KR20220012683A

KR20220012683A - 인공신경망 모델을 이용한 토양 오염원 예측 방법

Info

Publication number: KR20220012683A
Application number: KR1020200091768A
Authority: KR
Inventors: 배효관; 오정은; 티 민 응우옌
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-02-04
Also published as: KR102537092B1

Abstract

본 발명은 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염원을 예측하는 방법 또는 상기 예측 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 관한 것이다. 본 발명의 토양 오염원 예측 방법 및 이를 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 이용하면, 오염된 토양의 오염원인을 쉽고, 경제적이며, 빠르게 분석이 가능하여 환경법의학 분야에서 널리 응용될 수 있다.

Description

인공신경망 모델을 이용한 토양 오염원 예측 방법 {Soil Pollution Source Prediction Method using Artificial Neural Network Model}

본 발명은 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염원을 예측하는 방법 또는 상기 예측 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 관한 것이다.

산업에서 널리 사용되는 유해 화학 물질은 누출 사고가 발생할 경우 환경 파괴의 잠재적 위험을 유발한다. 화학 물질 누출 사고의 유해한 영향은 산업 현장과 주거 지역이 명확하게 구분되지 않은 경우 산업 노동자, 주변 지역 사회 및 자연 환경에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 2012 년에는 구미의 Hube Global 화학 공장에서 약 8 톤의 고독성 불화수소가 인근 지역으로 누출되었다. 이 사건은 노동자의 사망과 자연 환경의 악화를 초래하였다. 그 외에도 염산, 질산 등의 산은 한국의 전자 장치 제조에서 에칭 및 양극 산화 처리와 같은 화학 처리에 일반적으로 사용된다.

화학사고의 원인을 밝히기 위해, 물질이 확산되거나 분해되기 전에 검사가 신속하게 이루어져야 한다. 오염원이 식별되면, 목표 물질을 제거하기 위한 방제대책을 정확하게 새우고 효율적으로 시행할 수 있다. 이를 위해, 오염 원인을 추적하기 위한 환경 법의학 기술의 개발이 필요하다.

환경 법의학 기술은 원인물질과 생분해 혹은 화학적 반응에 의해 생성된 중간체를 분석하는 기술이다. 크로마토그래피, 질량 분석 및 안정 동위 원소 기법의 조합을 분석에 사용할 수 있다. 분석법에 따라 고가의 장비 구입, 방사성 물질의 위험, 인적자원의 숙련, 노동 집약적 분석 등으로 인해 물질분석이 제한될 수 있다. 그리고 증발, 광반응, 강우에 의한 세척, 흡착, 생분해, 풍화 과정 등의 결과로 원인 물질 혹은 중간체가 소실될 수 있다. 그리고 질량이 과다하게 낮은 물질로 분해되면 원인물질의 특성을 대부분 잃어버리기 때문에 원인물질을 특정할 수 없다. 그리고 환경에서 일어나는 다양한 반응들은 시간과 장소에 따라 다르기 때문에 중간체에 대한 분석이 복잡하고 불확실성이 높다.

산/염기 누출 사고가 발생하면 토양의 산도가 급격히 변하고, 자연 생태와 인간에게 위해를 끼칠 수 있다. 불행하게도, 산/염기는 물이 있는 환경에서 빠르게 해리되어 양이온과 음이온으로 전환되고 강우나 지표수, 세척과정에서 발생된 물에 의해 오염을 쉽게 벗어난다. 그리고 불화수소 같은 경우 빠른 반응성 및 낮은 비점으로 인해 복잡한 분석절차가 필요하다.

박테리아 다양성은 중성 시료에서 높고 산성/염기성 시료에서 낮은 상관관계를 가진다. 이는 산도가 극도로 낮거나 높은 조건에서는 자생하는 미생물의 종류가 한정되기 때문이다. 토양 pH는 박테리아 커뮤니티를 구성하는데 중요한 요소다. 박테리아 성장에 가장 적합한 pH 범위는 5.5-9.0 이다. 그러나 예외의 경우도 있는데, 호산성 미생물은 약 pH 3.0에서 최적으로 자라고, 호알칼리성 미생물은 pH 8~10.5 사이에서 최적으로 자란다. 각 미생물 마다 최적의 pH가 있는데, 적절하지 않은 pH 환경에서는 박테리아 세포의 성장을 지지하는 효소 활성이 방해 받는다.

인공 신경망은 인간 두뇌의 정보 분석 활동과 유사한 정보 처리 기술 방법이다. 네트워크 구조에는 입력, 숨김 및 출력 레이어가 포함된다. 뉴런은 숨겨진 층으로 구성된다. 입력 레이어의 지정된 정보는 숨겨진 레이어로 전달된다. Khan 등 (Khan et al, 2019)은 Mycobacterium tuberculosis 감염에 대해 양성 또는 음성을 예측을 94 % 이상의 정확도에서 예측하였다. Nikkonen 등(Nikkonen et al., 2019)은 폐쇄성 수면 무호흡 상태를 교정하기 위해 환자를 분류하는데 90 % 이상의 정확도를 달성한 바 있다.

따라서, 박테리아 다양성과 인공 신경망 기술을 이용하여, 산/염기 유출사고 발생시 토양 오염원을 정확하고, 경제적이며, 신속하게 예측할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 박테리아 다양성과 인공신경망을 결합하여 토양 오염원을 예측하는 방법에 대해 연구하던 중 토양 샘플 내 미생물 DNA를 메타게놈 분석 또는 T-RFLP 분석을 시행하고, 이의 데이터를 이용하여 인공신경망 학습을 시키면 토양 오염원을 예측하는 것이 가능하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 토양 샘플 내 미생물 DNA 정보를 인공신경망 모델에 학습시켜, 토양 오염원을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 토양 오염 원인 정보가 있는 토양 샘플을 수집하는 단계; (2) 상기 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; (3) 상기 추출한 DNA를 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고, PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 토양 오염 원인 정보가 있는 T-RF 피크 데이터로 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계; (5) 오염 원인을 모르는 토양으로부터 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 상기 (3) 단계의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 단계; (6) 상기 증폭한 PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계; 및 (7) 상기 (6) 단계의 T-RF 피크 데이터를 입력변수로 하고, 상기 (4) 단계의 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염 원인을 예측하는 단계;를 포함하는, 토양 오염원 예측 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 토양 오염 원인 정보가 있는 토양 샘플을 수집하는 단계; (2) 상기 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; (3) 상기 추출한 DNA를 메타게놈 분석하고, 토양 내 존재하는 미생물의 조작분류단위(operational taxonomic unit)를 선정하는 단계; (4) 상기 (3)단계에서 선정한 조작분류단위를 이용하여, 토양 샘플 내 미생물 군집의 상대우점도 데이터를 산출하는 단계; (5) 상기 (4) 단계의 상대우점도 데이터로 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계; (6) 오염 원인을 모르는 토양으로부터 DNA를 추출하여 메타게놈 분석하고, 상기 (3)단계에서 선정한 조작분류단위를 이용하여, 토양 샘플 내 상대우점도 데이터를 산출하는 단계; 및 (7) 상기 (6) 단계의 토양 샘플 내 상대우점도 데이터를 입력변수로 하고, 상기 (5) 단계의 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염 원인을 예측하는 단계;를 포함하는, 토양 오염원 예측 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 토양 오염원 예측방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 제공한다.

본 발명의 토양 오염원 예측 방법 및 이를 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 이용하면, 오염된 토양의 오염원인을 쉽고, 경제적이며, 빠르게 분석이 가능하여 환경법의학 분야에서 널리 응용될 수 있다.

도 1은 토양 샘플이 담긴 토양 컬럼을 나타낸 도이다.
도 2는 산, 염기 누출 후 시간 경과에 따른 토양의 pH를 나타낸 도이다.
도 3은 산, 염기 누출 후 시간 경과에 따른 토양 컬럼 유출수의 pH를 나타낸 도이다.
도 4는 실험 개시 시점(0일)에 산, 염기 오염에 따른 토양 위치 별 pH 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 실험 개시 시 후 23일에 산, 염기 오염에 따른 토양 위치 별 pH 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 토양 샘플에 전처리 단계 없이 DNA를 추출하였을 때, DNA의 수율 및 품질을 나타낸 도이다.
도 7은 0.4 M 염화알루미늄 처리양에 따른 상등수 색도 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 산성 토양 샘플에 염화 알루미늄 전처리시 DNA 수율 및 품질 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 16S rRNA 기반 메타게놈 분석 결과를 주요 성분 분석 도표를 통해 시각화한 것을 나타낸 도이다.
도 10은 16S rRNA 기반 메타게놈 분석 결과를 계층적 군집화(hierarchical dendrogram)하여 그룹화한 것을 나타낸 도이다.
도 11은 산, 염기 처리 특성에 따른 미생물 군집구조를 확인하여 도출한 상대 우점도 데이터 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 OTU 선정을 위한 상동성 및 우점도 분석 기준 별 인공신경망 모델의 예측률(Accuracy %)을 나타낸 도이다.
도 13은 지표미생물이 적용된 종 수준 상대 우점도 데이터를 바탕으로 훈련시킨 인공신경망 모델의 예측률을 나타낸 도이다.
도 14는 토양 샘플 간 T-RF 피크 패턴을 RStudio(Boston, MA, USA)를 사용하여 주요 성분 분석(Principal component analysis)한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 토양 샘플 간 T-RF 피크 패턴을 RStudio(Boston, MA, USA)를 사용하여 계층적 군집화(hierarchical dendrogram)한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 지표미생물 결과를 T-RF 피크 데이터에 적용한 데이터를 이용하여 인공신경망을 훈련시키고, 예측률을 평가한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 (1) 토양 오염 원인 정보가 있는 토양 샘플을 수집하는 단계; (2) 상기 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계; (3) 상기 추출한 DNA를 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고, PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 토양 오염 원인 정보가 있는 T-RF 피크 데이터로 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계; (5) 오염 원인을 모르는 토양으로부터 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 상기 (3) 단계의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 단계; (6) 상기 증폭한 PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계; 및 (7) 상기 (6) 단계의 T-RF 피크 데이터를 입력변수로 하고, 상기 (4) 단계의 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염 원인을 예측하는 단계;를 포함하는, 토양 오염원 예측 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)는 환경 DNA시료에서 16S rRNA(박테리아)나 18S rRNA(곰팡이) 유전자 정보를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 확보한 후 제한 효소 소화(restriction enzyme digestion)를 통해서 해당 미생물군집의 지문정보(fingerprint)를 획득하는 방법이다. T-RFLP는 환경시료로부터 PCR을 통해 증폭된 미생물 DNA 염기서열의 차이를 빠르게 비교할 수 있으며 많은 양의 시료를 한번에 분석할 수 있는 장점이 있다(Dunbar 등, 2001). 하지만 종에 대한 정확한 정보를 알 수 없고, 종 다양성 분석 시 해상도(resolution)가 다소 떨어지는 단점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계의 DNA를 추출하는 단계는, 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계는 토양 오염 원인이 산성인 경우, 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계일 수 있으며, 바람직하게는 토양 샘플 1g당 0.2 내지 0. 6 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 466.7 내지 866.7μL를 전처리 하는 단계일 수 있고, 가장 바람직하게는 토양 샘플 1g당 0. 4 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 666.7μL를 전처리 하는 단계일 수 있다. 산성 토양 샘플에 상기 전처리 하는 단계를 더 포함하여 DNA 추출시 DNA의 품질이 향상되어 PCR에 적합한 DNA의 추출이 가능한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 '프라이머'는 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머 또는 서열번호 2의 역방향 프라이머일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 (3) 단계의 프라이머는 각 서열번호 1 및 2 중 어느 하나의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 PCR 증폭은 토양 내 미생물의 16s rRNA 유전자를 증폭하는 것 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (4) 단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계는 은닉층 뉴런을 1 내지 151의 범위로 하는 단계일 수 있으며, 바람직하게 (3) 단계의 프라이머를 서열번호 1의 정방향 프라이머로하고, (4) 단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계의 은닉층 뉴런을 143으로 하는 경우, 토양 오염원을 78.8%의 높은 확률로 예측할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 토양 오염원은 토양에 변화를 일으키는 물질이면 제한없이 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 무(無)오염, 암모니아, 염산, 황산, 불화수소 및 질산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 토양 내 존재하는 미생물의 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계의 DNA를 추출하는 단계는, 토양 오염 원인이 산성인 경우, 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 토양 샘플 1g당 0.2 내지 0. 6 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 466.7 내지 866.7μL를 전처리 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 토양 샘플 1g당 0. 4 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 666.7μL를 전처리 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 산성 토양 샘플에 상기 전처리 하는 단계를 더 포함하여 DNA 추출시 DNA의 품질이 향상되어 PCR에 적합한 DNA의 추출이 가능한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 메타게놈 분석은 추출한 DNA의 일부 또는 전체를 분석하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 미생물 DNA의 16S rRNA 유전자 V3 및/또는 V4 영역을 대상으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계의 조작분류단위(operational taxonomic unit)를 선정하는 단계는 토양 샘플로부터 추출한 DNA를 메타게놈 분석하여 토양 내 존재하는 여러 미생물의 염기서열을 분석하고, 분석한 여러 미생물의 염기서열을 사용자가 설정한 상동성 수준으로 그룹화하며, 상기 그룹화된 미생물 염기서열 중 개별 그룹 내 임의의 미생물 염기서열을 조작분류단위(operational taxonomic unit)로 선정하는 단계를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 상기 조작분류단위를 선정하는 단계는 염기서열 사이의 상동성을 95 내지 100%의 상동성 수준으로하여 선정하는 단계일 수 있다 .

본 발명에 있어서, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 계(Kingdom), 문(Phylum), 강(Class), 목(Order), 과(Family), 속(Genus) 또는 종(Species)을 기준으로 산출하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 과(Family), 속(Genus) 또는 종(Species)을 기준으로 산출하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계는 99%의 상동성 수준으로 조작분류단위를 선정하고, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 종(species)을 기준으로 산출하는 것일 수 있으며, 이 경우, 토양 오염원을 80.8%의 높은 확률로 예측할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 오염원 특이적인 지표 미생물의 상대우점도 데이터일 수 있으며, 바람직하게 상기 지표 미생물은 오염원이 없는 토양인 경우 Angustibacter luteus, Runella slithyformis, Cystobacter velatus, Geodermatophilus daqingensis, Pseudonocardia soli, Aquabacterium commune 및 Skermanella rubra으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 암모니아인 경우 Nitrosospira tenuis, Flavihumibacter sediminis, Flavobacterium saliperosum, Brevundimonas naejangsanensis, Actinotalea ferrariae, Nocardioides caricicola, Chryseobacterium montanum, Flavobacterium dankookense 및 Pedobacter bauzanensis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 염산인 경우 Mucilaginibacter polysacchareus, Dyella japonica, Actinocorallia aurantiaca, Pedobacter kyungheensi, Flavobacterium resistens, Pedobacter cryoconitis 및 Flavobacterium spartansii으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 질산인 경우 Methylophilus rhizosphaerae, Pseudomonas silesiensis, Ralstonia pickettii 및 Cupriavidus campinensis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 불화수소인 경우 Bacillus marisflavi, Paenibacillus aceris, Paraburkholderia hospital, Halobacillus profundi, Clostridium puniceum, Bacillus plakortidis, Bacillus aryabhattai, Paenibacillus populi, Rhodanobacter xiangquanii 및 Bordetella flabilis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 황산인 경우 Micromonospora noduli, Actinospica acidiphila, Desulfohalotomaculum peckii 및 Tumebacillus ginsengisoli으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 미생물 군집의 상대우점도 데이터를 오염원 특이적인 지표 미생물의 상대우점도 데이터로 하는 경우, 잡음 데이터를 줄여주므로 훈련 진행속도를 높이고 예측률을 높일 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계는 99%의 상동성 수준으로 조작분류단위를 선정하고, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 종(species)을 기준으로 산출하며, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 오염원 특이적인 지표 미생물의 상대우점도 데이터로 하며, 상기 (5) 단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계는 은닉층 뉴런을 7로 하는 경우, 토양 오염원을 85.0%의 높은 확률로 예측할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 하드웨어, 펌웨어, 또는 소프트웨어 또는 이들의 조합으로 구현될 수 있다. 소프트웨어로 구현되는 경우 저장매체는 컴퓨터와 같은 장치에 의해 판독 가능한 형태의 저장 또는 전달하는 임의의 매체를 포함한다. 예를 들면 컴퓨터 판독 가능한 매체는 ROM(read only memory); RAM(random access memory); 자기디스크 저장 매체; 광저장 매체; 플래쉬 메모리 장치 및 기타 전기적, 광학적 또는 음향적 신호 전달 매체 등을 포함한다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산/염기 오염원에 따른 토양 변화 분석

1.1 실험실 규모의 산, 염기 노출 토양 컬럼의 준비

35° 14' 38.4" N, 129° 03' 23.4" E 위치에 있는 부산에 위치한 정원에서 농장 토양을 채집하였다. 내경이 5 cm 인 총 6 개의 플라스틱 실린더를 사용하여 21 cm 길이의 토양 컬럼을 준비하였다. 실험 개시 시점(0 일)에 염산(1 N HCl), 질산(1 N HNO3), 불화수소(1 N HF), 황산(1 N H2SO4), 암모니아(0.01 N NH3)를 토양 컬럼에 토양의 부피와 동일하게 투여하였다. 대조군으로 수돗물을 투여하였다. 자연적인 강우 효과를 시뮬레이션하기 위해, 토양과 동일한 부피의 수돗물을 1 일부터 6 일까지 컬럼 상단에 투여하였다. 다음으로, 건조 기간을 적용하였다. 구체적으로, 컬럼을 5 일 동안 건조시킨 후, 수돗물을 6 일째에 첨가하였다. 상기 강우-건조 과정을 2회 반복하였다. 실험 개시 시점(0 일)과 실험 개시 후 23일에 토양 샘플을 상단(T), 중간(M), 바닥(B)의 세 위치에서 수집하였으며, 다른 날에는 컬럼 상단에서만 샘플을 채취하였다. 상기 토양 샘플이 담긴 21 cm 길이의 토양 컬럼을 도 1에 나타내었다.

1.2 산, 염기 오염 후 기간 별 pH 변화 분석

실시예 1.1에서 준비한 산, 염기 노출 토양 컬럼을 이용하여, 산, 염기 오염에 따른 기간 별 pH 변화를 분석하였다. 산, 염기 누출 후 시간 경과에 따른 토양의 pH를 도 2에 나타냈으며, 산, 염기 누출 후 시간 경과에 따른 토양 컬럼 유출수의 pH를 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실험 전 토양의 pH는 7.3이었고, 이 값은 컬럼에 산 용액이 도입되었을 때 4.7 미만으로 급격히 감소하였다. 황산 칼럼에서 가장 낮은 토양 pH 값이 확인되었고, 약 1.8이었다. 반응 초기 질산, 염산 및 불화수소 컬럼에서 pH는 각각 약 1.9, 2.0, 2.5의 pH 값이 관찰되었다. 6 일째에 황산, 질산, 염산 4.1, 5.6; 5.7, 6.3 의 pH 값을 보였다. 대조 컬럼 토양의 pH 7.7과 비교하여, 황산 컬럼은 실험이 끝날 때 최저 토양 pH 4.1을 보여, 테스트에 사용된 네 가지 유형의 산 중에서 황산이 토양 pH에 가장 악영향을 미쳤다. 암모니아를 누출시킨 토양은 pH 8.9에서 실험 2일 이후 pH7.5~8.0으로 빠르게 안정화된 것을 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 토양 컬럼 유출수의 pH 경향은 토양 pH와 유사한 경향을 나타내었다.

1.3 산, 염기 오염 토양의 위치 별 pH 변화 분석

실시예 1.1에서 준비한 산, 염기 노출 토양 컬럼을 이용하여, 산, 염기 오염에 따른 토양 위치 별 pH 변화를 분석하였다. 칼럼 상단의 토양은 산, 염기의 누출의 가장 직접적인 영향을 받으며, 산, 염기가 컬럼의 수직방향으로 하강함에 따라 토양의 pH 완충효과에 의해 pH가 변한다. 실험 개시 시점(0일)에 산, 염기 오염에 따른 토양 위치 별 pH 변화를 도 4에 나타냈으며, 실험 개시 시 후 23일에 산, 염기 오염에 따른 토양 위치 별 pH 변화를 도 5에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 실험 개시 시점에서 토양 pH는 상단(T) 토양에서 가장 낮고, 중간(M) 토양과 바닥(B) 토양에서 pH가 다소 증가하는 것을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 23일 실험 종료 후, 토양의 pH는 위치에 따른 변화가 거의 나타나지 않았다. 이는 미생물의 중화 활성에 의해 토양 pH 경향이 달라지는 것이 반영된 것이다.

실시예 2. 산, 염기 오염원 예측을 위한 토양 내 미생물 DNA 추출 방법 구축

2.1 오염원에 따른 토양 샘플 준비

다양한 산, 염기 오염원에 의해 오염된 토양 샘플 84개를 수집하였다. 수집 직후 토양 샘플의 pH를 측정하였다. DNA 추출을 위해, 토양 샘플은 사용할 때까지 4 ℃ 암실에서 보관하였다. 84 개의 토양 샘플 중 28 개의 토양 샘플이 대조군 및 암모니아 누출 토양으로부터 수집한 샘플에 해당한다. 염산, 질산, 황산, 불화수소 누출 토양 칼럼으로부터 얻어진 토양 샘플은 1.85 내지 6.35의 산성의 pH 값을 가졌다. 토양 샘플 정보를 표 1에 나타내었다.

2.2 전처리 단계 없이 추출된 DNA 시료의 수율 및 품질 비교

대조군, 암모니아 토양 샘플, 산성 토양 샘플(염산, 질산, 불화수소, 황산)을 별도의 전처리 단계 없이 FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedical, USA)를 사용하여 DNA 추출하였다. 절차는 제조업체가 제공한 지침에 따라 수행하였다. 추출한 DNA의 농도(DNA concentration) 및 품질(A260/A280)은 NanoDrop ND-1000 UV-Vis 분광 광도계(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 별도의 전처리가 없을 때, 산성 토양의 DNA는 0.8 내지 20.9 ng/μL 사이의 낮은 농도를 나타낸 반면, 대조군 및 암모니아 토양 샘플의 DNA는 더 높은 농도(33.4 ng/μL 초과)를 나타내었다. DNA 품질(A260/A280)은 대조군 토양 컬럼 시료에서 가장 안정적이었고, 암모니아 컴럼 토양 시료는 변동 폭이 넓었으나 평균적으로 PCR에 적합한 수준을 나타내었다. 다만, 산성 토양 내 DNA의 품질은 다소 낮은 것으로 확인되어, 산성 토양 내 DNA의 품질을 PCR에 적합한 수준으로 추출, 정제할 방법이 요구되었다.

2.3 산성 토양 샘플에 대한 전처리 방법 구축

2.3.1 염화 알루미늄 전처리 농도의 선정

산성 토양은 DNA 추출에 악영향을 주므로, 토양으로부터 DNA 추출 품질을 향상시키기 위한, 염화 알루미늄 (AlCl₃) 전처리 단계를 구축하였다. 알루미늄 (Al³⁺)과 같은 양이온 금속은 길항 전하(antagonistic charge)로 인해 부식산(humic acid)을 제거할 수 있다. 실제로, Al³⁺는 부식산 및 DNA 모두에 결합하고 응집할 수 있다. 따라서, 과잉되거나 불충분한 염화 알루미늄은 DNA 수율의 손실을 유도할 수 있으므로, 산성 pH 토양에서 DNA를 추출하기 위한 최적 투입량을 산출하기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로, 0.3g의 토양 샘플 당 56 개의 산성 토양 샘플 (pH < 6.5)에 대하여, 염화 알루미늄 0.4 M 용액을 100, 200, 400, 500, 600 μL으로 처리하였으며, 0.4 M 염화알루미늄 처리에 의한 상등수 색도 변화를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 0.3g의 토양 샘플 당 200 μL이상의 염화 알루미늄의 조건에서 맑은 갈색 상등수가 생성되는 것을 확인하였다. 따라서, 토양 샘플 1g당 666.7μL의 0.4 M 염화 알루미늄을 산성 토양 전처리를 위한 처리 농도로 선정하였다.

2.3.2. 산성 토양 샘플에 염화 알루미늄 전처리시 DNA 수율 및 품질 변화 측정

염화 알루미늄 전처리에 의한 DNA 수율 및 품질 변화를 측정하기 위한 실험을 실시하였다. 토양 샘플 1g당 666.7μL의 0.4 M 염화 알루미늄으로 전처리한 산성 토양 샘플을 FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedical, USA)를 사용하여 DNA 추출하였다. 절차는 제조업체가 제공한 지침에 따라 수행하였다. 추출된 DNA의 농도(DNA concentration) 및 품질(A260/A280)은 NanoDrop ND-1000 UV-Vis 분광 광도계(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였으며, 이를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 염화 알루미늄 전처리에 의해 DNA 수율은 11.8~14.0 ng/uL로 전처리 전에 비하여 대폭 낮아졌으나, PCR 수행에는 문제가 없는 수준이었다. 염화 알루미늄 전처리 샘플 대한 품질은 1.7 내지 2.1의 범위였으며, 이는 최적값으로 알려진 1.8에 가까운 것을 확인하였다.

이와 같은 결과를 종합하여, 다음과 같은 산, 염기 오염원 예측을 위한 토양 내 미생물 DNA 추출 방법을 완성하였다. 대조군 및 암모니아 토양 샘플은 별도의 전처리 단계를 진행하지 않으며, 산성 토양 샘플의 경우 토양 샘플 1g당 666.7μL의 0.4 M 염화 알루미늄으로 전처리하는 단계를 진행하였다. 이 후, FastDNA® Spin Kit for Soil(MP Biomedical, USA)를 사용하여 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 Dneasy Power clean Pro Cleanup Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제, 농축하여, PCR을 수행할 DNA 시료를 제조하였다.

실시예 3. 메타게놈 분석을 이용한 산, 염기 오염원 예측 방법의 구축

3.1 산, 염기 오염원 예측을 위한 미생물 상대 우점도 데이터 산출

실험실 규모 노출 실험에 의한 36 개 토양 샘플을 실시예 2의 DNA 추출 방법으로 추출한 DNA 샘플에 대해 Illumina MiSeq 플랫폼(Illumina, San Diego, CA, 미국)에서 박테리아 16S rRNA 유전자 V3, V4 영역을 시퀀싱하여 염기서열을 분석하였다(마크로젠, 한국). 키메라가 아닌 클러스터에서 남은 고품질 염기서열을 greedy 알고리즘을 사용하여 97% 상동성 내에서 OTU(Operational Taxonomic Unit)를 선정하였다. QIIME(Quantitative Insight Into Microbial Ecology) 파이프 라인을 이용하여 문(phylum)에서 종(species) 수준까지의 정보를 RDP(Ribosomal Database Project) 검색하였다. 미생물 다양성 지수(chao1, Shannon-Wiener, Simpson)를 산출하였다. 토양 박테리아 군집의 16S rRNA 유전자 라이브러리는 Illumina MiSeq 시퀀싱에 의해 구축되었으며, 36개의 DNA 샘플로부터 총 5,074,018 개의 서열이 확인되었다. Illumina MiSeq 시퀀싱에서 사용한 프라이머 정보를 표 2에 나타내었고, DNA 샘플의 염기서열 분석 결과를 표 3에 나타내었다. 16S rRNA 기반 메타게놈 분석 결과를 주요 성분 분석 도표를 통해 시각화한 것을 도 9에 나타내었고, 36 개의 샘플을 계층적 군집화(hierarchical dendrogram)하여 그룹화한 것을 도 10에 나타내었으며, 산, 염기 처리 특성에 따른 미생물 군집구조를 확인하여 도출한 상대 우점도 데이터 결과를 도 11에 나타내었다.

	서열번호	염기 서열 (5’ -> 3’)
27F (정방향)	서열번호 3	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCA
518R (역방향)	서열번호 4	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

도 9에 나타낸 바와 같이, 전반적으로, 대조군 및 암모니아 샘플은 산 샘플로부터 명확하게 이격되어 있는 것을 확인하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 36 개의 토양 샘플을 계층적 군집화한 결과, 그룹 1(대조군 및 암모니아 샘플), 그룹 2(산성 토양 샘플)가 생성되었다. 그룹 1은 그룹 2와 명확하게 분리되어 토양 pH의 감소로 인한 토양 박테리아 군집 구조가 변화한 것을 확인하였다. 그룹 2는 다음과 같이 3 개의 하위 그룹으로 분류되었다: 하위 그룹 1(D0.NT, D0.NM, D0.ST, D0.FT, D4.FT), 하위 그룹 2(D0.Cl.T, D0.Cl.M, D0.FM, D0.SM), 하위 그룹 3(D4.Cl.T, D4.NT, D4.ST, D11.Cl.T, D11.NT, D11.FT, D11.ST, D23.Cl.T, D23.Cl .M, D23.NT, D23.NM, D23.FT, D23.FM, D23.ST, D23.SM). 이러한 결과는 토양 내 고유한 박테리아 군집이 누출 사고가 발생함에 따라, 공간적 및 시간적 측면에서 거리 및 오염 유형에 따라 변화하는 것을 확인한 것이다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 문(phylum) 수준에서 확인한 상대우점도에서 Proteobacteria가 가장 풍부한 문(phylum)으로 확인되었으며, 그 비율은 거의 모든 암모니아 컬럼 토양 샘플과 산성 처리된 토양의 후기 샘플(23 일)에서 39.5% 이상을 차지하는 것을 확인하였다. 대조군 및 암모니아 샘플에서 Proteobacteria는 39.5 ~ 46.7 %의 범위에서 존재하는 것을 확인하였다. 이어서, 19.9 ~ 23.0 %의 Actinobacteria, 5.8 ~ 9.3 %의 Acidobacteria 및 7.2-13.2 %의 Bacteroidetes는 암모니아 토양 컬럼에서 우점하는 것을 확인하였다. Firmicutes는 pH 값이 4.7보다 낮은 거의 초기 산성 시료(0, 4 일)에서 35.1 ~ 94.8%로 우점하는 것을 확인하였다. 이들은 토양 환경에 널리 분포되어 있으며 농업에 주요한 영향을 준다. 강(class) 수준에서 확인한 상대우점도 결과, Proteobacteria 내에서 Alphaproteobacteria가 16.8-19.8%를 차지하여 가장 풍부한 것을 확인하였으며, 이어서 9.5-17.4 %의 Gammaproteobacteria, 8.2-11.0 %의 Betaproteobacteria, 및 3.1-4.1 %의 Deltaproteobacteria의 순서로 우점하고 있는 것을 확인하였다.

3.2 산, 염기 오염 특성 별 지표미생물 선별

CRAN(Comprehensive R Archive Network)에서 제공하는 "indicspecies" 패키지의 "multipatt(기능 "멀티 패트", nperm 1000, p≤0.01)" 기능을 기반으로 산, 염기 오염원에 따른 지표미생물을 선별하였다. 실시예 3.1에서 산출한 메타게놈 결과에 따른 우점도 데이터를 입력 데이터로 사용하였다. 통계적으로 유의한 종 (p<0.01)을 선별하였다. IndVal은 산/염기와 미생물 종과 간의 관계를 나타내는 지표값이다. IndVal의 계산은 Dufrene와 Legendre(1997)에 의해 정의되며, 가장 높은 IndVa값은 가장 강력한 상관관계를 나타낸다. 통계적 유의성 값은 이 방법의 신뢰도 판단에 사용되었다(Dufrene et al., 1997). 상기 방법으로 오염원에 따른 지표미생물 총 41 종을 선별하였으며, 이를 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 가장 우점하는 암모니아 지표 미생물로 Nitrosospira tenuis가 선정되었으며(p < 0.001), Nitrosospira tenuis 외에도 암모니아 오염원과 관련된 지표미생물 8 종으로 Flavihumibacter sediminis, Flavobacterium saliperosum, Brevundimonas naejangsanensis, Actinotalea ferrariae, Nocardioides caricicola, Chryseobacterium montanum, Flavobacterium dankookbacbau을 선정하였다.

또한, 네 가지 산 오염 유형(염산, 질산, 불화수소, 황산)과 그에 따른 지표미생물을 확인하였다. 10 개의 불화수소 지표미생물 중 7종이 Bacilli class (p≤0.01)에 속하는 것을 확인하였다. 질산의 경우 Pseudomonas silesiensis가 가장 우점하는 지표미생물로 확인되었다(우점율 30.54%, p<0.001). 염산은 Dyella japonica 을 비롯한 7 종의 미생물을 지표미생물 종으로 선정하였다. 황산은 Micromonospora noduli 을 비롯한 4 종의 미생물을 지표미생물 종으로 선정하였다.

3.3 상대 우점도 데이터를 이용한 오염원 예측 인공신경망 모델링

실시예 3.1의 메타게놈 분석을 통한 상대우점도 데이터 산출 방법에서 기준 상동성을 달리하여 상대우점도 데이터를 산출하고, 이를 토대로 인공 신경망을 훈련시키고 테스트하였다. 각 토양 샘플의 오염원을 여섯 가지 등급(대조군, 암모니아, 염산, 질산, 불화수소 그리고 황산)으로 설정하고, 신경망의 예측이 정확한지 검증하였다. 예측 모델의 최적화를 위해 은닉층 신경망의 개수를 1 내지 151의 범위로 각각 적용하였다. 또한, 모델 과적합(overfitting) 문제를 완화하기 위해 10배 교차 검증의 원리를 적용하여, 데이터 집단 내에서 훈련데이터와 검증데이터를 교체해가며 예측을 수행하였다. 각 라운드에서, 입력 데이터는 신경망의 효과를 테스트하기 위해 훈련 세트(90 %) 및 테스트 세트(10 %)로 무작위 분할되었다. 네트워크의 전체 정확도는 10 라운드의 교차 검증에 대한 평균 정확도이다. 소프트웨어는 MATLAB을 이용하였고, 신경망 도구 상자로 MATLAB 패키지(2019b, MathWorks, Natick, MA)를 함께 이용하였다.

인공신경망 예측률을 향상시키기 위해, OTU 산출을 위한 기준 상동성을 서로 달리하여 인공신경망 모델을 훈련, 평가하였으며, 인공신경망 모델의 예측률(Accuracy %)을 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 기준 상동성을 99, 97, 95, 93, 91%로 한 경우, 각각 59, 31, 22개의 은닉층 뉴런 수에서 가장 높은 70.0%, 72.5%, 80.8%의 예측률을 나타내었다. 특히, OTU선정에 있어서 사용되는 상동성의 수준을 낮추었을 때 예측률이 낮아지는 것을 확인하였다.

3.4 지표미생물 종을 적용한 오염원 예측 인공신경망 모델링

종(species) 수준의 상대 우점도 데이터에 실시예 3.2에서 도출한 지표미생물을 적용하였으며, 그 결과, 우점도 데이터의 생물지표는 403 종에서 41 종으로 축소되었다. 이러한 방법은 잡음 데이터를 줄여주므로 훈련 진행 속도를 높이고 예측률을 높일 수 있다. 상기 지표미생물을 적용한 상대 우점도 데이터 또는 지표미생물을 적용하지 않은 상대 우점도 데이터로 은닉층 뉴런을 달리하여 인공신경망 모델을 훈련하고, 예측률을 평가하였으며, 예측률 평가 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이 지표미생물이 적용된 종 수준 상대 우점도 데이터에서 가장 높은 정확도를 나타낸 인공신경망 모델의 예측률은 은닉층 뉴런수가 7개 인 경우, 85.05%인 것을 확인하여, 지표미생물을 적용하지 않은 상대 우점도 데이터로 훈련시킨 모델의 최고 예측률 대비 예측률이 4.2 % 증가한 것을 확인하였다.

실시예 4. T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)를 이용한 산, 염기 오염원 예측 방법의 구축

4.1 T-RF(Terminal Restriction Fragment) 피크 분석

16S rRNA 유전자의 증폭을 위하여, 실시예 2의 방법으로 제조한 토양 샘플의 DNA 시료를 프라이머 쌍 27F와 518R을 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 산물을 T-RFLP에 사용하기 위하여, 정방향 프라이머 27F 및 역방향 프라이머 518R에 각각 FAM 및 HEX 형광을 표지하였다. PCR 수행을 위하여 25 μL의 DreamTaq DNA 중합 효소(미국 Thermo Fisher, USA), 1 μL의 각 프라이머(10 μM), 2 μL의 DNA 주형 및 21 μL의 탈 이온수로 구성된 총 50 μL의 PCR 샘플을 제조하였다. PCR운영 조건은 다음과 같다: 93℃에서 3 분의 1사이클, 93℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 72℃에서 30 초의 30주기, 그리고 마지막 72℃에서 10 분의 1주기. 이를 위하여 SimpliAmp Thermal Cycler(Thermo Fisher, USA)를 사용하였다. PCR 생성물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하고, 37℃에서 3 시간 동안 제한효소 BsuR I(10 U)(Thermo Fisher, USA)으로 절편화하였다. T-RFLP 분석은 한국의 SolGent (Solution for Genetic Technology) 회사에서 수행하였다. 피크 스캐너 2.0 소프트웨어(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 말단 전편의 크기와 상대적 농도를 분석하였다. 50 bp 미만의 피크는 에러로 간주하였다. T-Align 웹 기반 프로그램을 통해 말단절편(T-RF)를 정렬하고, 각 샘플의 프로파일을 생성하여 T-RF 피크 데이터를 최종적으로 도출하였다. 상기 16S rRNA 유전자의 증폭을 위한 프라이머 쌍의 서열정보를 표 5에 나타내었다.

	서열번호	염기 서열 (5' -> 3')
27F (정방향)	서열번호 1	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
518R (역방향)	서열번호 2	ATTACCGCGGCTGCTGG

4.2 오염원 예측 지표로써 T-RF(Terminal Restriction Fragment) 피크의 활용 가능성 검증

실시예 4.1에서 도출한 T-RF 피크 데이터가 오염원 예측 지표로 사용가능한지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 토양 샘플 간 T-RF 피크 패턴의 유사성을 확인하기 위해, RStudio(Boston, MA, USA)를 사용하여 주요 성분 분석(Principal component analysis)과 계층적 군집화(hierarchical dendrogram)를 실시하였으며, 주요 성분 분석 결과를 도 14에 나타내었고, 계층적 군집화 결과를 도 15에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 주요 성분 분석 결과, 토양 샘플 별 오염원에 따른 그룹핑(grouping)이 명확히 이루어지지 않았다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 오염원 유형에 따라, 토양 샘플 내 토양 미생물 군집을 분류할 수 있었으며, 원인물질 규명을 위한 생물지표로서 T-RF 피크가 사용될 수 있음을 확인하였다.

4.3 T-RF 피크 데이터를 이용한 오염원 예측 인공신경망 모델링

실시예 4.1의 27F 정방향 프라이머로 도출한 T-FR 피크 데이터 및 518R 역방향 프라이머로 도출한 T-FR 피크 데이터를 이용하여 실시예 3.3의 오염원 예측 인공신경망 모델링 방법과 동일한 방법으로 인공신경망을 훈련시키고 예측률을 평가하였다. 또한, 지표미생물종으로 가정한 지표 T-RF 결과를 T-RF 피크 데이터에 적용한 데이터를 이용하여 인공신경망을 훈련시켰다. 구체적으로, 적용 데이터는 상기 T-Align 프로그램을 이용하여 산출한 각 T-RF의 상대적 우점도를 시작으로하여, 모든 T-RF 중 Indicspecies 프로그램을 통해 지표 T-RF를 선별하였다. 즉, 지표 T-RF는 지표미생물종으로 가정할 수 있다. 선별된 지표 T-RF의 상대적 우점도를 인공신경망 모델에 입력하였다. 이에 따른 예측률 평가 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 1에서 151까지의 뉴런 수를 적용한 결과, 1 내지 10 범위에서 19.2 ~ 24.2% 예측률을 보였고 그 이상의 범위에서 67.4 ~ 77.4%의 예측률을 보였다. 정방향 프라이머로 도출한 T-RF 피크 데이터를 이용하고 은닉층 뉴런을 143개로 훈련시킨 인공신경망 모델에서 78.8%의 최고 예측률이 확인되었다.

실시예 5. 메타게놈 분석을 이용한 산, 염기 오염원 예측 방법과 T-RFLP를 이용한 산, 염기 오염원 예측 방법의 비교

실시예 4.3에서 완성한 T-RF 피크 데이터를 이용한 오염원 예측 인공신경망 모델 (정방향 프라이머로 산출한 T-RF 피크 데이터 적용, 143개 은닉층, 지표 T-RF 미적용)과 실시예 3.4에서 완성한 85.05%의 예측률을 갖는 메타게놈 분석을 이용한 산, 염기 오염원 예측 인공신경망 모델 (7개 은닉층, 지표미생물 데이터 적용)의 특이도와 민감도를 비교하였다. 민감도는 True Positive 결과를 Total Positive 결과의 수로 나눈 비율로 정의하였으며, 특이성은 True Negative 결과를 Total Negative 결과의 수로 나눈 비율로 정의하였다. 특이도와 민감도 분석 결과를 표 6에 나타내었다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 메타게놈 분석을 이용한 산, 염기 오염원 예측 인공신경망 모델과 T-RF 피크 데이터를 이용한 오염원 예측 인공신경망 모델 모두 특이도와 민감도가 우수한 것을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Soil Pollution Source Prediction Method using Artificial Neural Network Model <130> pusan1-407P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-RFLP forward primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-RFLP reverse primer <400> 2 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metagenome forward primer <400> 3 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgca 49 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metagenome reverse primer <400> 4 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims

(1) 토양 오염 원인 정보가 있는 토양 샘플을 수집하는 단계;
(2) 상기 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
(3) 상기 추출한 DNA를 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고, PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 토양 오염 원인 정보가 있는 T-RF 피크 데이터로 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계;
(5) 오염 원인을 모르는 토양으로부터 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 상기 (3) 단계의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 단계;
(6) 상기 증폭한 PCR 산물을 T-RFLP 분석하여, T-RF 피크 데이터를 도출하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 T-RF 피크 데이터를 입력변수로 하고, 상기 (4) 단계의 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염 원인을 예측하는 단계;를 포함하는, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 DNA를 추출하는 단계는, 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계를 더 포함하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제2항에 있어서, 상기 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계는 토양 오염 원인이 산성인 경우에 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제3항에 있어서, 상기 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계는 토양 샘플 1g당 0.2 내지 0. 6 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 466.7 내지 866.7μL를 전처리 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머 또는 서열번호 2의 역방향 프라이머인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 PCR 증폭은 16s rRNA 유전자를 증폭하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (4)단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계는 은닉층 뉴런을 1 내지 151의 범위로 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머이고, 상기 (4)단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계는 은닉층 뉴런을 143으로 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항에 있어서, 상기 토양 오염원은 무(無)오염, 암모니아, 염산, 황산, 불화수소 및 질산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 토양 오염원 예측 방법.
(1) 토양 오염 원인 정보가 있는 토양 샘플을 수집하는 단계;
(2) 상기 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계;
(3) 상기 추출한 DNA를 메타게놈 분석하고, 토양 내 존재하는 미생물의 조작분류단위(operational taxonomic unit)를 선정하는 단계;
(4) 상기 (3)단계에서 선정한 조작분류단위를 이용하여, 토양 샘플 내 미생물 군집의 상대우점도 데이터를 산출하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 상대우점도 데이터로 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계;
(6) 오염 원인을 모르는 토양으로부터 DNA를 추출하여 메타게놈 분석하고, 상기 (3)단계에서 선정한 조작분류단위를 이용하여, 토양 샘플 내 상대우점도 데이터를 산출하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 토양 샘플 내 상대우점도 데이터를 입력변수로 하고, 상기 (5) 단계의 인공신경망 모델을 이용하여 토양 오염 원인을 예측하는 단계;를 포함하는, 토양 오염원 예측 방법.
제11항에 있어서, 상기 (2) 단계의 DNA를 추출하는 단계는, 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계를 더 포함하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제12항에 있어서, 상기 토양 샘플에서 DNA 추출 방해 물질을 제거하는 전처리 단계는 토양 오염 원인이 산성인 경우에 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제13항에 있어서, 상기 토양 샘플에 염화 알루미늄(AlCl₃)을 전처리 하는 단계는 토양 샘플 1g당 0.2 내지 0. 6 M 염화 알루미늄(AlCl₃) 466.7 내지 866.7μL를 전처리 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항에 있어서, 상기 (3) 단계의 메타게놈 분석은 추출한 DNA의 16S rRNA 유전자 V3 및 V4 영역을 대상으로 하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항에 있어서, 상기 (3) 단계는 95 내지 100%의 상동성 수준으로하여 조작분류단위를 선정하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항에 있어서, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 과(Family), 속(Genus) 또는 종(species)을 기준으로 산출하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항에 있어서, 상기 (3) 단계는 99%의 상동성 수준으로 조작분류단위를 선정하고, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 종(species)을 기준으로 산출하는 것인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 오염원 특이적인 지표 미생물의 상대우점도 데이터인, 토양 오염원 예측 방법.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (4) 단계의 미생물 군집의 상대우점도 데이터는 오염원 특이적인 지표 미생물의 상대우점도 데이터이며, 상기 지표 미생물은 오염원이 없는 토양인 경우 Angustibacter luteus, Runella slithyformis, Cystobacter velatus, Geodermatophilus daqingensis, Pseudonocardia soli, Aquabacterium commune 및 Skermanella rubra으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 암모니아인 경우 Nitrosospira tenuis, Flavihumibacter sediminis, Flavobacterium saliperosum, Brevundimonas naejangsanensis, Actinotalea ferrariae, Nocardioides caricicola, Chryseobacterium montanum, Flavobacterium dankookense 및 Pedobacter bauzanensis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 염산인 경우 Mucilaginibacter polysacchareus, Dyella japonica, Actinocorallia aurantiaca, Pedobacter kyungheensi, Flavobacterium resistens, Pedobacter cryoconitis 및 Flavobacterium spartansii으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 질산인 경우 Methylophilus rhizosphaerae, Pseudomonas silesiensis, Ralstonia pickettii 및 Cupriavidus campinensis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 불화수소인 경우 Bacillus marisflavi, Paenibacillus aceris, Paraburkholderia hospital, Halobacillus profundi, Clostridium puniceum, Bacillus plakortidis, Bacillus aryabhattai, Paenibacillus populi, Rhodanobacter xiangquanii 및 Bordetella flabilis으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 오염원이 황산인 경우 Micromonospora noduli, Actinospica acidiphila, Desulfohalotomaculum peckii 및 Tumebacillus ginsengisoli으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 토양 오염원 예측 방법.
제20항에 있어서, 상기 (5) 단계의 인공신경망 모델을 훈련시키는 단계는 은닉층 뉴런을 7로 하는 단계인, 토양 오염원 예측 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록하는 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.