CN107533592B - 微生物群落分析系统、判定系统、微生物群落分析方法及判定方法 - Google Patents

微生物群落分析系统、判定系统、微生物群落分析方法及判定方法 Download PDF

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Abstract

高精度地分析进行水处理的活性污泥中所含的微生物群落。微生物群落分析系统(1)的计算机(10)具备：输入部(12)，输入多个数据组，所述数据组包含表示存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；相似度计算部(13)，基于所输入的数据组中所包含的碱基序列，计算数据组间的相似度；以及坐标计算部(14)，基于所计算出的相似度，计算数据组各自在多维空间上的坐标。

Description

微生物群落分析系统、判定系统、微生物群落分析方法及判定 方法
技术领域
本发明涉及对进行水处理的活性污泥中所含的微生物群落进行分析的微生物群落分析系统和微生物群落分析方法、以及与它们相关的判定系统和判定方法。
背景技术
期待化学、钢铁等重化学工业等中的废水以充分降低了对人、环境生物的影响的状态排放到自然环境中。作为为此而进行的废水处理，进行使用复合微生物体系、即活性污泥的生物处理。为了适当地进行废水处理，需要对活性污泥中所含的微生物的集合、即微生物群落的状态(健康状态)进行管理。例如，在专利文献1中公开了：为了对微生物群落的状态进行管理，利用T-RFLP法分析微生物群落的基因并将微生物群落的状态绘制在多维空间上。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第3928492号说明书
发明内容
发明所要解决的问题
用专利文献1记载的方法所绘制的坐标基于片段化基因的电泳分析。电泳分析不论是定量还是定性，精度都未必高。因此，担心所绘制的表示微生物的状态的坐标也未必准确。即，不能说专利文献1记载的方法以足够高的精度对微生物群落进行了分析。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种能够高精度地分析进行水处理的活性污泥中所含的微生物群落的微生物群落分析系统和微生物群落分析方法、以及与它们相关的判定系统和判定方法。
用于解决问题的方法
为了达到上述目的，本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统具备：输入单元，输入多个数据组，数据组包含表示存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；相似度计算单元，基于由输入单元输入的数据组中所包含的碱基序列，计算数据组间的相似度；以及坐标计算单元，基于由相似度计算单元计算出的相似度，计算数据组各自在多维空间上的坐标。
在本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统中，基于构成微生物群落的多种微生物各自的基因的碱基序列，计算在多维空间上的坐标。基于碱基序列的分析与电泳分析相比，不论是定量还是定性精度都更高。因此，与使用电泳分析的情况相比，通过本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统计算出的坐标更高精度地表示出微生物群落的状态。即，根据本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统，能够高精度地对微生物群落进行分析。
也可以是，微生物群落分析系统还具备判定规则生成单元，该判定规则生成单元基于由坐标计算单元计算出的坐标生成判定规则，该判定规则用于根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态。根据该结构，例如，能够生成用于判定微生物群落是否处于正常状态(健康状态)的判定规则。如上所述，通过本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统计算出的坐标高精度表示出微生物群落的状态，因此根据该判定规则，能够高精度地进行判定。
也可以是，输入单元输入还包含表示多种微生物各自的存在比例的信息的数据组，相似度计算单元还基于由输入单元输入的数据组中所包含的表示存在比例的信息，计算数据组间的相似度。根据该结构，能够使坐标进一步高精度地表示出微生物群落的状态。
也可以是，微生物群落分析系统还具备：读取单元，从存在于活性污泥中的多种微生物读取基因的碱基序列；以及数据生成单元，基于由读取单元读取的基因的碱基序列，生成数据组，并将数据组输入到输入单元。根据该结构，能够可靠地输入包含表示碱基序列的信息的数据组，能够可靠地实施本发明的一个实施方式。
本发明的一个实施方式的判定系统，基于由本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统生成的判定规则，根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态，该判定系统具备：输入单元，输入数据组，该数据组包含表示作为判定对象的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；相似度计算单元，基于由输入单元输入的判定对象的数据组中所包含的碱基序列，计算该判定对象的数据组与生成判定规则所用的数据组之间的相似度；坐标计算单元，基于由相似度计算单元计算出的相似度，计算判定对象的数据组在多维空间上的坐标；以及判定单元，基于由微生物群落分析系统生成的判定规则，根据由坐标计算单元计算出的判定对象的数据组的坐标来判定多种微生物的状态。根据本发明的一个实施方式的判定系统，能够进行基于由微生物群落分析系统生成的判定规则的判定。
另外，本发明除了可以如上述那样记载为微生物群落分析系统和判定系统的发明以外，还可以如下述那样记载为微生物群落分析方法和判定方法的发明。其是仅类型不同、但实质上相同的发明，发挥同样的作用和效果。
即，本发明的一个实施方式的微生物群落分析方法为微生物群落分析系统的操作方法，包括以下步骤：输入步骤，输入多个数据组，该数据组包含表示存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；相似度计算步骤，基于在输入步骤中输入的数据组中所包含的碱基序列，计算数据组间的相似度；以及坐标计算步骤，基于在相似度计算步骤中计算出的相似度，计算数据组各自在多维空间上的坐标。
此外，本发明的一个实施方式的判定方法为判定系统的操作方法，该判定系统基于由本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统生成的判定规则，根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态，该判定方法包括以下步骤：输入步骤，输入数据组，该数据组包含表示作为判定对象的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；相似度计算步骤，基于在输入步骤中输入的判定对象的数据组中所包含的碱基序列，计算该判定对象的数据组与生成判定规则所用的数据组之间的相似度；坐标计算步骤，基于在相似度计算步骤中计算出的相似度，计算判定对象的数据组在多维空间上的坐标；以及判定步骤，基于由微生物群落分析系统生成的判定规则，根据在坐标计算步骤中计算出的判定对象的数据组的坐标来判定多种微生物的状态。
发明效果
在本发明的一个实施方式中，基于构成微生物群落的多种微生物各自的基因的碱基序列，计算在多维空间上的坐标。基于碱基序列的分析与电泳分析相比，不论是定量还是定性精度都更高。因此，与使用了电泳分析的情况相比，通过本发明的一个实施方式的微生物群落分析系统计算出的坐标更高精度地表示出微生物群落的状态。即，根据本发明的一个实施方式，能够高精度地对微生物群落进行分析。
附图说明
图1是示出本发明的实施方式的微生物群落分析系统的结构的图。
图2是示出所计算出的二维空间上的坐标的例子的图。
图3是示出所计算出的三维空间上的坐标的例子的图。
图4是示出通过本发明的实施方式的微生物群落分析系统生成判定规则时所执行的处理(微生物群落分析方法)的流程图。
图5是示出通过本发明的实施方式的微生物群落分析系统进行判定时所执行的处理(判定方法)的流程图。
具体实施方式
以下，对附图以及本发明的微生物群落分析系统、判定系统、微生物群落分析方法及判定方法的实施方式进行详细说明。此外，在附图的说明中，对同一要素标记同一标号并省略重复的说明。
图1示出本实施方式的微生物群落分析系统1。微生物群落分析系统1对存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物的集合、即微生物群落(细菌群落)的状态进行定量化而进行管理。在本实施方式中，作为对象的水处理例如为用于减小工业废水、公共下水、污水等危害自然环境的水对自然环境的影响的处理。此外，该水处理通过使用了包含微生物群落的活性污泥的水处理系统来进行。活性污泥中所含的微生物种类数通常为数千～数万以上。此外，该活性污泥通常添加到生物反应槽(bio tank、活性污泥槽)中，通过使作为处理对象的水流入到该生物反应槽内来进行水处理。生物反应槽通常包括好氧槽和厌氧槽。该水处理例如与工厂的运行相应地持续进行。此外，该水处理本身是一直以来都在进行的水处理。
微生物群落分析系统1计算表示微生物群落的状态的在多维空间上的坐标，来作为微生物群落的状态的定量化。该坐标基于多个微生物群落的状态间的相似度(相似性、β多样性)而相对地确定。如果两个表示微生物群落的状态的坐标彼此靠近则意味着它们的状态相近。如果两个表示微生物群落的状态的坐标彼此远离则意味着它们的状态相差较大。本实施方式中，微生物群落的状态至少反映微生物群落中的微生物构成(微生物群落中包含何种微生物)。
能够利用该坐标来管理微生物群落的状态。例如，预先存储表示正常进行水处理(即，水处理后的水对自然环境的影响充分减小)的活性污泥中的微生物群落的状态、即处于健康状态的微生物群落的状态的坐标。计算表示未知状态的微生物群落的状态的坐标，并与表示处于健康状态的微生物群落的状态的坐标进行比较，由此能够判定微生物群落的状态。
微生物群落分析系统1使用表示微生物群落的状态的坐标来生成用于判定微生物的状态的判定规则。此外，微生物群落分析系统1还使用所生成的判定规则来进行判定。
如图1所示，微生物群落分析系统1包括计算机10和测序仪20而构成。计算机10是承担微生物群落分析系统1的主要功能的装置，是进行坐标的计算、判定规则的生成及使用判定规则的判定的装置。具体而言，计算机10具备CPU(Central Processing Unit，中央处理器)、存储器、通信模块等硬件。这些构成要素根据程序等而工作，从而发挥后述的计算机10的功能。
测序仪20是从存在于活性污泥中的多种微生物读取(确定)基因的碱基序列的读取单元。作为测序仪20，可以使用可同时读取(分析)多种微生物的基因的所谓新一代测序仪。作为测序仪20，也可以使用现有的测序仪，例如罗氏公司制造的GS Junior System测序仪、罗氏公司制造的GS FLX+System测序仪、或者Illumina公司制造的MiSeq System测序仪。此外，作为微生物的基因的碱基序列，测序仪20可以读取16S核糖体RNA基因的碱基序列。其原因在于，16S核糖体RNA基因的碱基序列是对于每一微生物种别而言相对特征性的序列。此外，为了读取16S核糖体RNA基因的碱基序列，预先制备从活性污泥采集并输入到测序仪20的测序用样品(污泥样品)。活性污泥例如从好氧槽和厌氧槽分别采集。测序用样品的制备、以及碱基序列的读取(测序)例如可以如下进行。
[微生物群落的DNA的制备]
从活性污泥采集约1.5ml的含微生物群落的溶液，在室温下离心(13,000rpm×5分钟)。除去上清后加入1ml灭菌生理盐水，颠倒混合5秒左右，然后在室温下离心(13,000rpm×5分钟)。除去上清后，加入300μl裂解缓冲液(AMR公司制造)并充分混合后，将所得到的悬浮液添加到加入了珠子的管(Easy Extract for DNA(AMR公司制造))中后，用涡旋混合器进行2分钟的搅拌破碎。在破碎液中添加300μl的TE溶液(10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)(以下记作TE)，在4℃下离心(13,000rpm×5分钟)。然后，将450μl上清液加入到新管中，向其中加入600μl的苯酚混合液(Easy Extract for DNA所附带的(AMR公司制造))，进行1分钟的涡旋混合、搅拌后，在4℃下离心(13,000rpm×5分钟)。回收300μl上清并加入到新管(1.5ml)中，在其中加入1200μl的乙醇(99.5％)，在4℃下离心(13,000rpm×5分钟)。除去上清后，加入1000μl的冷乙醇(70％)，在4℃下离心(13,000rpm×5分钟)，将得到的DNA片状沉淀物真空干燥，然后加入150μl的TE，作为细菌群落DNA的溶液。
[16S核糖体RNA基因的V3-V4区域的PCR扩增]
测定细菌群落DNA的溶液中的双链DNA浓度，基于其测定值而以50ng的DNA为模板，使用通用引物组(正向引物fw357F(序列号1)和反向引物RV926r(序列号2))，对16S核糖体RNA基因(以下记作16S基因)的V3-V4区域进行PCR扩增。关于PCR，使用宝生物公司制造的“Premix Ex Taq Hot Start Version”(注册商标)，制作50μl的含有50pmol各引物的反应液，在94℃下预热2分钟后，分别以98℃×10秒、50℃×30秒、72℃×80秒进行变性、退火、延伸，重复25个循环。
以下示出正向引物HA13621-fw357F的序列结构。该正向引物在5’末端侧含有用测序仪20进行序列确定所需的接头A序列(以大写字母示出)、夹着各被测物所特有的10个碱基的条形码序列、且在3’末端侧含有与全部真细菌的16S基因退火的通用引物序列fw357F(以小写字母示出)。上述条形码序列是用于样品间的识别、同时与供于测序仪20的样品数对应的任意设计的碱基序列。
接头A序列(序列号3)
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3’
通用引物序列fw357F(序列号1)
5’-cctacgggaggcagcag-3’
对上述条形码序列的作用进行说明。例如，在同时进行10个被测物的分析时，可以制作10套具有不同条形码序列的HA13621-fw357F，并使用各套对各被测物进行PCR扩增。在将这些混合并供于测序仪20时，在利用通过1次运行能够得到100万个数据的GS FLX+System测序仪的情况下，通过使用与100个被测物对应的100套条形码序列，能够通过1次运行得到1万个数据/被测物的序列数据。
以下示出反向引物HA13619-RV926r的序列结构。该反向引物在5’末端侧含有用测序仪20进行序列确定所需的接头B序列(以大写字母示出)、且在3’末端侧含有与全部真细菌的16S基因退火的通用引物序列RV926r(以小写字母示出)。
HA13619-RV926r的序列(序列号4)
5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGccgtcaattccttttragttt-3’
通过使用上述通用引物组的PCR，能够扩增构成细菌群落的各种细菌种的包含16S基因的V3-V4区域的DNA(约570个碱基)，并以其PCR产物DNA形式得到它们的混合物。
[PCR产物的生成和测序用样品的制备]
将从各个细菌群落DNA得到的PCR产物DNA(构成该细菌群落的各种细菌种的包含16S基因的V3-V4区域的DNA的混合物)混合，用DNA CLEANER(和光纯药公司制造)处理以除去过量的引物、底物核苷酸等而进行纯化。纯化DNA在用200μl的TE洗脱后回收。然后，将所回收的纯化DNA溶液供于琼脂糖凝胶电泳，切出约570bp的DNA片段，用MinElute GelExtractionKit(Qiagen公司制造)提取，从而制备供于测序仪20的DNA。将其作为用于以下测序的测序用样品。
[16S基因的测序和序列数据的精度评价]
将上述测序用样品供于作为测序仪20的罗氏公司制造的GS FLX+System测序仪，进行测序。测序的条件和步骤工序等按照制造商规定的操作说明。此外，在该测序仪中，将上述制备的PCR产物DNA的1分子固定在1个珠子上，然后将珠子一个一个地捕捉到在水(含有用于扩增测序用模板DNA的PCR引物、底物核苷酸、DNA合成酶)与油的乳液中独立形成的一个一个的微小水滴中，在其中进行PCR，从而扩增、制备测序用模板DNA。因此，通过在滴定板上将固定有该扩增出的模板DNA的各珠子分区后、在该分区位置上读取测序反应的信号，从而能够随机地确定上述测序用样品中所含的PCR产物DNA(构成该细菌群落的各个细菌种的包含16S基因的V3-V4区域的DNA的混合物)的碱基序列。此外，如果预先将正向引物HA13621-fw357F中的上述条形码序列设为来自各样品的各被测物的特征性的任意序列，则能够使用GS FLX+System测序仪对约100种细菌群落样品进行同时分析，能够用约10～23小时对来自某一活性污泥的样品确定2,000～10,000个16S基因的序列数据。即，能够不受菌种限定地对活性污泥中所含的细菌群落进行包罗性分析。
以上为进行测序用样品的制备、和碱基序列的读取的方法的一例。此外，测序用样品的制备、和碱基序列的读取还可以通过上述方法以外的方法来进行。测序仪20与计算机10可以以能进行信息的发送和接收的方式来连接。测序仪20将所读取的表示各微生物的碱基序列的信息(序列信息)发送到计算机10。这里，被发送到计算机的序列信息为利用测序仪20测序而得的原始序列数据、即所谓的粗序列数据。
接下来说明本实施方式的计算机10的功能。如图1所示，计算机10构成为具备数据生成部11、输入部12、相似度计算部13、坐标计算部14、判定规则生成部15及判定部16。
数据生成部11是从测序仪20接收测序仪20所读取的存在于活性污泥中的多种微生物的碱基序列、并基于该碱基序列生成用于计算坐标的数据的数据生成单元。用于计算坐标的数据是包含表示各微生物的种别(微生物种、菌种)的存在于活性污泥中的微生物各自的基因的碱基序列的信息的数据组。1个数据组对应于1个微生物群落，对于被加入到同一生物反应槽的活性污泥，包含表示存在于同一时间点的活性污泥中的微生物的全部种别各自的基因的碱基序列的信息。其中，在难以严密地把握所述全部种别的碱基序列的情况下，不需要严密地包含表示所述全部种别的碱基序列的信息，含有计算坐标所需的程度的碱基序列即可。
作为用于计算坐标的数据，需要多个上述数据组。例如，对于被加入到同一生物反应槽的活性污泥，将与多个不同时间点的活性污泥各自相关的数据组作为用于计算坐标的多个数据组。例如，多个数据组为每隔一周的多周的微生物群落的碱基序列的数据。即，每隔一周从活性污泥采集含微生物群的溶液，来生成数据组。或者，也可以将与被加入到彼此不同的生物反应槽的活性污泥各自相关的数据组作为用于计算坐标的多个数据组。
各数据组中可以仅含有微生物的每个种别的碱基序列，也可以含有微生物各自的存在比例(存在概率)的数据。该存在比例是各微生物种别(微生物种、菌种)的、活性污泥中所含的该种别的微生物数量相对于该活性污泥中所含的全部微生物数量的比例。其中，在难以严密地把握该比例等的情况下，不需要严密地为相对于全部微生物数量的数量比例，为接近于计算坐标所需的程度的比例即可。
例如，数据生成部11按照以下方式进行该数据的生成。数据生成部11从测序仪20接收粗序列数据。此外，将从测序仪20接收的粗序列数据设为与多个数据组相关的数据、例如与多个时间点的活性污泥相关的数据。即，按照可得到这样的数据的方式利用测序仪20进行测序。
对于所得到的粗序列数据(例如，上述例子中为约570个碱基/数据)，数据生成部11基于序列数据中所含的样品固有的条形码序列将各序列分配到各固有的样品(相当于多个数据组的各数据组)。数据生成部11除去该序列数据的序列长度不足200、为1000以上、与通用引物序列(fw357F)的错配为1以上、用测序仪附带的质量程序求出的确定了序列的碱基序列的平均质量值为25以下的序列数据，从而提取高精度数据。
数据生成部11将所取得的高精度序列数据供于基于聚类分析(相似度95％、97％、或99％的阈值)的运算分类单元(Operational Taxonomic Unit)分析(以下记作OTU分析)。在OTU分析中，进行以序列数据的相似度为基准将各序列数据分组的操作。在此检测彼此具有95％以上的序列相似度的序列数据的聚类组(以下记作OTU)。此外，序列数据的聚类分析可以使用现有技术、例如免费软件Uclust来进行。能够推测各OTU基本来自同种细菌(微生物)。从而能够认为，利用聚类分析得到的OTU的总数(OTU数量)在可检测范围内与构成该细菌群落(微生物群落)的细菌种(微生物种)的数量等价。数据生成部11确定代表各聚类组的碱基序列、即代表序列数据。代表序列数据的确定可以使用此前一直使用的方法来进行。
此外，根据各OTU中所含的序列数据数能够求出总序列数据数中的各OTU的比例，即菌种组成比，也即上述存在比例。进而，通过对各OTU的代表序列数据在上述16S基因和细菌基因组的数据库中进行同源性检索，能够归属于具有最高序列相似度的已知菌种，即鉴定OTU的菌种。此外，在本实施方式中，虽然并非必须进行菌种的鉴定，但由于能够把握活性污泥中具体包含哪种菌种的细菌，因而对判定结果的分析等有益。此外，对于数据组中所包含的序列数据数(序列数的计数)非常少(例如1、2或3)的OTU(聚类组)，由于多数情况下并非有效的信息而有时成为计算上的噪声，因此可以预先从数据组的数据中去除。
数据生成部11将上述各聚类组的代表序列数据作为构成数据组的碱基序列。此外，数据生成部11还可以对于各数据组计算上述细菌种(碱基序列)各自的存在比例，并作为微生物各自的存在比例(存在概率)的数据包含在数据组中。数据生成部11将所生成的多个数据组输出到输入部12。
输入部12是从数据生成部11输入多个上述数据组的输入单元。输入部12将所输入的数据组输出到相似度计算部13。
相似度计算部13是基于由输入部12输入的数据组中所含的碱基序列来计算数据组之间的相似度的相似度计算单元。此外，在数据组包含微生物各自的存在比例的数据的情况下，相似度计算部13也可以基于表示该存在比例的信息来计算数据组间的相似度。例如，当数据组中所含的微生物的碱基序列本身、以及微生物的碱基序列的构成(以何种存在比例包含何种碱基序列)彼此相似时，则相似度提高。相似度计算部13计算两个数据组之间的相似度。此外，相似度计算部13对于全部数据组的组合计算相似度。
相似度的计算可以利用此前一直使用的方法、例如UniFrac分析来进行。UniFrac分析是如下方法：对于由碱基序列的数据组构成的任意的多个组，根据属于各组的碱基序列(属于各OTU的代表碱基序列)彼此的相似度和序列数对各组间的相似度进行数值化(Lozupone C and Knight R:UniFrac：a new phylogenetic method for comparingmicrobial communities.ApplEnviron Microbiol 71：8228-8235(2005))。UniFrac分析例如可以使用科罗拉多大学提供的免费软件Unifrac来进行。
利用UniFran分析得到的相似度是以系统树上的系统距离(UniFrac Distance)(以下记作组间相似距离)的形式被计算出的。数据组间的相似度越高则组间相似距离的值越小。相似度计算部13将所计算的数据组间的相似度、即组间相似距离的值输出到坐标计算部14。此外，为了进行基于判定规则的判定，相似度计算部13预先存储有用于计算相似度的信息。此外，相似度的计算并非必须利用UniFrac分析来进行，只要能够计算多个含有碱基序列的数据组间的相似度则可以通过任意的方法来进行。
坐标计算部14是基于由相似度计算部13计算出的相似度来计算数据组各自在多维空间上的坐标的坐标计算单元。这里计算的坐标是表示对应于各数据组的上述微生物群落的状态的坐标。以相似的数据组的坐标靠近、不相似的数据组的坐标远离的方式计算。所计算的坐标的维数预先设定并存储在坐标计算部14中。例如，计算二维、或三维的坐标。通过设为二维、或三维的坐标，能够进行图示，能够从视觉上确认微生物群落的状态。
坐标的计算可以利用一直以来使用的方法、例如多维尺度构成法(MDS)来进行。多维尺度构成法是如下方法：以关于对象的任意基准的相似度为基础，将该对象作为坐标配置在多维空间上。多维尺度构成法例如可以使用免费软件(R等)、市售的程序来进行。此外，坐标的计算并非必须使用多维尺度构成法进行，只要能够基于相似度计算坐标则可以利用任意的方法来进行。
图2中的(a)和图3中示出了对所计算的坐标进行图示的图表的例子。图2中的(a)是在二维空间上绘制坐标而成的。图3是在三维空间上绘制坐标而成的。图2中的用正方形和三角形表示的各坐标、以及图3中的用圆形表示的各坐标对应于各数据组、即各微生物群落的状态。坐标计算部14将表示所计算出的坐标的信息输出到判定规则生成部15。此外，为了进行基于判定规则的判定，相似度计算部13预先存储有用于计算坐标的信息。
判定规则生成部15是如下的判定规则生成单元：基于坐标计算部14所计算出的坐标，生成用于根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态的判定规则。判定规则是例如对该多种微生物、即微生物群落能否正常进行水处理进行判定的规则。能正常进行水处理是指：例如，处理后的水满足水处理后的水对自然环境的影响充分降低这样的一定的基准。更具体而言，是指能够以一定以上的比例处理(分解)成为处理对象的特定化学物质。
判定规则使用坐标来进行判定，其中，所述坐标基于构成成为判定对象的微生物群落的微生物各自的基因的碱基序列。即，判定规则使用基于与计算上述坐标时所用的数据组同样形式的数据组的信息来进行判定。
判定规则生成部15在生成判定规则时，例如，预先将与由坐标计算部14计算的坐标相关的微生物群落设为能正常进行水处理的微生物群落。即，由坐标计算部14计算的坐标的集合相当于能正常进行水处理的微生物群落的集合。判定规则生成部15确定一个范围来作为判定规则，所述范围包含从与能正常进行水处理的微生物群落相关的坐标的集合推定的、与能正常进行水处理的微生物群落相关的坐标而成。判定能够通过判断与成为判定对象的微生物群落相关的坐标是否包含在该范围内来进行。如果与成为判定对象的微生物群落相关的坐标包含在该范围内，则判定成为判定对象的微生物群落为能正常进行水处理的微生物群落。另一方面，如果与成为判定对象的微生物群落相关的坐标未包含在该范围内，则判定成为判定对象的微生物群落可能不是能正常进行水处理的微生物群落。
判定规则生成部15根据与能正常进行水处理的微生物群落相关的多个坐标，计算例如被推定为在统计学上以一定以上的概率(例如95％)包含该多个坐标的范围(例如95％置信区间)，来作为成为判定规则的范围。95％置信的计算可以利用一直以来使用的统计学方法进行。95％置信的计算例如可以使用免费软件(R等)、市售的程序来进行。
或者，判定规则生成部15生成判定规则时，例如预先将与由坐标计算部14计算的坐标相关的微生物群落设为包含能正常进行水处理的微生物群落和不能正常进行水处理的微生物群落双方，并且使得在计算机10中能够区别这两者。可以使判定规则生成部15计算最佳地区分包含与能正常进行水处理的微生物群落相关的坐标的区域和包含与不能正常进行水处理的微生物群落相关的坐标的区域的边界，来作为判定规则。根据该判定规则，能够通过与成为判定对象的微生物群落相关的坐标包含在哪一区域中来进行判定。该边界的计算可以利用一直以来使用的统计学方法或数理方法进行。
此外，判定规则生成部15还可以通过机器学习来生成判定规则。判定规则生成部15将表示所生成的判定规则的信息输出到判定部16。
判定部16是基于由判定规则生成部15生成的判定规则来判定作为判定对象的微生物群落的状态的判定单元。如上所述，判定规则用于根据与作为判定对象的微生物群落相关的坐标来判定该作为判定对象的微生物群落的状态。即，判定部16输入表示与作为判定对象的微生物群落相关的坐标的信息并进行判定。判定对象为(想进行判定的时间点的)水处理系统的活性污泥中所含的微生物群落。作为判定对象的微生物群落可以设为：与取得生成判定规则所用的数据组的水处理系统相同的(且不同时间点的)水处理系统的活性污泥中所含的微生物群落。但是，作为判定对象的微生物群落也可以是取得生成判定规则所用的数据组的水处理系统以外的水处理系统的活性污泥中所含的微生物群落。
与作为判定对象的微生物群落相关的坐标可与生成判定规则时的各数据组的坐标同样地求出。即，坐标的计算可如下地进行。测序仪20从构成作为判定对象的微生物群落的多种微生物读取基因的碱基序列。测序仪20将所读取的表示成为判定对象的多种微生物各自的碱基序列的信息(序列信息)发送到计算机10中。
在计算机10中，数据生成部11从测序仪20接收序列信息、并根据该序列信息生成包含表示成为判定对象的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息的数据组。
数据生成部11将所生成的包含表示判定对象微生物的碱基序列的信息的数据组输出到输入部12。输入部12输入该数据组而输出到相似度计算部13。相似度计算部13输入该数据组而计算该数据组与生成判定规则时所用的各数据组之间的相似度。相似度计算部13将所计算出的相似度输出到坐标计算部14。坐标计算部14基于由从相似度计算部13输入的信息表示的相似度，计算判定对象的数据组在多维空间上的坐标。相似度的计算和坐标的计算与生成判定规则时同样地进行。坐标计算部14将表示判定对象的数据组的坐标的信息输出到判定部16。
判定部16基于判定规则，使用由从坐标计算部14输入的信息表示的坐标来进行判定。例如，如上所述，判定部16对成为判定对象的坐标是否包含在95％置信区间加以判断。在判断成为判定对象的坐标包含在95％置信区间的情况下，判定部16判定：成为判定对象的微生物群落为能正常进行水处理的微生物群落。在判断成为判定对象的坐标未包含在95％置信区间的情况下，判定部16判定：成为判定对象的微生物群落可能不是能正常进行水处理的微生物群落。
判定部16输出判定结果。判定结果的输出例如通过在计算机10所具备的显示器等显示装置中显示来进行。此外，判定结果的输出例如也可以通过发送到其它装置、计算机10内的其它模块来进行。以上为本实施方式的计算机10的功能。
接下来使用图4和图5的流程图来说明本实施方式的微生物群落分析系统1所执行的处理(微生物群落分析系统1的操作方法)、即微生物群落分析方法和判定方法。首先，使用图4的流程图来说明生成判定规则时所执行的处理。本处理中，首先利用测序仪20读取构成水处理系统中所用的微生物群落的微生物的基因的碱基序列(S01、读取步骤)。在此读取多个时间点的构成微生物群落的微生物的基因的碱基序列。将所读取的碱基序列的数据从测序仪20输出到计算机10。
在计算机10中，利用数据生成部11接收从测序仪20发送的碱基序列的数据。接下来，利用数据生成部11基于碱基序列的数据生成多个包含表示多种微生物各自的基因的碱基序列的信息的数据组(S02、数据生成步骤)。接下来，将所生成的多个数据组、至此为止所生成的数据(包含基于以前所生成的多个时间点的构成微生物群落的微生物的基因的碱基序列碱基序列的数据来表示多种微生物各自的基因的碱基序列的信息的数据组)从数据生成部11输入到输入部12(S03、输入步骤)。
将所输入的多个数据组从输入部12输出到相似度计算部13。接下来，利用相似度计算部13计算数据组间的相似度(S04、相似度计算步骤)。将所计算出的表示数据组间的相似度的信息从相似度计算部13输出到坐标计算部14。
接下来，利用坐标计算部14基于由相似度计算部13计算出的相似度来计算数据组各自在多维空间上的坐标(S05、坐标计算步骤)。将表示所计算出的坐标的信息从坐标计算部14输出到判定规则生成部15。接下来，利用判定规则生成部15基于由从相似度计算部13输入的信息表示的坐标来生成判定规则(S06、判定规则生成步骤)。将表示所生成的判定规则的信息从判定规则生成部15输出到判定部16。以上为生成判定规则时所执行的处理。
接下来，使用图5的流程图来说明进行判定时所执行的处理。在本处理中，首先利用测序仪20读取判定对象的时间点的构成在水处理系统中所用的微生物群落的微生物的基因的碱基序列(S11、读取步骤)。将所读取的碱基序列的数据从测序仪20输出到计算机10。
在计算机10中，利用数据生成部11接收从测序仪20发送的碱基序列的数据。接下来，利用数据生成部11基于碱基序列的数据，基于碱基序列的数据来生成包含表示多种微生物各自的基因的碱基序列的信息的判定对象的数据组(S12、数据生成步骤)。接下来，将所生成的数据组从数据生成部11输入到输入部12(S13、输入步骤)。
将所输入的判定对象的数据组从输入部12输出到相似度计算部13。接下来，利用相似度计算部13计算判定对象的数据组与生成判定规则时所用的各数据组之间的相似度(S14、相似度计算步骤)。将所计算出的表示数据组间的相似度的信息从相似度计算部13输出到坐标计算部14。
接下来，利用坐标计算部14基于由相似度计算部13计算出的相似度来计算判定对象的数据组在多维空间上的坐标(S15、坐标计算步骤)。将所计算出的表示判定对象的坐标的信息从坐标计算部14输出到判定部16。
接下来，利用判定部16基于由判定规则生成部15生成的判定规则，根据由坐标计算部14计算出的坐标来判定该判定对象的微生物群落的状态(S16、判定步骤)。表示判定结果的信息例如以用户能够识别的方式来显示。以上为判定时所执行的处理。
如上所述，根据本实施方式，基于构成微生物群落的多种微生物各自的基因的碱基序列，计算在多维空间上的坐标。基于碱基序列的分析与电泳分析相比，不论是定量还是定性精度都高。因此，通过本实施方式计算出的坐标与使用电泳分析的情况相比，高精度地表示出微生物群落的状态。即，根据本实施方式，能够高精度地对微生物群落进行分析。
此外，也可以是如本实施方式所示地，根据所计算出的坐标来生成用于判定微生物群落的状态的判定规则。根据该结构，例如能够生成上述那样的用于判定微生物群落是否处于正常状态(健康状态)的判定规则。通过本实施方式计算出的坐标高精度地表示出微生物群落的状态，因此根据该判定规则，能够高精度地进行判定。
此外，可以具有使用如本实施方式所示地生成的判定规则进行判定的结构。即，微生物群落分析系统1可以如本实施方式那样兼具判定系统。根据该结构，能够进行基于所生成的判定规则的判定。但是，判定规则的生成或判定并非必须在微生物群落分析系统1中进行，也可以利用微生物群落分析系统1以外的装置或系统来进行。在这种情况下，将通过微生物群落分析系统1计算出的坐标、或者通过微生物群落分析系统1生成的判定规则输出到该微生物群落分析系统1以外的判定系统。该判定系统具有与上述微生物群落分析系统1的判定相关的功能。
关于化学工厂等的生物学性废水处理施设，在工厂设备的定期检修期间，使甲醇等流入到生物学性废水处理施设中来维持活性污泥，但对于定期检修期之后的废水处理为实现稳定处理，需要驯化期间，处理需要时间。截至目前仍没有计量驯化期间的终点的管理方法，难以判明能稳定地进行处理的状态，谋求新的管理方法。通过进行基于如上所述的本实施方式的微生物群落的状态的分析、判定，能够容易地判明能稳定地进行处理的状态，能够适宜地进行水处理系统的微生物群落的管理。
此外，也可以是如本实施方式所示地，还基于微生物的存在比例来计算数据组间的相似度。根据该结构，能够使坐标进一步高精度地表示出微生物群落的状态。但是，对于相似度的计算而言，存在比例并非必需，也可以仅根据碱基序列来进行相似度的计算。
此外，也可以是如本实施方式所示地，读取微生物的基因的碱基序列的测序仪20包含于微生物群落分析系统1，并且基于所读取的碱基序列来生成数据组。根据该结构，能够可靠地输入微生物的碱基序列的数据组，能够可靠地实施本发明的一个实施方式。但是，微生物群落分析系统1并非必须包含测序仪20。即，微生物群落分析系统1(的计算机10的输入部12)也可以从外部输入数据组。
接下来，对通过本实施方式的微生物群落分析系统1计算出的表示微生物群落的状态的坐标和判定规则的例子进行说明。图2中的(a)示出在二维空间上绘制表示微生物群落的状态的坐标而成的图表。在图2中的(a)中，用方形表示的坐标是表示正常进行水处理的活性污泥中的微生物群落(正常细菌群)的状态的坐标。用三角形表示的坐标是表示对微生物群落进行8周的甲醇驯化而使水处理的功能下降了的活性污泥中的微生物群落(甲醇驯化第8周细菌群)的状态的坐标。图2中的(b)中示出各微生物群落的开始(S)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸处理起的第4.7天和第6天的处理率(％)。
如图2中的(a)所示，在配置有与正常细菌群对应的坐标的坐标区域和配置有甲醇驯化第8周细菌群的坐标区域中，分别形成了明显不同的坐标区域。由此明显可以看出，正常细菌群与甲醇驯化第8周细菌群至少在构成细菌群的细菌的种类及其存在量的多寡的菌群结构方面显著不同。
此外，如图2中的(a)所示，根据正常细菌群的坐标的集合计算作为本实施方式的判定规则的95％置信区间的区域A1。通过判断表示微生物群落的状态的坐标是否包含在该区域A1中，能够判定微生物群落的状态是否为健康状态。由此，以相对于正常细菌群的上述组间相似距离为指标，能够从任意被测物中检测出被评价为处理不良细菌群的被测物。
图3示出在三维空间上绘制表示微生物群落的状态的坐标而成的图表。在图3中，用空心圆形表示的坐标是表示正常进行水处理的活性污泥中的微生物群落(正常细菌群)的状态的坐标。用黑色圆形表示的坐标是表示对微生物群落进行甲醇驯化而使水处理的功能下降了的活性污泥中的微生物群落的状态的坐标。用黑色圆形表示的坐标的符号中所含的数值表示进行了几周的甲醇驯化。即，MTA12w表示进行了12周的甲醇驯化。
如图3所示，与进行了12周的甲醇驯化的微生物群落对应的坐标位于远离与正常细菌群对应的坐标的位置。在该例子中，如图3所示，也根据正常细菌群的坐标的集合来计算作为本实施方式的判定规则的区域A2。
标号说明
1…微生物群落分析系统、10…计算机、11…数据生成部、12…输入部、13…相似度计算部、14…坐标计算部、15…判定规则生成部、16…判定部、20…测序仪。
Figure ISB0000167728270000011
Figure ISB0000167728270000021

Claims (6)

1.一种微生物群落分析系统，具备：
输入单元，输入多个数据组，所述数据组包含表示存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；
相似度计算单元，基于由所述输入单元输入的数据组中所包含的碱基序列，计算数据组间的相似度；
坐标计算单元，基于由所述相似度计算单元计算出的相似度，计算所述数据组各自在多维空间上的坐标；以及
判定规则生成单元，该判定规则生成单元基于由所述坐标计算单元计算出的坐标生成判定规则，该判定规则用于根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态。
2.根据权利要求1所述的微生物群落分析系统，其中，
所述输入单元输入还包含表示多种微生物各自的存在比例的信息的所述数据组，
所述相似度计算单元还基于由所述输入单元输入的数据组中所包含的表示存在比例的信息，计算数据组间的相似度。
3.根据权利要求1或2所述的微生物群落分析系统，其中，还具备：
读取单元，从存在于所述活性污泥中的多种微生物读取基因的碱基序列；以及
数据生成单元，基于由所述读取单元读取的基因的碱基序列，生成所述数据组，并将所述数据组输入到输入单元。
4.一种判定系统，基于由权利要求1所述的微生物群落分析系统生成的判定规则，根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态，所述判定系统具备：
输入单元，输入数据组，所述数据组包含表示作为判定对象的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；
相似度计算单元，基于由所述输入单元输入的所述判定对象的数据组中所包含的碱基序列，计算该判定对象的数据组与生成所述判定规则所用的数据组之间的相似度；
坐标计算单元，基于由所述相似度计算单元计算出的相似度，计算所述判定对象的数据组在多维空间上的坐标；以及
判定单元，基于由所述微生物群落分析系统生成的判定规则，根据由所述坐标计算单元计算出的所述判定对象的数据组的坐标来判定所述多种微生物的状态。
5.一种微生物群落分析方法，其为微生物群落分析系统的操作方法，包括以下步骤：
输入步骤，输入多个数据组，所述数据组包含表示存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；
相似度计算步骤，基于在所述输入步骤中输入的数据组中所包含的碱基序列，计算数据组间的相似度；
坐标计算步骤，基于在所述相似度计算步骤中计算出的相似度，计算所述数据组各自在多维空间上的坐标；以及
判定规则生成步骤，该判定规则生成步骤基于由所述坐标计算步骤计算出的坐标生成判定规则，该判定规则用于根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态。
6.一种判定方法，其为判定系统的操作方法，所述判定系统基于由权利要求1所述的微生物群落分析系统生成的判定规则，根据存在于进行水处理的活性污泥中的多种微生物各自的基因的碱基序列来判定该多种微生物的状态，所述判定方法包括以下步骤：
输入步骤，输入数据组，所述数据组包含表示作为判定对象的多种微生物各自的基因的碱基序列的信息；
相似度计算步骤，基于在所述输入步骤中输入的所述判定对象的数据组中所包含的碱基序列，计算该判定对象的数据组与生成所述判定规则所用的数据组之间的相似度；
坐标计算步骤，基于在所述相似度计算步骤中计算出的相似度，计算所述判定对象的数据组在多维空间上的坐标；以及
判定步骤，基于由所述微生物群落分析系统生成的判定规则，根据在所述坐标计算步骤中计算出的所述判定对象的数据组的坐标来判定所述多种微生物的状态。
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