菌種(微生物種)之數量相等。資料生成部11確定代表各叢集群組之鹼基序列即代表序列資料。代表序列資料之確定可藉由先前一直使用之方法而進行。
又，可根據各OTU中所包含之序列資料數而求出序列資料數整體中之各OTU之比例、即菌種組成比、即上述存在比例。進而，可藉由對各OTU之代表序列資料進行向上述16S基因及細菌基因體之資料庫之同源性檢索，而歸屬至具有最高之序列相似度之已知菌種，即，特定出OTU之菌種。再者，於本實施形態中，未必必須進行菌種之特定，但由於可掌握具體何種菌種之細菌包含於活性污泥中，故而於判定結果之解析等方面有益。再者，對於資料群中所包含之序列資料數(序列數之計數)非常少(例如1、2或3)之OTU(叢集群組)，並非有效之資訊之情形較多，有時成為計算上之雜訊，因此亦可預先自資料群之資料去除。
資料生成部11將上述各叢集群組之代表序列資料作為構成資料群之鹼基序列。又，資料生成部11亦可對於各資料群算出每種上述細菌 種(鹼基序列)之存在比例，而於資料群中包含微生物各自之存在比例(存在機率)之資料。資料生成部11將所生成之複數個資料群輸出至輸入部12。
輸入部12係將複數個上述資料群自資料生成部11輸入之輸入機構。輸入部12將所輸入之資料群輸出至相似度算出部13。
相似度算出部13係基於利用輸入部12所輸入之資料群中所包含之鹼基序列算出資料群間之相似度之相似度算出機構。又，於資料群中包含微生物各自之存在比例之資料之情形時，相似度算出部13亦可基於表示該存在比例之資訊，算出資料群間之相似度。例如，若資料群中所包含之微生物之鹼基序列本身、及微生物之鹼基序列之構成(以何種存在比例包含何種鹼基序列)相互類似，則相似度變高。相似度算出部13算出2個資料群間之相似度。又，相似度算出部13對於全部資料群之組合算出相似度。
相似度之算出可藉由先前一直使用之方法、例如UniFrac解析而進行。UniFrac解析係如下方法：對於包含鹼基序列之資料群之任意之複數個群，根據屬於各群之鹼基序列(屬於各OTU之代表鹼基序列)彼此之相似度與序列數，將各群間之相似度數值化(Lozupone C and Knight R：UniFrac：a new phylogenetic method for comparing microbial communities.ApplEnviron Microbiol 71：8228-8235(2005))。UniFrac解析例如可使用科羅拉多大學所提供之免費軟體Unifrac而進行。
藉由UniFran解析而獲得之相似度係以系統樹上之系統距離(UniFrac Distance)(以下，稱為群間類似距離)之形式算出。群間類似距離係資料群間之相似度越高，其值越小。相似度算出部13將所算出之資料群間之相似度即群間類似距離之值輸出至座標算出部14。又，相似度算出部13為了進行利用判定規則之判定，而預先記憶用於算出相似度之資訊。再者，相似度之算出未必一定要藉由UniFrac解析進 行，只要為可算出複數個包含鹼基序列之資料群間之相似度者即可，可藉由任意方法進行。
座標算出部14係基於利用相似度算出部13所算出之相似度，算出資料群各自之多維空間上之座標之座標算出機構。此處所算出之座標係表示與各資料群對應之上述微生物相之狀態之座標。以類似之資料群之座標接近、不類似之資料群之座標遠離之方式算出。算出之座標之維數預先被座標算出部14設定而記憶。例如，算出二維、或三維之座標。藉由設為二維、或三維之座標，而可進行圖示，可視覺性地確認微生物相之狀態。
座標之算出可藉由先前一直使用之方法、例如多維尺度法(MDS)而進行。多維尺度法係根據對於對象之任意之基準之相似度，將其對象以座標之形式佈置於多維空間上之方法。多維尺度法例如可使用免費軟體(R等)或市售之程式而進行。再者，座標之算出未必必須藉由多維尺度法進行，只要為可基於相似度算出座標者即可，可藉由任意方法進行。
將圖示有所算出之座標之圖表之例示於圖2(a)及圖3。圖2(a)係於二維空間上對座標進行繪圖者。圖3係於三維空間上對座標進行繪圖者。圖2中之正方形及三角形所表示之各個座標、及圖3中之圓所表示之各個座標對應於各個資料群、即各個微生物相之狀態。座標算出部14將表示所算出之座標之資訊輸出至判定規則生成部15。又，相似度算出部13為了進行利用判定規則之判定，而預先記憶用於算出座標之資訊。
判定規則生成部15係基於利用座標算出部14所算出之座標，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，生成用以判定該複數種微生物之狀態之判定規則的判定規則生成機構。判定規則例如係判定該複數種微生物、即微生物相是否可正常 地進行水處理者。所謂可正常地進行水處理，例如指處理後之水滿足如水處理後之水對自然環境之影響充分減小之一定標準。更具體而言，係指能夠以一定以上之比例對成為處理對象之特定化學物質進行處理(分解)。
判定規則係使用基於構成成為判定對象之微生物相之微生物各自之基因之鹼基序列之座標進行判定者。即，判定規則係使用基於與用於上述座標之算出之資料群相同之形式之資料群之資訊進行判定者。
於判定規則生成部15生成判定規則時，例如，預先將利用座標算出部14所算出之座標之微生物相設為可正常地進行水處理之微生物相。即，利用座標算出部14所算出之座標之集合相當於可正常地進行水處理之微生物相之集合。判定規則生成部15確定自可正常地進行水處理之微生物相之座標之集合所推定之包含可正常地進行水處理之微生物相之座標之範圍作為判定規則。判定可藉由判斷成為判定對象之微生物相之座標是否包含於該範圍而進行。若成為判定對象之微生物相之座標包含於該範圍，則成為判定對象之微生物相被判定為可正常地進行水處理之微生物相。另一方面，若成為判定對象之微生物相之座標不包含於該範圍，則成為判定對象之微生物相被判定為存在並非可正常地進行水處理之微生物相之可能性。
判定規則生成部15自可正常地進行水處理之微生物相之複數個座標算出被推定例如以統計學上一定以上之機率(例如95%)包含該複數個座標之範圍(例如95%可靠區間)作為設為判定規則之範圍。可靠95%之算出可藉由先前一直使用之統計方法而進行。可靠95%之算出例如可使用免費軟體(R等)或市售之程式而進行。
或者，於判定規則生成部15生成判定規則時，例如，預先將利用座標算出部14所算出之座標之微生物相設為包含可正常地進行水處 理之微生物相及無法正常地進行水處理之微生物相兩者之微生物相，且使之成為於電腦10中可區分其等。判定規則生成部15亦可算出最佳地區分包含可正常地進行水處理之微生物相之座標之區域與包含無法正常地進行水處理之微生物相之座標之區域之邊界作為判定規則。根據該判定規則，可根據成為判定對象之微生物相之座標包含於何區域進行判定。該邊界之算出可藉由先前一直使用之統計或數理方法而進行。
又，判定規則生成部15亦可藉由機器學習而生成判定規則。判定規則生成部15將表示所生成之判定規則之資訊輸出至判定部16。
判定部16係基於利用判定規則生成部15所生成之判定規則而對判定對象之微生物相之狀態進行判定之判定機構。如上所述，判定規則係用以根據判定對象之微生物相之座標判定該判定對象之微生物相之狀態者。即，判定部16輸入表示判定對象之微生物相之座標之資訊並進行判定。判定對象係(欲進行判定之時點之)水處理系統之活性污泥中所包含之微生物相。判定對象之微生物相可設為與取得用於生成判定規則之資料群之水處理系統相同之(且不同之時點之)水處理系統之活性污泥中所包含之微生物相。其中，判定對象之微生物相亦可為取得用於生成判定規則之資料群之水處理系統以外之水處理系統之活性污泥中所包含之微生物相。
判定對象之微生物相之座標係以與生成判定規則時之各個資料群之座標相同之方式求出。即，座標之算出係以如下方式進行。定序儀20自構成判定對象之微生物相之複數種微生物讀取基因之鹼基序列。定序儀20將表示所讀取之成為判定對象之複數種微生物之每種之鹼基序列之資訊(序列資訊)發送至電腦10。
於電腦10中，資料生成部11自定序儀20接收序列資訊，根據該序列資訊生成包含表示成為判定對象之複數種微生物各自之基因之鹼基 序列之資訊的資料群。
資料生成部11將所生成之包含表示判定對象之微生物之鹼基序列之資訊的資料群輸出至輸入部12。輸入部12輸入該資料群，輸出至相似度算出部13。相似度算出部13輸入該資料群，算出該資料群與生成判定規則時所使用之各個資料群之間之相似度。相似度算出部13將所算出之相似度輸出至座標算出部14。座標算出部14基於自相似度算出部13輸入之資訊所表示之相似度算出判定對象之資料群之多維空間上之座標。相似度之算出及座標之算出係以與判定規則之生成時相同之方式進行。座標算出部14將表示判定對象之資料群之座標之資訊輸出至判定部16。
判定部16基於判定規則，使用自座標算出部14輸入之資訊所表示之座標進行判定。例如，如上所述，判定部16判斷成為判定對象之座標是否包含於95%可靠區間。於判斷成為判定對象之座標包含於95%可靠區間之情形時，判定部16判定成為判定對象之微生物相係可正常地進行水處理之微生物相。於判斷成為判定對象之座標不包含於95%可靠區間之情形時，判定部16判定成為判定對象之微生物相有並非可正常地進行水處理之微生物相之可能性。
判定部16輸出判定結果。判定結果之輸出例如藉由利用電腦10所具備之顯示器等顯示裝置進行顯示而進行。又，判定結果之輸出例如亦可藉由發送至其他裝置或電腦10內之其他模組而進行。以上係本實施形態之電腦10之功能。
繼而，利用圖4及圖5之流程圖，對作為藉由本實施形態之微生物相解析系統1所執行之處理(微生物相解析系統1之運作方法)之微生物相解析方法及判定方法進行說明。首先利用圖4之流程圖，對生成判定規則時所執行之處理進行說明。於本處理中，首先，利用定序儀20讀取構成水處理系統中所使用之微生物相的微生物之基因之鹼基序 列(S01、讀取步驟)。此處，讀取複數個時點之構成微生物相之微生物之基因之鹼基序列。所讀取之鹼基序列之資料自定序儀20被輸出至電腦10。
電腦10中，利用資料生成部11接收自定序儀20發送之鹼基序列之資料。繼而，利用資料生成部11，基於鹼基序列之資料而生成複數個包含表示複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群(S02、資料生成步驟)。繼而，所生成之複數個資料群或至此為止所生成之資料(基於以前生成之複數個時點之構成微生物相之微生物之基因之鹼基序列之資料，而表示複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群)自資料生成部11被輸入至輸入部12(S03、輸入步驟)。
所輸入之複數個資料群自輸入部12被輸出至相似度算出部13。繼而，利用相似度算出部13算出資料群間之相似度(S04、相似度算出步驟)。表示所算出之資料群間之相似度之資訊自相似度算出部13被輸出至座標算出部14。
繼而，利用座標算出部14，基於利用相似度算出部13所算出之相似度，算出資料群各自之多維空間上之座標(S05、座標算出步驟)。表示所算出之座標之資訊自座標算出部14被輸出至判定規則生成部15。繼而，利用判定規則生成部15，基於自相似度算出部13輸入之資訊所表示之座標，生成判定規則(S06、判定規則生成步驟)。表示所生成之判定規則之資訊自判定規則生成部15被輸出至判定部16。以上係生成判定規則時所執行之處理。
繼而，利用圖5之流程圖，對判定時所執行之處理進行說明。於本處理中，首先，利用定序儀20讀取判定對象之時點之構成水處理系統中所使用之微生物相的微生物之基因之鹼基序列(S11、讀取步驟)。所讀取之鹼基序列之資料自定序儀20被輸出至電腦10。
電腦10中，利用資料生成部11接收自定序儀20發送之鹼基序列之 資料。繼而，利用資料生成部11，基於鹼基序列之資料，且基於鹼基序列之資料，生成包含表示複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊之判定對象之資料群(S12、資料生成步驟)。繼而，所生成之資料群自資料生成部11被輸入輸入部12(S13、輸入步驟)。
所輸入之判定對象之資料群自輸入部12被輸出至相似度算出部13。繼而，利用相似度算出部13，算出判定對象之資料群與生成判定規則時所使用之各個資料群之間之相似度(S14、相似度算出步驟)。表示所算出之資料群間之相似度之資訊自相似度算出部13被輸出至座標算出部14。
繼而，利用座標算出部14，基於利用相似度算出部13所算出之相似度，算出判定對象之資料群之多維空間上之座標(S15、座標算出步驟)。表示所算出之判定對象之座標之資訊自座標算出部14被輸出至判定部16。
繼而，利用判定部16，基於利用判定規則生成部15所生成之判定規則，根據利用座標算出部14所算出之座標進行該判定對象之微生物相之狀態之判定(S16、判定步驟)。表示判定結果之資訊例如以可識別之方式對使用者顯示。以上係判定時所執行之處理。
如上所述，根據本實施形態，基於構成微生物相之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，算出多維空間上之座標。關於基於鹼基序列所進行之解析，與藉由電泳所進行之解析相比，無論於定量上抑或定性上精度均較高。因此，藉由本實施形態所算出之座標係與使用藉由電泳所進行之解析之情形相比高精度地表現微生物相之狀態者。即，根據本實施形態，可高精度地對微生物相進行解析。
又，如本實施形態般，亦可生成用以根據所算出之座標判定微生物相之狀態之判定規則。根據該構成，例如，可生成如上所述之用以判定微生物相是否為正常之狀態(健康之狀態)之判定規則。藉由本 實施形態所算出之座標係高精度地表現微生物相之狀態者，因此根據該判定規則，可高精度地進行判定。
又，如本實施形態般，亦可具有使用所生成之判定規則進行判定之構成。即，微生物相解析系統1亦可如本實施形態般兼具判定系統。根據該構成，可進行基於所生成之判定規則之判定。但是，判定規則之生成或判定未必必須於微生物相解析系統1中進行，亦可利用微生物相解析系統1以外之裝置或系統進行。於該情形時，利用微生物相解析系統1所算出之座標、或利用微生物相解析系統1所生成之判定規則被輸出至該微生物相解析系統1以外之判定系統。該判定系統具有上述微生物相解析系統1之判定之功能。
化學工廠等之生物學排水處理設施中，於工廠設備之定期修理期間，會使甲醇等流入生物學排水處理設施，雖然維持活性污泥，但對於定期修理期間後之排水處理，至穩定處理之前必需馴化期間，處理需要時間。迄今為止尚無計算馴化期間之終點之管理方法，難以判明可穩定地進行處理之狀態，需要新的管理方法。藉由進行如上所述之本實施形態之微生物相之狀態之解析、判定，變得容易判明可穩定地進行處理之狀態，可恰當地進行水處理系統之微生物相之管理。
又，如本實施形態般，亦可基於微生物之存在比例算出資料群間之相似度。根據該構成，可使座標精度更高地表現微生物相之狀態。但是，相似度之算出未必必需存在比例，亦可僅根據鹼基序列進行相似度之算出。
又，如本實施形態般，讀取微生物之基因之鹼基序列之定序儀20亦可包含於微生物相解析系統1，基於所讀取之鹼基序列生成資料群。根據該構成，可確實地輸入微生物之鹼基序列之資料群，可確實地實施本發明之一實施形態。但是，微生物相解析系統1中未必必須包含定序儀20。即，微生物相解析系統1(之電腦10之輸入部12)亦可 自外部輸入資料群。
繼而，對藉由本實施形態之微生物相解析系統1所算出之表示微生物相之狀態之座標及判定規則之例進行說明。圖2(a)中表示於二維空間上對表示微生物相之狀態之座標進行繪圖而成之圖表。圖2(a)中，四角所表示之座標係表示正常地進行有水處理之活性污泥中之微生物相(正常細菌群)之狀態之座標。三角所表示之座標係表示對微生物相進行8週甲醇馴化而使水處理之功能降低之活性污泥中之微生物相(甲醇馴化第8週之細菌群)之狀態之座標。圖2(b)中表示開始各微生物相之(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸之處理後第4.7日及第6日之處理率(%)。
如圖2(a)所示，佈置有對應於正常細菌群之座標之座標區域、與佈置有甲醇馴化第8週之細菌群之座標區域分別形成明顯不同之座標區域。由此可知：正常細菌群與甲醇馴化第8週之細菌群至少於構成其等之細菌之種類與其存在量之多寡之菌相結構方面存在顯著差異。
又，如圖2(a)所示，自正常細菌群之座標之集合算出作為本實施形態之判定規則之95%可靠區間之區域A1。可藉由判斷表示微生物相之狀態之座標是否包含於該區域A1，而判定微生物相之狀態是否為健康狀態。如此，可將相對於正常細菌群之上述群間類似距離作為指標，自任意之檢體檢測出被評價為處理不良細菌群之檢體。
圖3中表示於三維空間上對表示微生物相之狀態之座標進行繪圖而成之圖表。圖3中，中空之圓所表示之座標係表示正常地進行有水處理之活性污泥中之微生物相(正常細菌群)之狀態之座標。黑色圓所表示之座標係表示對微生物相進行甲醇馴化而使水處理之功能降低之活性污泥中之微生物相之狀態之座標。黑色圓所表示之座標之符號中所包含之數值表示進行了幾週甲醇馴化。即，MTA12w表示進行了12週甲醇馴化。
如圖3所示，對應於進行了12週甲醇馴化之微生物相之座標位於遠離與正常細菌群對應之座標之位置。於該例中，亦自正常細菌群之座標之集合，如圖3所示算出作為本實施形態之判定規則之區域A2。
<110> 日商住友化學股份有限公司
<120> 微生物相解析系統、判定系統、微生物相解析方法及判定方法
<130> S40537W001
<150> JP 2015-076946
<151> 2015-04-03
<160> 4
<170> PatentIn第3.1版
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 通用引子fw357F
<400> 1
Figure 105110647-A0202-12-0023-1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 通用引子RV926r
<400> 2
Figure 105110647-A0202-12-0023-2
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 銜接子A
<400> 3
Figure 105110647-A0202-12-0024-3
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 反向引子HA13619-RV926r
<400> 4
Figure 105110647-A0202-12-0024-4
1‧‧‧微生物相解析系統
10‧‧‧電腦
11‧‧‧資料生成部
12‧‧‧輸入部
13‧‧‧相似度算出部
14‧‧‧座標算出部
15‧‧‧判定規則生成部
16‧‧‧判定部
20‧‧‧定序儀

Claims (7)

  1. 一種微生物相解析系統，其具備：輸入機構，其輸入複數個包含表示進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出機構，其基於利用上述輸入機構所輸入之資料群中所包含之鹼基序列，算出資料群間之相似度；及座標算出機構，其基於利用上述相似度算出機構所算出之相似度，算出上述資料群各自之二維或三維空間上之座標。
  2. 如請求項1之微生物相解析系統，其進而具備判定規則生成機構，該判定規則生成機構基於利用上述座標算出機構所算出之座標，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，生成用以判定該複數種微生物之狀態之判定規則。
  3. 如請求項1之微生物相解析系統，其中上述輸入機構輸入亦包含表示複數種微生物各自之存在比例之資訊之上述資料群，上述相似度算出機構亦基於利用上述輸入機構所輸入之資料群中所包含之表示存在比例之資訊，算出資料群間之相似度。
  4. 如請求項1至3中任一項之微生物相解析系統，其進而具備：讀取機構，其自上述活性污泥中存在之複數種微生物讀取基因之鹼基序列；及資料生成機構，其基於利用上述讀取機構所讀取之基因之鹼基序列生成上述資料群而供輸入機構進行輸入。
  5. 一種判定複數種微生物之狀態之判定系統，其係基於利用如請求項2之微生物相解析系統所生成之判定規則，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，判 定該複數種微生物之狀態者，並且具備：輸入機構，其輸入包含表示成為判定對象之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出機構，其基於利用上述輸入機構所輸入之上述判定對象之資料群中所包含之鹼基序列，算出該判定對象之資料群與用於上述判定規則之生成之資料群之相似度；座標算出機構，其基於利用上述相似度算出機構所算出之相似度，算出上述判定對象之資料群之二維或三維空間上之座標；及判定機構，其基於利用上述微生物相解析系統所生成之判定規則，根據利用上述座標算出機構所算出之上述判定對象之資料群之座標，判定上述複數種微生物之狀態。
  6. 一種微生物相解析方法，其係作為微生物相解析系統之運作方法之微生物相解析方法，並且包括：輸入步驟，其係輸入複數個包含表示進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出步驟，其係基於上述輸入步驟中所輸入之資料群中所包含之鹼基序列，算出資料群間之相似度；及座標算出步驟，其係基於上述相似度算出步驟中所算出之相似度，算出上述資料群各自之二維或三維空間上之座標。
  7. 一種判定複數種微生物之狀態之判定方法，其係作為基於利用如請求項2之微生物相解析系統所生成之判定規則，根據進行水處理之活性污泥中存在之複數種微生物各自之基因之鹼基序列，判定該複數種微生物之狀態之判定系統之運作方法之判定方法，並且包括： 輸入步驟，其係輸入包含表示成為判定對象之複數種微生物各自之基因之鹼基序列之資訊的資料群；相似度算出步驟，其係基於上述輸入步驟中所輸入之上述判定對象之資料群中所包含之鹼基序列，算出該判定對象之資料群與用於上述判定規則之生成之資料群之相似度；座標算出步驟，其係基於上述相似度算出步驟中所算出之相似度，算出上述判定對象之資料群之二維或三維空間上之座標；及判定步驟，其係基於利用上述微生物相解析系統所生成之判定規則，根據上述座標算出步驟中所算出之上述判定對象之資料群之座標，判定上述複數種微生物之狀態。
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