WO2000055361A2 - Verfahren zur identifizierung von organismen durch vergleichende genetische analyse sowie primer und hybridisationssonden zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von organismen durch vergleichende genetische analyse sowie primer und hybridisationssonden zur durchführung des verfahrens Download PDF

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Matthias Hahn
Olga Niki Koufaki
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Hans Konrad Schackert
Matthias Hahn
Olga Niki Koufaki
Goergens Heike
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the genetic analysis of organisms of various animal and / or plant species by examining coding and non-coding areas of highly conserved genes or pseudogenes and their homologs in various animal and plant species.
  • the known methods for the simple, fast and precise determination of gene sequences for the determination of kinship relationships and for the identification of organisms are based on the use of oligonucleotides which are specific for a species. These oligonucleotides are required in order to provide sufficient genetic material for the subsequent sequencing reaction by means of a polymerase chain reaction or other methods.
  • An o-nucleotide is usually a short synthetic produced molecule that attaches to a specific gene segment and has a specific sequence complementary to this strand.
  • the invention is therefore based on the object of a method for genetic engineering
  • Time expenditure provides reliable results, is also suitable for large series examinations and routine tests, and can also be carried out automatically if necessary. Furthermore, the object of the invention is to develop means for carrying out this method.
  • the invention relates to a method by which the gene sequence of a
  • Primer-serving oligonucleotides for the amplification of the DNA have to bind to regions of the genome that are highly conserved in order to ensure amplification of genetic material by means of an identical pair of oligonucleotides in all or the greatest possible number of different organisms.
  • Oligonucleotides must span an area that has a high sequence diversity between different species in order to enable differentiation.
  • the area that is spanned by the oligonucleotides used as primers should be as small as possible in order to maximize the yield of amplificates and to ensure that DNA degraded in the starting material!
  • this object is achieved by providing a method for
  • oligonucleotide pair Binds oligonucleotide pair to DNA sequences that are highly conserved between different species, thus allowing the amplification of a gene segment that is identical for all species.
  • the oligonucleotides include or several gene regions that have the greatest possible sequence differences between different species.
  • the determination of the gene sequence of this highly polymorphic gene region in a subsequent reaction step allows the gene sequence to be assigned to a specific species. Genotyping is carried out by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of sequence variants.
  • PCR polymerase chain reaction
  • OLA oligonucleotide ligation assays
  • DNA isolation DNA is isolated and purified from blood samples, tissues, hair, foods and samples which contain DNA.
  • Polymerase chain reaction The polymerase chain reaction serves to amplify DNA for the subsequent sequencing reaction.
  • one or more pairs of oligonucleotides attach to the DNA to be analyzed (template DNA) of genes that are highly conserved between organisms of different species.
  • One of the molecules of an oligonucleotide pair is complementary to one of the two template DNA strands on the 5 ' or 3 ' flank of a DNA sequence.
  • the addition takes place in such an orientation that the polymer products obtained in an oligonucleotide-controlled polymerase chain reaction with in each case one of the two oligonucleotides, after denaturation, can serve as a template for the attachment of the other oligonucleotide.
  • the pair of oligonucleotides flank the area to be duplicated.
  • These oligonucleotides are extended in accordance with the nucleotide sequence of the matrix strand by means of a polymerase and after addition of nucleotide building blocks.
  • the addition, extension and denaturation take place at different temperatures and are usually carried out 20 to 35 times in succession, so that the area spanned by the oligonucleotides is multiplied exponentially.
  • c) Agarose gel electrophoresis In an agarose gel, the DNA fragments are separated from the oligonucleotides under a tension field and the band specific for the PCR product is cut out with a scalpel and purified.
  • d) Sequencing reaction Another polymerase is added, as well as all nucleotide building blocks and special nucleotide building blocks that lead to chain termination in the extension reaction. This creates DNA fragments that differ in length by one nucleotide each. Areas within the gene are sequenced which are polymorphic in their gene sequence between the different species. In this way, the DNA sequence characteristic of a species can be determined and assigned to a species.
  • Oligonucleotide pairs which attach to coding or non-coding regions of highly conserved genes or pseudogens and their homologs, that is to say to genes or pseudogens and their homologs which have little or no sequence differences between the individual species, are preferably used in the method for amplification according to the invention it is ensured that in the gene segment to be analyzed in each case an amplificate can be formed in a wide variety of species by means of a pair of primers.
  • regions of the gene or pseudogen and their homologs are preferably analyzed which differ in their gene sequence between organisms of different species. These can be sequences of coding or non-coding DNA.
  • oligonucleotides of different lengths are used in a reaction mixture (multiplex-PCR), all of which partially match an initial sequence.
  • the sense or antisense oligonucleotides differ with respect to the nucleotide sequence in that some oligonucleotides differ in length in the 3 ' region by one or more nucleotides.
  • the use of several oligonucleotides with different lengths is intended to ensure that an attachment of the oligonucleotides to the template DNA is possible even if the template DNA differs in the 3 ' region from some of the oligonucleotides used.
  • the agreement at the 3 ' region of the oligonucleotides with the template DNA is essential for the specific amplification and should therefore be as precise as possible in this region.
  • multiple pairs of oligonucleotides are used in a multiplex PCR which are identical in terms of their length, but differ in one or more positions at the 3 ' end of the oligonucleotides with respect to the nucleotide sequence.
  • the use of a reaction mixture of several oligonucleotides which differ in the base sequence at the 3 ' end of the oligonucleotide is intended to ensure that one
  • HETZBLATT (RULE 26) an amplificate can be formed in a wide variety of species by means of a pair of primers.
  • regions of the gene or pseudogen and their homologs are preferably analyzed which differ in their gene sequence between organisms of different species. These can be sequences of coding or non-coding DNA.
  • oligonucleotides of different lengths are used in a reaction mixture (multiplex-PCR), all of which partially match an initial sequence.
  • the sense or antisense oligonucleotides differ with respect to the nucleotide sequence in that some oligonucleotides differ in length in the 3 ' region by one or more nucleotides.
  • the use of several oligonucleotides with different lengths is intended to ensure that an attachment of the oligonucleotides to the template DNA is possible even if the template DNA differs in the 3 ' region from some of the oligonucleotides used.
  • the agreement at the 3 ' region of the oligonucleotides with the template DNA is essential for the specific amplification and should therefore be as precise as possible in this region.
  • multiple pairs of oligonucleotides are used in a multiplex PCR which are identical in terms of their length, but differ in one or more positions at the 3 ' end of the oligonucleotides with respect to the nucleotide sequence.
  • the use of a reaction mixture of several oligonucleotides which differ in the base sequence at the 3 ' end of the oligonucleotide is intended to ensure that one
  • oligonucleotides are also attached to the template DNA if the template DNA sequence at the 3 ′ binding site of the oligonucleotide differs from the oligonucleotide that is usually used. For this purpose, a mixture of different oligonucleotides, which have all conceivable nucleotide sequences at the 3 ' end, is provided for the amplification.
  • oligonucleotide sequences in the method according to the invention, care is preferably taken to ensure that as many of the oligonucleotides at the 3 ' end as possible match the first nucleotide of the codon which codes for the highly conserved amino acid. From theoretical considerations and also from observations it follows that the second nucleotide within a codon has a greater degree of correspondence between organisms of different species than the first or third nucleotide of the codon.
  • the nucleotide at the 3 ' end of the oligonucleotide is also exactly complementary to the opposite nucleotide of the template DNA strand - that is, an A is a T or a G is a C - the sequence of the oligonucleotides used is chosen such that the last nucleotide at the 3 ' end of the oligonucleotide is attached to the most conserved nucleotide of the codon which codes for an amino acid.
  • a single pair of oligonucleotides is used for different sections of the gene, the pseudogenes and its homologues, which pairs with the highly conserved tumor suppressor gene PTEN / MMAC1, its pseudogen and their homologues different species, namely in the region of the gene that shows a high degree of agreement between the species [Steck et al., 1997].
  • This area concerns the entire coding sequence of the gene, pseudogen and their homologs as well as exon-intron transitions and 5 'and 3' untranslated regions of the gene, the pseudogen and their homologs.
  • the regions amplified with the methods described above contain sequence sections which have more or less large sequence differences between the individual species. This is particularly true for intron regions and especially for intron 4.
  • the pair of oligonucleotides used for the amplification can bind to exons 4 and 5, since the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologs between the species in exon 4 and exon 5 do not or shows very little difference.
  • Comparative analyzes can be used to determine whether different samples belong to an identical species based on the agreement of intron sequences. Furthermore, the comparative analysis of an intron region of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs comprising a few to several hundred bases can determine the degree of kinship of different species based on the similarity of the sequences. In general, longer intron sections have to be examined for the differentiation of closely related species than for distantly related species. This procedure described for exon 4/5 and intron 4 can also be applied to all other introns that are enclosed by exons. It also applies to pure exon regions, pseudogenes and the 5'- and 3'-untranslated region, as well as their homologues, in which case the sequence differences between the individual species are smaller than in the intron regions.
  • pseudogenes and their homologs are examined in various organisms and to determine the species-specific gene sequence used. These pseudogenes and their homologs offer the advantage that they are also highly conserved in their nucleotide sequence and allow amplification in certain species. However, the sequence differs in some areas of the pseudogen and its homologues between different species, so that pseudogenes and their homologues can be used for the species-specific characterization of organisms. Since the intron regions are missing, these, like pure exon regions, and the 5'- and 3'-untranslated regions, due to their small size, are particularly suitable for the analysis of DNA which is degraded due to environmental influences.
  • An advantageous implementation of the method uses the 9 base pair deletion identified by the inventors in a PCR product (see FIG. 3 and example 2) which corresponds to a gene sequence variant of PTEN / MMAC1 and was amplified by DNA from pig cells.
  • This 9 base pair deletion is typically found in domestic pigs and all examined wild boars and otherwise not in any of the examined species.
  • this difference in length is used to detect pork in food.
  • This length variant is genotyped by sequencing or by other methods which are suitable for the detection of this deletion. This includes PCR-supported genotyping methods such as PCR using species-specific oligonucleotides.
  • Hybridization techniques such as the light cycler technology but also other genotyping methods using restriction enzymes, as well as in principle any currently and future available method for variant detection including the chip technology in all its technological versions.
  • deletions and insertions such as those found in various species in intron 4, exon 8 and in the 5'-untranslated region, can be used appropriately for species identification (see Appendix: “Compilation of the species sequences”).
  • the method according to the invention was carried out using DNA from various species as a model system and the gene sequence in the region of two sections in intron 4 of the PTEN / MMAC1 gene and its homologs was determined. It was possible to amplify all species with only one pair of oligonucleotides in the sequencing reaction 10 using only one oligonucleotide and in the subsequent analytical polyacrylamide gel electrophoresis, it was evident that all the examined species differ in the nucleotide sequence in the intron region (see Appendix: "Compilation of the species sequences").
  • the method is due to the conservatism of the PTEN / MMAC1 tumor suppressor and Its pseudogen and its homologues in other species are also suitable for successfully amplifying the corresponding gene sequences in lower organisms and possibly plants using an oligonucleotide pair.
  • the method according to the invention is therefore suitable for determining the identity and relationship of different organisms.
  • a database has been established on which can be used in the identification of different species and humans and includes PCR primers, sequencing primers and hybridization probes, as well as sequences of the coding and non-coding regions including ch selected highly variant intron regions, exon regions, the 5'-untranslated region of the gene and its homologues as well as the pseudogen and its homologues from various vertebrates (see Appendix: "Compilation of the species sequences").
  • the method according to the invention is suitable for quickly, easily and reliably reproducibly determining the degree of relatedness in certain species which are clearly classified (phyiogenetic analyzes).
  • the identity of tissue samples, blood samples and food and all samples which contain DNA and are of unknown origin can be determined by comparison with gene sequences which can be clearly assigned to a species.
  • the method is therefore also suitable for applications in forensic medicine. Since DNA is used as the starting material in a preferred embodiment of the method according to the invention, organic samples (eg blood, saliva, tissue residues) can be clearly assigned to human or animal origin based on their gene sequence. Because of the possibility of comparing the DNA sequence obtained with an already established database with DNA sequences of known species, statements regarding the species can be made. If the gene sequence is unknown, statements can be made on the basis of sequence similarities as to what degree of relationship the species to be examined has with a comparative DNA.
  • An advantageous embodiment of the invention uses hybridization probes to distinguish the DNA of different species from one another.
  • the method uses different methods to differentiate the species based on the LightCycler analysis system (Röche Molecular Biochemicals) using hybridization probes (patents WO 97/46714, WO 97/39008 )
  • the LightCycler analysis system With the LightCycler analysis system, the amplification, detection and specific analysis of DNA of different species and their differentiation is possible in a very short time and with relatively little effort.
  • the LightCycler is a micro-volume fluorometer with a thermocycler that enables fast thermocycling with real-time fluorescence observation combined during the PCR (Wittwer et al, 1997a) With this technology, the time for the amplification and detection of nucleic acids is reduced from approx. 5 hours to approx. 30 minutes.
  • the synthesis can be based on the fluorescence Resonance energy transfers (FRET) can be observed via two adjacent hybridization probes labeled with fluorescent dyes.
  • FRET fluorescence Resonance energy transfers
  • One of the probes at the 3 ' end is marked with a donor fluorophore (usually fluorescence) and the neighboring probe at the 5' end with an acceptor fluorophore of the FRET, the donor dye is applied via an external light source excites and emits light which is absorbed by the acceptor fluorophore which in turn emits light of a different wavelength which is specifically measured
  • This FRET can only be carried out if the two probes side by side within the amplification pair at a distance of approx.
  • the LightCycler can be used to carry out melting point analyzes.
  • the melting point analysis is based on the fact that two complementary DNA strands separate at a characteristic temperature, the melting temperature into two single strands.This melting temperature depends on the base composition in that GC-rich sequences have a higher melting point than sequences with predominantly AT bases. If you carry out a melting point analysis by choosing more or less complementary hybridization probes under certain
  • a melting curve in the form of the fluorescence intensity as a function of the temperature can be created for each sample. Comparing the melting peaks created by the first negative derivative of the fluorescence to temperature (-dF / dt vs T) enables the verification and differentiation of different DNAs. Fragments with a lower or higher
  • oligonucleotide pairs for the polymerase chain reaction have been found which attach to the highly conserved tumor suppressor gene PTEN / MMAC1, its pseudogen and their homologues in areas which show a great match between the species. These are mostly exon regions or untranslated regions of the 3 'and 5' end of the gene, its pseudogen and their homologues.
  • Examples 4, 5 and 6 use a 9-base pair deletion of the pig homolog of the PTEN / MMAC " / pseudogen and numerous other sequence variants of the gene, the pseudogen and their homologs in different species to use different hybrid profiles with the help of specific hybridization probes to produce different species that clearly differentiate the species from each other, and this preferred range of Examples 4-6 only concerns exon 5 of the gene, pseudogen and their
  • the PCR primers used for the amplification of the corresponding gene section are:
  • Antisense primer Zoo44aRV 5 ' - ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3 '
  • Hybridization probes according to the invention were selected on the one hand with the target region of the 9-base pair deletion of the pig pseudogenes.
  • the A1 / A2 probe enables pig DNA to be distinguished from all other species.
  • Probes A1 / A2 specific for PTE / V pseudogene pig:
  • Probes B1 / B2 specific for PTE / V pseudogene human:
  • Probes C1 / C2 specific for PTE / V homologue pig: C1: 5 ' - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - fluorescein - 3 ⁇ C2: corresponds to probe B2
  • the positions of the probes A1, A2, B1, B2, C1 and C2 in exon 5 are shown in FIG. 4.
  • the use of these three pairs of probes individually and the use of different combinations of the probes with one another (1 donor dye + 1 acceptor dye) results in a characteristic panel of different melting points for each individual species, which enables a clear differentiation of the species from one another (see FIGS. 5 and 7)
  • the use of these hybridization probe combinations allows investigations in reaction mixtures of two and more different species
  • a parallel analysis / detection of the fluorescence from two different wavelengths is possible in a multiplex reaction with two different pairs of probes in such a way that the respective donor probes are marked differently.
  • the sequence of the acceptor probes can be identical or different.After melting point analysis is obtained for each of the two wavelengths has a melting point specific to the corresponding probe and the target sequence it covers
  • the following general multiplex reaction approaches are possible, which are characterized in that at least one pair of hybridization probes is used and at least one gene section is amplified, different pairs of hybridization probe hybridize to different gene sections, and the melting points are determined by the different combinations and put together for each species to form a panel or used for identification
  • probes and / or P ⁇ mer can be combined according to the multiplex principle with the aim of species differentiation
  • all of the methods described, as well as all currently and in the future conceivable methods for analyzing the DNA sequence variants can be applied to both the sense and the antisense strand.
  • This principle of equivalence also applies to all PCR, sequencing primers and hybridization probes which are described in this patent application and the gene sequences described for the individual species.
  • Oligonucleotide 1 5 ' - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3 '
  • Oligonucleotide 2 5 ' - cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3 '
  • the oligonucleotides for the polymerase chain reaction were constructed so that they each have (underlined) a sequence at their 5 ' end that is complementary to the two oligonucleotides used in the sequencing reaction. This ensures that the specific parts of the oligonucleotide bind specifically to the template DNA (not underlined), but that other oligonucleotides can be used for the sequencing than for the polymerase chain reaction, which generally increases the quality of the sequencing reaction.
  • the specific proportion of the oligonucleotides binds to exon 4 and exon 5 of the PTEN / MMAC1 tumor suppressor gene and its homologues. As part of a routine procedure, 3 ml of the resulting amount were removed by a veterinarian
  • Kits (QIAGen) DNA was isolated from elephant blood and human blood according to the manufacturer's protocols and used until -
  • a polymerase chain reaction (PCR) was carried out to generate sufficient amounts of DNA for the sequencing reaction. There were 3
  • reaction vessel 1 Amounts of substrates and units of polymerase used: reaction vessel 1:
  • Reaction tube 3 no DNA, instead 1 ⁇ l distilled water. (Negative control). all
  • a 0.8% agarose gel was prepared with the addition of ethidium bromide and 1 x TAE buffer was added. Each 13 ⁇ l PCR product with the addition of 2 ⁇ l of dye was pipetted into prepared sample pockets in the gel matrix and a voltage of 100 V was applied. After 20 to 30 minutes, the electrophoresis was stopped
  • oligonucleotides with the sequence 5 ' - Cy-5 - cag gaa aca gct atg ac -
  • reaction vessels (A, C, G, T) were provided for each PCR product and the following volumes and concentrations were selected: 3 ⁇ l PCR product for A, C, G, T; 1 ⁇ l each of A, C, G, T, reagent (Amersham Pharmacia) consisting of Tris-HCL (pH 9.5),
  • the gel matrix was composed of: 16.8 g urea (Gibco BRL), 5.2 ml
  • Reaction tube A, C, G, T, 5 ⁇ l formamide loading dye were added and pipetted into the prepared sample pockets.
  • the following electrophoresis conditions were selected: 1000 V, 40 mA, 40 W.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence differences determined.
  • oligonucleotides labeled with Cy-5 were sequenced with the sequence 5 ' - Cy-5-cag gaa aca gct atg ac -3 ' .
  • the comparative analysis of pig liver from the butcher's shop with DNA of a pig already sequenced in this area showed complete agreement.
  • the control DNA (bovine salami) has a clearly different sequence from the pig DNA (see FIG. 3).
  • Hybridization probe pairs are shown. The comparative analysis was carried out by determining the melting points of the hybridization probe pairs C1 + B2, A1 + B2, A1 + A2 and C1 + A2 in pig DNA and human DNA were. The probes were selected and synthesized accordingly (Tib Mol
  • the prerequisite for probe hybridization is amplification of the target area with a suitable pair of primers.
  • the following pair of primers was selected and synthesized:
  • Antisense primer Zoo44aRV 5 * - ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3 ' (AmershamPharmacia)
  • Both primers bind to regions of exon 5 of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologues, which includes the target region of approximately 172 base pairs.
  • the DNA was isolated from pork and human blood using the Quiagen Kit (QIAGen) according to the manufacturer's protocols and stored at -20 ° until use.
  • the real-time PCR with hybridization probes and subsequent melting point analysis was carried out as follows: 3 rows, each with 4 sample batches (glass capillary cuvettes (Röche), were provided in a cooled pipetting block (Röche).
  • row 1 2 ⁇ l (50ng) pigs were added to each batch -DNA submitted, 2 ⁇ l (50ng) human DNA in each batch of the 2nd row and 2 ⁇ l distilled water for the negative controls in the 3rd row
  • the hybridization probes were used for the corresponding batches in the following combinations: 1st batch of each row: A1 , 1 ⁇ l (0, 1 ⁇ M) and A2, 2 ⁇ l (0.2 ⁇ M); 2nd batch of each row: C1, 1 ⁇ l (0, 1 ⁇ M) and B2, 2 ⁇ l (0.2 ⁇ M), 3 batches of each row A1, 1 ⁇ l (0.1 ⁇ M) and B2, 2 ⁇ l (0.2 ⁇ M),
  • Oligonucleotides PTEN se and Zoo44aRV each 2 ⁇ l (10 ⁇ M), MgCL 2 (Röche Molecular
  • the tempering rate is from denaturation to storage at 20 ° C /
  • the melting points of the pig DNA could be compared with those of the human DNA for the different probe combinations. DNA, 2 melting points were recorded for each pair of probes, one for the pseudogen and one for the gene. All melting points of the pig DNA were different from those of the human DNA (FIG. 5)
  • the comparative analysis was carried out by determining the melting points of a hybridization probe pair, the sequences of which are specific for the pseudogen of the pig in the region of the 9 base pair deletion (A1 / A2) and which were already used in Example 4
  • the DNA used was obtained from the bleeds of the species mentioned using QIAGen K ⁇ t (QIAGen) and purified.
  • QIAGen QIAGen K ⁇ t
  • a sample batch with 2 ⁇ l (50 ng) of the corresponding DNA is used for each species and a sample batch for a negative control presented with 2 ⁇ l distilled water 1 ⁇ l (1 ⁇ M) of probe A1 and 2 ⁇ l (0.2 ⁇ M) of probe A2 were pipetted into each sample batch.
  • the procedure was followed for pipetting further reagents in their volumes and concentrations and for further reaction steps on the LightCycler chosen under example 1
  • the comparative analysis was carried out by determining the melting points from various combinations of the hybridization probes from Example 4 in the combinations C1 + B2, A1 + B2, A1 + A2, C1 + A2, B1 + B2 and B1 + A2 and one for each animal species Panel were put together.
  • the DNA was obtained from the bleeds of the species mentioned using the QIAGen Kit (QIAGen) and purified.
  • the primers listed in Example 4 were used for the amplification.
  • the procedure, expanded by the additional probe combinations and larger number of species, was chosen under Example 4.
  • sequences of the examined species for exon 1-9 and the 5 ' untranslated region of the PTEN / MMAC1 gene, the pseudogen and their homologs are listed in the appendix under "Compilation of the species sequences".
  • These examples of different probe combination panels can be expanded and used by any number of probes and primers for the described gene PTEN / MMAC1, the pseudogen and its homologues, but also for all other genes.
  • a linear increase in the number and combination of probes in the entire genome results in an exponential increase in the possibility of differentiation of different species from one another.
  • sequence-specific probes and several and / or any number of combinations of probes a species can be distinguished from all other species by its very specific melting point panel
  • HPA-1 human platelet antigenl
  • Figure 1 Schematic representation of the method for
  • Figure 2 Comparison of the determined sequences of humans and African elephants according to Example 1
  • Figure 3 DNA sequence comparison of a pig with commercially available pig liver and bovine salami according to Example 2. The differences in the nucleotide sequences are shown. The 9-base pair large deletion (nucleotides 216-224) in the pig / pig liver is striking.
  • Figure 5 Example 4 - melting point panel of pig and human

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Abstract

Die Erfindung umfasst Verfahren, Primer und Hybridisationssonden zur Identifizierung von Organismen durch vergleichende genetische Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass man kodierende, nichtkodierende Bereiche und/oder funktionell bedeutende Bereiche von hochkonservierten Genen, Pseudogenen oder Homologen mit Hilfe der PCR amplifiziert und nachfolgend genotypisiert und analysiert. Der Vergleich von kodierenden und nicht kodierenden Bereichen von hochkonservierten Genen, Pseudogenen oder Homologen gewährleistet, dass ein einziges Oligonukleotidpaar an DNA-Sequenzen, die zwischen verschiedenen Spezies hochgradig konserviert sind, bindet und damit die Amplifikation eines für alle Spezies identischen Genabschnitts erlaubt. Die Oligonukleotide schliessen einen oder mehrere Genbereiche ein, die zwischen verschiedenen Spezies möglichst grosse Sequenzunterschiede aufweisen. Die Bestimmung der Gensequenz dieses hochgradig polymorphen Bereichs in einem darauf folgenden Reaktionsschritt erlaubt es, die Gensequenz einer spezifischen Spezies zuzuordnen. In besonders bevorzugten Ausführungsvarianten der Erfindung wurden Oligonukleotidpaare gefunden, die die Amplifikation des hochkonservierten Tumorsuppressorgens PTEN/MMAC1, seines Pseudogens und ihrer Homologen ermöglicht.

Description

WO 00/55361 PCTtEPOO/02330
Verfahren zur Identifizierung von Organismen durch vergleichende genetische Analyse sowie Primer und Hybridisationssonden zur Durchführung des
Verfahrens
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur genetischen Analyse von Organismen verschiedener Tier- und /oder Pflanzenspezies durch die Untersuchung von kodierenden und nichtkodierenden Bereichen hochkonservierter Gene oder Pseudogene und ihrer Homologe bei verschiedenen Tier- und Pflanzenspezies Die bekannten Verfahren zur einfachen, schnellen und präzisen Bestimmung von Gensequenzen zur Ermittlung von Verwandschaftsbeziehungen und zur Identifizierung von Organismen beruhen auf der Verwendung von Oligonukleotiden, die für eine Spezies spezifisch sind Diese Oligonukleotide werden benotigt um mittels Polymerase-Kettenreaktion oder anderer Verfahren ausreichend genetisches Material für die anschließende Sequenzierungsreaktion bereitzustellen Ein O gonukleotid ist ein meist kurzes synthetisch hergestelltes Molekül, das an einen spezifischen Genabschnitt anlagert und eine zu diesem Strang komplementäre spezifische Sequenz aufweist Der Nachteil von Methoden, die sich auf die Verwendung von Oligonukleotiden stutzen liegt dann begründet, daß sich Gensequenzen zwischen verschiedenen Spezies meist sehr stark unterscheiden Um Organismen verschiedener Spezies zu sequenzieren müssen in der Regel mittels kosten- und zeitaufwendiger Verfahren speziesspezifische DNA-Sequenzen bestimmt und in einem zweiten Schritt die entsprechenden Oligonukleotide die spezifisch an diese DNA-Sequenzen binden, synthetisiert werden Diese beiden Schπtte sind in der Regel für jeden zu untersuchenden Organismus unbekannter Herkunft jeweils erforderlich Für die spatere Analyse zur Bestimmung der Identität oder des Verwandschaftsgrades aufgrund der Gensequenz muß dann die DNA der zu untersuchenden Organismen mit einer meist großen Anzahl von verschiedenen Oligonukleotiden getestet werden Da meist nur Oligonukleotide von wenigen Spezies zur Verfugung stehen fuhrt die Untersuchung vornehmlich bei seltenen Tierarten oft nicht zum Erfolg Daruberhinaus ist die Untersuchung zeitaufwendig und teuer Andere Verfahren, die beispielsweise Restriktionslängenpolymorphismen der
Organismen ausnutzen oder Verfahren, die für die Amplifikation eine Mischung aus kurzen Oligonukleotiden verwenden, die in ihrer Sequenz randomisiert sind (random amplified polymorphic DNA, RAPD), führen nicht zur genauen und eindeutigen
Analyse der Gensequenz der einzelnen Tiere. Dies macht es schwierig, mittels dieser Verfahren den Grad der Verwandschaft zwischen Organismen zu ermitteln.
Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur genetischen
Analyse von Organismen bereitzustellen, das hochempfindlich ist, bei geringem
Zeitaufwand zuverlässige Ergebnisse liefert, auch für große Reihenuntersuchungen und Routinetests geeignet ist, und gegebenfalls auch automatisch durchgeführt werden kann. Ferner liegt die Aufgabe der Erfindung darin, Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens zu entwickeln.
Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche realisiert, die Unteransprüche sind
Vorzugsvarianten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, mit dem die Gensequenz eines
Genbereiches von verschiedenen Spezies schnell, einfach und sicher reproduzierbar ermittelt werden kann. Es müssen hierbei drei Bedingungen erfüllt sein: Die als
Primer dienenden Oligonukleotide für die Amplifikation der DNA müssen an Bereiche des Genoms binden, die hochkonserviert sind, um eine Amplifikation von genetischem Material mittels eines identischen Oligonukleotidpaares bei allen oder einer möglichst hohen Zahl von verschiedenen Organismen zu gewährleisten. Diese
Oligonukleotide müssen einen Bereich umspannen, der eine hohe Sequenzdiversität zwischen verschiedenen Spezies aufweist, um eine Differenzierung zu ermöglichen.
Der Bereich, der durch die als Primer eingesetzten Oligonukleotide umspannt wird, sollte möglichst klein sein, um die Ausbeute an Amplifikaten zu maximieren und zu gewährleisten, daß auch von stark degradierter DNA im Ausgangsmateria!
Abschriften erzielt werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur
Bestimmung der Identität oder der Verwandschaft durch den Vergleich von kodierenden und nicht kodierenden Bereichen von hochkonservierten Genen oder
Pseudogenen und Homologen gelöst. Dadurch wird gewährleistet, daß ein einziges
Oligonukleotidpaar an DNA-Sequenzen, die zwischen verschiedenen Spezies hochgradig konserviert sind, bindet und damit die Amplifikation eines für alle Spezies identischen Genabschnittes erlaubt. Die Oligonukleotide schließen einen oder mehrere Genbereiche ein, die zwischen verschiedenen Spezies möglichst große Sequenzunterschiede aufweisen. Die Bestimmung der Gensequenz dieses hochgradig polymorphen Genbereiches in einem darauf folgenden Reaktionsschritt erlaubt es, die Gensequenz einer spezifischen Spezies zuzuordnen. Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Sequenzvarianten geeignet sind. Dazu gehören Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) gestützte Genotypisierungsverfahren wie z.B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (Beispiele wären „dot blotting", oder „Oligonucleotide Ligation Assays" (OLA)), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, Analyse von Längenpolymorphismen und „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP), Analyse mittels spektroskopischer Verfahren wie z.B. „Matrixassisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectroscopy" (MALDI), chromatographische Verfahren wie z.B. DHPLC zur Separierung von DNA-Strängen unterschiedlicher Länge und Sequenz sowie prinzipiell jedwede gegenwärtig und zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich DNA-, RNA- und PNA-Hybridisierungsverfahreπ, Light Cycler Technologie, TaqMan und Molecular Beacon-Technologie und der Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen.
Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren folgende Schritte durchgeführt: a) DNA-Isolierung: Aus Blutproben, Geweben, Haaren, Nahrungsmitteln und Proben, die DNA enthalten, wird DNA isoliert und aufgereinigt. b) Polymerase-Kettenreaktion: Die Polymerase-Kettenreaktion dient zur Amplifikation von DNA für die nachfolgende Sequenzierungsreaktion. Bei der Polymerase-Kettenreaktion lagern sich ein oder mehrere Oligonukleotidpaare an die zu analysierende DNA (Template-DNA) von Genen, die zwischen Organismen verschiedener Spezies hochkonserviert sind, an. Jeweils eines der Moleküle eines Oligonukleotidpaares (sense und antisense Oligonukleotid) ist komplementär zu einem der beiden Template-DNA Stränge an der 5'- bzw. 3' - Flanke einer DNA- Sequenz. Die Anlagerung erfolgt in solcher Orientierung, daß die bei einer Oiigoπukieotid-gesteuerten Polymerase-Kettenreaktion mit jeweils einem der beiden Oligonukleotide gewonnenen Syπtheseprodukte nach einer Denaturierung als Matritze zur Anlagerung des jeweils anderen Oligonukleotids dienen können. Das Oligonukleotidpaar flankiert den Bereich, der vervielfältigt werden soll. Es werden mittels einer Polymerase und nach Zugabe von Nukleotidbausteinen diese Oligonukleotide entsprechend der Nukleotidabfolge des Matritzenstranges verlängert. Die Anlagerung, Verlängerung und Denaturierung erfolgt bei unterschiedlichen Temperaturen und wird in der Regel 20 bis 35 Mal hintereinander durchgeführt, so daß der durch die Oligonukleotide umspannte Bereich exponentiell vervielfacht wird. c) Agarose-Gelelektrophorese: In einem Agarosegel werden die DNA-Fragmente unter einem Spannungsfeld von den Oligonukleotiden getrennt und die für das PCR- Produkt spezifische Bande mittels Skalpell ausgeschnitten und aufgereinigt. d) Sequenzierungsreaktion: Es wird eine weitere Polymerase zugegeben, sowie alle Nukleotidbausteine und spezielle Nukleotidbausteine, die zum Kettenabbruch bei der Verlängerungsreaktion führen. Dadurch entstehen DNA-Fragmente, die sich in ihrer Länge jeweils um ein Nukleotid unterscheiden. Es werden Bereiche innerhalb des Gens sequenziert, die in ihrer Gensequenz zwischen den verschiedenen Spezies polymorph sind. Dadurch läßt sich die für eine Spezies charakteristische DNA-Sequenz bestimmen und einer Spezies zuordnen e) Polyacrylamidgelelektrophorese Trennt man nach Abschluß der Sequenzierreaktionen die unterschiedlich langen DNA-Strange auf einem hochauflösenden PolyaciNiamidgel in einem elektrischen Feld auf, wandern kürzere DNA-Stränge schneller als längere Strange In dem entstehenden Bandenmuster entspricht die Reihenfolge von kürzerer zu jeweils nachstlangerer Bande - den entsprechenden Basen A, C, G oder T zugeordnet - der komplementären DNA- Sequenz des Templats Dadurch wird die Sequenz des DNA-Stranges, der vorher mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurde, lesbar f) Vergleichende Analyse der Geπsequenz zwischen den Tierspezies und Speicherung der Sequenzierdaten
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation Oligonukleotidpaare verwendet, die sich an kodierenden oder nichtkodierenden Bereichen von hochkonservierten Genen oder Pseudogenen und deren Homologen anlagern, das heißt an Genen oder Pseudogenen und deren Homologen, die keine oder nur geringe Sequenzuπterschiede zwischen den einzelnen Spezies aufweisen Dadurch wird gewährleistet, daß in dem jeweils zu analysierenden Genabschnitt mittels eines Primerpaares ein Amplifikat bei verschiedensten Spezies gebildet werden kann.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Bereiche des Gens oder Pseudogens und ihren Homologen analysiert, die sich in ihrer Gensequenz zwischen Organismen verschiedener Spezies unterscheiden. Es können dies Sequenzen kodierender oder nicht kodierender DNA sein.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in bestimmten Ansätzen für die Polymerase-Kettenreaktion mehrere verschieden lange Oligonukleotidpaare in einem Reaktionsgemisch (Multiplex-PCR) verwendet, die alle teilweise mit einer Ausgangssequenz übereinstimmen. Hierbei unterscheiden sich jeweils die sense bzw. antisense Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz dahingehend, daß einige Oligonukleotide im 3'- Bereich um ein oder mehrere Nukleotide in ihrer Länge differieren. Die Verwendung von mehreren, in ihrer Länge unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann möglich ist, wenn die Template-DNA sich in dem 3'- Bereich von einigen verwendeten Oligonukleotiden unterscheidet. Die Übereinstimmung am 3'- Bereich der Oligonukleotide mit der Template-DNA ist für die spezifische Amplifikation wesentlich und sollte daher in diesem Bereich möglichst genau sein. Beispiel: sense:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3', antisense:
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3'. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform im erfindungsgemäßen Verfahren werden multiple Oligonukleotidpaare in einer Multiplex-PCR verwendet, die bezüglich ihrer Länge gleich sind, sich jedoch an einer oder mehreren Positionen am 3' - Ende der Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz unterscheiden. Die Verwendung eines Reaktionsgemisches von mehreren, in der Basenfolge am 3'- Ende des Oligonukleotids unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine
HETZBLATT (REGEL 26) mittels eines Primerpaares ein Amplifikat bei verschiedensten Spezies gebildet werden kann.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Bereiche des Gens oder Pseudogens und ihren Homologen analysiert, die sich in ihrer Gensequenz zwischen Organismen verschiedener Spezies unterscheiden. Es können dies Sequenzen kodierender oder nicht kodierender DNA sein.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in bestimmten Ansätzen für die Polymerase-Kettenreaktion mehrere verschieden lange Oligonukleotidpaare in einem Reaktionsgemisch (Multiplex-PCR) verwendet, die alle teilweise mit einer Ausgangssequenz übereinstimmen. Hierbei unterscheiden sich jeweils die sense bzw. antisense Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz dahingehend, daß einige Oligonukleotide im 3'- Bereich um ein oder mehrere Nukleotide in ihrer Länge differieren. Die Verwendung von mehreren, in ihrer Länge unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann möglich ist, wenn die Template-DNA sich in dem 3'- Bereich von einigen verwendeten Oligonukleotiden unterscheidet. Die Übereinstimmung am 3'- Bereich der Oligonukleotide mit der Template-DNA ist für die spezifische Amplifikation wesentlich und sollte daher in diesem Bereich möglichst genau sein. Beispiel: sense:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3', antisense:
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3'. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform im erfindungsgemäßen Verfahren werden multiple Oligonukleotidpaare in einer Multiplex-PCR verwendet, die bezüglich ihrer Länge gleich sind, sich jedoch an einer oder mehreren Positionen am 3' - Ende der Oligonukleotide bezüglich der Nukleotidsequenz unterscheiden. Die Verwendung eines Reaktionsgemisches von mehreren, in der Basenfolge am 3'- Ende des Oligonukleotids unterschiedlichen Oligonukleotide soll gewährleisten, daß eine
ERSAT ATT (REGEL 26) Anlagerung der Oligonukleotide an die Template-DNA auch dann erfolgt, wenn sich die Template-DNA Sequenz an der 3'- Bindungsstelle des Oligonukleotids von dem üblicherweise verwendeten Oligonukleotid unterscheidet. Dazu wird ein Gemisch von verschiedenen Oligonukleotiden, die am 3'- Ende alle denkbaren Nukleotidsequenzen aufweisen, für die Amplifikation bereitgestellt.
Beispiel: sense:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3', antisense:
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3'. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren bei der Auswahl von geeigneten Oligonukleotidsequenzen darauf geachtet, daß möglichst viele der Oligonukleotide am 3'- Ende mit dem ersten Nukleotid des Codons übereinstimmen, das für die hochkonservierte Aminosäure kodiert. Aus theoretischen Überlegungen und auch aufgrund von Beobachtungen ergibt sich, daß jeweils das zweite Nukleotid innerhalb eines Codons einen größeren Grad der Übereinstimmung zwischen Organismen verschiedener Spezies aufweist als das erste oder dritte Nukleotid des Codons. Da die Amplifikation normalerweise nur dann funktioniert, wenn neben anderen Voraussetzungen auch das am 3'- Ende des Oligonukleotids befindliche Nukleotid exakt komplementär zum gegenüberliegenden Nukleotid des Template- DNA-Stranges ist - also einem A ein T oder einem G ein C gegenübersteht - , wird die Sequenz der eingesetzten Oligonukleotide so gewählt, daß das letzte Nukleotid am 3'- Ende des Oligonukleotids sich möglichst an das am höchsten konservierte Nukleotid des Codons, das für eine Aminosäure kodiert, anlagert. Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren für verschiedenen Abschnitte des Gens, der Pseudogene und seiner Homologe jeweils ein einziges Oligonukleotidpaar eingesetzt, das sich an das hochkonservierte Tumorsuppressorgen PTEN/MMAC1 , dessen Pseudogen und ihrer Homologe bei verschiedenen Spezies anlagert, und zwar in dem Bereich des Gens, der eine große Übereinstimmung zwischen den Spezies aufweist [Steck et al., 1997]. Dieser Bereich betrifft die gesamte kodierende Sequenz des Gens, Pseudogens und ihrer Homologe sowie Exon-Intronübergänge und 5'- und 3'-untranslatierten Regionen des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe.
Die mit oben beschriebenen Verfahren amplifizierten Bereiche beinhalten Sequenzabschnitte, die mehr oder weniger große Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Spezies aufweisen. Dies gilt insbesondere für Intronbereiche und speziell für das Intron 4. Das für die Amplifikation verwendete Oligonukleotidpaar kann sich an die Exons 4 und 5 binden, da das PTEN/MMAC1 Gen, das Pseudogen und ihre Homologe zwischen den Spezies in Exon 4 und Exon 5 keine oder nur sehr geringe Unterschiede aufweist. Der von beiden Oligonukleotiden umspannte Intronbereich 4, der im Gegensatz zu dem Exonbereich 4 und 5 zwischen den Spezies wesentlich größere Sequenzunterschiede aufweist, wird amplifiziert. Anschließend wird vorzugsweise mittels einer Sequenzierungsreaktion ein Teil dieses Intronbereiches sequenziert (siehe Figur 1). Durch vergleichende Analysen kann aufgrund der Übereinstimmung von Intronsequenzen bestimmt werden, ob verschiedene Proben einer identischen Spezies angehören. Desweiteren kann durch vergleichende Analyse eines von wenigen bis mehreren hundert Basen umfassenden Intronbereiches des PTEN/MMAC1 Gens und seiner Homologe aufgrund der Ähnlichkeit der Sequenzen der Verwandschaftsgrad von verschiedenen Spezies bestimmt werden. Allgemein gilt, daß für die Differenzierung von eng verwandten Spezies längere Intronabschnitte untersucht werden müssen als bei entfernt verwandten Spezies. Dieses für Exon 4/5 und Intron 4 beschriebene Vorgehen kann auch auf alle anderen Introns angewendet werden, die von Exons umschlossen werden. Es gilt auch für reine Exonbereiche, Pseudogene und die 5'- und 3'-untranslatierte Region, sowie deren Homologe wobei in diesen Fällen die Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Spezies geringer sind als in den Intronbereichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden hochkonservierte Pseudogene und deren Homologen bei verschiedenen Organismen untersucht und zur Bestimmung der speziesspezifischen Gensequenz verwendet. Diese Pseudogene und deren Homologe bieten den Vorteil, daß diese ebenfalls in hohem Maße in ihrer Nukleotidsequenz konserviert sind und in bestimmten Spezies eine Amplifikation erlauben. Die Sequenz unterscheidet sich jedoch in manchen Bereichen des Pseudogens und seiner Homologe zwischen verschiedenen Spezies, so daß Pseudogene und deren Homologen zur speziesspezifischen Charakterisierung von Organismen genutzt werden können. Da die Intronbereiche fehlen, eignen sich diese, ebenso wie reine Exonbereiche und die 5'- und 3'-untranslatierte Regionen aufgrund ihrer geringen Größe für die Analyse besonders von DNA, die durch Umwelteinflüsse degradiert vorliegt.
Eine vorteilhafte Durchführung des Verfahrens nutzt die von den Erfindern identifizierte 9 Basenpaar große Deletion in einem PCR-Produkt (siehe Figur 3 und Beispiel 2), das einer Gensequenzvariante von PTEN/MMAC1 entspricht und von DNA aus Zellen des Schweines amplifiziert wurde. Diese 9 Basenpaar große Deletion findet sich typischerweise beim Hausschwein und allen untersuchten Wildschweinen und sonst bei keiner der untersuchten Spezies. In einer Ausführungsvariante der Erfindung dient dieser Längenunterschied zum Nachweis von Schweinefleisch in Nahrungsmitteln. Die Genotypisierung dieser Längenvariante erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für den Nachweis dieser Deletion geeignet sind. Dazu gehören PCR - gestützte Genotypisierungsverfahren wie z.B PCR mittels speziesspezifischer Oligonukleotide. Hybridisierungstechniken wie z.B. der Light Cycler Technologie aber auch andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen, sowie prinzipiell jedwede derzeit und zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen. Darüber hinaus können Deletionen und Insertionen, wie sie bei verschiedenen Spezies in Intron 4, Exon 8 und in der 5'-untranslatιerten Region gefunden wurden, entsprechende Verwendung zur Speziesidentifizierung finden (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen").
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit DNA von verschiedenen Spezies als Modellsystem ausgeführt und die Gensequenz im Bereich zweier Abschnitte in Intron 4 des PTEN/MMAC1 Gens und seiner Homologe bestimmt. Es gelang, alle Spezies mit nur einem Oligonukleotidpaar zu amplifizieren In der Sequenzierungsreaktion 10 mittels nur einem Oligonukleotid und in den nachfolgenden analytischen Polyacrylamidgelelektrophoresen wurde ersichtlich, daß alle untersuchten Spezies sich in der Nukleotidsequenz im Intronbereich unterscheiden (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen"). Das Verfahren ist aufgrund der Konserviertheit des PTEN/MMAC1 Tumorsuppressorgens sowie seines Pseudogens und deren Homologen bei anderen Spezies geeignet, auch die entsprechenden Gensequenzen bei niederen Organismen und eventuell Pflanzen erfolgreich mittels eines Oligonukleotidpaares zu amplifizieren. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Identitäts- und Verwandschaftsbestimmung von verschiedenen Organismen geeignet. Es wurde eine Datenbank etabliert, auf die bei der Identifizierung von verschiedenen Spezies und des Menschen zurückgegriffen werden kann. Sie beinhaltet PCR-Primer, Sequenzierprimer und Hybridisierungssonden, sowie Sequenzen der kodierenden und nichtkodierenden Bereiche einschließlich ausgewählter hochvarianter Intronbereiche, von Exonbereichen, der 5'- untranslatierten Region des Gens und seiner Homologe sowie des Pseudogens und seiner Homologe von verschiedensten Vertebraten (siehe Anhang: „Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen"). Einerseits ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, um bei bestimmten Spezies, die eindeutig klassifiziert sind, schnell, einfach und sicher reproduzierbar den Grad der Verwandheit zu bestimmen (phyiogenetische Analysen). Andererseits kann durch den Vergleich mit Gensequenzen, die eindeutig einer Spezies zugeordnet werden können, die Identität von Gewebeproben, Blutproben und Nahrungsmittel und allen Proben, die DNA enthalten und unbekannter Herkunft sind, ermittelt werden. Daher ist das Verfahren auch für Anwendungen in der forensischen Medizin geeignet. Da in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als Ausgangsmaterial DNA benutzt wird, können organische Proben (z.B. Blut, Speichel, Gewebereste) aufgrund ihrer Gensequenz eindeutig menschlicher oder tierischer Herkunft zugeordnet werden. Aufgrund der Möglichkeit, die gewonnene DNA- Sequenz mit einer bereits etablierten Datenbank mit DNA-Sequenzen bekannter Spezies zu vergleichen, können Aussagen bezüglich der Spezies getroffen werden. Ist die Gensequenz unbekannt, so können aufgrund von Sequenzähnlichkeiten Aussagen getroffen werden, welchen Grad der Verwandheit die zu untersuchenden Spezies mit einer Vergieichs-DNA aufweist. Eine vorteilhafte Ausfuhrungsform der Erfindung benutzt Hybridisationssonden zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies untereinander Das Verfahren nutzt verschiedene Methoden zur Unterscheidung der Spezies auf der Basis des LightCycler-Analysesystems (Röche Molecular Biochemicals) unter Anwendung von Hybridisationssonden (Patente WO 97/46714, WO 97/39008)
Mit dem LightCycler-Analysesystem ist in kürzester Zeit und relativ geringem Aufwand die Amplifikation, Detektion und spezifische Analyse von DNA verschiedener Spezies und deren Unterscheidung möglich Der LightCycler ist ein Mikro-Volumen-Fluoπmeter mit einem Thermocycler, das schnelles Thermocyceln mit Real-time-Fluoreszenzbeobachtung wahrend der PCR vereint (Wittwer et al , 1997a) Mit dieser Technologie verkürzt sich die Zeit für die Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren von ca 5 Stunden auf ca 30 Minuten Zur spezifische Detektion wahrend der PCR-Reaktion kann die Synthese auf der Basis des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) über zwei benachbarte mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Hybridisationssonden beobachtet werden Dabei ist die eine Sonde am 3'-Ende mit einem Donorfluorophor (in der Regel Fluorescem) und die benachbarte Sonde am 5'-Ende mit einem Akzeptorfluorophor markiert Wahrend des FRET wird der Donor-Farbstoff über eine externe Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, welches durch das Akzeptorfluorophor absorbiert wird Dieser wiederum emittiert Licht einer anderen Wellenlange, das spezifisch gemessen wird Dieser FRET kann nur erfolgen wenn die beiden Sonden nebeneinander innerhalb des Amplifikationspaares in einem Abstand von ca 1-5 bp, auf der Target-DNA hybridisieren Dabei ist die Sequenz der Sonden komplementär zum Zielbereich gewählt [Wittwer et al 1997b, Lay, 1997, Bernard, 1998, Riπe, 1997, Bernard, 1999 Nauck 1999a Nauck, 1999b Kreuzer 1999 Kyger 1998 Mangasser-Stephan 1999 Aslandis 1999]
Um das spezifische Amplifikationsprodukt nachzuweisen und zur Differenzierung von Unterschieden in der Zielsequenz besteht mit dem LightCycler die Möglichkeit Schmelzpunktanalysen durchzufuhren Die Schmeizpunktanalyse basiert darauf dass sich zwei komplementäre DNA-Strange bei einer charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur in zwei Einzelstrange trennen Diese Schmelztemperatur ist von der Basenzusammensetzung abhangig indem GC-reiche Sequenzen einen höheren Schmelzpunkt besitzen, als Sequenzen mit vorwiegend AT-Basen. Führt man eine Schmelzpunktanalyse durch, indem man mehr oder weniger gut komplementär passende Hybridisationssonden unter bestimmten
Temperaturbedingungen von der Template-DNA ablöst, ergibt sich ein für die
Passung zwischen Sonde und zu analysierender Zielsequenz charakteristisches
Schmelzprofil in Form einer Fluoreszenzintensitätsmessung. Dadurch lassen sich
Veränderungen in der Zielsequenz detektieren. Sind die Sequenzen vollständig komplementär zueinander, hybridisieren die Sonden vollständig. Enthält die
Zielsequenz in ihrer Basenfolge Veränderungen, erniedrigt sich der Schmelzpunkt der Sonden entsprechend. Durch kontinuierliche Detektion der Fluoreszenz bis zum
Abschmelzen der Sonden kann eine Schmelzkurve in Form der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Temperatur für jede Probe erstellt werden. Das Vergleichen der durch die erste negative Ableitung der Fluoreszenz zur Temperatur (-dF/dt vs T) erstellten Schmelzpeaks ermöglicht die Verifizierung und Differenzierung unterschiedlicher DNAs. Fragmente mit einer niedrigeren oder höheren
Schmelztemperatur können eindeutig unterschieden werden.
In besonders bevorzugten Ausführungsvarianten der Erfindung wurden Oligonukleotidpaare für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) gefunden, die sich an das hochkonservierte Tumorsuppressorgen PTEN/MMAC1 , seines Pseudogens und ihrer Homologe in Bereichen anlagert, die eine große Übereinstimmung zwischen den Spezies aufweist. Es handelt sich meist um Exonbereiche bzw. untranslatierte Bereiche des 3'- und 5'-Endes des Genes, seines Pseudogens und ihrer Homologe.
Diese Oligonukleotidpaare gestatten es, kleine Genabschnitte zu amplifizieren, welche Bereiche beinhalten, die unterschiedliche Basensequenzen zwischen den einzelnen Spezies aufweisen einschließlich Basenaustausche, Basendeletionen und Baseninsertionen. In den Beispielen 4, 5 und 6 wird eine 9-Basenpaar-Deletion des Schweinehomologs des PTEN/MMAC "/-Pseudogens und zahlreiche weitere Sequenzvarianten des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe bei verschiedenen Spezies benutzt, um mit Hilfe spezifischer Hybridisationssonden unterschiedliche Schmelzprofile bei unterschiedlichen Spezies zu erzeugen, die die Spezies eindeutig voneinander unterscheiden. Dieser bevorzugte Bereich der Beispiele 4-6 betrifft ausschließlich das Exon 5 des Gens, des Pseudogens und ihrer
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) Homologe. Die verwendeten PCR-Primer für die Amplifikation des entsprechenden Genabschnitts lauten:
Sense-Primer: PTEN se 5X- atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3'
Antisense-Primer: Zoo44aRV 5'- ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3'
Erfindungsgemäße Hybridisationssonden wurden zum einen mit dem Zielbereich der 9-Basenpaardeletion des Schweinepseudogenes ausgewählt. Die Sonde A1/A2 ermöglicht die Unterscheidung der Schweine-DNA von allen anderen Spezies.
Da mit obigem PCR-Primerpaar nicht nur das Pseudogen, sondern auch der Genbereich von Exon 5 des Schweinhomologs von PTEN/MMAC1 amplifiziert wird, wurde ein weiteres Sondenpaar mit der komplementären Sequenz des Schweinehomologs bereitgestellt. Es handelt sich um die Sonde C1 /C2.
Da die verschiedenen Spezies in diesem Genbereich geringe Sequenzunterschiede aufweisen, die für eine detailliertere Differenzierung untereinander genutzt werden sollten, wurde ein drittes Sondenpaar, welches der Sequenz des menschlichen Pseudogenes im ausgewählten Bereich entspricht, konstruiert (Sonde B1/B2).
Gemäß der Erfindung handelt es sich um die
Sonden A1/A2: spezifisch für PTE/V-Pseudogen Schwein:
A1 : 5' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3'
A2: 5"- LC Red 705 - tta aag gca caa g t ttc tat ggg ga - ph - 3'
Sonden B1/B2: spezifisch für PTE/V-Pseudogen Mensch:
B1 : 5'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3'
B2: 5'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3'
Sonden C1/C2: spezifisch für PTE/V-Homolog Schwein: C1 : 5'- tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3~ C2: entspricht Sonde B2
Die Positionen der Sonden A1 , A2, B1 , B2, C1 und C2 im Exon 5 werden in Figur 4 wiedergegeben. Die Anwendung dieser drei Sondenpaare einzeln und die Anwendung von verschiedenen Kombinationsmogiichkeiten der Sonden untereinander (1 Donorfarbstoff+1 Akzeptorfarbstoff) ergibt für jede einzelne Spezies ein charakteristisches Panel von unterschiedlichen Schmelzpunkten, die eine eindeutige Unterscheidung der Spezies voneinander ermöglicht (siehe Figuren 5 und 7) Desweiteren erlaubt der Einsatz dieser Hybridisationssondenkombinationen Untersuchungen in Reaktionsgemischen von zwei und mehreren unterschiedlichen Spezies
Eine parallele Analyse/Detektion der Fluoreszenz von zwei verschiedenen Wellenlangen (640nm und 705nm) ist in einer Multiplexreaktion mit zwei verschiedenen Sondenpaaren derart möglich, dass die jeweiligen Donorsonden unterschiedlich markiert sind Die Akzeptorsonden können in ihrer Sequenz identisch oder unterschiedlich sein Nach angeschlossener Schmelzpunktanalyse erhalt man für jede der beiden Wellenlangen einen für die entsprechende Sonde und der von ihr abgedeckten Zielsequenz spezifischen Schmelzpunkt
Die alternative Kombination aus zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer Wellenlange ergibt für ein Reaktionsgemisch von zwei unterschiedlichen Spezies mit geringen Sequenzunterschieden im Zielbereich zwei Schmelzpunkte innerhalb einer Wellenlange
Generell sind folgende allgemeine Multiplex-Reaktionsansatze möglich, die dadurch gekennzeichnet sind, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird, unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw zur Identifizierung verwendet werden
Diese allgemeinen Multiplex-Reaktionsansatze können weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, dass nicht nur mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt und nicht nur mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird sondern auch von mindestens einer Spezies DNA eingesetzt wird und damit unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte unterschiedlicher Spezies hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw. zur Identifizierung verwendet werden
Auf dieser Basis sind folgende Analysenansätze möglich, wobei Schmelzpunktüberschneidungen zu vermeiden sind
a) Analyse einer unbekannten Speziesprobe mit zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer oder unterschiedlicher Wellenlänge b) Analyse zwei oder mehrerer unbekannter Speziesproben mit zwei verschiedenen Donorsonden und einer Akzeptorsonde einer oder unterschiedlicher Wellenlangen c) Analyse einer unbekannten Speziesprobe mit einem Gemisch von jeweils zwei oder mehreren Donorsonden und Akzeptorsonden d) Analyse von einem Gemisch unbekannter Speziesproben mit einer Donorsonde und einer Akzeptorsonde e) Analyse von einem Gemisch unbekannter Speziesproben mit zwei oder mehreren verschiedenen Donorsonden und zwei oder mehreren Akzeptorsonden einer oder mehrerer verschiedener Wellenlängen
Dieses Vorgehen ist auf alle hochkonservierten Abschnitte des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe sowie auch auf andere hochkonservierte Gene übertragbar, wenn das Ziel die Speziesunterscheidung ist
Ausgewählte Pπmer für die Amplifikation sind unter den Patentansprüchen Nr 18-25 und ausgewählte Hybridisationssonden-Sequenzen für die LightCycler-Anwendung sind unter den Patentansprüchen Nr 35-42 für verschiedene Exons des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe aufgeführt Aufgrund der hohen Konservierung des Gens in der Evolution sind Pπmer und Hybridisationssonden auch in allen denkbaren anderen Bereichen des Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe möglich, die nach oben beschriebenem Prinzip zur Spezies-Unterscheidung verwendet werden können
Diese Sonden und/oder Pπmer lassen sich entsprechend dem Multiplexprinzip mit dem Ziel der Speziesunterscheidung beliebig kombinieren Generell gilt, daß alle beschriebenen als auch alle derzeit und zukünftig denkbaren Verfahren zur Analyse der DNA-Sequenzvarianten sowohl auf den Sense- als auch den Antisensestrang angewendet werden können. Dieses Äquivalenzprinzip gilt auch für sämtliche PCR-, Sequenzierprimer und Hybridisierungssonden, die in dieser Patentanmeldung beschrieben werden sowie die beschriebenen Gensequenzen der einzelnen Tjerspezies.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
Beispiel 1
In diesem Versuch wird die Sequenzdiversität zwischen menschlicher und Elefanten- DNA bestimmt. Es wurde die in Figur 1 wiedergegebene Anordnung gewählt. Die vergleichende Sequenzanalyse wurde durchgeführt, indem die speziesspezifischen Sequenzen des Introns 4 des Tumorsuppressorgens PTEN/MMAC1 und seiner Homologe bestimmt wurden. Ein Oligonukleotidpaar, das für Bereiche innerhalb von Exon 4 und 5 der DNA-Sequenz dieses Gens für die Maus spezifisch ist, wurde ausgewählt und anschließend synthetisiert (Amersham Pharmacia).
Oligonukleotid 1 : 5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3' Oligonukleotid 2: 5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3'
Die Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion wurden so konstruiert, daß sie an ihrem 5'- Ende jeweils eine Sequenz aufweisen (unterstrichen), die zu den zwei Oligonukleotiden, die bei der Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden, komplementär ist. Dadurch wird gewährleistet, daß die spezifischen Oligonukleotidteile an die Template-DNA (nicht unterstrichen) jeweils spezifisch binden, jedoch für die Sequenzierung andere Oligonukleotide als für die Polymerase- Kettenreaktion verwendet werden können, was ganz allgemein die Qualität der Sequenzierungsreaktion erhöht. Der spezifische Anteil der Oligonukleotide bindet jeweils an Exon 4 und Exon 5 des PTEN/MMAC1 Tumorsuppressorgens und seiner Homologe. Es wurden von einem Tierarzt im Rahmen eines Routineeingriffes 3 ml anfallendes
Restblut eines afrikanischen Elefanten zur Verfügung gestellt. Mittels des QIAgen
Kits (QIAGen) wurde die DNA aus Blut vom Elefanten und aus Blut vom Menschen entsprechend den Protokollen des Herstellers isoliert und bis zum Gebrauch bei -
20°C gelagert.
Um ausreichende Mengen an DNA für die Sequenzierungsreaktion zu generieren, wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Es wurden 3
Probenansätze bereitgestellt und folgende Volumina und Endkonzentrationen bzw.
Mengen an Substraten und Einheiten an Polymerase verwendet: Reaktionsgefäß 1 :
Elefanten-DNA 1 μl (50 ng); Reaktionsgefäß 2: menschliche DNA 1 μl (50 ng);
Reaktionsgefäß 3: keine DNA, statt dessen 1 μl Aqua dest. (Negativkontrolle). Allen
Probenansätzen wurde jeweils beigefügt: 14,35 μl Aqua dest.; dNTPs (Promega): 4 μl (200 μM); MgCI2 (InViTek): 1 μl (2 mM); 10 x Puffer (InViTek) bestehend aus 160 mM (NH4)2SO4, 500 mM Tris-HCI pH 8,8, 0, 1% Tween 20: 2,5 μl; Oligonukleotid 1 und 2: 1 μl (0,2 μM); Taq Polymerase (InViTek): 0, 15 μl (0,75 Units).
Insgesamt wurden 35 Zyklen in einem Perkin Eimer Thermocycler 9600 durchgeführt, wobei jeweils 50 Sekunden bei 94°C denaturiert wurde, 50 Sekunden lang sich die Oligonukleotide bei 53°C an die DNA-Stränge anlagerten und 60
Sekunden lang (pro Zyklus eine Sekunde länger) bei 72°C verlängert wurden. Vor
Beginn des ersten Zyklus wurde 3 Minuten lang bei 94°C denaturiert und nach dem letzten Zyklus wurde eine letzte Verlängerungsphase von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Um den Erfolg der PCR zu überprüfen, die amplifizierte DNA zu isolieren und die
Negativkontrolle zu überprüfen, wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt:
Es wurde ein 0,8% Agarose-Gel unter Zugabe von Ethidiumbromid hergestellt und 1 x TAE-Puffer zugegeben. Jeweils 13 μl PCR-Produkt unter Zusatz von 2 μl Farbstoff wurde in vorbereitete Probentaschen in die Gelmatrix pipettiert und eine Spannung von 100 V angelegt. Nach 20 bis 30 Minuten wurde die Elektrophorese gestoppt, die
DNA-Banden unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht und anschließend mit einem
Skalpell ausgeschnitten. Die Aufreinigung der PCR-Produkte gelang durch Auftragen der ausgeschnittenen Banden auf MicroSpin Colums (Amersham Pharmacia) und
Zentrifugation bei 1020 g für 10 Minuten. Das Eluat wurde je nach Stärke der Bande auf dem Agarose-Gel mit bis zu 30 μl Aqua dest. verdünnt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden einer Cycle-Sequenzierungsreaktion unter
Gebrauch von Oligonukleotiden mit der Sequenz 5'- Cy-5 - cag gaa aca gct atg ac -
3' unterworfen. Die Oligonukleotide waren am 5'-Ende mit dem Farbstoff Cy-5 markiert. Pro PCR-Produkt wurden 4 Reaktionsgefäße (A,C,G,T) bereitgestellt und folgende Volumina und Konzentrationen gewählt: Je 3 μl PCR-Produkt für A,C,G,T; je 1 μl A,C,G,T, -Reagenz (Amersham Pharmacia) bestehend aus Tris-HCL (pH 9.5),
MgCI2, Tween 20, Nonidet P-40, 2-mercaptoethanoi, dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, thermostabile Pyrophosphatase und Thermo Sequenase DNA Polymerase, wobei in Reaktionsgefäß A,C,G und T entsprechend ddATP, ddCTG, ddGTP und ddTTP enthalten war. Anschließend erfolgt die Zugabe von 1 μl Oligonukleotid der oben angegebenen Sequenz (0,5 μM). Folgende Reaktionsbedingungen wurden gewählt: Insgesamt wurden 25 Zyklen in einem Perkin Eimer Thermocycler 9600
(Perkin Eimer) durchgeführt, wobei jeweils 20 Sekunden bei 94°C denaturiert wurde,
30 Sekunden lang sich die Oligonukleotide bei 54°C an das Amplifikat anlagerten und die DNA-Stränge beim Hochheizen zur Denaturierungstemperatur verlängert wurden. Vor Beginn des ersten Zyklus wurde 3 Minuten und 30 Sekunden lang bei
94°C denaturiert und nach dem letzten Zyklus wurde eine letzte Verlängerungsphase von 5 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Um die Sequenz sichtbar zu machen, wurden die Produkte auf einem
Polyacrylamidgel im elektrischen Feld aufgetrennt. Hierfür wurde das automatische
Laser Fluoreszenzdetektionssystem A.L.F.express der Firma Amersham Pharmacia gewählt. Die Gelmatrix setzte sich zusammen aus: 16,8 g Urea (Gibco BRL), 5,2 ml
50% Long Ranger Gel Solution (FMC) und 4 ml 10 x TBE (Gibco BRL), die mittels
Aqua dest. auf 40 ml verdünnt wurden. Die Polymerisation des Gels erfolgte unter
Zugabe von 140 μl 10% APS (Merck) und 20 μl TEMED (Serva). Zu jedem
Reaktionsgefäß A,C,G,T, wurden 5 μl Formamide loading dye gegeben und in die vorbereiteten Probentaschen pipettiert. Folgende Elektrophoresebedingugnen wurden gewählt: 1000 V, 40 mA, 40 W.
Nach der Gelelektrophorese wurden die Sequenzen vom A.L. Fexpress System
(Amersham Pharmacia) generiert und konnten nun miteinander verglichen werden. In
Figur 2 werden die ermittelten Nukleotidsequenzunterschiede dargestellt. Der
Vergleich der Sequenzen zwischen Elefanten- und menschlicher DNA im
Exonbereich ergab große Übereinstimmung und diente als Kontrolle für die
PTEN/MMAC1 Spezifität, während der Intronbereich hochgradig unterschiedlich war.
ERSATZBIATT (REGEL 26) Beispiel 2
In diesem Versuch wird ein Sequenzvergleich von Schweineleber, die von einer Metzgerei zur Verfügung gestellt wurde, mit bereits vorhandener DNA eines Schweines durchgeführt. Als Kontroll-DNA diente Rindersalami. Es wurden aus 50 bis 60 mg Schweineleber und 50 bis 60 mg Rindersalami mittels QIAgen Kits (QIAGen) DNA gewonnen und aufgereinigt. Für die vergleichende Analyse wurde das unter Beispiel 1 durchgeführte Vorgehen unter Verwendung der Oligonukleotide 1 und 2 für die Polymerase-Kettenreaktion gewählt. Für die Sequenzanalyse wurde eine Bande mit etwa 300 bp Länge aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Diese Bande entspricht in ihrer Länge dem PTEN/MMAC1 Pseudogen. Nach Aufreinigung des ausgeschnittenen Amplifikats wurde mit Cy-5 markierten Oligonukleotiden mit der Sequenz 5'- Cy-5- cag gaa aca gct atg ac -3' sequenziert. Die vergleichende Analyse von Schweineleber aus der Metzgerei mit bereits in diesem Bereich sequenzierter DNA eines Schweines ergab eine komplette Übereinstimmung. Die Kontroll-DNA (Rindersalami) weist eine von der Schweine-DNA deutlich unterschiedliche Sequenz auf (siehe Figur 3).
Beispiel 3
Die PCR und die Sequenzierung der Exons 1 bis 9 wird mit den in den Ansprüchen 19-26 beschriebenen Primern bei sonst analoger Reaktionsführung durchgeführt. Die entsprechenden Sequenzen der untersuchten Spezies sind im Anhang unter "Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen " aufgeführt.
Beispiel 4
In diesem Versuch soll die Speziesunterscheidung zwischen Schweine-DNA und menschlicher DNA mit verschiedenen Kombinationen von
Hybridisationssondenpaaren gezeigt werden. Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte der Hybridisationssondenpaare C1 +B2, A1 +B2, A1+A2 und C1+A2 in Schweine-DNA und menschlicher DNA bestimmt wurden. Die Sonden wurden dementsprechend ausgewählt und synthetisiert (Tib Mol
Biol Berlin).
Sonden:
A1 : 5' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3'
A2: 5'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3"
B1 : 5'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3"
B2: 5'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3'
C1 : 5Λ- tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3
C2: 5'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3Λ
Voraussetzung für eine Sonden-Hybridisation ist die Amplifizierung des Zielbereiches mit einem geeigneten Primerpaar. Dazu wurde folgendes Primerpaar ausgewählt und synthetisiert:
Sense-Primer: PTEN se 5'- atc ttg acc aat ggc taa gtg - 3' (Tib Mol Biol)
Antisense-Primer: Zoo44aRV 5*- ttgt ctc tgg tcc tta ctt c-3' (AmershamPharmacia)
Beide Primer binden an Bereiche des Exon 5 des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe, welcher den Zielbereich von ca. 172 Basenpaaren einschließt.
Die DNA wurde mittels des Quiagen Kits (QIAGen) aus Blut vom Schwein und vom Menschen entsprechend den Protokollen des Herstellers isoliert und bis zum Gebrauch bei -20° gelagert.
Die Real-time-PCR mit Hybridisationssonden und anschließender Schmelzpunktanalyse wurde wie folgt durchgeführt: Es wurden 3 Reihen mit jeweils 4 Probenansätzen (Glaskapillarküvetten (Röche) in einem gekühlten Pipettierblock (Röche) bereitgestellt. In Reihe 1 werden in jeden Ansatz 2μl (50ng) Schweine-DNA vorgelegt, in jeden Ansatz der 2. Reihe 2μl (50ng) menschliche DNA und in der 3. Reihe 2μl Aqua dest. für die Negativkontrollen. Die Hybridisationssonden wurden für die entsprechenden Ansätze in folgenden Kombinationen verwendet: 1. Ansatz jeder Reihe: A1 , 1 μl (0, 1 μM) und A2, 2μl (0,2μM); 2. Ansatz jeder Reihe: C1 , 1 μl (0, 1 μM) und B2, 2μl (0,2μM), 3 Ansatz jeder Reihe A1 , 1 μl (0,1 μM) und B2, 2μl (0,2μM),
4 Ansatz jeder Reihe C1 , 1 μl (0,1 μM) und A2, 2μl (0,2μM)
Folgende Volumina und Endkonzentrationen bzw Mengen an Substraten und
Einheiten an Polymerase wurden in allen Probenansatzen verwendet
Oligonukleotide PTEN se und Zoo44aRV je 2μl (10 μM), MgCL2 (Röche Molecular
Diagnostics) 2,4μl (4mM), LightCycler-DNA Master Hybridisation Probes (Röche
Molecular Diagnostics) 2μl einer 10-fach-konzentπerten Stocklosung aus Taq-DNA-
Polymerase, Reaktionspuffer, dNTP-Mischung und 10mM MgCI2 Die MgCI2-
Endkonzentration im Gesamtreaktionsansatz von 20μl betragt 5mM Nach vollständigem Laden aller Reagenzien werden die Glaskapillarkuvetten verschlossen, bei 2000g für 1 Minute zentπfugiert und in das für die Kapillaren vorgesehene
Reaktionskarussel des LightCyclers eingesetzt
Insgesamt werden 45 Zyklen im LightCycler-Analysesystem wie folgt durchgeführt
Denaturierung für 1 Sekunde bei 95°C, Anlagerung der Oligonukleotide und Sonden für 10 Sekunden bei 54°C und die Veriangerung der DNA-Strange für 5 Sekunden bei 72°C Vor Beginn des ersten Zyklus wurde 30 Sekunden bei 95°C denaturiert
Die Temperierungsrate wird von der Denaturierung zur Anlagerung auf 20°C/
Sekunde programmiert, von der Anlagerung zur Veriangerung der DNA-Strange auf
20°C/ Sekunde und auf 20°C/ Sekunde für den Schritt von der Veriangerung bis zur
Denaturierung Die Fluoreszenz, die aus dem FRET der komplementär nebeneinander anlagernden Sonden resultiert, wird zur Beobachtung der PCR am
Ende der Anlagerunsphase in jedem Zyklus gemessen Sonden, die sich auf Grund von Sequenzunterschieden der Target-DNA nicht vollständig anlagern können, da deren Anlagerungstemperatur unter der der Oligonukleotide liegt, können zu diesem
Zeitpunkt der Fluoreszenzmessung noch nicht erfasst werden
Nach vollständiger Amplifikation wird eine abschließende Schmelzkurve wie folgt aufgezeichnet Denaturierung der Amplifikationsprodukte für 5 Sekunden bei 95°C
Kuhlen auf 30°C mit einer Tempeπeruπgsrate von 20°C/Sekunde, Halten dieser
Temperatur für 15 Sekunden und anschließendes langsames Heizen von 0,2°C/
Sekunde bis 95°C Wahrend des langsamen Temperaturanstieges wird die
Fluoreszenz der angelagerten Hybridisationssonden bis zum jeweiligen
Abschmelzen/ Dissoziieren kontinuierlich registriert Für jede Probe wird durch das
Aufzeichnen des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Temperatur eine
Schmelzkurve aufgezeichnet Durch Bilden der ersten negativen Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur werden die Schmelzkurven in Schmelzpeaks umgewandelt
Nach Abgleichen der Fluoreszenzsignale bei 640nm und 705nm gegen die mit einem Colorcompensation Kit (Röche Molecular Diagnostics) erstellten Standardkunten für die jeweilige Wellenlange, konnten die Schmelzpunkte der Schweine-DNA mit denen der menschlichen DNA für die verschiedenen Sondenkombinationen verglichen werden Dabei konnten für die Schweine-DNA jeweils 2 Schmelzpunkte für jedes Sondenpaar aufgezeichnet werden, je einer für das Pseudogen und einer für das Gen Alle Schmelzpunkte der Schweine-DNA waren von denen der menschlichen DNA verschieden (Figur 5)
Beispiel 5
In diesem Versuch wird die Speziesunterscheidung der Schweine-DNA von verschiedenen anderen Tierspezies mit einem einzigen Hybridisationssondenpaar gezeigt Dazu wurden DNAs von Rind Schaf, Zwergziege, Huhn und Pute zur Analyse herangezogen (Gensequenzen in Anlage "Zusammenstellung der Spezies- Sequenzen" unter "Sequenzen-lntron4-Exon5")
Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte eines Hybridisationssondenpaares, dessen Sequenzen für das Pseudogen des Schweines im Bereich der 9 Basenpaardeletion spezifisch sind (A1/A2) und welches bereits in Beispiel 4 Verwendung fand, bestimmt wurden Für die Amplifizierung wurden die unter Beispiel 4 verwendeten Pπmer verwendet Die DNA wurde aus den Bluten der genannten Spezies mittels QIAGen Kιt(QIAGen) gewonnen und aufgereinigt Für die Real-time-PCR werden für jede Spezies ein Probenansatz mit jeweils 2μl (50 ng) der entsprechenden DNA und für eine Negativkontrolle ein Probenansatz mit 2μl Aqua dest vorgelegt In jeden Probenansatz wurde weiterhin jeweilsl μl (1 μM) der Sonde A1 und 2μl (0,2μM) der Sonde A2 pipettiert Für das Pipettieren weiterer Reagenzien in ihren Volumina und Konzentrationen und für die weiteren Reaktionsschπtte am LightCycler wurde das Vorgehen unter Beispiel 1 gewählt
Das Vergleichen der Schmelzpunkte von der Schweine-DNA mit denen der anderen Tierspezies zeigt deutliche Unterscheidung der Schweine-DNA von den anderen Tierspezies (Figur 6) Beispiel 6
In diesem Versuch soll die Speziesunterscheidung zwischen verschiedenen Tierspezies am Beispiel folgender Spezies mit Hybridisationssonden von Beispiel 4 gezeigt werden:
Schwein, Hirsch, Hund, indischer Elefant, Forelle, Wachtel, Ente, Kropfgazelle, Maus, Meerschwein (Gensequenzen in Anlage "Zusammenstellung der Spezies- Sequenzen" unter "Sequenzen-lntron4-Exon5")
Die vergleichende Analyse wurde durchgeführt, indem die Schmelzpunkte aus verschiedenen Kombinationen der Hybridisationssonden aus Beispiel 4 in den Kombinationen C1+B2, A1+B2, A1+A2, C1+A2, B1+B2 und B1+A2 bestimmt und für jede Tierspezies zu einem Panel zusammengestellt wurden.
Die DNA wurde aus den Bluten der genannten Spezies mittels QIAGen Kit(QIAGen) gewonnen und aufgereinigt. Für die Amplifizierung wurden die unter Beispiel 4 aufgeführten Primer verwendet. Für den weiteren Versuchsverlauf und die anschließende Schmelzpunktanalyse wurde das Vorgehen, erweitert durch die zusätzlichen Sondenkombinationen und größere Anzahl an Spezies, unter Beispiel 4 gewählt.
Für jede Spezies wurde ein Panel ihrer Schmelzpunkte für die entsprechenden Sondenkombinatioπen zusammengestellt (Figur 7). Durch Vergleich der Panel der verschiedenen Spezies resultiert eine Unterscheidung jeder Spezies von den anderen in mindestens einem Schmelzpunkt.
In Figur 8 sind die Mittelwertkun/en, die für ausgewählte Sondenkombinationen (C1+C2/ A1+A2/ B1+A2 und A1+C2 aus je 15 Schweine-DNAs und C1+C2/ A1+A2/ B1+A2 und C1+A2 aus je 15 Menschen-DNAs) ermittelt wurden, mit den entsprechenden Standardabweichungen dargestellt. Die Versuchsdurchführung entspricht dem Beispiel 4.
Desweiteren sind im Anhang unter der "Zusammenstellung der Spezies-Sequenzen" die Sequenzen der untersuchten Spezies für die Exon 1-9 und der 5'-untranslatierten Region des PTEN/MMAC1 Gens, des Pseudogens und ihrer Homologe aufgeführt. Diese Beispiele für verschiedene Sondenkombinations-Panel können durch eine beliebige Anzahl von Sonden und Primer für das beschriebene Gen PTEN/MMAC1 , des Pseudogens und ihrer Homologe, aber auch für alle anderen Gene, erweitert und angewendet werden. Eine lineare Zunahme der Pπmer und Sondenkombinationen im gesamten Genom ergibt einen exponentiellen Zuwachs an Unterscheidungsmoglichkeiten verschiedenster Spezies untereinander Durch den Einsatz von sequenzspezifischen Sonden und mehreren und/oder beliebig vielen Sondenkombinationen kann eine Spezies durch ihr ganz spezifisches Schmelzpunktpanel von allen anderen Spezies unterschieden werden
Literatur
Steck, P A , Pershouse, M A , Jasser, S A , Yung, W K.A , Lin, H , Ligon, A H , Langford, L A , Baumgard, M L , Hattier, Th , Davis, T , Frye, Ch Hu, R , Swedlund, B , Teng, D H F , and Tavtigian, S V (1997) Identification of a candidate tumor suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23 3 that is mutated in multiple advanced cancers Nat Genet 15 356-362
Wittwer C T , Herrmann, M G , Moss A A , and Rasmussen, R P (1997) Continuous fluorescence monitoπng of rapid cycle DNA amplification BioTechniques 22 130-138
Wittwer, C T , Rme, K M , Andrew, R V David D A , Gundry R A and Balis, U J (1997) The LightCycler™ A mikrovolume multisample fluoπmeter with rapid temperatur control BioTechniques 176-181
Lay M J and Wittwer, C T (1997) Real-time fluorescence genotypmg of factor V Leiden duπng rapid-cycle PCR Clinical Chemestry 43 12, 2262-2267
Bernard, P S , Lay M J and Wittwer C T (1998) Integreated amplification and detection of the C677T pomt mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Analytical biochemestry 255 101-107
Riπe, K M , Rasmussen, R P and Wittwer, C T (1997) Product differentation by analysis of DNA meltmg curves duπng the Polymerase Chain reaction Analytical Biochemestry 245 154-160
Bernard, P S , Pntham, G H , and Wittwer, C T (1999) Color multiplexing hybπdization probes using the Apolipoprotein E locus as a model System for genotyping Analytical Biochemestry 273 221-228
Nauck, M , Wieland, H and März, W (1999) Rapid, homogeneous genotyping of the 4G/5G polymorphism in the promotor region of the PAI I gene by fluorescence resonance energy transfer and probe meltmg curves Clinical Chemestry 45 8, 1141-1147
Nauck, M S , Gierens, H , Nauck, M A , März, W and Wieland, H (1999) Rapid genotyping of human platelet antigenl (HPA-1) with fluorophore- labelled hybπdization probes on the LightCycler™ Bπtish Journal of Haematology 105 803-810
Kreuzer K -A , Lass U , Bohn A Landt O and Schmidt C A (1999) LightCycler technology for the quantitation of brc/abl fusion transcπpts Cancer Research 59 3171-3174
Kyger, E M , Krevolin, M D and Powell M J (1998) Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase chain reaction and peptide nucleic acid clamping Analytical Biochemistry 260 142- 148
Mangasser-Stephan, K Tag, C , Reiser, A and Gressner A M (1999) Rapid genotyping of hemochromatosis gene mutations on the LightCycler with fluorescent hybπdisation probes Clinical Chemistry 45 10 1875-1881 Asiandis, O, Nauck, M., Schmitz and G. (1999) High-speed prothrombin G to 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C to 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves. BioTechniques 27: 234- 238
Anhang
Zusammenstellung - Figuren 1-8:
Figur 1 : Schematische Darstellung des Verfahrens zur
Identifizierung von Organismen gemäß Beispiel 1
Figur 2: Vergleich der ermittelten Sequenzen vom Mensch und afrikanischen Elefant gemäß Beispiel 1
Figur 3: DNA-Sequenzvergleich eines Schweines mit käuflich erworbener Schweineleber und Rindersalami gemäß Beispiel 2. Die Unterschiede der Nukleotidsequenzen sind dargestellt. Auffallig ist die 9-Basenpaar große Deletion (nukleotide 216-224) beim Schwein / Schweineleber.
Figur 4: Positionen der Hvbridisationssonden im Exon 5 des PTEV
Gens, Pseudogens und ihrer Homologe
Figur 5: Beispiel 4 - Schmelzpunkt-Panel von Schwein und Mensch
Figur 6: Beispiel s - Schmelzpunkte der Sondenkombination AI +
A2 beim Schwein im Vergleich zu verschiedenen Spezies
Figur 7: Beispiel 6 - Schmelzpunkt-Panel verschiedener Spezies
Figur 8: Standardabweichungen ausgewählter Sonden für Schwein
(HS) und Mensch (WT)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung von Organismen durch vergleichende genetische Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß man kodierende und/oder nichtkodierenden Bereiche und/oder funktioneil bedeutende Bereiche hochkonseπtierter Gene und/oder deren homologe Gene, und/oder deren cDNA-Abschriften und/oder deren Pseudogene mit Hilfe der PCR amplifiziert und nachfolgend genotypisiert und analysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß jeweils für einen bestimmten Abschnitt des hochkonservierten Gens jeweils ein Primerpaar benutzt wird, das in der hochkonservierten Exonregion und/oder nichtkodierenden Bereichen und/oder funktioneil bedeutenden Bereichen und/oder im 5'- oder 3'- untranslatierten Bereich des Gens liegt und bei möglichst vielen, bevorzugt allen untersuchten Spezies-DNAs bindet und die Amplifikation des entsprechenden Genbereiches ermöglicht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Primern liegende kodierende und/oder nichtkodierende Bereiche, die entweder hochvariante Intronbereiche und/oder Variante Exonbereiche oder 5'- oder 3'- untranslatierte Bereiche des Gens sind, bezüglich ihrer Sequenz analysiert und durch Vergleich mit den speziesspezifischen Sequenzvarianten identifiziert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß entweder der Sense- oder der Antisensestrang jeglicher Spezies-DNA oder auch deren PCR-Abschriften für die Identifizierung verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Animalia identifiziert werden.
6 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Vertebraten identifiziert werden
7 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Saugetiere identifiziert werden
8 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Pflanzen identifiziert werden
9 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Genotypisierung durch DNA-Sequenzierung, jegliche Hybndisierungsverfahren, Restriktionsfragmentlangenanalysen, chromatographische Verfahren, spektroskopische und insbesondere massenspektroskopische Verfahren, allelspezifische PCR oder durch andere Methoden, die für den Nachweis von DNA- Sequenz-Vananten geeignet sind, erfolgt
10 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß Exon- und/oder Intronbereiche sowie funktioneil bedeutsame Bereiche des hochkonservierten Tumorsuppressorgens PTEN/MMAC1 und dessen Homologe zur Amplifikation und anschließender genetischer Analyse verwendet werden
11 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, bei dem cDNA-Abschnften des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden
12 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, bei dem Pseudogene oder Abschnitte von Pseudogenen des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden
13 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet daß vorzugsweise nebeneinander angeordnete Exons des PTEN/MMAC1 Gens und dessen Homologe und/oder die an die Exons anschließenden Teile des Introns genetisch analysiert werden
14 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Exonbereiche 1 und 2 und/oder 3 und 4 und/oder 4 und 5 und/oder 5 und 6 und/oder
6 und 7 und/oder 7 und 8 und/oder 8 und 9 mit den eingeschlossenen Intronbereichen 1 und/oder 2 und/oder 3 und/oder 4 und/oder 5 und/oder 6 und/oder
7 und/oder 8 sowie die 5'- und 3'-untranslatιerten Regionen des PTEN/MMAC1 Gens und deren Homologe zur genetischen Analyse verwendet werden
15 Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Bereiche hochkonservierter Gene und/oder Pseudogene und deren Homologe auswählt, als Primer geeignete Oligonukleotide konstruiert, die an die entsprechenden komplementären kodierenden und/oder nichtkodierenden Bereiche und/oder funktioneil bedeutenden Bereiche anlagern, mittels einer geeigneten Technik amplifiziert und durch genetische Analyse die Sequenz des jeweiligen kodierenden und/oder nichtkodierenden Bereiches bei verschiedenen Spezies vergleichend analysiert
16 Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Bereiche des PTEN/MMAC1 -Gens und/oder des Pseudogens und ihrer Homologe auswählt
17 Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß man unterschiedliche Sequenzabschnitte jedes einzelnen Exons, Introns oder untranslatierter Region des PTEN/MMAC1 -Gens und deren Homologen bzw die entsprechende cDNA auswählt
18 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 dadurch gekennzeichnet, daß eine Genctyp!S!e.rung von DNA des Schweines, die bevorzugt aus Nahrungsmitteln gewonnen wird, auf der Grundlage der Gensequenzvariante von PTEN/MMAC1 , die eine 9 Basenpaar große Deletion enthalt, durchgeführt wird
19 Oligonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 1 und/oder 5'-untranslatιerter Region des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENexl -401 sense 5'- cccttctactgcctcca -3'
PTENexl -465 sense 5'- gggagggggtctgagt - 3'
PTENexl ATG sense
5'- atgacagccatcatcaaaga - 3"
PTENexl R antisense
5'- aggtcaagtctaagtcgaatc - 3'
20 Ohgonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 2 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENex2F sense
5'- atatttatccaaacattattgctat - 3'
PTENex2R antisense
5' - cttactacatcatcaatattgttcc - 3'
21 Oligonukleotid-Pπmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 4, Intron 4 und Exon 5 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
Zoo43sUV sense
5'- tgtgctgagagacattatgac-3*
SPL5 sense 5"-aaatttaattgcagaggt-3'
Zoo44aRV antisense 5'- ttgtctctggtccttacttc-3
22 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 5 des
PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTEN se sense 5'-atcttgaccaatggctaagtg-3"
Zoo44aRV antisense 5'- ttgtctctggtccttacttc-3'
23 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 6 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENex6F sense
5"-gga gta act att ccc agt cag ag -3"
PTENex6R antisense 5'-gca agt tcc gcc act gaa-3'
24 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 7 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENex7F sense
5'-cct cag ttt gtg gtc tgc ca-3
PTENex7R antisense
5'-c ctt ttt tag cat ctt gtt ctg ttt-3'
25 Oligonukleotid-Pnmer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 8 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENexδF sense
5^-caa aat gtt tca ctt ttg ggt aaa-3' PTENexδR antisense
5' -taa aat ttg gag aaa agt atc ggt t-3'
26. Oligonukleotid-Primer für die PCR und die Sequenzierung von Exon 9 des PTEN/MMAC1 Gens und seinen Homologen, gekennzeichnet durch die Sequenzen:
PTENexθF sense
5*-gtg aag ctg tac ttc aca aaa ac-3'
PTENexθtga antisense
5'-aaa aaa att cag act ttt gta att tg -3'
27. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man für die DNA-Amplifikation eine Mischung von Oligonukleotiden verwendet, die sich am 3'- Bereich des Oligonukleotids in ihrer Länge um ein oder mehrere Nukleotide unterscheiden oder die hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenz am 3'- Ende des Oligonukleotids an einer oder mehreren Positionen unterschiedlich sind.
28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 und 26, bei der die Oligonukleotide sense:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat t - 3', antisense:
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta c - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc t - 3', zur Amplifikation verwendet werden
29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 und 26, bei der die Oligonukleotide sense:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gaa - 3', 5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3', 5 - cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gag - 3',
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gat - 3', antisense
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt a- 3 ,
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c- 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt g - 3',
5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt t - 3' zur Amplifikation benutzt werden
30 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der genetischen Analyse DNA-Sequenzierungstechniken eingesetzt werden
31 Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei der genetischen Analyse für das PTEN/MMAC1 und/oder seiner Pseudogene und ihrer Homologe DNA-Sequenzierungstechniken eingesetzt werden
32 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird, die Schmelzpunkte von verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt werden
33 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt amplifiziert wird unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw zur Identifizierung mit diesem Panel verglichen werden
34 Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet dass mindestens ein Hybridisationssondenpaar eingesetzt wird und mindestens ein Genabschnitt von mindestens einer Spezies amplifiziert wird unterschiedliche Hybridisationssondenpaare an unterschiedliche Genabschnitte unterschiedlicher Spezies hybridisieren, und die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt bzw. zur Identifizierung mit diesem Panel verglichen werden.
35. Verfahren zur Unterscheidung der DNA verschiedener Spezies nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Hybridisationssonden der SEQ Nr. 3 bis 8 eingesetzt werden, die Schmelzpunkte von den verschiedenen Kombinationen bestimmt und für jede Spezies zu einem Panel zusammengestellt werden.
36. Verfahren nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Speziesunterscheidung der Schweine-DNA von verschiedenen anderen Spezies mit dem Hybridisationssondenpaar A1/A2 als Hybridisationssondenpaar erfolgt.
37. Verfahren nach Anspruch 33 und 34, dadurch gekennzeichnet, dass zur Speziesunterscheidung zwischen verschiedenen Spezies die Hybridisationssonden in den Kombinationen C1/C2; A1/B2/; A1/A2; C1/A2; B1/B2; B1/A2 eingesetzt werden.
38. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 5. gekennzeichnet durch die Sequenzen
A1 : 5' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3'
A2: 5'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3'
B1 : 5'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3'
B2: 5'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3'
C1 : 5' - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3'
C2: 5'- LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3'
39. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 6, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENexδFL
5'- tca tct gga tta tag acc agt ggc act - Fluorescein - 3' PTENex6LC 640
5"- LC Red 640- ttc aca aga tga tgt ttg aaa cta ttc caa- ph-3'
PTENex6F*
5 - gtg cca ctg gtc tat aat cca gat- Fluorescein - 3'
PTENexβL* 705
5N- LC Red 705- ttc ttt aac agg tag cta taa taa tac aca ta- ph - 3'
40. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 7, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENex7F*
5'- taa agg tga aga tat att cct cca att ca - Fluorescein - 3'
PTENex7L*640
5'- LC Red 640- acc cac acg acg gga aga caa g - ph - 3'
PTENex7 FL
5"- ggtaacggctgagggaactcaaagtac - Fluorescein - 3'
PTENex7 LC (705-markiert)
5'- LC Red 705- tgaacttgtcttcccgtcgtgtgg- ph - 3'
41. LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 8, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENexδF*
5'- tga caa gga ata tct agt act tac ttt aac aaa - Fluorescein - 3'
PTENexδL* 705
5'- LC Red 705- ctt gac aaa gca aat aaa gac aaa gc- ph - 3' PTENexδ FLU
5"- tgctatcgatttcttgatcacatagacttccatttt - Fluorescein - 3'
PTENexδ LCR (640-markιert)
5'- LC Red 640- actttttctgaggtttcctctggtcctggtat - ph - 3'
42 LightCycler-Hybridisationssonden für Exon 9, gekennzeichnet durch die Sequenzen
PTENex9 FL
5'- aac atc tgg tgt tac aga agt tga act gct - Fluorescein - 3'
PTENexθ LC 640
5'- LC-640- cct ctg gat ttg acg gct cct cta et - ph - 3'
43 Hybndisationssondenpaar A1/A2 spezifisch für PTEN-Pseudogen Schwein gekennzeichnet durch die
SEQ Nr 3 A1 5' - tgc ata ttt gtt tca tcc ggg caa att - Fluorescein - 3
SEQ Nr 4 A2 5'- LC Red 705 - tta aag gca caa gat ttc tat ggg ga - ph - 3
44 Hybndisationssondenpaar B1/B2 spezifisch für Pseudogen Mensch gekennzeichnet durch die
SEQ Nr 5 B1 5'- tgc ata ttt att aca tcg ggg caa att - Fluorescein - 3
SEQ Nr 6 B2 5 - LC Red 640 - aag gca caa gag gcc cta gat ttc ta -ph - 3
45 Hybndisationssondenpaar C1/C2 spezifisch für PTEN-Pseudogen Mensch (C2) und Homolog des Schweins (C1 ) gekennzeichnet durch die
SEQ Nr 7 - C1 5 - tgc ata ttt gtt aca tcg ggg taa att - Fluorescein - 3 SEQ Nr 8 - C2 entspricht Sonde B2
46 DNA-Sequenzen und/oder Fragmente von Homologen des PTEN/MMAC1 Gens und/oder der Homologen des PTEN/MMAC1 Pseudogens, die Proteine codieren, die an der Zell-Zell-Adhasion und der Zellzyklusregulation beteiligt sind sowie eine unverzichtbare Funktion in der Embryogenese der jeweiligen Spezies haben und die im Anhang unter "Zusammenstellung der Speziessequenzen" zusammengestellt
47 DNA-Sequenzen von Homologen des PTEN/MMAC1 Gens und/oder von Homologen des PTEN/MMAC1 Pseudogens, die im Anhang unter "Zusammenstellung der Speziessequenzen" zusammengestellt sind, welche im Vergleich zum PTEN/MMAC1 Gen und/oder dem PTEN/MMAC1 Pseudogen genetische Varianten wie Basenaustausche und/oder Insertionen und/oder Deletionen aufweisen und zur Identifizierung entsprechender Spezies geeignet sind
48 Besteck (Kit) zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR- und/oder Sequenzierungsoligonukleotiden, die an hochkonservierten Genen binden, wobei die Oligonukleotide gegebenfalls radioaktiv oder mittels eines Farbstoffes oder andersartig markiert sind b) Gefäße mit weiteren gebrauchlichen Reagenzien für die DNA-Amplifizierung und/oder DNA-Analyse, insbesondere für die DNA-Sequenzierung und
c) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbedingungen geeignet ist
49 Besteck (Kit) nach Anspruch 48 zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR- und/oder Sequenzierungs-Oligonukieotiden gemäß den Ansprüchen 19-26
50. Besteck (Kit) zur Identifikation von Spezies zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 18 sowie weiterer Ansprüche enthaltend:
a) ein Gefäß mit einem Oligonukleotidpaar mit folgenden Sequenzen:
5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt tgt gct gag aga cat tat gac - 3' und 5'- cag gaa aca gct atg act tgt ctc tgg tcc tta ctt c - 3',
b) zwei Gefäße mit jeweils einem der folgenden Sequenzierungsoligonukleotide, wobei diese Oligonukleotide gegebenfalls radioaktiv oder mittels eines Farbstoffes oder andersartig markiert sind:
5'- cag gaa aca gct atg ac - 3' und 5'- cga cgt tgt aaa acg acg gcc agt - 3'.
c) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbedingungen geeignet ist.
51. Besteck (Light Cycler Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 32 bis 37 sowie weiterer Ansprüche, enthaltend a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR-Primern und Hybridisationssonden, die an hochkonservierten Genen binden, wobei die Hybridisationssonden gegebenfalls mittels eines Farbstoffs markiert sind, b) Gefäße mit weiteren gebräuchlichen Reagenzien für die DNA-Amplifizierung und/oder DNA-Analyse, insbesondere für die Light Cycler Analyse und b) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Oligonukleotide und der Reaktionsbediπgungen geeignet ist.
52. Besteck (Light Cycler Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 32 bis 37 sowie weiterer Ansprüche, enthaltend: a) ein oder mehrere Gefäße mit PCR-Primern und Hybridisationssonden gemäß den Ansprüchen 38 bis 42.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004033216A (ja) * 2002-05-13 2004-02-05 Univ Utah アンプリコン融解曲線分析による遺伝子型分析

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10111420A1 (de) * 2001-03-09 2002-09-12 Gnothis Holding Sa Ecublens Bestimmung von Analyten durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie
DE10313791A1 (de) * 2003-03-20 2004-10-07 Bange, Franz-Christoph, Dr. Spezifischer Nachweis von Mykobakterien des M. tuberculosis-Komplex
FR2873716B1 (fr) * 2004-07-30 2008-07-04 Univ Claude Bernard Lyon Procede permettant de detecter et d'identifier simultanement differentes especes animales ou vegetales, dans un echantillon de matiere organique
DE102014221734A1 (de) * 2014-10-24 2016-04-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Messvorrichtung und System zur Schmelzkurvenanalyse eines DNA Microarrays, sowie Verwendung eines Fluoreszenzdetektorarrays zur Analyse

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992005277A1 (en) * 1990-09-26 1992-04-02 William Scott Davidson Test to determine an organism's species and/or population identity by direct nucleotide sequence analysis of defined segments of its genome
DE19629166A1 (de) * 1995-08-22 1997-02-27 Ztb Zentrum Technologietransfe Analytisches Verfahren zur Feststellung der Abstammung verschiedener Materialien biologischer Herkunft unter Verwendung mindestens eines Primers
US5614361A (en) * 1981-09-25 1997-03-25 Webster, Jr.; John A. Method for identifying and characterizing organisms
WO1997039008A1 (en) * 1996-04-12 1997-10-23 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays
US5849492A (en) * 1994-02-28 1998-12-15 Phylogenetix Laboratories, Inc. Method for rapid identification of prokaryotic and eukaryotic organisms

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614361A (en) * 1981-09-25 1997-03-25 Webster, Jr.; John A. Method for identifying and characterizing organisms
WO1992005277A1 (en) * 1990-09-26 1992-04-02 William Scott Davidson Test to determine an organism's species and/or population identity by direct nucleotide sequence analysis of defined segments of its genome
US5849492A (en) * 1994-02-28 1998-12-15 Phylogenetix Laboratories, Inc. Method for rapid identification of prokaryotic and eukaryotic organisms
DE19629166A1 (de) * 1995-08-22 1997-02-27 Ztb Zentrum Technologietransfe Analytisches Verfahren zur Feststellung der Abstammung verschiedener Materialien biologischer Herkunft unter Verwendung mindestens eines Primers
WO1997039008A1 (en) * 1996-04-12 1997-10-23 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAHIA PATRICIA L M ET AL: "A highly conserved processed PTEN pseudogene is located on chromosome band 9p21." ONCOGENE, Bd. 16, Nr. 18, 7. Mai 1998 (1998-05-07), Seiten 2403-2406, XP000979030 ISSN: 0950-9232 *
DATABASE EMBL [Online] EMBL; Accession no. AF029308, 4. November 1997 (1997-11-04) "Homo sapiens chromosome 9 duplication of the T cell receptor beta locus and trypsinogen gene families" XP002162060 *
DATABASE EMBL [Online] EMBL; Accession no. AF67844, 8. Februar 1999 (1999-02-08) "Homo sapiens chromosome 10 clone PTEN, complete sequence" XP002162059 *
See also references of EP1169478A2 *
STECK P A ET AL: "IDENTIFICATION OF A CANDIDATE TUMOUR SUPPRESSOR GENE, MMACI, AT CHROMOSOME 10Q23.3 THAT IS MUTATED IN MULTIPLE ADVANCED CANCERS" NATURE GENETICS,US,NEW YORK, NY, Bd. 15, Nr. 4, 1. April 1997 (1997-04-01), Seiten 356-362, XP002066156 ISSN: 1061-4036 in der Anmeldung erw{hnt *
TENG D H -F ET AL: "MMAC1/PTEN MUTATIONS IN PRIMARY TUMOR SPECIMENS AND TUMOR CELL LINES" CANCER RESEARCH,US,AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, Bd. 57, 1. Dezember 1997 (1997-12-01), Seiten 5221-5225, XP002915160 ISSN: 0008-5472 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004033216A (ja) * 2002-05-13 2004-02-05 Univ Utah アンプリコン融解曲線分析による遺伝子型分析

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