EP1261738A2 - Nukleinsäure und hieraus abgeleitete oligonukleotide zur spezifischen amplifikation und zum spezifischen nachweis von aquaporin-genen aus vitis spec - Google Patents

Nukleinsäure und hieraus abgeleitete oligonukleotide zur spezifischen amplifikation und zum spezifischen nachweis von aquaporin-genen aus vitis spec

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Publication number
EP1261738A2
EP1261738A2 EP01913861A EP01913861A EP1261738A2 EP 1261738 A2 EP1261738 A2 EP 1261738A2 EP 01913861 A EP01913861 A EP 01913861A EP 01913861 A EP01913861 A EP 01913861A EP 1261738 A2 EP1261738 A2 EP 1261738A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
dna
nucleic acids
genes
vitis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01913861A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isabel Maria Baiges Blanco
Anton Rudolf SCHÄFFNER
Albert Mas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1261738A2 publication Critical patent/EP1261738A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids and oligonucleotides derived therefrom for the amplification and for the qualitative and quantitative detection of aquaporin genes, gene fragments, RNA sequences derived therefrom or the expression of these genes from Vitis spec, in particular from Vitis vinifera.
  • Aquaporins are transmembrane proteins that are present in plants in the plasma membrane and in the vacuolar membrane (tonoplast). They belong to a family of major intrinsic proteins (MIPs) and are called PIP (plasma intrinsic protein) or TIP (tonoplast intrinsic protein).
  • the invention is therefore based on the object of providing nucleic acids and oligonucleotides derived therefrom which are specific for aquaporin genes from Vitis spec. are and with which a specific amplification, a specific quantitative and / or qualitative detection of aquaporin genes and gene fragments and of RNA sequences derived therefrom or the expression of these genes from Vitis spec. is made possible.
  • the object is achieved by nucleic acids which are disclosed in SEQ ID NO: 1-28, and by derivatives of these sequences.
  • the invention also encompasses the complementary, reverse and reverse-complementary sequences, it being possible for one or more of these sequences in each case to be used in detection or amplification methods.
  • the sequences are each specific for aquaporin genes or fragments of aquaporin genes from Vitis spec. at the DNA or RNA level.
  • Figures 1-3 show the expression of aquaporin genes in different tissues from Vitis spec. using probes according to the invention.
  • Figure 4 shows the sequence of specific probes (small letters), ie including the flanking sections, which are used for the synthesis of specific oligonucleotides (capital letters) in the 5'-3 'direction (S' end) (forward direction) or in 3 '-5' direction (3 'end) (reverse) were used.
  • nucleic acids and derivatives derived therefrom are thus provided, which can be used, for example, as probes and primers, for example for the specific detection of aquaporin genes from Vitis spec. and to enable amplification of the genes coding therefor and gene fragments derived therefrom and the detection of the expression of aquaporin proteins.
  • “derivatives” and “modifications” are to be understood as those nucleic acids in which at least 1, but also 2, 3, 4 or more nucleotides are missing at one or both ends of the nucleic acids or also inside the nucleic acids or are replaced by other nucleotides were.
  • the prerequisite here is that a specific binding to aquaporin genes and gene fragments from Vitis vinifera is maintained, so that the object of the present invention can be achieved.
  • the nucleic acids can also be parts of larger DNA units and can therefore also be integrated in vectors, for example in plasmids.
  • the invention also includes fragments of the nucleic acids provided according to the invention and the nucleic acids provided therefrom and the oligonucleotides derived therefrom.
  • fragments are understood to mean nucleic acids which are more than 12, preferably more than 15, more than 20, more than 25 or more than 30 and up to 50 nucleotides.
  • oligonucleotides comprises fragments of 12-50 nucleotides and partial regions These sequences can be combined as desired from the nucleic acid sequences presented here, provided that they have at least 12 consecutive nucleotides.
  • the fragments and oligonucleotides described above are to be subsumed under the term “derivatives”.
  • nucleic acid sequences disclosed above the person skilled in the art can determine by testing which derivatives and modifications, in particular which oligonucleotides, which can be derived from these nucleic acids, are suitable for special detection methods, for example hybridization methods and PCR methods, and which are not or less suitable.
  • the nucleic acids and Oligonucleotides of the invention can also be present, for example, in larger DNA or RNA sequences, for example flanked by restriction enzyme cuts.
  • Amplification and detection methods are known from the prior art. For example, reference is made here to laboratory manuals known to the person skilled in the art that describe this method, for example to Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and all subsequent editions. PCR methods are e.g. described in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 and subsequent editions.
  • the invention also includes such modifications of the nucleic acids and derivatives and oligonucleotides claimed in the present case which hybridize with them, preferably under stringent conditions.
  • Stringent hybridization conditions are understood in particular to be 0.2 ⁇ SSC (0.03 M NaCl, 0.003 M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C.
  • the hybridization temperature is below 65 ° C., for example above 55 ° C., preferably above 50 ° C., but in each case below 65 ° C.
  • Stringent hybridization temperatures depend on the size or length of the probe and its nucleotide compositions and are to be determined by a person skilled in the art by manual tests.
  • the oligonucleotides of the invention which are derived from the nucleic acids described here, preferably in detection methods and amplification methods of aquaporin genes from Vitis spec. used. However, they can also be used in detection methods of aquaporin genes from other types of Vitis, for example V. cinerea, V. coignetiae, V. labrusca, V. riparia, V. orientalis, V. rupestris, V. berlandieri, V. candicans. Other important types of wine are known to those skilled in the art, and the oligonucleotides presented here are suitable for the detection of aquaporin genes in all of these types due to the relationship between the Vitis types used for wine production.
  • the person skilled in the art can use the methods known per se with the present oligonucleotides.
  • the DNA or the RNA of a sample to be examined for the presence of said genes is brought into contact with at least one of the oligonucleotides.
  • the detection of the hybridization of the oligonucleotides with the RNA or the DNA of the sample is then carried out using, for example, PCR and hybridization techniques in order to show the presence of specific DNA and / or RNA sequences. All disclosed oligonucleotides can also be used in reverse complementary orientation as primers for reverse transcription of mRNA.
  • the nucleic acids and oligonucleotides preferably have a label.
  • a label examples of this are radioactive labeling, fluorescent labeling, biotin labeling, digoxigenin labeling, peroxidase labeling or labeling with labels detectable by alkaline phosphatase.
  • the oligonucleotides are bound to a solid phase matrix. Further chemical modifications of the nucleic acids and oligonucleotides are possible, for example to facilitate the PCR method, hybridization method, etc. Such modifications are known to the person skilled in the art.
  • oligonucleotides according to the invention are particularly suitable in detection methods such as a polymerase chain reaction (PCR), a reverse polymerase chain reaction (RT-PCR), an in situ PCR, a dot blot, a northern blot, a reverse northern blot, an in situ hybridization, a Differential display or a Southern blot.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse polymerase chain reaction
  • in situ PCR a dot blot
  • a northern blot a reverse northern blot
  • an in situ hybridization a Differential display or a Southern blot.
  • the invention relates to the use of the oligonucleotides as described above as markers in transformation and / or breeding processes.
  • This makes it possible in an advantageous manner to be able to make statements by means of such genetic markers in a breeding process by Vitis spec, which has the goal of providing plants which are more resistant to drought, for example, which would otherwise only be possible by testing the plants under the respective growth conditions is possible.
  • the breeding process can be brought to success faster and more economically.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined is either isolated directly from the plant cell or the plant cells are disrupted in a suitable manner or made permeable, so that direct contact of the primers and probes with the DNA and / or the RNA the samples is made possible without extensive and time-consuming cleaning procedures having to be carried out beforehand.
  • the oligonucleotides of the invention can also be used in in-situ hybridizations and in-situ PCR methods.
  • the application is not only restricted to plant cells, but can also be applied to all cells which are to be examined for the presence of aquaporin genes or fragments or for the expression of aquaporins, in each case from Vitis spec.
  • reaction buffer and wash buffer are composed of the following functional components:
  • Buffer system for adjusting and stabilizing the pH value between 7 and 8 (e.g. Tris / HCl or citrate buffer)
  • detergent for lowering the surface tension of aqueous solutions e) Nonionic, aprotic compounds (eg formamide) weaken the binding energy of duplex nucleic acids.
  • Salt functional units are cations which neutralize the negative charges of the nucleic acid - phosphate groups and thereby facilitate the duplex formation of two single stranded nucleic acids (eg Na + in NaCl).
  • Components e) and f) influence the binding strengths of nucleic acid duplex molecules. Increasing the monovalent cations in the reaction or washing solution stabilizes the duplex molecules formed, while with an increasing content of e.g. Formamide the duplex bonds are weakened.
  • a suitable nucleic acid or oligonucleotide concentration must be used.
  • the hybridization must take place at a suitable temperature (the higher the temperature, the weaker the binding of the hybrids).
  • Stringent hybridization and washing conditions are the reaction conditions (the right choice of the four factors) under which only duplex molecules between the oligonucleotides and the desired target molecules (perfect hybrids) are formed or only the desired target organism is detected.
  • Stringent reaction conditions for oligonucleotides mean, for example, a hybridization temperature of approximately 5-10 ° C. below the respective oligonucleotide melting point.
  • the stability of the DNA / DNA or RNA / DNA hybrids must be guaranteed even at low salt concentrations corresponding to 0.1 x SSC / 0.5% SDS. In this way, undesirable cross-reactions with other genes can be prevented.
  • the respective temperature conditions can, however depending on the chosen test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined, and must then be adapted accordingly.
  • the hybridization product can be detected, for example, by autoradiography in the case of radioactively labeled primer molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled oligonucleotides.
  • Suitable stringency conditions can be determined, for example, using reference hybridizations.
  • the oligonucleotides are used as forward and backward primers for a PCR reaction.
  • the PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected. Depending on the material to be detected, the temperature conditions and the cycle numbers of the PCR have to be modified. The optimal reaction conditions can be determined by hand tests in a manner known per se.
  • An example of a PCR is as follows:
  • the respective PCR conditions are determined by the person skilled in the art on the basis of known regulations.
  • the hybridization temperatures / annealing temperatures for the PCR are thus calculated from the length and sequence of the oligonucleotides according to algorithms known to the person skilled in the art. For example, a hybridization temperature of 55 ° C. for 30 seconds (typical for short fragments) was used for the nucleic acids (oligonucleotides) and their complementary forms specified in SEQ ID NO 8-21.
  • the initial denaturation takes place, for example, at 94 ° C. for 2 minutes, whereby these conditions can of course be varied depending on the nucleic acids used; for example, the temperature can also be 95 ° C or above and / or the denaturation times can be longer. Denaturation is preferably carried out for 30 seconds during the cycles.
  • the polymerization time preferably at 72 ° C., is preferably 30 seconds, since the nucleic acid sequences SEQ LD NO 8-21 are relatively short DNA fragments.
  • the conditions have to be adapted.
  • the characteristic, species-specific DNA marker fragments formed in the course of the PCR amplification by the extension of the primer sequences can be detected, for example, by gel electrophoresis or fluorimetrically using fluorescence-labeled oligonucleotides. Of course, other detection methods known to the person skilled in the art can also be used.
  • the probes are hybridized with the DNA or RNA sample to be investigated, stringent hybridization conditions being selected. Stringent conditions must be met for the the respective application can be determined empirically. The conditions described above can serve as guidelines.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined can be present either in the PCR reaction or RT-PCR as well as in the hybridization reaction either in extracted form or in the form of complex mixtures in which the DNA or RNA to be examined has only a very small proportion on the fraction of the special biological sample.
  • the cells to be examined can thus either be in purified form or, for example, "contaminated” in the tissue. Both in situ PCR and in situ RT-PCR can be carried out with the oligonucleotides described here.
  • the oligonucleotides of the invention are used for the PCR amplification of fragments on cDNA matrices which are generated after reverse transcription with oligo (dT) or with these oligonucleotides at the 3 'end.
  • the expression can then be evaluated qualitatively, in conjunction with suitable standards and techniques, such as an internal standard and a quantitative PCR, also quantitatively.
  • DNA, RNA or PNA can be present, in particular in the form of oligonucleotides, are used as probes on dot blots or DNA microarrays for qualitative and / or quantitative analysis of the expression of the aquaporin genes from Vitis spec. used.
  • PNA means nucleic acids in which the heterocyclic bases are coupled to a protein backbone and not, as usual, to a sugar-phosphate backbone. This results in higher stability and better hybridization properties, and such PNA connections are particularly suitable for microarray analysis methods.
  • the fragments derived from the nucleic acids presented in the present invention are synthesized on a solid support and after prior isolation (for example via amplification after cloning into a vector or, preferably, via a PCR reaction) on a solid support , for example glass, nylon or nitrocellulose, applied.
  • the dot blot and microarray is then hybridized in a reverse Northern experiment with labeled cDNA, which was produced from RNA from Vitis plants.
  • Usual markings such as radioactive markings or
  • Fluorescence labels can be used for this. This makes it possible to measure and compare the transcription of the Vitis aquaporins defined by the nucleic acids.
  • the oligonucleotides of the invention are produced in a manner which is customary and known per se.
  • the probes can, for example, be inserted into vectors and cut out again after propagation, they can be produced as a template by PCR or else synthetically. Production in the form of, for example, PNA (peptide-based nucleic acid) or derivatized nucleic acids in order to change the stability, the hybridization properties or binding properties to solid supports is also possible.
  • the oligonucleotides presented here can be used for a quantitative and qualitative detection of aquaporin genes and their expression from Vitis spec. be used and then correlated with properties such as the drought tolerance and / or the salt tolerance of the cultivars. This means that these traits can also be tracked in breeding programs.
  • nucleic acids claimed in the present patent application and the derivatives derived therefrom, in particular also their fragments and oligonucleotides, were derived from aquitisin genes from Vitis vinifera by sequencing complete cDNA clones (SEQ ID NO 29-35).
  • Vitis vinifera cDNA fragments were used to screen a Vitis vinifera cDNA library.
  • These probes were obtained by an RT-PCR reaction using degenerate primers directed against conserved regions of plant genes encoding TIP or PIP. 7 complete nucleic acids were isolated, which are shown in the attached sequence listing under SEQ ID NO 29-35. The specific probes were derived from 3 'end sequences after comparison of these sequences.
  • the oligonucleotides shown in SEQ ID NO 8-21 were used to quantify the transcripts of the associated aquaporin genes from Vitis vinifera. For this purpose, either an RT or a PCR or a dot blot analysis with PCR fragments, which cover the entire nucleic acid sequences shown in SEQ LD NO 1-7, was used. The specificity of the probes is based on the following observations: - In all cases, only a single PCR product was amplified; all PCR products had the sizes predicted from the gene sequences, e.g. 160 bp for SEQ ID NO 1.
  • fragments thereof can also be derived according to rules that are known to the person skilled in the art and used in PCR methods. This also applies to use in microarrays in which fragments of the nucleic acids presented here, in particular DNA, RNA and / or DNA fragments, for example oligonucleotides, were fixed on the supports or synthesized thereon.
  • the detection of expression by means of dot blot / reverse Northem analysis was investigated, for example, to determine the tissue specificity of the expression in roots and leaves of the aquaporins from Vitis vinifera, as shown in SEQ ID NO 29-35.
  • two members were analyzed by RT-PCR to examine daily rhythms in expression.
  • the detection via RT-PCR was preferably carried out with 0.2-0.4 ⁇ g of total RNA from Vitis plants after reverse transcription with oligo (dT) and 25-30 cycles in the PCR amplification.
  • reverse transcription can also be carried out directly by an oligonucleotide which is specific for aquaporin genes from Vitis vinifera.
  • Vitis PIP1-1 (SEQ1) (Fig. 1) Vitis PIP2-1 (SEQ4) (Fig. 2) Vitis TIP 1 (SEQ6) (Fig. 3)
  • Vitis GDH Glutamate Dehydrogenase
  • Vitis-malic Malic Enzyme
  • sequences SEQ ID NO. 29 - 40 show:
  • SEQ ID NO. 29 Vitis vinifera plasma membrane intrinsic protein (Vitis PIP 1-1), cDNA, complete sequence
  • SEQ ID NO. 30 Protein sequence for SEQ ED NO. 29
  • SEQ ID NO. 31 Complete Vitis MIPl protein cDNA. potential
  • SEQ ID NO. 32 amino acid sequence for SEQ ID NO. 31
  • SEQ ID NO. 33 Complete Vitis MIPl protein cDNA. Possible water tunnel protein. Arabidopsis PIP 1 -like protein. (Vitis PIP1-3).
  • SEQ ID NO. 34 amino acid sequence to SEQ ID NO. 33rd
  • SEQ ID NO. 35 Complete citis from Vitis MIPl protein; potential
  • SEQ ID NO. 36 Amino acid sequence for SEQ ID NO. 35
  • SEQ ID NO. 37 Complete citis of Vitis MIPl protein. potential
  • SEQ ID NO. 38 amino acid sequence to SEQ ID NO. 37
  • SEQ ID NO. 39 TIP1 from Vitis vinifera
  • SEQ ID NO. 40 TIP 2 from Vitis vinifera

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Abstract

Die Erfindung beschreibt Nukleinsäuren zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen, -Genfragmenten und hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis spec.

Description

Nukleinsäure und hieraus abgeleitete Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von Aquaporin-Genen aus Vitis spec.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin- Genen, Genfragmenten, hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis spec, insbesondere aus Vitis vinifera.
Aquaporine sind Transmembran-Proteine, die in Pflanzen in der Plasmamembran und in der vakuolären Membran (Tonoplast) vorliegen. Sie werden zu einer Familie von major intrinsic proteins (MIPs) gezählt und als PIP (plasma intrinsic protein) bzw. TIP (tonoplast intrinsic protein) bezeichnet.
Bezüglich ihrer Funktion ist bekannt, daß sie die Permeabilität von Membranen für Wasser erhöhen und bei der Regulation des Wasserhaushalts von Pflanzen, z.B. in die und aus den Leitgefäßen, oder beim Zellgrößenwachstum, beteiligt sind. Es konnte auch gezeigt werden, daß die Expression bekannter Aquaporine durch Trocken- und Salzstress beeinflußt wird.
Wein (insbesondere Vitis vinifera) stellt eine wichtige Kulturpflanze dar, die gerade in ariden Gebieten eine große wirtschaftliche Bedeutung hat. Ob und in welchem Umfang in Vitis vinifera Aquaporine vorkommen, konnte bis jetzt nicht oder nur unzureichend geklärt werden. Trotz des wirtschaftlichen Stellenwertes von Weinpflanzen konnten bisher keine für Aquaporine codierenden oder zumindest keine vollständigen codierenden Nukleinsäuren aus Vitis vinifera isoliert werden. Ferner fehlen detaillierte Daten bezüglich des Expressionsmusters und der Expressionshöhe derartiger Nukleinsäuren bzw. Proteine in Vitis vinifera.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Oligonukleotide bereitzustellen, die spezifisch für Aquaporin-Gene aus Vitis spec. sind und mit denen eine spezifische Amplifikation, ein spezifischer quantitativer und/oder qualitativer Nachweis von Aquaporin-Genen und -Genfragmenten und von hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der Expression dieser Gene aus Vitis spec. ermöglicht wird.
Die Aufgabe wird erfmdungsgemäß durch Nukleinsäuren gelöst, die in SEQ ID NO: 1 - 28 offenbart sind, sowie durch Derivate dieser Sequenzen. Von der Erfindung umfaßt werden auch die komplementären, reversen und revers-komplementären Sequenzen, wobei jeweils eine oder mehrere dieser Sequenzen in Nachweis- oder Amplifikationsverfahren eingesetzt werden können. Die Sequenzen sind jeweils spezifisch für Aquaporin-Gene oder - Fragmente von Aquaporin-Genen von Vitis spec. auf DNA- oder RNA-Ebene.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung mit den Ausführungsbeispielen. Die nachfolgende Beschreibung und die Ausführungsbeispiele bilden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung, d.h. die Erfindung ist nicht hierauf beschränkt. Abwandlungen sind dem Fachmann ohne weitere erfinderische Tätigkeit auf Grundlage der hier offenbarten Oligonukleotide möglich, insoweit diese vom Erfindungsgedanken umfaßt werden.
Die Abbildungen 1-3 zeigen die Expression von Aquaporin-Genen in verschiedenen Geweben von Vitis spec. unter Verwendung von Sonden gemäß der Erfindung. Die Abbildung 4 zeigt die Sequenz spezifischer Sonden (kleine Buchstaben), d.h. einschließlich der flankierenden Abschnitte, die zur Synthese spezifischer Oligonukleotide (Großbuchstaben) in 5'-3'-Richtung (S'-Ende) (Vorwärts -Richtung) bzw. in 3'-5'-Richtung (3'-Ende) (revers) eingesetzt wurden. Erfϊndungsgemäß werden somit Nukleinsäuren und hieraus abgeleitete Derivate bereitgestellt, die z.B. als Sonden und Primer einsetzbar sind, um beispielsweise einen spezifischen Nachweis von Aquaporin-Genen aus Vitis spec. sowie eine Amplifikation der hierfür codierenden Gene und daraus abgeleiteter Genfragmente und den Nachweis der Expression von Aquaporin-Proteinen zu ermöglichen.
Unter „Derivate" und „Abwandlungen" sind erfindungs gemäß solche Nukleinsäuren zu verstehen, bei denen zumindest 1, aber auch 2, 3, 4 oder mehr Nukleotide an einem oder beiden Enden der Nukleinsäuren oder auch im Inneren der Nukleinsäuren fehlen oder durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an Aquaporin-Gene und -Genfragmente aus Vitis vinifera beibehalten bleibt, so daß die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst werden kann. Die Nukleinsäuren können aber auch Teile größerer DNA-Einheiten sein und deshalb auch integriert in Vektoren, beispielsweise in Plasmide, vorliegen.
Von der Erfindung umfaßt werden auch Fragmente der erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus bereitgestellten Nukleinsäuren und der hieraus abgeleiteten Oligonukleotide. Unter „Fragmente" werden erfindungs gemäß Nukleinsäuren verstanden, die mehr als 12, bevorzugt mehr als 15, mehr als 20, mehr als 25 oder mehr als 30 und bis zu 50 Nukleotide verstanden. Der Begriff Oligonukleotide umfaßt Fragmente von 12 - 50 Nukleotiden und Teilbereiche hiervon. Diese Sequenzen können beliebig aus den hier vorgestellten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 12 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Unter dem Ausdruck „Derivate" sind die vorstehend beschriebenen Fragmente und Oligonukleotide zu subsumieren.
Ausgehend von den vorstehend offenbarten Nukleinsäuresequenzen kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate und Abwandlungen, insbesondere welche Oligonukleotide, die aus diesen Nukleinsäuren abgeleitet werden können, zu speziellen Nachweisverfahren, beispielsweise Hybridisierungsverfahren und PCR-Verfahren, geeignet und welche nicht oder weniger geeignet sind. Die Nukleinsäuren und Oligonukleotide der Erfindung können auch beispielsweise in größeren DNA- oder RNA- Sequenzen vorliegen, z.B. flankiert von Restriktionsenzymschnittsteϊlen.
Amplifikations- und Nachweisverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Nur beispielsweise sei hier auf dem Fachmann bekannte Laborhandbücher verwiesen, die diese Methodik beschreiben, beispielsweise auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor und alle nachfolgenden Auflagen. PCR- Verfahren sind z.B. beschrieben in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994 und nachfolgende Auflagen.
Die Erfindung umfaßt auch solche Abwandlungen der vorliegend beanspruchten Nukleinsäuren und Derivate und Oligonukleotide, die mit diesen, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, hybridisieren. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden insbesondere 0,2x SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumeitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Oligonukleotiden aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 50°C, jeweils aber unter 65°C. Stringente Hybridisierungstemperaturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Sonde und ihrer Nukleotidzusammensetzungen und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln.
Die Oligonukleotide der Erfindung, die sich von den hier beschriebenen Nukleinsäuren ableiten, bevorzugt in Nachweisverfahren und Amplifϊkationsverfahren von Aquaporin- Genen aus Vitis spec. eingesetzt. Sie sind aber auch in Nachweisverfahren von Aquaporin- Genen anderer Vitis-Arten einsetzbar, z.B. V. cinerea, V. coignetiae, V. labrusca, V. riparia, V. orientalis, V. rupestris, V. berlandieri, V. candicans. Weitere wichtige Weinarten sind dem Fachmann bekannt, und die hier vorgestellten Oligonukleotide sind aufgrund der Verwandtschaftsverhältnisse der zur Weinherstellung benutzten Vitis-Arten zum Nachweis von Aquaporin-Genen in allen diesen Arten geeignet. Der Fachmann kann die bereits an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden einsetzen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch beispielsweise PCR- und Hybridisierungstechniken, um das Vorliegen spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind in revers komplementärer Orientierung auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar.
Zur Detektion weisen die Nukleinsäuren und Oligonukleotide bevorzugt eine Markierung auf. Beispiele hierfür sind eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Markierung mit durch Alkalischer Phosphatase nachweisbaren Markern. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen die Oligonukleotide an eine Festphasenmatrix gebunden vor. Weitere chemische Modifikationen der Nukleinsäuren und Oligonukleotide sind möglich, um beispielsweise die PCR- Verfahren, Hybridisierungsverfahren usw. zu erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt.
Insbesondere geeignet sind die erfindungsgemäßen Oligonukleotide in Nachweisverfahren wie einer Polymerase Kettenreaktion (PCR), einer Reversen Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), einer in situ PCR, einem Dot Blot, einem Northern Blot, einem Reverse Northern Blot, einer in situ Hybridisierung, einem Differential Display oder einem Southern Blot.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der wie oben beschriebenen Oligonukleotide als Marker in Transformations- und/oder Züchtungsverfahren. Hierdurch wird es in vorteilhafter Weise möglich, bei einem Züchtungs verfahren von Vitis spec, das die Bereitstellung von z.B. gegen Trockenheit widerstandsfähigeren Pflanzen zum Ziel hat, mittels derartiger genetischer Marker Aussagen treffen zu können, die andernfalls erst durch einen Test der Pflanzen unter den jeweiligen Wuchsbedingungen möglich ist. Dadurch kann das Züchtungsverfahren schneller und wirtschaftlicher zum Erfolg gebracht werden.
Bei den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren und Amplifikationsverfahren wird die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe entweder direkt aus der Pflanzenzelle isoliert oder die Pflanzenzellen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlässig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Primer und Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Proben ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen. So sind die Oligonukleotide der Erfindung in einer Ausführungsform auch bei in situ- Hybridisierungen und in situ-PCR-Verfahren einsetzbar. Selbstverständlich ist die Anwendung nicht nur auf Pflanzenzellen beschränkt, sondern ist auf alle Zellen anwendbar, die auf das Vorliegen von Aquaporin-Genen oder -Fragmenten oder die Expression von Aquaporinen, jeweils aus Vitis spec, untersucht werden sollen.
Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:
a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH- Wertes zwischen 7 und 8 (z.B. Tris/HCl oder Citrat-Puffer) b) Wasser als 'Lösungsmittel' c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z.B. Ca2+), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt. d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen e) Nichtionische, aprotische Verbindungen (z.B. Formamid) schwächen die Bindungsenergie von Nukleinsäure-Duplexmolekülen. f) Salz (funktioneile Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsäure - Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren erleichtem (z.B. Na+ in NaCl).
Z.B. haben die folgenden Faktoren Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Nukleinsäuren und den hieraus abgeleiteten Oligonukleotiden mit dem Zielmolekül:
Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungs stärken von Nukleinsäure- Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z.B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.
Eine geeignete Nukleinsäure- bzw. Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride).
Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.
Unter stringenten Reaktionsbedingungen für Oligonukleotide wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA- Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 x SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden erfolgen.
Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts -Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt.
Das PCR- Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:
Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 2 Minuten lang;
Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei ca. 50°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA; - zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;
30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA-Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (30 Sek. lang); Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3 '-Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5- 8 Minuten lang).
Die jeweiligen PCR-Bedingungen werden vom Fachmann anhand bekannter Vorschriften bestimmt. So werden die Hybridisierungstemperaturen/Annealingtemperaturen für die PCR aus der Länge und der Sequenz der Oligonukleotide nach dem Fachmann bekannten Algorithmen berechnet. Beispielsweise wurden für die in SEQ ID NO 8 - 21 angegebenen Nukleinsäuren (Oligonukleotide) und ihre komplementären Formen eine Hybridisierungstemperatur von 55°C für 30 Sek. (typisch für kurze Fragmente) eingesetzt. Die initiale Denaturierung erfolgt beispielsweise bei 94°C für 2 Minuten, wobei diese Bedingungen selbstverständlich in Abhängigkeit von den verwendeten Nukleinsäuren variierbar sind; so kann die Temperatur beispielsweise auch bei 95°C oder darüber liegen und/oder die Denaturierungszeiten können länger sein. Während der Zyklen werden bevorzugt 30 Sekunden lang denaturiert. Die Polymerisationszeit, bevorzugt bei 72°C, liegt bei bevorzugt 30 Sek., da es sich bei den Nukleinsäuresequenzen SEQ LD NO 8 - 21 um relativ kurze DNA-Fragmente handelt.
In Abhängigkeit von der Länge und der Zusammensetzung der Nukleinsäuren müssen die Bedingungen angepaßt werden.
Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primers equenzen entstandenen, charakteristischen, spezies-spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gelelektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungsbedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die vorstehend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.
Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungsreaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende DNA oder RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise "verunreinigt,, im Gewebeverband . Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar.
Zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen und ihrer Expression durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Oligonukleotide können aus dem Stand der Technik bekannte Strategien eingesetzt werden, um beispielsweise eine gewebespezifische, stressabhängige oder kultivarspezifische Expression festzustellen. Beispiele hierfür sind:
a) RT-PCR:
Die Oligonukleotide der Erfindung werden zur PCR-Amplifikation von Fragmenten an cDNA Matrizen eingesetzt, die nach einer reversen Transkription mit oligo(dT) oder mit diesen Oligonukleotiden am 3 '-Ende erzeugt werden. Die Expression kann dann qualitativ, in Verbindung mit geeigneten Standards und Techniken, wie einem internen Standard und einer quantitativen PCR, auch quantitativ ausgewertet werden.
b) DOT Blot/ Microarray Reverser Northern:
Die von den Nukleinsäuren der Erfindung abgeleiteten Fragmente, die beispielsweise als
DNA, RNA oder PNA vorliegen können, inbesondere in Form von Oligonukleotiden, werden als Sonden auf Dot Blots oder DNA Microarrays zur qualitativen und/oder quantitativen Analyse der Expression der Aquaporin-Gene aus Vitis spec. eingesetzt. Unter PNA versteht man Nukleinsäuren, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein- Rückgrat und nicht wie üblich an ein Zucker-Phosphat-Rückgrat gekoppelt sind. Hierdurch werden eine höhere Stabilität und bessere Hybridisierungseigenschaften erzielt, und derartige PNA-Verbindungen sind insbesondere für Microarray-Analyseverfahren geeignet.
Die aus den in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Nukleinsäuren abgeleiteten Fragmente, insbesondere deren Oligonukleotide, werden hierzu auf einen festen Träger synthetisiert und nach vorheriger Isolierung (beispielsweise über Amplifϊzierung nach Klonierung in einen Vektor oder, bevorzugt, über eine PCR-Reaktion) auf einen festen Träger, beispielsweise Glas, Nylon oder Nitrozellulose, aufgebracht.
Der Dot Blot und Microarray wird anschließend in einem reversen Northern-Experiment mit markierter cDNA hybridisiert, die aus RNA von Vitis-Pflanzen hergestellt wurde.
Übliche Markierungen wie beispielsweise radioaktive Markierungen oder
Fluoreszenzmarkierungen sind hierzu einsetzbar. Damit ist die Messung und der Vergleich der Transkription der durch die Nukleinsäuren definierten Vitis-Aquaporine möglich.
Diese Verfahren können zur Analyse des Wachstumszustandes und der Wachstumsbedingungen von Vitis-Pflanzen, bevorzugt unter Wasser-limitierenden
Bedingungen, eingesetzt werden, oder auch zum Vergleich von verschiedenen Vitis-
Kultivaren.
Die Herstellung der Oligonukleotide der Erfindung erfolgt in an sich üblicher und bekannter Weise. Die Sonden können beispielsweise in Vektoren insertiert werden und nach Vermehrung wieder herausgeschnitten werden, sie können als Matrize durch PCR oder auch synthetisch hergestellt werden. Auch eine Herstellung in Form von z.B. PNA (Peptide-based nucleic acid) oder derivatisierte Nukleinsäuren, um die Stabilität, die Hybridisierungseigenschaften oder Bindungseigenschaften an feste Träger zu verändern, ist möglich. Die hier vorgestellten Oligonukleotide können zu einem quantitativen und qualitativen Nachweis von Aquaporin-Genen und ihrer Expression aus Vitis spec. benutzt werden und dann mit Eigenschaften wie der Trockentoleranz und/oder der Salztoleranz der Kultivaren korreliert werden. Damit können diese Merkmale auch in Züchtungsprogrammen verfolgt werden.
Die in der vorliegenden Patentanmeldung beanspruchten Nukleinsäuren und die von diesen abgeleiteten Derivate, insbesondere auch deren Fragmente und Oligonukleotide, wurden durch die Sequenzierung vollständiger cDNA Klone (SEQ ID NO 29-35) von Aquaporin- Genen aus Vitis vinifera abgeleitet. Hierzu wurden Vitis vinifera cDNA-Fragmente verwendet, um eine Vitis vinifera cDNA-Bibliothek zu durchmustern. Diese Sonden wurden mittels einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung von degenerierten Primern erhalten, die gegen konservierte Regionen von Pflanzengenen gerichtet waren, die für TIP oder PIP kodieren. Es wurden 7 vollständige Nukleinsäuren isoliert, die im anliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO 29 - 35 dargestellt sind. Die spezifischen Sonden wurden nach Vergleich dieser Sequenzen von 3 '-Endsequenzen abgeleitet. Die in SEQ ID NO 8 - 21 dargestellten Oligonukleotide wurden zur Quantifizierung der Transkripte der zugehörigen Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera eingesetzt. Hierzu wurde entweder eine RT- oder eine PCR- oder eine Dot Blot-Analyse mit PCR-Fragmenten, die die gesamten, in SEQ LD NO 1 - 7 dargestellten Nukleinsäuresequenzen abdecken, eingesetzt. Die Spezifität der Sonden begründet sich dabei auf folgende Beobachtungen: - In allen Fällen wurde nur ein einzelnes PCR-Produkt amplifϊziert; alle PCR-Produkte besaßen die aus den Gensequenzen vorhergesagten Größen, z.B. 160 bp für SEQ ID NO 1.
Alternativ zu diesen PCR-Fragmenten, die die gesamte Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO 1 - 7 abdecken, können auch Fragmente hiervon nach Regeln, die dem Fachmann geläufig sind, abgeleitet und in PCR- Verfahren eingesetzt werden. Dies gilt ebenso für die Verwendung in Microarrays, bei denen Fragmente der hier vorgestellten Nukleinsäuren, insbesondere DNA-, RNA- und/oder DNA-Fragmente, beispielsweise Oligonukleotide, auf den Trägem fixiert oder hieran synthetisiert wurden.
Der Nachweis der Expression mittels Dot Blot/reverse Northem-Analyse wurde beispielsweise zur Bestimmung der Gewebespezifität der Expression in Wurzeln und Blättern der Aquaporine aus Vitis vinifera, wie sie in SEQ ID NO 29 - 35 dargestellt sind, zu untersuchen. Beispielsweise wurden zwei Mitglieder mittels RT-PCR analysiert, um Tagesrhythmen in der Expression zu untersuchen. Der Nachweis über RT-PCR wurde bevorzugt mit 0,2 - 0,4 μg Gesamt-RNA aus Vitis-Pflanzen nach reverser Transkription mit Oligo (dT) und 25 - 30 Zyklen bei der PCR-Amplifikation durchgeführt. Ebenso kann aber auch eine reverse Transkription direkt durch ein Oligonukleotid erfolgen, das spezifisch für Aquaporin-Gene aus Vitis vinifera ist.
Nachfolgend einige konkrete Beispiele zu Anwendungsmöglichkeiten der hier beschriebenen Nukleinsäuren und deren Fragmente.
Vitis Aquaporin Expression in verschiedenen Geweben:
Es wurden Untersuchungen mit Hilfe reverser Northemhybridisierungen über Dotblots, die DNA der beanspruchten Sequenzen SEQ 1-7 enthielten, durchgeführt. Beispielhaft sind die Ergebnisse für 3 Gene gezeigt, also die Auswertung von jeweils einer Sonde nach Hybridisierung mit markierter cDNA, die an RNA aus den verschiedenen Geweben isoliert wurde.
Vitis PIP1-1 (SEQ1) (Abb. 1) Vitis PIP2-1 (SEQ4) (Abb. 2) Vitis TIP 1 (SEQ6) (Abb. 3)
Sonden für die Gene Vitis GDH (Glutamate Dehydrogenase) und Vitis-malic (Malic Enzyme) wurden als nahezu konstitutive Vergleichswerte mitbestimmt. Die gezeigten Beispiele weisen Vitis PL? 1-1 als besonders in der Wurzel, hier wiederum in lateralen Wurzeln exprimiertes Gen aus, während PIP2-1 gleichmäßiger in allen untersuchten Geweben exprimiert wird. TIP 1 wiederum ist präferentiell in der Wurzel und besonders in Wurzelspitzen exprimiert.
Die Sequenzen SEQ ID NO. 29 - 40 zeigen:
SEQ ID NO. 29: Vitis vinifera Plasma Membran intrinsisches Protein (Vitis PIP 1-1), cDNA, vollständige Sequenz SEQ ID NO. 30: Proteinsequenz zu SEQ ED NO. 29
SEQ ID NO. 31: Vollständige cDNA von Vitis MIPl Protein. Mögliches
Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP- 1 -ähnliches Protein (PIP 1-2)
SEQ ID NO. 32: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 31
SEQ ID NO. 33: Vollständige cDNA von Vitis MIPl Protein. Mögliches Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP 1 -ähnliches Protein. (Vitis PIP1-3).
SEQ ID NO. 34: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 33.
SEQ ID NO. 35: Vollständige cDNA von Vitis MIPl Protein; mögliches
Wassertunnelprotein; Arabidopsis PLP-2 ähnliches Protein (Vitis PLP2-1)
SEQ ID NO. 36: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 35 SEQ ID NO. 37: Vollständige cDNA von Vitis MIPl Protein. Mögliches
Wassertunnelprotein. Arabidopsis PIP2-ähnliches Protein. (PIP2-2)
SEQ ID NO. 38: Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO. 37
SEQ ID NO. 39: TIP1 aus Vitis vinifera
SEQ ID NO. 40: TIP 2 aus Vitis vinifera

Claims

PATENTANSPRUCHE
1. Nukleinsäuren zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Aquaporin-Genen, -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteter RNA oder der Expression dieser Gene, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der nachfolgenden Nukleinsäuren oder ihre komplementäre oder reverse oder revers-komplementäre Form oder eine Kombination hiervon sowie die hiervon abgeleitete RNA oder Derivate hiervon umfassen, die je spezifisch an für Aquaporin-Gene oder Genfragmente kodierende DNA oder hiervon abgeleitete RNA binden, wobei die Nukleinsäuren die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1 - 28 umfassen und sie jeweils spezifisch für Vitis spec. sind.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Fragment mit mindestens 12 Nukleotiden, bevorzugt mit 12 - 50 Nukleotiden, ist.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat unter stringenten Bedingungen, insbesondere 0,2x SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumeitrat, pH 7) bei 50 bis 65°C, mit einer der Nukleinsäuren hybridisiert.
4. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Nukleotid hinzugefügt, deletiert und/oder ausgetauscht ist, wobei die spezifische Bindung an Aquaporin-Gene oder -Genfragmente von Vitis spec. beibehalten bleibt, oder daß mindestens ein, zwei oder drei oder vier der Nukleotide, zusammenhängend oder einzeln, an einem oder beiden Enden oder im Inneren der Nukleinsäure durch ein anderes Nukleotid ersetzt oder deletiert sind, wobei je die spezifische Bindung beibehalten bleibt.
5. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren spezifisch für Vitis vinifera sind.
6. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure durch eine Phosphorylierung, einen Aminolinker oder einen Thiolinker chemisch modifiziert vorliegt.
7. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Markierung aufweist.
8. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung einer radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung,
Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder durch
Alkalische-Phosphatase-nachweisbare Markierung ist.
9. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.
10. Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an ein Protein-Rückgrat gebunden vorliegen.
1 1. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von Aquaporin- Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteten RNA-Sequenzen oder der
Expression dieser Gene mit den nachfolgenden Schritten:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einer der Nukleinsäuren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche; und - Nachweis der Hybridisierung der Nukleinsäuren mit der RNA oder DNA der
Probe, um das Vorliegen Aquaporin-spezifischer DNA- und/oder RNA- Sequenzen aus Vitis spec. aufzuzeigen.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren als Primer in PCR-Verfahren oder als Sonden in
Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit einer der Nukleinsäuren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR-Amplifikation durch Verlängerung der Nukleinsäuresequenzen (Primer-Sequenzen) ein charakteristisches DNA-Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird; oder b) zumindest eine der Nukleinsäuren mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion nachgewiesen wird.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14 , dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen wie folgt definiert sind: für eine Hybridisierung: 0,2x SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumeitrat, pH 7) bei 50 bis 65°C; für PCR-Bedingungen:
Annealingbedingungen 55°C, 30 Sek.
Denaturierung: 94°C, 2 Min.
Zyklus-Denaturierung: 94°C, 30 Sek. Polymerisation 72°C, 30 Sek.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridisierungsreaktion oder Polymerase-Ketten-Reaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten; b) die Nukleinsäure an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden wird; c) die Nukleinsäure mittels einer DNA-Polymerase verlängert wird; d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungs- zyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR- Produkts zu erhalten; und e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.
18. Testkit zum Nachweis von Aquaporin-Genen und -Genfragmenten aus Vitis vinifera oder deren Expression, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest eine Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche enthält.
19. Mikroarray, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche umfaßt.
20. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zum spezifischen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis oder zur Amplifikation von Aquaporin-Genen oder -Genfragmenten oder der Expression dieser Gene oder Fragmente aus Vitis spec.
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