KR101982627B1 - Ｓｔｒ 유전자좌의 신속한 다중 증폭 방법 및 조성법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적 핵산으로부터 매우 특이적인 STR 프로파일을 빠르게 생성하는데 사용할 수 있는 단기 일렬 반복 (STR) 유전자좌의 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 위한 방법을 제공한다. 생성되는 STR 프로파일은 법 집행, 국토안보부, 군사, 정보, 및 친자감별 용도에서 개인 인증의 목적에 유용하다.

Description

ＳＴＲ 유전자좌의 신속한 다중 증폭 방법 및 조성법{METHOD AND COMPOSITIONS FOR RAPID MULTIPLEX AMPLIFICATION OF STR LOCI}

관련 출원의 참조 연계

본 출원은 미국 출원 번호 11/132,712의 표제 "핵산 및 단백질의 내구성 분석 장치 (Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins)"; 미국 출원 번호 12/080,746의 표제 "표적 핵산의 신속한 다중화 적용 방법 (Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids)" ; 미국 출원 번호 12/080,745의 표제 "플라스틱 미세 유체 분리 및 검출 플랫폼 (Plastic Microfluidic Separation And Detection Platforms)" 미국 출원 번호 12/080,751의 표제 "통합 핵산 분석 (Interrated Nucleic Acid Analysis)"; 및 미국 출원 번호 13/044,485의 표제 "단일 바이오칩 (Unitary Biochips)"의 출원의 전체내용을 참조로서 포함한다.

정부의 지원

본 발명은 국토 안보부, 제 N10PC2010S호로부터 SBIR 지원금하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 가질 수 있다.

발명의 분야

본 발명은 핵산 시료 간의 단기 일렬 반복 유전자좌 (Short Tandem Repeat, STR)의 신속한 증폭 조성물 및 방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 시험관내에서 핵산 서열의 신속한 지수적 증폭을 촉진하는 효소 반응이다. 법의학에서, PCR은 단기 일렬 반복(Short Tandem Repeat, STR)으로 공지된 반복되는 DNA의 일부를 포함하는 인간 유전체의 작은 영역의 증폭을 기초로 하여 개체를 감별하는데 사용될 수 있다. 2 내지 10개의 염기쌍 범위의 제공된 STR 반복의 단위 길이, 및 STR들은 일반적으로 비-코딩 및 플랭킹(flanking) 서열 내에 해당되나, 이는 때때로 코딩 영역 내에 해당된다(Edwards et al ., Am . J. Hum . Genet . 1991, 49, 746-756). 인간 유전체에는 각각 평균 6-10kb로 발생하고(Beckman and Weber, Genomics 1992, 12, 627-631), 고도로 다형체인 (Edwards et al ., Trans . Assoc . Am . Physicians 1989, 102, 185-194) 수십만개의 STR 유전자좌가 존재한다. STR 분석은 법의학 설비에서 주요 도구가 되고 있으며, 친자 감별, 대형 참사 시의 개인 감별, 및 통상적인 아동의 형결정(typing of children)을 포함하여 적용 추세가 증가하고 있다.

발명의 개요

첫번째 양태에서, 본 발명은 (a) STR 유전자좌에 대한 6개 이상의 상이한 프라이머 쌍과 상기 샘플을 하나의 용액에서 접촉시키는 단계, 여기서 각 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머는 형광 염료로 표지되고, 생성된 STR 멀티플렉스 (multiplex)는 3.20 이상의 멀티플렉스 밀도 (Multiplex Density)를 갖고; (b) 증폭된 핵산 산물을 생성하기 위해 상기 6개 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 하나의 반응 챔버에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 동시 증폭하는 단계; 및 (c) 레이저 유도 형광법으로 상기 핵산 생성물 검출하는 단계를 포함하는, STR 유전자좌의 다중 증폭 방법을 제공한다. 관련된 양태에서, 다중 STR 분석은 3.0 이상, 3.1 이상, 3.2 이상, 3.3 이상, 3.4 이상, 3.5 이상, 3.6 이상, 3.7 이상, 3.8 이상, 3.9 가 이상, 4.0 이상, 4.2 이상, 4.4 이상, 4.6 이상, 4.8 이상, 5.0 이상 , 5.5 이상, 6.0 이상, 6.5 이상, 7.0 이상, 7.5 이상, 8.0 이상, 8.5 이상, 9.0 이상, 9.5 이상, 또는 10 이상의 멀티플렉스 밀도 (Multuplex Density)를 갖는다. 일부 실시 예에서, 총 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 여기(excitation) 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 자극 및 검출법에 기초하여 검출된다. 형광 염료의 수가 늘어나면 보다 큰 다중 밀도를 얻을 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) STR 유전자좌에 대한 6개 이상의 상이한 프라이머 쌍과 상기 샘플을 하나의 용액에서 접촉시키는 단계, 여기서 각 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머는 형광 염료로 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되고, 생성된 STR 멀티플렉스는 1044 이상의 STR 유전자좌 크기 범위합 (Multiplex Locus Size Range Sum)을 갖고; (b) 증폭된 핵산 산물을 생성하기 위해 상기 6개 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 하나의 반응 챔버에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 동시 증폭하는 단계; 및 (c) 레이저 유도 형광법으로 상기 핵산 생성물 검출하는 단계를 포함하는, STR 유전자좌의 다중 증폭 방법을 제공한다. 관련된 양태에서, 다중 STR 분석은 1050개 염기 이상, 1075개 염기 이상, 1100개 염기 이상, 1125개 염기 이상, 1150개 염기 이상, 1175개 염기 이상, 1200개 염기 이상, 1225개 염기 이상, 1250개 염기 이상, 1275개 염기 이상, 1300개 염기 이상, 1325개 염기 이상, 1350개 염기 이상, 1375개 염기 이상, 1400개 염기 이상, 1425개 염기 이상, 1450개 염기 이상, 1475개 염기 이상, 1500개 염기 이상, 1600개 염기 이상, 1700개 염기 이상, 1800개 염기 이상, 1900개 염기 이상, 2000개 염기 이상, 2500개 염기 이상, 3000개 염기 이상, 4000개 염기 이상 또는 5000개 염기 이상의 STR 유전자좌 크기 범위합을 갖는다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 형광 염료의 수가 늘어나면 보다 큰 STR 유전자좌 크기 범위합을 얻을 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 특정 양태는 (a) 하나 이상의 공급원으로부터 얻은 1개 이상의 핵산 주형 샘플을 6개 이상의 상이한 프라이머 쌍과 하나의 용액에서 접촉하고, 각 쌍은 하나 이상의 핵산 주형 내의 6개 이상의 STR 유전자좌 중 하나와 하이브리드화되며, 여기서 프라이머 쌍 중 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의(특정 양태에서는 5개, 다른 어떤 양태에서는 6개 이상) 상이한 표지제가 사용되며; (b) 6개 이상의 핵산 산물을 생성하기 위해 1개 이상의 핵산 내의 6개 이상의 STR 다형성 유전자좌를 하나의 반응 챔버에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 증폭하는 것을 포함하는 다형성 유전자좌의 다중 증폭 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 6개 이상의 유전자좌가 증폭된다. 일부 구체예에서, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상, 31 이상, 32 이상, 34 이상, 36 이상, 38 이상, 40 이상의 STR 유전자좌가 증폭된다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D22S1045, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍과, 하나 이상의 추가 STR 유전자좌에 대한 프라이머 한 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D22S1045, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍과, STR 유전자좌 SE33, 펜타 C, 펜타 D, 펜타 E, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, DYS391 및 D6S1043의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대한 1개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D16S539, VWA, D21S11, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍과, 하나 이상의 추가 STR 로커스에 대한 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D16S539, VWA, D21S11, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 유전자좌 SE33, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D12S391, D22S1045, DYS391 및 D6S1043의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대한 1개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, FGA, D8S1179, D6S1043에 대한 프라이머 쌍, 및 적어도 하나 이상의 추가 유전자좌에 대한 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, FGA , D8S1179 , D6S1043D에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 SE33, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D22S1045 및 DYS391의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대한 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 하나 이상의 추가 STR 유전자좌에 대한 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및STR 유전자좌 SE33, 펜타 C, 펜타 D, TPOX, 펜타 E, D22S1045 및 D6S1043의 세트로 부터 선택된 STR 유전자좌 대한 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 2개 이상의 추가 STR 유전자좌에 대한 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 펜타 C, 펜타 D, 펜타E, SE33 및 D6S1043의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대한 각각 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, SE33, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391 , D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 하나 이상의 추가 STR 로커스에 대한 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, SE33, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 펜타 C, 펜타 D, 펜타 E 및 D6S1043의 세트로 부터 선택된 STR 유전자좌에 대한 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 각각 STR 유전자좌 D3S1358, TH01, D18S51, D16S539, VWA, D21S11, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 하나 이상의 추가 STR 유전자좌를 각각 증폭하는 6개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, TH01, D18S51, D16S539, VWA, D21S11, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 D19S433, D2S1338, SE33, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D12S391, 펜타 D, 펜타 E, D22S1045 및 DYS391의 세트로부터 선택된 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개 이상의 추가 STR 유전자좌에 대한 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 6개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, TH01, D18S51, D1S6156, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D22S1045, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 하나 이상의 추가 STR 유전자좌를 각각 증폭하는 2개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433m D2S1338, TH01, D18S51, D16S539, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D22S1045, FGA, D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 SE33, 펜타 C, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, DYS391 및 D6S1043의 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가 STR 유전자좌를 각각 증폭하는 2개 이상의 추가 프라이머 쌍들을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D18S51, D16S539, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, FGA, D8S1179 및 D6S1043에 대한 프라이머 쌍, 및 하나 이상의 추가 STR 유전자 좌에 대한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D18S51, D16S539, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, FGA, D8S1179 및 D6S1043에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자좌 SE33, TH01, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, VWA, 펜타 D, D22S1045, 펜타 E, SE33 및 D6S1043의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대해 각각 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D18S51, D16S539, D10S1248, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, D22S1045, FGA 및 D8S1179에 대한 프라이머 쌍, 및 STR 유전자 좌 SE33, 펜타 C, 펜타 D, TPOX, 펜타 E, DYS391 및 D6S1043의 세트로부터 선택된 STR 유전자좌에 대해 각각 1개 이상의 추가 프라이머 쌍을 가지거나 가지지 않은 프라이머 쌍을 포함한다. 총 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료들이 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 일부 구체예에서, 성별 감식을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커는 임의로 멀티플렉스에 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 3.0 이상, 3.1 이상, 3.2 이상, 3.3 이상, 3.4 이상, 3.5 이상, 3.6 이상, 3.7 이상, 3.8 이상, 3.9 이상, 4.0 이상, 4.2 이상, 4.4 이상, 4.6 이상, 4.8 이상, 5.0 이상, 5.5 이상, 6.0 이상, 6.5 이상, 7.0 이상, 7.5 이상, 8.0 이상, 8.5 이상, 9.0 이상, 9.5 이상 또는 10.0 이상인 멀티플렉스 밀도를 갖는다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료가 프라이머를 표지하기 위하여 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 형광 염료의 수가 늘어나면 보다 큰 멀티플렉스 밀도를 얻을 수 있다.

일부 구체예에서, 다중 STR 분석은 1044개 염기 이상, 1050개 염기 이상, 1075개 염기 이상, 1100개 염기 이상, 1125개 염기 이상, 1150개 염기 이상, 1175개 염기, 1200개 염기 이상, 1225개 염기 이상, 1250개 염기 이상, 1275개 염기 이상, 1300개 염기 이상, 1325개 염기 이상, 1350개 염기 이상, 1375개 염기 이상, 1400개 염기 이상, 1425개 염기 이상 , 1450개 염기 이상, 1475개 염기 이상, 1500개 염기 이상, 1600개 염기 이상, 1700개 염기 이상, 1800개 염기 이상, 1900개 염기 이상, 2000개 염기 이상, 2500개 염기 이상, 3000개 염기 이상 4000개 염기 이상 또는 5000개 염기 이상의 STR 유전자좌 크기 범위합을 갖는다. 일부 구체예에서, 총 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료가 프라이머를 표지하기 위하여 사용되고 (각 프라이머 쌍의 하나의 프라이머만 표지됨), 염료 표지된 단편은 레이저 여기 및 검출법에 기초하여 검출된다. 형광 염료의 수가 늘어나면 보다 큰 STR 유전자좌 크기 총합을 얻을 수 있다.

6개 이상 형광 표지제 (예를 들면, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 표지제) 사용은 많은 장점을 제공한다. 예를 들어, 분해된 DNA 샘플로 작업할 때, 원하는 증폭 산물을 모두 생성할 가능성 이 다중 STR 실험에서 작은 앰플리콘 (amplicon)의 사용으로 증가한다. 6개 또는 그 이상의 표지 염료의 사용은 프라이머 변인물 (artifacts) 및 프라이머 이량체 보다 큰 최소 가능 범위에서 설계되는 추가적인 유전자좌를 허용함으로써 유전자좌의 평균 앰플리콘의 크기를 감소시켜 분해된 DNA 샘플의 성공 가능성을 높인다. 일부 구체예에서, 6개 이상의 유전자좌는 하나의 멀티플렉스 세트에서 증폭되는데, 여기서 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용된다. 일부 구체예에서, 12개 이상의 유전자좌는 하나의 멀티플렉스 세트에서 증폭되는데, 여기서 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용된다. 일부 구체예에서 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 유전자좌는 하나의 멀티플렉스 세트에서 중합되는데, 여기서 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용된다. 정부는 시간이 지남에 따라 추가적인 유전자좌를 특별히 구상하고 있고, 27개보다 많은 유전자좌를 허용하도록 멀티플렉스 내에 6개 이상의 색을 사용하는 것을 구상하고 있다. 보다 많은 유전자좌 중 하나는 대체 될 수 있다. 예를 들어, FBI는 현재 미국 CODIS 데이터베이스에 입력할 샘플 프로필에 현재 필요한 상태로부터 추천 상태로 TPOX 유전자좌를 하향조정하는 것을 고려하고 있다 .

또한, 정보를 얻을 수 있는 STR 유전자좌의 색상 및 수의 증가는 우연한 일치의 경우를 줄일 수 있고 (DNA-데이터베이스 관리 2010의 ENFSI 문서), 다양한 다른 STR-기반 적용들을 실행하는데 확신을 더할 수 있다. 예를 들어, DNA 프로파일링의 역할은 데이터베이스의 가족 검색을 포함하도록 확장되고 있으며 [참조: 비버 등, 친족 관계의 DNA를 통한 범죄자 검색 (Bieber et al. Bieber et al. Finding criminals through DNA of their relatives.) Science. 2006;312(5778):1315-6; 노트나겔 등. 상염색체 단기 일렬 반복 유전자좌를 이용한 친족 관계 분석의 가능성과 한계 (Nothnagel et al. Potentials and limits of pairwise kinship analysis using autosomal short tandem repeat loci.) Int J Legal Med. 2010;124(3):205-15)] 및 친족 관계 분석은 난민, 망명자 및 이민 적용 프로그램에 채택되고 있다. [참조: 베이커 등. 재결합 가족: 서류 미비 이민체류자의 식별을 돕기 위한 온라인 데이터베이스; (Baker et al. Reuniting Families: An Online Database to Aid in the Identification of Undocumented Immigrant Remains)*. J Forensic Sci. 2008;53(1):50-3; 프레스턴. 미국은 DNA 샘플링의 방대한 확장 시작 착수; 이민자에 큰 효과; 연방 요원에 구금되거나 체포되는 대부분 사람들에 적용하는 법 (US set to begin a vast expansion of DNA sampling; big effect on immigrants; law to cover most people detained or arrested by federal agents.) The New York times. 2007:A1, A15].

6개 이상의 표지제 사용의 또 다른 장점은 몇몇 국가가 각종 범죄의 가해자의 식별에 도움을 주기위해 채택한 국가 데이타베이스 생성에 사용하기 위해 STR 유전자좌의 표준 세트를 확정한다는 사실에 근거한다 [버드윌 등. 아프리카계 미국인, 미국백인, 히스패닉, 버마인 자메이카인 및 트리니다드계인의 13개 CODIS 코어 단기 일렬 반복 유전자좌의 방대한 데이터 (Budowle et al. Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians.) J Forensic Sci. 1999;44:1277-86; 부틀러. 인간 개인 식별에 이용되는 코어 단기 일렬 반복 유전자좌의 유전학 및 유전자체학. (Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing.) J Forensic Sci. 2006 Mar;51(2):253-65; 길 등. 유럽용 신 멀티플렉스--전략 개발을 위한 수정 및 설명 (Gill et al . New multiplexes for Europe--Amendments and clarification of strategic development.) Forensic Sci Int. 2006;163(1-2):155-7]. 이러한 표준 세트는 나라마다 다양하다. 국경을 넘어 STR 프로파일 데이터를 공유하고자 하는 요구에 따라 지역, 국가 및 국제 데이터베이스의 크기는 증가하고 있다. 데이터베이스 검색 호환성은 동시에 분석될 수 있는 STR 유전자좌의 수를 증가하는 것으로부터 유용할 것이다. 6개 이상의 표지제 사용은 개별 국가에서 사용되는 모든 STR 유전자좌를 본질적으로 통합하는 새로운 국제 STR 표준의 생성을 허용한다.

다중화 STR의 분석에 포함될 수 있는 STR 유전자좌의 여러 범주가 있다. 상염색체의 STRs (상기 논의된 대부분), X-STRs, Y-STRs 및 미니-STR (상염색체, Y- 및 X-STR의 저분자량 형태) 등이 포함된다. STR 분석은 주어진 분석에서 한가지 유형의 STR 유전자좌 또는 STR 유전자좌의 조합으로 구성할 수 있다 (예를들어, 상염색체, X 및 Y-STRs은 함께 통합될 수 있다)

남성-남성 유전의 직통 혈계를 평가하는 경우, 지리적 혈통의 친족 관계 분석 및 조사는 Y 염색체 STR 마커를 사용하는 것이 상당히 유리하다. 일부 구체예에서, 6개 이상의 Y 염색체 STR 유전자좌 (6, 8, 10, 12, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30개 또는 그 이상의 Y 염색체 STR 유전자좌는 일부 적용에 바람직함)는 멀티플렉스 세트에서 증폭되는데, 여기서 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용된다. 일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는 18개 이상의 유전자좌가 멀티플렉스 세트에서 증폭된다. 일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는, DYS19, DYS378I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385a/b, DYS437, DYS438, DYS439, DYS472, DYS476, DYS480, DYS481, DYS485, DYS487, DYS488, DYS490, DYS491, DYS492, DYS494, DYS495, DYS497, DYS505, DYS508, DYS511, DYS522, DYS525, DYS530, DYS531, DYS533, DYS537, DYS540, DYS549, DYS554, DYS556, DYS565, DYS567, DYS568, DYS569, DYS570, DYS572, DYS573, DYS575, DYS576, DYS578, DYS579, DYS580, DYS583, DYS589, DYS590, DYS594, DYS617, DYS618, DYS636, DYS640, DYS641 또는 DYS643로부터 선택된 1개 이상의 유전자좌를 갖는 18개 이상의 유전자좌가 멀티플렉스 세트에서 증폭된다. 일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는, DYS19, DYS378I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385a/b, DYS437, DYS438, DYS439, DYS472, DYS476, DYS480, DYS481, DYS485, DYS487, DYS488, DYS490, DYS491, DYS492, DYS494, DYS495, DYS497, DYS505, DYS508, DYS511, DYS522, DYS525, DYS530, DYS531, DYS533, DYS537, DYS540, DYS549, DYS554, DYS556, DYS565, DYS567, DYS568, DYS569, DYS570, DYS572, DYS573, DYS575, DYS576, DYS578, DYS579, DYS580, DYS583, DYS589, DYS590, DYS594, DYS617, DYS618, DYS636, DYS640, DYS641 또는 DYS643으로부터 선택된 1개 이상의 유전자좌를 갖는 24개 이상의 유전자좌가 멀티플렉스 세트에서 증폭된다.

일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는, DYS19, DYS378I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS385a/b, DYS437, DYS438, DYS439, DYS472, DYS476, DYS480, DYS481, DYS485, DYS487, DYS488, DYS490, DYS491, DYS492, DYS494, DYS495, DYS497, DYS505, DYS508, DYS511, DYS522, DYS525, DYS530, DYS531, DYS533, DYS537, DYS540, DYS549, DYS554, DYS556, DYS565, DYS567, DYS568, DYS569, DYS570, DYS572, DYS573, DYS575, DYS576, DYS578, DYS579, DYS580, DYS583, DYS589, DYS590, DYS594, DYS617, DYS618, DYS636, DYS640, DYS641, 또는 DYS643로부터 선택된 1개 이상의 유전자좌를 갖는 30 개 이상의 유전자좌가 멀티플렉스 세트에서 증폭된다.

친족, 법의학, 및 인류학에서 복잡한 결함들에서, X 염색체 마커는 분석에 특히 유용하다. 남성의 X 염색체 프로파일은 가족 식별을 위한 고도의 다형성 결합 시스템을 만드는, 일배 체형 (haplotype)으로 자손에 전달된다. 일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30개 또는 이상의 X 염색체 STR 유전자들은 멀티플렉스 세트에서 증폭된다. 일부 구체예에서, 각 프라이머 쌍의 1개 이상의 프라이머는 표지되고, 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되는, DXS6807, DXS9895, DXS10135, DXS8378, DXS9902, DXS10076, DXS10077, DXS10078, DXS7132, DXS10074, DXS981, DXS6800, DXS9898, DXS6801, DXS6809, DXS6789, DXS7424 , DXS101, DXS6797, DXS7133, GATA172D05, HPRTB, DXS10101, DXS9908, DXS8377, DXS10134, DXS7423, DXS10011, DXS10102, DXS10103, DXS10104, DXS10105 , DXS10106 또는 DXS10107로부터 선택된 1개 이상의 유전자좌를 갖는 13개 이상의 유전자좌가 멀티플렉스 세트에서 증폭된다.

일부 구체예에서, 13 CODIS 유전자좌 (즉, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, VWA) 중 5개 이상에 대한 프라이머 쌍 및 1개 이상의 Y-마커는 멀티플렉스에 통합된다. 또 다른 구체예에서, 5개 이상의 13 CODIS 유전자좌에 대한 프라이머 쌍, 1개 이상의 Y-마커 및 D1S1656, D2S441, D2S1338, D6S1043, D10S1248, D12S391, D19S433, 펜타 B, 펜타 C, 펜타 D, 펜타 E, D22S1045 및 SE33를 포함하는 그룹으로부터 2개 이상의 마커들이 멀티플렉스에 통합된다. 이들 구체예에서, 총 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 이상의 형광 염료가 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (프라이머 쌍 당 1개의 표지제), 성별 식별을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커가 선택적으로 멀티플렉스에 포함될 수 있다 (이러한 선택 마커는 상기 언급한 1개 이상의 Y-마커와는 구별됨).

일부 구체예에서, 13 CODIS 유전자좌 (즉, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, VWA) 중 5개 이상의 유전자좌에 대한 프라이머 쌍 및 1개 이상의 X-마커는 멀티플렉스에 통합된다. 또 다른 구체예에서, 13개 이상의 13 CODIS 유전자좌에 대한 프라이머 쌍, 1개 이상의 X-마커 및 D1S1656, D2S441, D2S1338, D6S1043, D10S1248, D12S391, D19S433, 펜타 B, 펜타 C, 펜타 D, 펜타 E, D22S1045 및 SE33를 포함하는 그룹으로부터 두개 이상의 마커들이 멀티플렉스에 통합된다. 이들 구체예에서, 총 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 이상의 형광 염료가 프라이머를 표지하기 위해 사용되고 (프라이머 쌍 당 1개의 표지제), 성별 식별을 위한 아멜로게닌 또는 다른 마커가 선택적으로 멀티플렉스에 포함될 수 있다 (이러한 선택 마커는 상기 언급한 1개 이상의 X-마커와는 구별됨).

일부 구체예에서, 프라이머 쌍의 순방향 또는 역방향 또는 이 둘 모두의 프라이머는 고유하게 표지된다 (예를들어, 형광 염료). 일부 구체예에서, 표지제는 형광 염료이다. 일부 구체예에서, 형광 표지된 앰플리콘은 레이저 (예를들어, 사파이어 (Saphire) 488 nm 레이저)를 사용하여 검출된다. 레이저를 사용하는 장점은 분석의 검출 감도와 한계가 예를 들어 평판 판독기에 비해 크게 향상된다는 것이다.

일부 구체예에서, 핵산 산물은 약 180분 미만, 120분 미만, 90분 미만, 80분 미만, 70분 미만, 60분 미만, 55분 미만, 50분 미만, 45분 미만, 40분 미만, 35분 미만, 30분 미만, 25분 미만, 20분 미만, 18분 미만, 17분 미만, 16분 미만, 15분 미만, 14분 미만, 13분 미만, 12분 미만, 11분 미만, 10분 미만, 9분 미만, 8분 미만, 7분 미만, 5분 미만 또는 4분 미만 동안 증폭된다.

본 발명에 제공된 구체예들 중 일부에 기재된 방법을 위해, 반응 챔버는 미세 유체 바이오칩에 있을 수 있다. [예를 들어 "전통적인 미세 유체 단기 일렬반복 분석을 위한 신속한 다중화 중합효소 연쇄 반응 ( Giese et al . " Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis ." J Forensic Sci 54(6): 1287-96)]. 또한, 반응 챔버는 조작하는 사람의 조작에 대한 요구가 없는 한 샘플-인에서 결과물-아웃 시스템의 설정으로 하나 이상의 샘플에 대한 처리 단계의 복합 시리즈를 동시에 수행할 수 있는 완전히 통합된 미세유체 바이오칩 상에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 핵산 산물의 전기영동 분리 및 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 산물의 분리 및/또는 검출는 미세유체 바이오칩 상에서 수행된다.

본 발명에 기재된 임의의 실시예에서, 샘플은 하나 이상의 핵산(들) (주형(들) 약 1pg에서 10μg 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 하나 이상의 핵산 (들) (템플릿 (들)) 1ng 미만을 포함한다. 특정 양태에서, 핵산 산물 각각의 이형 피크 높이비 (PHR)은 0.05ng부터 4.0 ng의 범위의 핵산 주형 수준에 대해 0.6과 1.0 사이이다.

본 발명의 또 다른 양태로는, (a) 염, 완충용액, dNTP, 중합 효소; (b) 상기 기재한 것으로부터 선택된 STR 프라이머 세트, 각 프라이머 쌍은 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 가지며, 하나 이상의 핵산 또는 핵산의 혼합물에서 6개 이상의 유전자좌 중 하나와 하이브리드화되고, 여기에서 각 프라이머 쌍의 순방향 또는 역방향 또는 이둘 모두의 프라이머는 형광 염료로 표지되고; (c) STR 유전자좌의 신속한 다중 증폭 성분 (예를들어, 염, 완충용액, 마그네슘, dNTP 및 중합 효소), 여기서 성분 (a), (b), 및 (c)가 단일 반응 용기 내에 배치되는 것을 포함하는, 다형성 유전좌의 신속한 다중 증폭 키트에 관한 것이다.

본 발명에 기재된 임의의 구체예에서, 임의의 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 예를들어, 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq), 피로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu), 피로코쿠스 웨세이(Pyrococcus woesei)(Pwo), 써마스 플라부스(Thermas flavus)(Tfl), 써무스 써모필루스(Themus thermophilus)(Tth), 써무스 리토리스(Thermus litoris)(TIi) 및 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime)(Tma)를 포함한다. 상기 효소, 상기 효소의 변형된 형태, 및 상기 효소의 조합물이 로슈(Roche), 인비트로젠(Invitrogen), 키아젠(Qiagen), 스트라테진(Strategene), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)를 포함하는 업체에서 시판한다. 대표적인 효소는 퓨젼(PHUSION)(New England Biolabs, Ipswich, MA), 핫 마스터택(Hot MasterTaq™)(Eppendorf), 퓨젼 Mpx(PHUSION Mpx)(Finnzymes), 피로스타트(PyroStart)(Fermentas), KOD(EMD Biosciences), Z-택(Z-Taq)(TAKARA), 및 CS3AC/LA(KlenTaq, University City, MO)를 포함한다.

본 발명의 방법은 다중 엔드-포인트 PCR (end-point PCR), 실시간 PCR, 역전사 PCR, 비대칭 PCR, 중첩 PCR, LATE PCR, 터치다운 PCR, 디지털 PCR, 등온 PCR, 압연 원형 증폭, 표준 변위 증폭 및 다중 변위 증폭에 제한을 두지 않고 핵산 증폭에 대해 어떠한 접근 방식도 적용할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 유전자좌에서 다양한 대립 유전자 크기에 의해 특징되는 임의의 다중화된 유전자좌의 분석에 적용될 수 있다. 다중화 STR 분석은 인간이 아닌 포유 동물, 어류, 조류, 파충류 및 양서류 종을 포함하여 광범위한 생물체에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 다중 유전자좌 다양한 개수의 일렬 반복 분석 (MLVA; Multiple Loci Variable Number Tandem Repeats Analysis ) 및 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP; Amplified Fragment Length Polymorphism ) 분석에 의해 박테리아 (병원균 등)의 동정 및 특성화에 이용될 수 있다. 이러한 접근 방식은 STR 분석과 유사하며 또한 식물, 곰팡이 및 동물의 형질 결정 및 특성화에 광범위하게 적용 할 수 있다. 본 발명의 방법은 다형성이 아닌 유전자좌의 분석, 또는 다형성이 아닌 유전자좌의 조합에 적용할될 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 단일 누클레오티드 다형체 (SNPs)의 다중화된 분석에 직접 적용할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 5-색 26-유전자좌, 25-STR 공식 유전자좌의 디자인이다.

도 2a는 PCR을 수행하는 미세유체 바이오칩의 사진이다.

도 2b는 도 2a의 바이오칩을 수용하는 신속한 열 순환기의 사진이다.

도 3은 26개-유전자좌, 25개-STR 공식 유전자좌 다중 반응에서 각 유전자좌에 대한 증폭된 산물의 색 보정 스캔이다.

도 4는 25개-STR 유전자좌 실질적 비중첩 STR 분석의 설계를 도시한다.

도 5는 유전자좌의 증폭된 세트의 산물에 표지하기 위한 8개 염료 사용 설계를 보여준다.

도 6은 상 염색체 STR 및 Y STR 유전자좌의 증폭된 세트의 산물을 표지하기 위한 8개 염료 사용 설계를 보여준다.

도 7은 단일 반응에서 26개 STR 유전자좌 및 아멜로게닌 유전자좌의 공동 증폭 수행 설계를 보여준다.

도 8a는 본 발명의 분광사진기의 도면을 도시한다.

도 8b는 분광기 사용을 위해 선택된 수차 보정 오목 홀로그램 회절 격자를 도시한다.

도 8c는 통합 파장 모듈 또는 기존 필터 및 이산 PMT으로 작동을 위해 쉽게 구성될 수 있는 기기를 허용하는 거울을 나타낸다.

도 8d는 6- 및 8-색 기기의 빔 경로를 보여준다.

도 9는 코어 5-염료 세트와 DyLight 633 (DL633) 염료의 발광 스펙트럼을 보여준다. 검출기 채널은 도면 하단에 기록된다. 상대 신호 강도는 Y축에 표시된다. 각 박스 영역의 숫자는 각각의 염료에 대한 최대 발광 파장 (nm)을 나타낸다.

도 10은 증폭된 산물의 8-색 분리의 베이스 라인을 삭제한 색 보정 전자 사진 (electrophrogram)을 보여준다. 증폭된 산물은 실시예 6의 8-색 기기에서 분리되고 검출된다. 증폭된 단편은 각각의 패널에서 단편을 표지하는데 사용되는 염료로 표지된다.

도 11a는 iNTA을 줄이기 위해 비표지 프라이머의 5' 말단에 GTTTCTT 꼬리 첨가의 효과를 나타낸다.

도 11b는 iNTA 을 줄이기 위해 비표지 프라이머의 5'-말단에 G-꼬리 첨가의 효과를 나타낸다.

도 11c는 D8S1179 프라이머 쌍의 하나의 프라이머로부터 또 다른 프라이머로의 염료 표지제 교체의 효과를 나타낸다.

도 12a는 젠벤치 (GeneBench FX) 기기로 분리함에 따라, 5 색으로 표시된 6개-염료 26개-유전자좌 다중 증폭 산물의 중 변인물 제거 전에 2개 이상의 변인물 (화살표 아래)이 존재함을 보여준다.

도 12b는 젠벤치 (GeneBench FX) 기기로 분리함에 따라, 5 색으로 표시된 6개-염료 26개-유전자좌 다중 증폭 산물 중 변인물 제거 전에 2개의 변인물이 존재 (왼쪽 패널에 있는 화살표 아래)와 변인물 제거 후 그들의 부재 (오른쪽 패널의 화살표 아래)를 확대하여 보여준다.

도 12c는 젠벤치 (GeneBench FX) 기기로 분리함에 따라, 5 색으로 표시된 6개염료 26개-유전자좌 다중 증폭 산물 중 변인물 제거 후 2개의 변인물의 부재 (화살표 아래)를 보여준다.

도 13은 본 발명에 기재된 개선 방법에 따라 6-/8 색 기기로 분리하고 검출한 남성 DNA의 6-색 27개-유전자좌 증폭 산물을 나타낸다.

도 14a는 6-/8-색 기기로 분리 및 검출한 남성 DNA의 6-색 27개-유전자좌 증폭 산물을 나타낸다.

도 14b는 6-/8-색상 기기로 분리 및 검출한 여성 DNA의 6-색 27개-유전자좌 증폭 산물을 나타낸다.

도 15a는 CODIS 13 코어 STR 유전자좌를 평가하기 위한 5개 염료를 이용하는 설계를 나타낸다.

도 15b는 CODIS 13 코어 STR 유전자좌를 실험하기 위해 필요한 작은 멀티플렉스 크기 범위 및 큰 멀티플렉스 밀도를 나타내는 6개 염료를 이용하는 설계를 나타낸다.

도 15c는 CODIS 13 코어 STR 유전자좌를 실험하기 위해 필요한 작은 멀티플렉스 크기 범위 및 큰 멀티플렉스 밀도를 나타내는 8개 염료를 이용하는 설계를 나타낸다. 표는 5개-염료, 6개-염료 및 8개-염료 선택에 대한 멀티플렉스 크기 범위 및 멀티플렉스 밀도의 수치를 표시한다.

도 16은 24개 유전자좌 증폭 설계를 나타낸다.

도 17은 23개 유전자좌 증폭 설계를 나타낸다.

도 18은 22개 유전자좌 증폭 설계를 나타낸다.

도 19은 21 유전자좌 증폭 디자인을 표시한다.

발명의 상세한 설명

본원에 기재된 방법은 유전자 분석에 유용한 방법이다. 본 방법의 일부 구체예에서는 하나 이상의 핵산 주형의 고도의 특정 유전자 프로파일, 예를 들어 단기 일렬 반복 (STR) 프로파일을 제공하도록 설계되었다. 각 프로파일은 수득된 핵산 주형을 얻은 것으로부터 개인 (또는 개인 또는 개인의 혈족에 관한 정보)를 식별하기 위해 몇몇 구체예에서 사용될 수 있는, 상기의 핵산 주형 내의 다중 다형성 게놈 유전자좌의 DNA "지문"을 제공한다.

본 발명의 목적은 다양한 용도에서 유용한 인간 식별 정보를 생성하는 다중화된 STR 분석을 제공하는 것이다. 예를 들어, 법의학 연구소는 최근 가족 검색 수가 증가하는 것을 확인했는데, 즉 데이터 베이스에 있는 프로파일을 갖는 개인의 가족 구성원에 대한 가능한 용의자의 목록을 좁혀 조사를 지원하기 위해 도시, 국가 또는 국제 데이터베이스에 존재하는 프로파일과 범죄 현장 샘플에서 채취된 프로파일 간의 관계를 조사하는 것이다. 본 발명의 분석은 가족 검색에 실질적으로 더 많은 확신을 제공하고, 증가하는 크기의 데이터베이스를 검색에서 얻은 우발적 일치의 수를 상당히 감소시킨다.

본 발명의 분석의 보다 큰 변별력은 이민 및 난민 신청의 분석에 DNA 프로파일링의 사용을 강화하는 것이다. 이러한 상황에서, 미국 시민 또는 특정 난민에 대한 개인의 권리에 관한 미 국무부의 정책 구현은 올바른 결과의 큰 자신감을 가지고 수행될 수 있다. 13 CODIS STR 유전자좌는 부모-자식 관계와 형제- 자매 관계 실험에는 충분한 보증을 제공하는 반면 조부모-손자 또는 이모/삼촌-조카/조카와 같이 보다 확장된 관계의 친족 분석에서는 제한된 신뢰 수준의 많은 결과를 가져온다. STR 유전자좌 수의 증가 및/또는 테스트에 사용될 보다 많은 다형성 유전자좌의 선택은 결과의 신뢰도를 증가시키는 친족 분석에 사용되는 가능상의 강도는 증가하고 잠재적인 오류의 위험은 감소한다. 또한, 본 발명의 분석법은 때때로 법의학 샘플로부터 얻은 분해된 DNA 시료의 검사에 이점을 제공한다.

STR 분석법이 증거를 입증하는 최적 기준이 되었지만, STR 유전자좌의 세트는 국제적으로 표준화되지 않았다. 미국의 경우, 연방 수사국은 결합된 DNA 색인 시스템 (CODIS)과 함께 사용하기 위해 13개 STR 유전자좌와 아멜로게닌(성별 감결)을 선별했다. 미국 세트는 종종 "CODIS 코어 유전자좌"로 언급되며, STR 유전자좌 CSF1PO, FGA, THO1, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 및 D21S11으로 구성되어 있다. 일반적으로, 각각의 STR 유전자좌는 발견되는 염색체 (예를 들어, D3S1358는 인간 염색체 3에 위치)나 주변 유전자 (예를 들어 CSF1PO는 콜로니 자극 인자-1 수용체 유전자에 대한 인간의 C-fms 발암 유전자 수용체를 인코딩하는 유전자의 인트론 내에 위치)에 의해 명명된다. 영국 코어 유전자좌는 FGA, TH01, VWA, D2S1338, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11 및 아멜로게닌이다. 유럽 코어 유전자좌는 FGA, ThO1, VWA, D1S1656, D2S441, D3S1358, D8S1179, D10S1248, D12S391, D18S51, D21S1, D22S1045 및 아멜로게닌이다. 오스트리아 정부는 유럽의 코어 유전자좌에 D2S1338, D16S539 및 D19S433를 추가하고, 독일 정부는 유전자좌 SE33를 추가한다. 유전자좌 D6S1043은 종종 STR 유전자좌 CSF1PO, FGA, vWA, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D12S391, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11 및 아멜로게닌과 함께 중국에서 사용된다. 인터폴 표준 세트 유전자좌에는 FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11 및 선택적으로 아멜로게닌이 있다.

본 발명은 전세계의 나라별 데이터베이스에 포함하기 위해 선택된 모든 STR 유전자좌와 이러한 유전자좌를 포함하는 하위세트를 동시에 수행하는 STR 분석법을 제공한다. 이러한 국제 STR 표준 세트는 사회 안전을 개선하기 위해 국가 간의 효과적인 협력을 비약적으로 향상시킬 것이다. 다중 STR 분석법을 설계하고 구축할 때 본 당업계의 숙련된 사람 인정받을 것이며, 많은 요인들은 균형을 이루어야 한다. 이러한 요인들은 특히 분석에서 STR 유전자좌의 수가 18개 초과로 증가하게 되면 균형 유지가 좀더 더 어려워진다. 균형을 이루어야 하는 요인들로는 STR 변인물 (예를 들어 iNTA 및 두개 이상의 프라이머와 샘플 핵산과의 의도치 않은 상호작용 산물)의 방지 및 제거, 절대 및 상대 신호 강도, 반응 효율 및 시간, STR 유전자좌 중첩, STR 앰플리콘 해상도, STR 유전자좌 크기 범위 및 중첩의 허용도, STR 유전자좌 이형, 반응에 사용된 형광 염료 표지제의 개수, 중합체 크기 범위 및 반응을 수행하는 기기의 사양 및 성능이 포함된다. 이러한 요인들은 대략 3.15 보다 큰 STR 멀티플렉스 밀도와 1022개의 STR 유전자좌 크기 범위합을 갖는 상기 18개 공식 유전자좌가 단일 동시 반응에서 이동하는 것으로부터 STR 분석을 방해했다. 원하는 결과에 따라, 이러한 도구 및 방법은 STR 멀티플렉스에 통합되는 공식 유전자좌의 더 많은 개수를 허용하고, 더 큰 멀티플렉스 밀도 및 STR 유전자좌 크기 범위합을 얻게 할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "STR 유전자좌" 및 "STR 유전자좌들"은 표적 핵산의 제공된 유전자좌에서 2개 이상의 누클레오티드의 반복 패턴으로 이루어지는 누클레오티드 서열을 의미한다. 반복 패턴은 2 내지 10개의 염기쌍(bp) 길이의 범위일 수 있고, 이는 통상적으로 비-코딩 인트론 영역에 존재한다. 반복 패턴은 반복 단위에 해당하지 않는 간성 서열을 포함할 수 있거나, 하나 이상의 반복 패턴을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "STR 대립 유전자" 또는 "대립 유전자"는 개체의 유전체 (Genome)에서 발견된 STR 유전자좌의 형성을 의미한다. 주어진 STR 유전자좌는 두개의 대립 유전자 (각각 생물학적 부모로부터 유전된 하나)가 다른 길이와 염기 쌍 조합을 갖는 이형체일 수도 있거나, 두개의 대립 유전자가 동일한 길이 (및 대개 염기쌍 조합은 항상 같지는 않음)를 의미하는 동형체일 수 있다. 드물게개체는 주어진 STR 유전자좌에 대해 3개 이상의 대립 유전자를 가질 수 있다. 가끔은, 주어진 STR 유전자좌에서 개체의 대립 유전자가 하나 이상의 돌연변이로 인해 그 또는 그녀의 부모와 다를 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대립 유전자 사다리"는 각 STR 유전자좌에서 관찰된 일반적인 대립 유전자와 상응하는 길이의 DNA 세트를 의미한다. 다른 시판 STR 키트는 각 유전자좌를 나타내는 대립 유전자 사다리에서 상이한 대립 유전자를 갖는다.

본원에서 사용되는 용어 "STR 유전자좌 크기 범위" 또는 "유전자좌 크기 범위"는 집단에서 관찰된 일반적인 대립 유전자의 크기 범위를 말한다. 일반적이지 않은 대립 유전자는 실험되고 있는 DNA 샘플의 공지된 임의의 특정 개수가 관찰되지 않을 수 있거나 테스트된 수천의 하나 또는 몇몇 개체에서 관찰될 수 있다. 시판 키트가 다른 크기 범위 (회사들는 시간이 지나면서 그들의 대립 유전자 사다리에 희귀한 대립 유전자를 추가하는 경향이 있음)를 갖는 것처럼, 관심있는 모든 STR 유전자좌에 대해 STR 유전자 크기 범위를 결정하는 것은 중요하다. 이러한 결정은 다양한 STR 분석이 서로 비교될 수 있게 한다. 일반적이지 않는 대립 유전는 임의의 특정 대립 유전자 사다리에 포함되지 않을 수 있거나, 편의상 포함되지 않을 수 있다. 대립 유전자 사다리가 기존 대립 유전자 사다리 성분과 크기 비교로 식별할 수 있는 추가적인 대립 유전자로서 공지된 모든 대립 유전자를 포함할 필요는 없다. 시판 대립 유전자 사다리의 세트에서 각 유전자좌에 대한 최대 및 최소 대립 유전자 간의 크기 차이는 표준 STR 유전자좌 크기 범위를 결정하는데 사용되고 표 1에 제시하였다. 다음의 비교물을 포함하는 STR 유전자좌 크기 범위는 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) 생산물 앰피스타 아이덴티필러 (AmpFlSTR Identifiler), 앰피스타 아이덴티필러 플러스 (AmpFlSTR Identifiler Plus), 앰피스타 아이덴티필러 다이렉트 (AmpFlSTR Identifiler Direct), 앰피스타 NGM 셀렉트(AmpFlSTR NGM Select), 앰피스타 시노필러 (AmpFlSTR Sinofiler) 및 프로 메가사 제품 파워플렉스 16 HS (PowerPlex 16 HS), 파워플레스 ESX 17 (PowerPlex ESX 17) 및 파워플렉스 18D (PowerPlex 18D)사의 온라인상 시판되는 공지된 공업용 재료들을 비교하여 결정한다. 각 유전자좌에 대해서는, 상기 기술할 공업용 재료로 기재한 시판 대립 유전자 사다리의 결합 세트 간의 최대 및 최소 대립 유전자가 결정된다. 염기에서는, 최대와 최소 대립 유전자 사이의 크기 차이는 반복 회수 및 4개 또는 5개 염기 반복 길이가 유전자좌에 존재하는지 여부에 기초하여 결정된다. 그 유전자좌에 대한 "유전자좌 표준 크기 범위"로 명명된 수치는 각 유전자좌에 할당되었다. 이들 각 수치는 "다중 유전자좌 크기 범위합 (Multlocus size range sum)" (즉, 각 다중체 내에 포함된 각 유전자좌들에 대한 모든 표준 크기 범위의 총합)을 결정하는데 사용된다.

표 1의 STR 유전자좌들은 4가지 범주로 분류될 수 있다; 1) 1개 이상의 국가로부터 공식적으로 승인받은 유전자좌들: CSF1PO, FGA, THO1, TPOX, VWA, D1S1656, D2S441, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D10S1248, D12S391, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, D22S1045, SE33, 및 아멜로게닌 (Amelogenin); 2) 중국에서 널리 사용하는 유전자좌 : D6S1043; 3) 미국에서 사용하기 위해 제안한 유전자좌: DYS391; 및 4) 시판 STR 키트에 사용되는 세 개의 유전자좌: 펜타 B, C, D 및 E. 이러한 4가지 범주에 포함된 임의의 STR 유전자좌 모두를 "공식 STR 유전자좌 (Formal STR Locus)"라 한다. 일반적으로, 이러한 범주내의 유전자좌는 현재 엄격한 검증과 실험을 거치고 있다. 시간이 지남에 따라, 새로운 유전자좌가 상기 범주에 추가될 수 있다: 1) 하나 이상의 국가의 공식적인 승인을 받은 새로운 유전자좌; 2) 하나 이상의 국가에서는 광범위하게 사용되나 공식적인 승인을 받지 못한 새로운 유전자좌; 3) 미국에서 사용 제안된 새로운 유전자좌들; 및 4) 시판 키트에서 발견된 새로운 유전자좌. 이후 이들 범주 중 하나의 구성원이 될 새로운 유전자좌에 대해, 유전자좌의 최대 및 최소 대립 유전자의 공지된 한계는 각 STR 유전자좌의 크기 범위를 결정하는데 사용한다.

이러한 4가지 범주의 하나에 해당하지 않는 "비공식 (Informal)" STR 유전자좌의 경우, 유전자좌의 최대 및 최소 대립 유전자의 공지된 제한을 각 STR 유전자좌의 크기 범위를 결정하는데 사용한다.

표 1

본원에서 사용되는 용어 "사실상 비중첩된 STR 유전자좌 분석(Substantially Non-overlapping STR Assay)"는 STR 유전자좌 크기 범위의 대립 유전자가 매우 드물고 STR 유전자좌 크기 범위 밖에 있는 대립 유전자를 제외하고는 동일한 염료(또는 적용가능한 다른 검출 방법)를 표지한 유전자좌의 어떠한 다른 STR 유전자좌 크기 범위와도 중첩되지 않은, STR 유전자좌 다중 분석법을 설명한다.

본원에서 사용되는 용어 "STR 유전자좌 크기 범위합 (STR Locus Size Range Sum)"은 다중 STR 세트에 포함된 유전자좌들에 대한 개별 STR 유전자좌 크기 범위의 합을 말한다. 예를 들어, 실시예 I의 26개-유전자좌 STR 세트는 1,487개 염기의 STR 유전자좌 크기 범위합을 가지고, 아이덴티필러 유전자좌 (Life Technologies)의 16-유전자좌 STR 세트는 809개 염기의 STR 유전자좌 크기 범위합을 갖는다.

본원에서 사용되는 "다중체 크기 범위 (Multiplex Size Range)"는 주어진 STR 멀티플렉스의 임의의 유전자좌 내의 최대 대립 유전자와 멀티플렉스의 임의의 유전자 내의 최소 대립 유전자의 크기 차이를 말한다. 이 두 유전자좌들 및 다중체 크기의 범위는 특정 멀티플렉스의 특징이다. 멀티플렉스 크기 범위 계산하기: 1) 최소 공통 대립 유전자를 포함하는 멀티플렉스 내의 STR 유전자좌 확인; 2) 상기 유전자좌 내의 최소 공통 대립 유전자의 크기 결정("STR 유전자좌 크기 범위"에 기재한 바와 동일한 방법을 이용); 3) 최대 표준 대립 유전자를 포함하는 멀티플렉스 내의 STR 유전자좌 확인; 4) 상기 유전자좌 내의 최대 표준 대립 유전자의 크기 결정 ("STR 유전자좌 크기 범위"에 기재한 바와 동일한 방법을 이용); 5) 두 표준 대립 유전자들 간의 차이를 계산. 예를 들어, 실시예 1의 26개-유전자좌 STR 세트는 411개 염기의 다중 유전자좌 크기 범위를 갖고, 아이덴티필러 유전자좌 (Life Technologies)의 16개-유전자좌 STR 세트는 257개 염기의 STR 유전자좌 멀티플렉스 크기 범위를 갖는다.

몇몇 요인들은 주어진 분석에 사용되는 멀티플렉스 크기 범위에 영향을 준다. 전기영동법 및 질량 분석법을 비롯한 다양한 접근 방법들을 이용하여 STR 대립 유전자의 특징지을 수 있다. 전기영동 분리의 경우, 예를 들어, 크기 제한을 낮추면 STR 프라이머, 프라이머 이량체 또는 기타 증폭 변인물로부터 단기 앰플리콘을 구별하기 어렵게 만드는 크기에 영향받을 수 있다. 크기 한계를 높이면 1개 또는 몇몇의 염기에 의해 달라지는 큰 대립 유전자를 분리하기 위해 감소된 능력을 갖는 시스템의 해상도에 영향받을 수 있다. 이와 유사하게, 주어진 분석에 더 큰 대립 유전자가 있으면, 분해된 DNA 샘플이 상기 큰 대립 유전자의 증폭을 충분히 수행하는데 충분한 평균 단편 길이를 갖지 않을 가능성이 더욱 커진다.

말디토프 질량분석법 (MALDI-TOF; matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-flight)의 경우, STR 단편의 크기는 단편을 함유한 샘플을 레이저로 펄싱(puse)하고, 검출기에서 표준 질량과 비교하여 토프 (time-offlight)를 측정하는 것을 기반으로 한다. 크기 제한을 높이면 STR 대립 유전자를 검출하거나 해상하는 질량 분광기의 성능이 떨어지는데 영향을 준다. 말디토프는 STR 단편의 정확한 분자량을 생성하며, 따라서 대립 유전자 사다리를 필요로 하지 않음에 주목하자. 전기 영동기반의 방법들과 직접적인 비교를 할 수 있도록, STR 유전자좌 크기 범위계, 멀티플렉스 크기 범위 및 멀티플렉스 밀도는 상기 기재한 바와 같이 계산한다. 질량 분석법으로 정확도를 향상시켰기 때문에, STR 대립 유전자는 대립 유전자 사다리와 비교하지 않고서 안정적으로 타입화할 수 있다. 절대 질량은 전기 영동 분석과 같은 상대적 이동성 측정 (DNA 크기 기준과 비교하여)보다는 질량 분석법으로 측정한다. 진트레이스 (GeneTrace)사에서 설계한 유전자형 소프트웨어는 관찰된 피크량과 표준 서열, PCR 프라이머 위치 및 반복 단위량으로 부터 얻어진 예상 대립 유전자량을 기초로 유전자형에 대한 관찰된 chleofd과의 상관관계를 입증한다. 각 샘플은 기본 데스크탑 개인용 컴퓨터를 사용하여 대략 1초 동안 처리되고 유전자형을 정할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 밀도 (Multiplex Density)"는 멀티플렉스 크기 범위"로 나눈 "STR 유전자좌 크기 범위합"으로 정의된다. 이 값은 주어진 멀티플렉스로부터 얻을 수 있는 STR 정보의 밀도의 측정치이다. 보다 높은 값은 멀티플렉스가 검출에 허용된 제한된 크기 범위 내에서 대립 유전자의 범위가 크다는 것을 나타냄을 의미한다. 예를 들어, 표 2는 몇몇 STR 세트에 대한 STR 유전자좌들의 총 개수, 공식 STR 유전자좌들의 개수, 염료 개수, 멀티플렉스 크기 범위, 멀티플렉스 크기 범위 총합 및 멀티플렉스 밀도를 나타낸다. 이 표는 또한 유전자좌 표준 크기 범위 및 이러한 수치를 판별할 수 있는 기본 데이터도 포함한다. 본 발명의 STR 세트들은 적어도 2 이상, 2.25 이상, 2.5 이상, 2.75 이상, 2.93 이상, 3.00 이상, 3.1 이상, 3.2 이상, 3.3 이상, 3.4 이상, 3.5 이상, 3.6 이상, 3.7 이상, 3.8 이상, 3.9 이상, 4.0 이상, 4.1 이상, 4.2 이상, 4.3 이상, 4.4 이상, 4.5 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 멀티플렉스 밀도를 갖는다.

표 2

본원에서 사용되는 용어 "핵산 주형"또는 "핵산 주형들"은 STR 프로파일의 합성을 위한 개시 물질로 쓰이는 핵산 및 핵산들은 나타낸다. 핵산 주형(들)은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 주형은 개체의 하나 이상의 전체 유전체, 개체의 부분 유전체 또는 개체의 DNA로부터 이전에 증폭된 산물을 포함할 수 있고, 둘 이상의 개체로부터 전체와 부분 유전체의 혼합물을 포함할 수 있다. 분석할 유전체는 인간, 다른 포유 동물 종 또는 이들의 혼합물로부터 유도할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자좌 (locus)" 및 "유전자좌들 (loci)"은 본원에 기재한 바와 같이 주어진 종의 전체 또는 부분적 유전자체 내에 하나 이상의 특정 부위를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "고다형성 유전자좌 (highly polymorphic locus) "또는 "고다형성 유전자좌들 (highly polymorphic locui)은 0.5 이상의 다형성 정보량 (polymorphic information content)를 갖는 유전자좌 (유전자좌들)를 나타낸다. 다형성 정보량 내용 (PIC; polymorphic information content) [참조 Botstein D, White RL, Skolnick M, David RW, 1980. AM J Hum Genet 32:314-331, 본원에 통합되어 개시함]는 당 업자에게 잘 알려져 있다. 다음의 방정식을 특정 유전자좌의 PIC를 계산하는데 이용할 수 있다.

(여기서 pi는 i 번째 대립 유전자의 빈도이고, n은 대립 유전자의 개수를 나타낸다). 일부 구체예에서, 고다형성 유전자좌는 약 0.5 이상의 PIC 값을 갖는다. 일부 구체예에서, 고다형성 유전자좌는 약 0.5 내지 약 0.7의 PIC 값을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 원에 기재한 방법은 두가지 이상의 고다형성 유전자좌들을 증폭하는데 이용하고, 또 다른 구체예에서는 다형성 (PIC < 0.4 )과 고다형성 (PIC > 0.5) 유전자좌들의 혼합물을 증폭하는데 이용한다.

본원에 기재된 일부 구체예의 방법은 핵산 샘플 내에 일부가 고다형성이고, 이들 모두는 레이저 유도 형광법으로 검출할 수 6개 이상의 다형성 유전자좌에 대해 신속하고, 실질적인 동시 중합효소 연쇄 반응 증폭을 제공한다. 일부 구체예에서, 최대 35개 이상의 다형성 유전자좌를 증폭한다. 본 발명의 중합체 내의 일부 유전자좌들은 고다형성이 아닐 수 있다. 예를 들어, 신체적 특징, 질병에 대한 유전자좌, 지역민족성 (geoethnicity)과 관련된 유전자좌 또는 그것의 일반적인 이용에 포함되는 유전자좌는 최소한의 다형성체로 존재할 수 있다. 구체예의 멀티플렉스 중에서, 아멜로게닌 유전자좌는 고다형성이 아니다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 동시"라 함은 시간에 있어서의 즉시 또는 거의 즉시 연속을 의미한다.

본원에서 기술되는 방법은 STR 유전자좌들의 신속한 증폭을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 0.006ng 이상의 인간 유전체 DNA를 포함하는 샘플로부터 약 45분 이하 또는 약 20분 이하 동안 신속한 PCR 증폭 다형성 유전자좌를 제공한다. 다른 구체예에서, 다수의 다형성 유전자좌는 약 100분 이하 동안 증폭된다. 그러나 또 다른 구체예에서, 다수의 다형성 유전자좌는 약 80분 이하, 70분 이하, 60분 이하, 50분 이하, 40분 이하, 30분 이하, 또는 약 20분 이하 동안 증폭된다. 또한 다른 구체예에서, 다수의 STR 유전자좌는 약 1분 내지 약 10분 동안 증폭된다.

일부 구체예에서, 다수의 다형성 유전자좌는 표적 핵산 유전자좌의 하나 이상의 카피로부터 시작하여 증폭될 수 있다. 예를 들어, 분석되는 샘플은 다중 증폭 반응 전에 표적 핵산의 1000개 미만의 카피, 400개 미만의 카피, 200개 미만의 카피, 100개 미만의 카피, 50개 미만의 카피, 30개 미만의 카피, 10개 미만의 카피 또는 1개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 또한, 표적 핵산 유전자좌가 유전체 내에 1개 이상의 카피로 존재하는 경우, DNA의 단일 유전체 당량 미만이 증폭에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 2개 이상 및 약 250개 이하의 유전자좌가 본원에 기재된 방법에 따라 샘플 내의 각각의 표적 핵산에서 동시에 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, 약 26개 또는 27개 다형성 (또는 고다형성) 유전자좌는 동시에 증폭된다. 또 다른 구체예에서, 2개 이상 및 약 250개 이하의 유전자좌가 다른 공급원이나 동일한 공급원으로부터 각각 얻어진 1개 또는 다수의 표적 핵산으로부터 동시 증폭될 수 있다.

본원에 이용된 표적 핵산은 임의의 핵산, 예를 들어, 인간 핵산, 박테리아 핵산 또는 바이러스 핵산일 수 있다. 표적 핵산 샘플은, 예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들어, 혈액, 소변, 정액, 임프액, 뇌척수액, 또는 양수, 또는 다른 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직 배양 세포, 구강 면봉, 구강세척액, 대변, 조직 박편, 생검 흡출물, 및 고고학 샘플, 예를 들어, 뼈 또는 미이라화된 조직으로부터의 핵산 샘플일 수 있다. 표적 핵산은, 예를 들어, DNA, RNA, 또는 역전사에 적용된 RNA의 DNA 생성물일 수 있다. 표적 샘플은 진핵생물, 식물, 동물, 척추동물, 어류, 포유동물, 인간, 비-인간, 박테리아, 미생물, 바이러스, 생물학적 공급원, 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 정액, 임파액, 뇌척수액, 양수, 생검, 바늘 흡출 생검, 암, 종양, 조직, 세포, 세포 용해질, 미정제 세포 용해질, 조직 용해질, 조직 배양 세포, 구강 면봉, 구강세척액, 대변, 미이라화된 조직, 법의학 공급원, 검시, 고고학 공급원, 감염, 원내 감염, 생성물 공급원, 약물 제조물, 생물학적 분자 생성물, 단백질 제조물, 지질 제조물, 탄수화물 제조물, 무생물 대상, 공기, 토양, 수액, 금속, 화석, 굴착된 물질, 및/또는 다른 지구상 또는 우주 물질 및 공급원을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 샘플은 또한 하나의 공급원 또는 다양한 공급원으로부터의 물질읜 혼합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용하여 상기 감염된 세포 또는 조직으로부터의 핵산이 증폭되는 경우 인간 핵산과 함께 감염성 박테리아 또는 바이러스의 핵산이 증폭될 수 있다. 유용한 표적 샘플의 유형은 진핵생물 샘플, 식물 샘플, 동물 샘플, 척추동물 샘플, 어류 샘플, 포유동물 샘플, 인간 샘플, 비-인간 샘플, 박테리아 샘플, 미생물 샘플, 바이러스 샘플, 생물학적 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 소변 샘플, 정액 샘플, 임파액 샘플, 뇌척수액 샘플, 양수 샘플, 생검 샘플, 바늘 흡출 생검 샘플, 암 샘플, 종양 샘플, 조직 샘플, 세포 샘플, 세포 용해질 샘플, 미정제 세포 용해질 샘플, 조직 용해질 샘플, 조직 배양 세포 샘플, 구강 면봉 샘플, 구강세척액 샘플, 대변 샘플, 미이라화된 조직 샘플, 검시 샘플, 고고학 샘플, 감염 샘플, 원내 감염 샘플, 생성물 샘플, 약물 제조물 샘플, 생물학적 분자 생성물 샘플, 단백질 제조물 샘플, 지질 제조물 샘플, 탄수화물 제조물 샘플, 무생물 대상 샘플, 공기 샘플, 토양 샘플, 수액 샘플, 금속 샘플, 화석 샘플, 굴착 물질 샘플, 및/또는 다른 지구상 또는 우주 샘플을 포함한다. 법의학 샘플의 유형은 혈액, 건조된 혈액, 혈흔, 구강 면봉, 지문, 접촉 샘플(예를 들어, 음료수 유리의 입술에 대해 남겨진 상피 세포, 야구 모자의 내부 테두리, 또는 담배 꽁초), 츄잉 검, 위 내용물, 타액, 손톱 부스러기, 토양, 성폭행 샘플, 모발, 뼈, 피부 및 고형 조직을 포함한다. 환경 샘플의 유형은 여과되거나 여과되지 않은 공기 및 물, 토양, 및 표면, 외피 및 분말로부터의 면봉 샘플을 포함한다.

예를 들어, 특정 구체예에서 본원의 방법은 분석이 법의학 해석에 적합한 데이터, 특히 법의학 해석 가이드라인을 충족시키는 데이터를 분석하는 증폭된 핵산 샘플을 제공할 수 있다. 이러한 가이드라인은 신호 강도, 유전자좌 간 피크 높이 균형, 이형 피크 높이 비(PHR), 불완전한 비-주형 누클레오티드 첨가(NTA), 및 스터터를 포함한다(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods, Short Tandem Repeat ( STR ) Interpretation Guidelines. Forensic Science Communications, 2000, 2(3)).

본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일 및 이중 가닥의 DNA 및 RNA, 뿐만 아니라 변형된 염기, 당 및 백본을 함유하는 임의의 형태 및 모든 형태의 대체 핵산을 포함한다. 따라서, 용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA(및 이의 부분적으로 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥일 수 있는 형태), cDNA, 앱타머(aptamer), 펩티드 핵산("PNA"), 2'-5' DNA(DNA의 A 형태와 매치되는 염기 간격을 갖는 짧아진 백본을 갖는 합성 물질; 2'-5' DNA는 보통 B 형태의 DNA와 하이브리드되지 않으나, RNA와는 용이하게 하이브리드됨), 및 잠금 핵산(locked nucleic acids, "LNA")을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해될 것이다. 핵산 유사체는 염기쌍 특성의 유사하거나 개선된 결합 및 하이브리드화를 갖는 천연 누클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 "유사체" 형태는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 아지리디닐시토신, 4-아세틸시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 이노신, N⁶-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N⁶-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 의해 제공되는 DNA 백본 유사체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 술파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 및 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 결합 또는 대체 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 결합(Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698), 및 US6,664,057호에 논의된 바와 같은 벤질포스포네이트 결합을 포함한다; 참조[OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan, 1993, J. Med . Chem. 36: 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)]. 본원의 핵산은 세포로부터 추출되거나, 당업자에게 공지된 임의의 수단에 따라 합성 제조될 수 있고; 예를 들어, 핵산은 화학적으로 합성되거나, 다른 공급원 중에서 cDNA 또는 mRNA로부터 전사되거나, 역전사될 수 있다.

특정 측면에서, 본원에 기재된 방법은 신속한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 1개 이상의 표적 핵산 내의 다중 다수의 핵산 유전자좌를 실질적으로 동시에 증폭하는 방법이다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 (a) 1개 이상의 공급원으로부터 얻은 1개 이상의 핵산 주형 샘플을, 각 쌍이 1개 이상의 핵산 주형 내 6개 이상의 유전자좌 중 하나와 하이브리드화하는 6개 이상의 각기 상이한 프라이머 쌍과 하나의 용액에서 접촉시키고, 여기서 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머는 표지되고 6개 이상의 상이한 표지제가 사용되며; (b) 하나의 반응 챔버에서 6개 이상의 핵산 산물을 생성하기 위해 하나 이상의 핵산 내의 6개 이상의 다형성 유전자좌를 중합 효소 반응 (PCR)으로 증폭시키는 것을 포함한다. 샘플은 단일 개체 또는 1개 이상의 개체로터 얻어진 (분리되거나 유도된) 하나 이상의 핵산을 가질 수 있다. 또한, 1개 이상의 핵산은 다수의 공급원, 예를 들어 두 개 이상의 개체이거나 동일한 개체로부터의 2개 이상의 다른 조직 샘플 (예를 들어, 기관, 세포 유형)을 얻을 수 있다. 반응 챔버는 1개 이상의 핵산의 하나의 샘플 또는 1개 이상의 핵산의 하나 이상의 샘플들을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 동일한 핵산 샘플 또는 다수의 핵산 샘플에 다중 실질적 동시 분석 (증폭)을 실행하는데 이용될 수 있다.

PCR 증폭을 위한 프라이머는 표적 DNA의 유전자좌에 하이브리드화되도록 특별히 고안된 올리고누클레오티드 서열이다. 이러한 프라이머는 중합효소 신장을 위한 시작 포인트로 작용한다. 증폭된 단편 (핵산)의 분석을 촉진하기 위해, PCR 반응에서 표지된 프라이머도 사용될 수 있다. 표지된 프라이머는, 이의 비제한적인 예로 형광 염료, 방사성 표지제 및 식별가능한 금속을 포함하는 검출가능한 부분에 커플링된 올리고누클레오티드 서열, 핵산 서열 및 단백질이다. 형광 표지된 프라이머를 이용하여 PCR이 수행되는 경우, 형광 표지를 갖는 앰플리콘 (핵산 증폭 산물)이 생성된다. 일부 구체예에서, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상의 형광 염료가 단일 증폭 반응 (하나의 반응 챔버에서)에 사용된다. 하나 이상의 염료는 크기 표준이나 대립 유전자 사다리와 같은 대조 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

프라이머 세트는 상기 기재된 바와 같이 표적 핵산 내의 이용한 다수의 유전자좌의 증폭을 위해 당업자에게 공지된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 샘플 중의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머는 US5,582,989호; US5,843,660호; US6,221,598호; US6,479,235호; US6,531,282호; 및 US7,008,771호; 및 US 특허 출원 공개 번호 2003/0180724호; 2003/0186272호; 및 2004/0137504호에 기재되어 있고, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

추가로, 바이러스 핵산 샘플 내의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머는, 예를 들어, US7,312,036호; US6,958,210호; US6,849,407호; US6,790,952호, 및 US6,472,155호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

박테리아 핵산 샘플 내의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머의 예는 US7,326,779호; US7,205,111호; US7,074,599호; US7,074,598호; US6,664,080호; 및 US5,994,066호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

염 및 완충용액은 MgCl₂, 및 Tris-HCl 및 KCl을 각각 포함하는 염 및 완충용액을 포함하여, 당업자에게 친숙한 것을 포함한다. 완충용액은 첨가제, 예를 들어 계면활성제 (예를 들어, Tweens), 디메틸 술폭시드(DMSO), 글리세롤, 우혈청 알부민(BSA) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 뿐만 아니라 당업자에게 친숙한 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 누클레오티드는 일반적으로 데옥시리보누클레오시드 트리포스페이트, 예를 들어, 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP)가 있으며, 이는 또한 표적 핵산의 증폭을 위해 적절한 양으로 합성 혼합물에 첨가된다.

용액은 임의로 핵산 중합효소의 고온-개시 활성화에 적합한 제 1 기간 동안 제 1 온도로 가열되고, 이에 고정될 수 있다. 일반적으로, 제 1 기간은 약 90초 미만이다. 제 1 온도는 약 90℃ 내지 약 98℃일 수 있다. 60초 이하에서 활성화될 수 있는 고온 개시 메커니즘을 갖는 중합효소는 항체 매개 고온-개시 및 앱트머(aptmer) 매개 고온 개시 메커니즘을 이용하는 것을 포함한다. 대안적으로, 고온-개시 중합효소가 본원에 기재된 방법에서 이용되는 것이 필요하지는 않다.

이후, 반응 용액의 온도는 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링 상태, 및 신장 상태 사이에서 순차적으로 순환된다. 일반적으로, 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 또는 약 1 내지 약 30℃/초; 또는 약 1 내지 약 20℃/초; 약 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 또는 약 4 내지 약 30℃/초; 또는 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 1 냉각 속도로 변성 상태로부터 어닐링 상태로 냉각된다. 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 약 1 내지 약 30℃/초; 약 1 내지 약 20℃/초; 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 약 4 내지 약 30℃/초; 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 1 가열 속도로 어닐링 상태로부터 신장 상태로 가열될 수 있고/있거나; 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 약 1 내지 약 30℃/초; 약 1 내지 약 20℃/초; 약 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 약 4 내지 약 30℃/초; 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 2 가열 속도로 신장 상태로부터 변성 상태로 가열된다. 최종적으로, 반응 용액은 1개 또는 다수의 증폭된 핵산 생성물을 제공하기 위해 최종 상태에서 유지된다.

어닐링 온도 및 시간은 표적 핵산 내의 특정 유전자좌로의 프라이머 결합의 특이성 및 효율성에 영향을 주고, 다중화 PCR 반응에 특히 중요하다. 어닐링 단계 동안 완전한 세트의 프라이머 쌍의 정확한 결합은 다수의 유전자좌의 다중 증폭의 생성, 예를 들어, 허용되는 PHR 및 유전자좌 간 신호 강도 균형을 갖는 1개 또는 다수의 충분한 STR 프로파일의 생성을 가능케 할 수 있다. 제공된 프라이머 쌍에 대해, 어닐링 상태는 약 50℃ 내지 70℃의 온도 및 약 1 내지 30초의 시간의 범위일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다.

신장 온도 및 시간은 주로 대립유전자 생성 수율에 영향을 주고, 이는 사용되는 효소의 고유의 특성이다. 제공된 효소에 대해, 신장 상태는 약 48 내지 80℃의 온도 및 약 1 내지 30초의 시간 범위일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다. 바람직하게는, 소정의 수의 순환 주기를 지속시키기 위해, 반응 용액은 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 또는 약 1 내지 약 30℃/초; 또는 약 1 내지 약 20℃/초; 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 또는 약 4 내지 약 30℃/초; 또는 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 3의 속도로 신장 상태로부터 변성 상태로 가열된다. 일반적으로, 소정의 수의 순환 주기가 약 10 내지 약 50 순환 주기로 선택되나, 필요에 따라 더 적거나 많은 순환 주기가 이용될 수 있다.

STR 반응의 경우, 최종 신장 시간은 불완전한 NTA가 증가하기 시작할 때까지 현저하게 감소될 수 있다. 제공된 효소에 대해, 최종 신장 온도는 일부 구체예에서 약 60 내지 75℃의 범위일 수 있고, 시간은 약 0 내지 5400초일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다.

상기 기재된 3-단계의 열 순환 접근법에 더하여, 본 발명의 이러한 방법 및 조성법은 또한 2-단계의 열 순환 접근법이 될 수 있다. 일부 구체예의 이러한 접근법에서, 반응 용액은 소정의 회수의 순환 주기 동안 변성 상태, 및 어닐링/신장 상태 사이로 순차적으로 순환된다. 이러한 접근법은 신장 온도에서 어닐링되어, 어닐링 및 신장 단계가 동일한 온도를 공유하도록 고안된 프라이머를 이용한다. 온도 전이 횟수가 감소하면 순환 주기 시간을 추가로 감소시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 다수의 증폭된 핵산 산물이 약 5 내지 약 20분 동안 수득될 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, 다수의 증폭된 핵산 산물이 약 5 내지 10분, 약 1 내지 5분, 또는 5분 미만 동안 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 각각의 증폭된 핵산 산물은 약 10 ng 미만의 표적 핵산으로부터 시작하여 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 증폭된 핵산 산물은 약 5 ng 미만 또는 약 2 ng 미만의 핵산, 또는 약 1 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.5 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.2 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.1 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.05 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.006 ng 미만의 핵산으로부터 시작하여 생성될 수 있다.

임상 또는 환경 샘플에서의 생물학적 무기 작용제의 확인, 또는 인간, 식물 및 동물에서의 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염의 진단과 같은 다른 구체예에서, 증폭된 핵산 산물은 표적 핵산의 1개 이상의 카피로부터 시작하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 분석되는 샘플은 다중 증폭 반응 전에 1000개 미만의 카피(예를 들어, 1 내지 1000개의 카피), 400개 미만의 카피, 200개 미만의 카피, 100개 미만의 카피, 50개 미만의 카피, 30개 미만의 카피, 10개 미만의 카피 또는 1개 카피의 표적 핵산을 포함할 수 있다.

임의의 상기 방법에서, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이 표적 핵산 내의 유전자좌의 충분한 증폭을 달성하기 위해 열 순환이 소정의 수의 순환 주기 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 소정의 수의 순환 주기는 약 10 내지 약 50 순환 주기 범위일 수 있고, 일부 구체예에서는 약 20 내지 50 순환 주기의 범위일 수 있다. 추가로, 임의의 상기 방법에서, 1개 또는 다수의 핵산의 2개 이상의 유전자좌가 실질적으로 동시에 증폭될 수 있다. 바람직한 적용에 따라, 4개 이상, 5 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개 또는 약 10 내지 250개의 유전자좌가 동시에 증폭될 수 있다. 예를 들어, STR 유전자좌의 증폭을 위해, 10-20개의 유전자좌가 증폭될 수 있다.

다수의 시판되는 중합효소는 본원에 기재된 접근법을 이용하여 신속한 PCR 적용에 적용하기 위해 적합할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 중합효소는 100 염기 이상/초 신장률을 갖는다. 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq), 피로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu), 피로코쿠스 웨세이(Pyrococcus woesei)(Pwo), 써마스 플라부스(Thermas flavus)(Tfl), 쎄무스 서모필루스(Themus thermophilus)(Tth), 써무스 리토리스(Thermus litoris)(TIi) 및 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime)(Tma)를 포함하는 다수의 중합효소가 PCR 증폭에 이용가능하다. 상기 효소, 상기 효소의 변형된 형태, 및 상기 효소의 조합물이 로슈(Roche), 인비트로젠(Invitrogen), 키아젠(Qiagen), 스트라테진(Strategene), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)를 비롯한 업체에서 시판된다. 대표적인 효소는 퓨젼(PHUSION)(New England Biolabs, Ipswich, MA), 핫 마스터택(Hot MasterTaq™)(Eppendorf), 퓨젼 Mpx(PHUSION Mpx)(Finnzymes), 피로스타트(PyroStart)(Fermentas), KOD(EMD Biosciences), Z-택(Z-Taq)(TAKARA), 및 CS3AC/LA(KlenTaq, University City, MO)를 포함한다. STR 형결정을 위한 PCR 증폭에 널리 사용되는 효소는 Taq DNA 중합효소이다.

많은 염료 개수 (100개 이상)은 형광 여기(excitation) 및 검출에 이용가능하다. 이용 가능한 염료의 넓은 범위는 검출 범위에 따라 분광되는 방사 파장을 갖고, 따라서 방출 최대치들 사이의 최소한의 중첩을 갖는 염료 세트의 선택을 허용한다. 염료는 올리고 누클레오티드 및 프라이머에 공유 결합되도록 화학적으로 변성된 것을 이용할 수 있고, 이들은 플루오르세인 (fluorescein), 로다민 (rhodamine), 알렉사플루오르(AlexaFluor), 보디피 (Bodipy), 쿠마린 (Coumarin), 캐스케이드 염료 (Cascade dyes) 및 시아닌 (Cyanine) 염료계를 포함한다. 형광 염료는 인비트로젠/몰레큘라 프로브 (Invirogen/MolecularProbes) (Carlsbad, CA), 아나스펙 (Anaspec) (Freemont, CA), GE 헬스케어 (GE Healthcare) (Piscataway, NJ) 및 피어스/써모 피셔 (Pierce/Thermo Fisher) (Waltham, MA)를 포함하는 많은 시판 공급업체로부터 상업적으로 구할 수 있으며, 이러한 염료는 올리고누클레오티드에 부착하기 위해 화학적으로 변성된 유도체(예를 들어, 아미 다이트, N-히드록시숙시미드 에스테르, 숙신 에스테르, 이소티오시아네이트)로서 수득될 수 있다. 수많은 회사들이 이러한 형광 표지된 올리고누클레오티드와 화학적으로 변성된 올리고누클레오티드의 합성물을 제공한다. (예를 들어, 인비트로젠,Carlsbad, CA; 오페론 바이오테크놀로지스, Hunsville, Alabama; IDT, Coralvile, IA; 진 링크 (Gene Link), Hawthorne, NY; 아나스펙 (Anaspec Inc.) Freemont, CA; 바이오신테시스(Biosynthesis, Lewisville, TX)

화학적으로 활성된 (변성된) 형광 염료는 올리고누클레오티드 (Amidite chemistry, PhAm chemistry)의 합성 또는 사후 합성 (NHS 에스테르, 숙신 에스테르 또는 이소티오시아네이트로 변성된 염료)의 과정에서 올리고누클레오티드 프로브/프라이머에 부착될 수 있다. 첫 번째 방법 (성장하는 올리고 사슬 염료 그룹이 연결된 포스포아미다이트 결합)이 더 편리하지만, 5' 아미노 결합체 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 활성화된 염료 (예를 들어, NHS 에스테르)의 사후 합성 커플링도 잘 확립되어있다. 그럼으로써 아미노기는 PCR, 하이브리드화(Hybridization) 및 다른 조작 동안 안정한 이중결합을 형성하는 활성화된 염료와 반응한다. 염료 부착된 포스포아미다이트의 예로는 팜(FAM), 조(JOE), 일부 사이(Cy) 염료들이다.

형광 염료는 자신의 최대 방사 파장으로부터 통상적으로 20 내지 50 nm 푸른색 이동된 (blue-shifted) 최대 여기 파장을 갖는다 (스토크 시프트 (Stokes shift)). 결과적으로, 광범위한 방사 파장에 걸친 염료의 사용은 방사 파장 범위에 걸친 염료의 효과적인 여기를 달성하기 위한 여기 파장을 갖는 다수의 여기 공급원의 사용을 요구할 수 있다. 예를 들어, Cy 5.5가 동일한 레이저 (Cy5.5 여기 최대치는 488nm에서 임)에 의해 매우 비효율적으로 여기되는 반면, 팜 (FAM)은 기존의 청색 아르곤 레이저 (48nm에서 최대 여기)를 사용하여 488nm에서 매우 효율적으로 여기된다. 이러한 적색 이동 (red-shifted) 염료를 효과적으로 여기시키는 방법은 FAM 과 Cy5.5와 같은 효과적인 단일 레이저 여기가 가능한 형광 에너지 전달에 의한 것이다. 이것은 선택된 광원에 의해 효과적으로 여기되는 염료(흡수체)를 동일한 광원에 의해 효과적으로 여기되지 않으나 적색 이동 파장을 방사하는 염료 (방사체)에 아주 근접하게 부착함으로써 획득된다. 방사체와 아주 근접하게 흡수체를 배치하면 장파장 염료의 보다 효과적인 여기를 위해 허용하는 흡수체로부터 방사체로 전달되는 흡수 에너지를 허용한다. 흡수체와 방사체의 최적의 공간 거리를 푀스터 거리 (Foster distance)라 하고, 흡수체와 방사체 염료 사이에 적당한 스페이서 잔기를 배치함으로써 실험적으로 결정된다. 이러한 잔기는 단일 탄소 스페이서 (예를 들어, C3, C6, C18 링커), 올리고누클레오티드 스페이서, 또는 변성 뉴클레오티드일 있고, 두 개의 염료가 최적 거리를 유지하기 위해 화학적으로 결합될 수 있다. 흡수체 및 방사체 염료의 최적의 간격 유지는 흡수체의 여기, 방사체로 에너지의 이동 및 방사체 염료만의 형광방사를 가져온다. 염료들이 너무 멀리 떨어져 이격된다면, 형광 에너지 전달은 비효율적이고, 방사체는 그의 형광 최대 파장에서 방사할 수 있다. 반대로, 흡수체와 방사체가 너무 근접하게 있다면, 형광 퀀칭 (형광/발산 없음)이 관찰될 수 있다.

마지막으로, 염료는 증폭된 단편의 전기영동 이동성을 변경할 수 있다. 일반적으로 변경된 이동성이 상이한 유전자좌로부터의 앰플리콘과 중첩을 야기하지 않는 한 이것은 중요한 문제가 아니다. 이러한 변경된 이동성이 중첩을 야기하는 비교적 드문 경우에서, 중첩을 제거하기 위한 프라이머 설계가 필요하다 (예를 들어, 중첩 유전자좌들의 큰 앰플리콘을 생성하는 유전자좌의 표지된 프라이머의 5-말단기에 염기를 첨가함).

당업자에게 알려진 여러 변수는 본원에 기재된 PCR 증폭 방법을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 프로토콜 최적화를 위한 기준은 전체 프로파일의 생성, 신호 강도, 동적 범위, 유전자좌 간 신호 강도의 균형, PHR, 불완전 NTA, 스터터 (stutter), 및 총 순환주기 시간을 포함한다. (Hill, CR, Butler, JM, Vallone, PM. A 26plex Autosomal STR Assay to Aid Human Identity Testing. J Forensic Sci 54:1008-1015. 2009. Brownstein, MJ, Carpten, JD, Smith, JR. Modulation of Non-Template Nucleotide Addition by Taq DNA Polymerase: Primer Modifications that Facilitate Genotyping. BioTechniques 30:1004-1010. 1996. SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories. 2010. http://www.fbi.gov/about-us/lab/codis/swgdam- interpretation - guidelines).

일부 구체예에서, 10, 20, 또는 30회 이상 다중 PCR 순환에 대한 총 순환 시간은 약 1분 내지 약 90 분 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 10, 20, 30회 이상 다중 PCR 순환에 대한 총 순환 시간은 약 1분 내지 약 90분 범위; 또는 약 1분 내지 약 85분; 또는 약 1분에서 약 80분; 또는 약 1분 내지 약 75분; 또는 약 1분 내지 약 70분; 또는 약 1분 내지 약 65분; 또는 약 1분 내지 약 60분; 또는 약 1분 내지 약 55분; 또는 약 1분 내지 약 50분; 또는 약 1분 내지 약 45분; 또는 약 1분분에서 약 40분; 또는 약 1분 내지 약 35분; 또는 약 1분 내지 약 30분; 또는 약 1분 내지 약 25분; 또는 약 1분 내지 약 20분; 또는 약 1분 내지 약 15분; 또는 약 1분 내지 약 10분; 또는 약 1분 내지 약 5분 범위이다. 다른 구체예에서, 10, 20, 또는 30회 이상 다중 PCR 순환에 대한 총 순환 시간은 약 90분 미만이다. 또 다른 구체예에서, 10, 20, 또는 30회 이상 다중 PCR 순환에 대한 총 순환 시간은 89분, 85분, 80분, 75분, 70분, 65분, 60분, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분이다.

본원에 기재된 방법은 GeneAmp® PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA)와 같은 기존의 PCR 열순환 장치를 이용하여 수행할 수 있음이 고려된다. 각각의 반응 챔버는 박벽 (thin-walled) 반응 튜브 내에 함유될 수 있다. 박벽 반응 튜브는 바람직하게는 약 200㎛ 미만의 두께를 갖는다. 바람직하게는 박벽 반응 튜브는 약 100㎛ 이하의 미만의 두께를 갖는다.

또한 본 발명의 PCR 증폭 방법은, 참조로서 본원에 포함되는 표제 "표적 핵산의 신속한 다중화 중합 방법 (Method for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids; App. Ser. No. 12/080,746)" 및 표제 "통합 바이오칩 (Unitary Biochips; App. Ser. No.13/044,485)"에 기재된 것과 같은 미세유체 바이오칩을 이용하여 수행되는 것으로 고려된다. 각 반응 챔버는 바이오칩 (예를 들어 미세유체 바이오칩) 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위해 일부 구체예에서 바이오칩을 사용할 수 있다. 특정 바이오 칩 설계는 일부 실시예 또는 일부 실시예의 통합에서 샘플 삽입부터 결과물 생성까지의 복잡한 과정의 모든 단계를 작동자 개입없이 단일 기기에서 수행되는 마이크로 유체 분야의 기본 목표를 달성 할 수 있다. 일부 구체예에서 바이오칩은 세포 용해, DNA 정제, 다중체 증폭, 및 전기영동 분리를 포함하는 분석 결과에 법의학적 샘플로부터 단기 일렬 반복 (STR) 프로파일을 생성하기 위한 방법; 세포 용해, DNA 정제, 다중화 증폭, 상거 시퀀싱 (Sanger Sequencing), 초미세여과 및 전기 영동 분리; 및 임상 샘플로부터 DNA 서열을 생성하기 위한 검사; 핵산 정제, 역전사, 다중화 증폭, 생거 시퀀싱, 초미세여과 및 전기영동 분리; 및 생물학적 무기 샘플로부터 DNA 서열을 생성하기 위한 검출, 및 핵산 정제, 전처리 및 인간, 박테리아 및 세균성 임상 및 실험 샘플로부터 유전적 DNA 서열을 생성하기 위한 단분자 시퀀싱 등 복잡한 샘플을 수행할 수 있다.

일부 구체예에서, 샘플 조작은 세포 용해; 세포 분리; 층별 세포 용해; 층별 여과; 전체 핵산 정제; DNA 정제; RNA 정제; mRNA의 정제; 단백질 정제; 전-핵산 증폭 방제; 핵산 증폭 (예를 들어, 단일 및 다중 엔드포인트 PCR 모두, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 비대칭 PCR, 네이티드 PCR, LATE PCR, 터치 다운 PCR, 디지털 PCR, 압연 원형 증폭, 가닥 치환 증폭, 및 다중 치환 증폭); Y- STR 증폭; 미니-STR 증폭; 단일 누클레오티드 다형체 분석; VNTR 분석; RFLP 분석; 사후-핵산 증폭 방제; 전-핵산 시퀀싱 방제; 핵산 시퀀싱 (예를 들어, 상거 시퀀싱, 파이로시퀀싱 및 단일 분자 시퀀싱); 사후 핵산 시퀀싱 방제; 역전사; 전-전사 방제; 사후 역전사 방제; 핵산 라이게이션 (ligation); SNP 분석; 핵산 하이브리드화; 전기 영동 분리 및 검출; 면역 분석; 결합 분석법; 단백질 분석법; 효소 분석법; 질량 분광법; 및 핵산 및 단백질 정량의 조합을 포함하는 바이오칩에서 수행된다.

일부 구체예에서, 바이오칩은 미처리된 생물학적 샘플로부터 핵산 및 다른 생물학적 성분을 정제, 조작 및 분석하도록 한다. 미처리 생물학적 샘플은 개체에 의해 수집된 다음 중간 처리 단계없이 (샘플 수집 장치는 표지될 수 있고/또는 처리 전에 저장될 수 있음에도 불구하고) 바이오칩의 수용 챔버에 삽입된 것이다. 조작자는 단지 샘플을 수집하거나 아니면 수득하고, 샘플을 장치에 삽입하고, 기기에 장치를 삽입하고 (장치가 기기 내에 미리 준비되어 있다면 필요없음), 버튼을 누르기만 하면 된다. 장치로 삽입하기 전에 샘플의 어떠한 처리, 조작 또는 변경도 필요치 않고 조작자는 면봉 절단, 혈액 튜브 개봉, 조직 및 생물학적 유체의 수집, 샘플을 다른 용기로 이동, 또는 샘플을 시약이나 조건 (예를 들어, 가열, 냉각, 진동)에 노출시키지 않아야 한다. 따라서, 조작자는 생물학 또는 실험 기술에 강도높은 훈련을 할 필요가 없다. 선택적으로, 바이오칩은 처리된 생물학적 샘플 (예를 들어, 연속 정제를 위한 세포 용해물)을 받아들일 수 있으나, 이러한 응용들은 조작자에게 기술 교육을 필요로 할 수 있다.

실제로는, 생물학적 이용될 수 있는 모든 수집 기구를 이용하여 본원에 기재된 방법으로 수집된다. 수집 기구는 일반적으로 시판되고 있으나, 주어진 상황에 따라 특별히 설계되고 제조될 수도 있다. 임상 샘플에 대해, 다양한 시판 면봉은 비강, 인두, 구강, 구강액, 대변, 편도선, 질, 자궁 경부, 및 상처용 면봉을 포함할 수 있다. 샘플 채취 기구의 치수나 재질은 다양하고, 장치는 특수핸들, 뚜껑, 용이하고 바로 파손을 위해 경계선, 및 채취 매트릭스를 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 다양한 부피의 광범위한 시판 튜브로 채취되며, 이들 중 일부는 첨가제 (헤파린, 시트르산, 및 EDTA 와 같은 항응고제를 포함), 샘플 출입에 용이한 진공, 바늘 삽이에 용이한 마개, 및 조작자를 샘플의 노출로부터 보호할 덮개를 포함한다. 조직 및 체액 (예를 들어, 가래, 화농성 물질, 흡인물)도 일반적으로 혈액 튜브와는 구별되는 튜브로 채취된다. 이러한 임상 샘플 채취 기구는 (신속한 병원성 구균 실험에 대한 목/편도선 면봉의 검사와 같은 특정 실험은 시료의 시점에 수행할 수 있지만) 일반적으로 종합 병원이나 테스트 전문 상업 임상 실험실로 보내진다. 환경 시료는 (예를 들어, 에어 브리더, 에어로졸 또는 물 여과 장치로부터) 필터 또는 필터 카트리지, 면봉, 분말, 또는 액체로 존재할 수 있다.

법의학적 증거를 위한 일반적인 수집 기술은 면봉을 사용하여 수행된다. 면봉은 보데 (Bode) (Lorton, VA), 퓨리탄 (Puritan) (Guilford, ME), 피츠코 (Fitzco) (Spring Park, MN), 보카 (Boca) (Coral Springs, FL), 코판 (Copan) (Murrieta, CA) 및 스타플렉스 (Starplex) (Etobicoke, ON, Canada)에서 시판한다. 스웨빙 (swabbing)은 거즈유사 재료, 일회용 브러쉬, 또는 시판 생물학적 샘플링 키트를 이용하여 수행할 수도 있다. 법의학적 샘플은 혈액, 정액, 상피 세포, 소변, 침, 대변, 다양한 조직, 및 뼈를 포함할 수 있다. 사람이 존재하는 개체로부터의 생물학적 증거는 구강 면봉을 사용하여 종종 채집된다. 널리 시판되고 있는 구강 면봉은 세큐어스웹 (SecurSwab) (The Bode Technology Group, Lorton, VA)이다. 구강 샘플은 피험자나 조작자의 지시에 따라 면봉을 입에 넣고 뺨 내부 표면위에서 1회 이상 위 아래로 문질러줌으로써 채취된다.

일부 구체예에서, 바이오칩은 동시에 다수의 샘플들에 복잡한 공정을 수행하기 위해 본원에서 기재한 방법에 사용된다. 일부 구체예에서, 다수의 샘플은 조작의 동일한 세트를 이용하여 처리되거나, 각 샘플은 (또는 샘플의 하위세트)는 조작의 맞춤형 세트를 이용하여 처리된다. 일부 구체예에서, 몇몇 독립적 분석법이 주어진 샘플에 수해된다. 예를 들어, 법의학 샘플은 정제된 재료에서 DNA 단리한 뒤, STR 분석 수행, SNP 분석, 및 미토콘드리아 시퀀싱을 수행함으로써 분석될 수 있다. 마찬가지로, 임상 샘플은 핵산 및 단백질 정제 및 PCR, 역전사 PCR, DNA 시퀀싱 및 면역 분석을 수행함으로써 분석될 수 있으며, 예를 들어 단일 바이오칩 상에서 많은 수의 병원체 및 세포 공정들이 동시에 조사되는 것을 허용한다.

일련의 소프트웨어 및 펌웨어가 바이오칩 작동 및 데이터 분석을 위해 제공 될 수 있다. 기기의 하드웨어는 구성요소 기능을 지시하고 기기 자체 테스트를 수행하는 소프트웨어 및 펌웨어에 의해 제어된다. 자동화된 스크립트는 모든 스크립트 공정 단계의 적용을 포함하여, 바이오칩과 기기의 모든 상호작용을 제어한다. 분석 소프트웨어는 원자료(예를 들어, 전기영동도의 색 보정) 결과 및 분석 결과가 있는 경우 (예를 들어, 단편 크기 결정, STR 대립 유전자 콜링, DNA 서열 분석) 분석 모두를 수행한다. 기기는 공정을 개시하는 유저를 허용하고, 공정 상태의 유저를 알리는 그래픽 유저 인터페이스 (graphic user interface)를 포함할 수 있다. 마지막으로, 시스템은 관련된 분석 비교치 (예를 들어, 관심 개체로부터 STR 프로파일 또는 병원체의 DNA 서열)를 저장할 수 있고, 외부 데이터베이스와의 매칭 및 추가 분석을 위해 결과를 출력할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예, 및 이의 다양한 용도의 예시이다. 이들은 설명의 목적으로만 기재된 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않는다.

실시예

실시예 1

5-색 증폭 및 분리 및 검출 시스템에서 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, D8S1179, FGA 및 SE33 및 아멜로게닌 유전자좌의 동시 다중 증폭의 형광 검출

다중화 설계의 첫 번째 단계는 유전자좌 선택을 필요로 한다. 수십만개의 이용가능한 다형성 유전자좌를 선택하는데 몇가지 기준이 사용되지만, 기본적인 차별 요인은 각 유전자좌의 다형성 정도였다. 보다 유사한 빈도를 나타내는 대립 유전자를 보다 많이 갖는 유전자좌는 높은 이형성 (

) (Weir, BS. Genetic Data Analysis II, Chapter 4, p.141. Sinaeur Associates Inc, Publishers 1996) 및 높은 다형성 정보 내용 (

, Botstein, D, White, RL, Skolnick, M, Davis, RW. Construction of a genetic Linkage Map in Manu Using Restriction Fragment Length Polymorphisms, Am J Hum Genet 32:314-331, 1980)을 나타낸다. 이러한 특성은 DNA 샘플 공급원이 다른 것과 일치하는데 상당한 이점을 제공한다. 개별 유전자의 높은 다형성 정보 내용은 관련 개체들을 포함하는 친자 및 친족 관계 분석에 매우 중요한데, 유전체가 이러한 분석에 유리한 한정된 수의 연결되지 않은 유전자좌만을 수용할 수 있기 때문이다. 이런 이유로, 다른 요인들이 선택에 영향을 주지 않는다면 많은 대립 유전자를 갖는 고다형성 유전자좌가 일반적으로 선택된다.

또 다른 중요한 요인은 미국과 전세계에서 법 집행 목적을 위해 이용되는 유전자좌의 포함이었다. 모든 국가가 식별을 위한 STR 유전자좌의 세트를 사용하지는 않는다. 다른 국가가 유전자좌의 다른 세트를 사용한다는 사실은 또 다른 나라에서 수집된 프로파일을 갖는 한 나라의 데이터베이스를 검색하는 활용도를 줄일 수 있다. 미국의 모든 표준 STR 유전자좌 뿐만 아니라 전세계의 관할지역에서 정기적으로 사용되는 모든 유전자좌를 포함하는 프라이머 세트를 개발함으로써, 데이터베이스를 검색하여 개인을 식별하는 것이 훨씬 더 유익해 질 것이다. 이러한 접근은 멀티플렉스가 세계 각국으로부터 데이터베이스를 검색하는데 적합한 유전자좌를 포함하고 있으므로, 이민 테스트 및 국제 범죄에 관련된 샘플 테스트에 사용하는 추가적인 장점을 제공한다.

표 3에 나타낸 바와 같이 아멜로게닌 유전자좌를 더한 25개 STR 유전자좌를 포함하는 멀티플렉스를 설계하였다. 이러한 멀티플렉스는 미국 CODIS 데이터베이스에서 동의된 모든 13개 STR 유전자좌를 포함하며 (표 3, 미국 CODIS 열), 이들은 유럽 DNA 프로파일링 (the European DNA Profiling; EDNAP) 그룹 및 법의학 연구소의 유럽 네트웍 (the European Network of Forensic Science Institutes; ENFSI)에 의해 유럽 나라들에 표준화로 권고되었다. (Schneider, PM. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci-The Current Situation. Profiles in DNA, Promega Corporation, March 2009) (표 3, 유럽 EDNAP/ENFSI 열). 세 가지 다른 유전자 좌는 오스트리아의 국가 데이터베이스 세트에 포함되고, 하나의 다른 유전자좌, SE33,는 독일 데이터베이스에 포함되어 있다. 마지막으로, 증폭된 대립 유전자 사이에서 관찰되는 증가된 분리 물질로 가치가 있는 펜타누클레오티드 또한 포함된다.

표 3. 유전자좌 선별

멀티플렉스 내의 STR 유전자좌의 배치는 분리 시스템에서 검출될 수 있는 단편의 범위, 분리 시스템의 분해능 (구별되는 두 개의 단편의 분자량에 따라 달라질 수 있음), 그리고 전기 영동 분리의 경우에서는 분리 시 검출될 수 있는 형과 염료의 개수를 포함하는 여러 가지 고려 사항에 따라 달라진다. 25 STR 유전자좌/아멜로게닌 멀티플렉스는 큰 앰플리콘의 위치에 상대적으로 적거나 거의 없는 희귀한 미세변이 (microvariant) 대립 유전자 (즉, 반복길이 한자리 정수개에 대해 다른 것과 다르지 않는 대립 유전자)를 갖는 4 및 5 염기 반복 유전자좌를 배치한다. 이 방법은 일반적으로 최저의 해상도를 갖는 영역에 이러한 대립 유전자를 배치함으로써 고분자량 영역 (주어진 분리 플랫폼과 주어진 분리 시간 )내에 대립 유전자의 분석을 최적화하는 이점을 제공한다. 저분자량 범위에서 3개의 염기 반복 (즉, D22S1045)을 포함하는 고다형성 유전자좌 및 보다 많은 미세변이 유전자좌들을 나타내는 유전자좌들을 배치하는 반면, 고분자량 범위에서 상대적으로 적거나 거의 없는 미세변이 대립 유전자를 갖는 추가의 4개 및 5개 염기 반복 유전자좌의 배치는 본 다중체 설계의 중요한 측면이다. 동일한 설계의 특징은 고분자량 영역에서 5개-염기 분리되는 대립 유전자가 보다 일반적으로 사용되는 4개 및 3개 염기 STR 반복 보다 용이하게 분리하는 것과 같이 포함된 유전자좌의 전체 스펙트럼에 걸쳐 대립 유전자의 보다 신속한 분리를 허용한다. 이러한 접근 방식은 멀티플렉스 설계에서 고분자량 영역의 사용을 허용하고, 각 염료로 표지된 고다형성 특성체를 갖는 보다 많은 유전자좌들의 포함을 허용, 궁극적으로는 멀티플렉스에서 이러한 유전자좌들을 보다 많이 함유하는 것을 허용하는 것이다. 25개 STR 유전자좌 및 아멜로게닌 유전자좌는 총 4개의 염료 (크기 마커를 표지하기 위해 5가지 염료가 사용됨)로 표지되고, 74개 염기 내지 485개 염기의 총 분자량 영역에 걸쳐 배치되었다. 우리는 또한 일부 고분자량 정보가 제거된 샘플을 변성시키는 경우 정보 손실을 제한하기 위해 큰 앰플리콘 위치의 자리에 최소 통상적으로 사용되는 유전자좌를 배치하였다.

도 1은 단일 반응에서 26개 유전자좌의 공동 중폭반응을 허용하는 설계를 보여준다. 첫 번째 패널은 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B 에 대한 것들을 포함하는 FAM으로 표지된 유전자좌를 나타내고, 두번째 패널은 유전자좌 TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C용에 대한 것들을 포함하는 JOE로 표지된 유전자좌를 나타내고, 세번째 패널은 유전자좌 D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 펜타 D에대한 것들을 포함하는 카르복시-테트라메틸로다민 (TMR)으로 표지된 유전자좌를 나타내고, 네번째 및 다섯번째 패널은 유전자좌 D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, Penta E, D8S1179, FGA, and SE33에 대한 것들을 포함하는 5,6-카르복시로다민 6G (CWR)로 표지된 유전자좌를 나타낸다. 여섯번째 패널은 분석용으로 포함된 크기 마커 (size marker)를 구성하는 CC5-표지된 단편을 보여준다.

다중 STR 세트의 구성은 혼합 과정에서 예기치 않은 프라이머 상호 작용으로 인해 생성된 변인물 (artifacts)의 제거가 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 유전자좌의 표지된 프라이머는 중합효소 연쇄 반응 동안 의도하지 않은 서열을 증폭하기 위해 다른 유전자좌의 표지되지 않은 프라이머와 함께 반응할 수 있다. 이것은 유전적 표적 DNA와 발생할 수 있지만, 반응 동안 설계된 앰플리콘의 농도가 증가하는 것처럼 만들며; 이러한 증가는 의도치않은 증폭 산물이 생성되는 동안 주형의 고농도를 제공한다. 일단 생성되면, 이러한 변인물은 프라이머의 문제가 되는 쌍과 완벽히 일치하고 증폭의 후속 단계에서 효율적으로 증폭된다.

이러한 변인물을 해결하기 위해, 멀티플렉스 내에 두개의 프라이머가 생성한 특정 변인물(들)을 식별하는 것이 도움이 된다. 이는 두개의 특정 프라이머가 각각 변인물의 존재 및 부재에 상응하여 존재 및 부재가 판별될 때까지 개별 프라이머 또는 혼합으로부터 프라이머 그룹을 체계적으로 제거함으로써 달성된다. 보통의 프라이머가 식별되면, 변인물들은 다양한 방법으로 제거될 수 있다. 이들은 (1) 잘못된 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 중 하나를 사용, (2) 3-말단의 염기를 제거하거나 새로운 결합 자리에 완전치 재설계함으로써 잘못된 프라이머 하나 또는 둘다의 서열을 변경, (3) 프라이머 쌍 내의 표지된 프라이머는 표지되지 않게하고 표지되지 않은 프라이머는 표지되도록 변경, 또는 (4) 의도치 않은 생성물의 생성을 감소시키기 위해 1개 또는 양쪽쌍에 있는 표지된 프라이머와 표지되지 않은 프라이머의 비를 변경하는 것을 포함한다. 실험적 분석 방법이 각 변인물 또는 변인물의 세트에서 인공물 감소를 달성하는 가장 효과적인 방법을 결정하는데 이용된다.

유전자좌 대 유전자좌 균형은 법의학적으로 유용한 멀티플렉스 세트의 생성에 중요한 속성이다. 이와 관련하여, 초기 프라이머 설계는 각각의 용융 온도에서 서로에게 유사한 프라이머 설계를 포함한다. 증폭 과정에 사용한 어닐링 온도는 모든 프라이머 표적이 변성 상태라기 보다 상보적 프라이머와 이중체 상태로 대부분 있는 모든 프라이머 표적을 보장하기 위해 이러한 용융 온도보다 낮게 설정한다. 그럼에도 불구하고, 회전 주기 당 증폭의 상대적 효율성은 다른 유전자좌들보다 어떤 유전자좌 보다 더 많이 나타나는 최종 다중 증폭 산물을 생성하는 또 다른 하나의 유전자좌와 다를 수 있다. 이러한 불균형을 극복하는 한가지 방법은 증폭 과정에 영향을 미치는 다른 요소의 일부를 보상하기 위해 다른 프라이머의 농도를 낮추면서 일부 프라이머의 농도는 상승시키는 것이다. 증폭의 장마다 2배 이상 증가의 증폭 효율을 향상시키는 것이 결코 가능하지 않는다는 본 접근 방법의 한계점이 있다.

26개 STR 유전자좌의 각 프라이머 서열은 표 4에 나열한 프라이머 서열을 포함하는 하나의 용액에서 결합되었다.

표 4

본 26개-혼합 25개 STR 용액을 이용하여, 인간의 유전적 DNA 주형 (변형 9947)는 개별 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, D8S1179, FGA, 및 SE33에서 단일 반응 용기 내에서 동시에 증폭된다. PCR 증폭은 미세 유체 바이오칩에서 7μl 반응으로 수행하였다. PCR 바이오칩 (도 2a)는 슬라이드 형식으로 사출성형되었고, 도 2b의 신속한 열 순환기를 이용하여 신속한 다중화 PCR를 성공적으로 시험하였다. 이러한 바이오칩은 25mm x 75mm x 1.1mm 두께이다. 이 시스템은 인간의 DNA (6pg의 DNA, 근본적으로 검출의 단일 카피 제한)와 동등한 단일 유전자체로부터 STR 단편에 다중화 증폭을 허용한다. 반응은 기스 등이 (Giese, H., et al. (2009)) "종래의 신속한 다중화된 중합 효소 연쇄 반응 및 미세유체 단기 일렬 연쇄 반응 (Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis)." (J Forensic Sci 54(6): 1287-96)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 31회의 순환주기 절차를 표지된 앰플리콘을 생성하는 열 순환 챔버 내에서 반응을 순환하는데 적용하였다. 순환 조건은 다음과 같다; 핫스타트 (Hotstart) 93℃ x 20초에 이어 (93℃ x 4 초, 56℃ x 15초 및 70℃ x 7 초)의 31회. 표제 "표적 핵산의 신속한 다중화 중합 방법 (Method for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids; App. Ser. No. 12/080,746)" 및 표제 "통합 바이오칩 (Unitary Biochips; App. Ser. No.13/044,485)"를 참조하고, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다. 증폭된 산물은 분리되고, 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이 네트바이오의 진벤치-FX (NetBio's Genebench -FX)를 사용하여 검출하였다.

도 3은 생성된 26개 다중체 반응의 각 유전자좌에 대한 증폭 산물의 색 보정 스캔을 보여준다. 26개 유전자좌 프라이머 세트는 각 유전자좌에 대한 단편을 증폭하는데 사용되었고, 네트바이오 젠벤치 (NetBio GeneBench FX ™) 기기로 분리 및 검출되었다. 첫 번째 패널은 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B에 대한 것들을 포함하는 FAM으로 표지된 피크를 표시하고, 두 번째 패널은 유전자좌 TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C에 대한 것들을 포함하는 JOE로 표지된 피크를 나타내고, 세 번째 패널은 유전자좌 D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 펜타 D에 대한 것들을 포함하는 카르복시-테트라메틸로다민 (TMR)로 표지된 피크를 나타내고, 네 번째 및 다섯 번째 패널은 유전자좌 D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, Penta E, D8S1179, FGA, and SE33에 대한 것들을 포함하는 5,6-카르복시로다민 6G (CWR)로 표지된 피크를 나타낸다. 여섯 번째 패널은 크기 마커를 구성하는 CC5-표지된 단편을 보여준다.

실시예 1은 효과적인 공동 증폭이 아멜로게닌 포함 25개 별개의 STR 유전자좌로 달성되고, 이러한 생성물이 분리되고 검출되는 것을 보여준다. 이것은 사용된 프라이머 서열이 증폭된 물질에서 관찰되는 국소 불순물과는 별개의 단편을 갖는 26개 유전자좌 각각의 증폭 산물을 생성하기에 충분히 잘 설계되고 균형잡혀 있음을 보여준다. 증폭된 성분이 인간 변형 9947로부터의 공지된 표준 DNA이기 때문에, 예상되는 단편이 알려졌고 확인되었다. 그러나, CXR-표지된 D8S1179, FGA 및 SE33 대립 유전자 범위가 각각 또 다른 6개의 CXR-표지된 유전자좌의 하나 이상과 상당히 중첩되기 때문에 5가지 염료의 한계는 특정 샘플의 해석이 어렵다는 것이다. 이러한 한계는 각 개별 염료 간에 고유한 크기 범위로 각 유전자좌의 대립 유전자의 전체 분리가 허용되는 6개의 형광 염료를 채택하는 실시예 2에서 극복된다.

실시예 2

25개-STR 유전자좌 멀티플렉스

실시예 2는 아멜로게닌 포함 25개 별개의 STR 유전자좌의 공동 증폭, 및 동일한 염료로 표지된 이웃하는 대립 유전자와 중첩되지 않고 구별된 대립 유전자 크기 범위로 공동 증폭된 산물의 분리 및 검출을 나타낸다. 이러한 유전자좌 세트는 13개의 완전한 CODIS 유전자좌, 추가 8개의 유럽, 오스트리아, 독일 표준 유전자좌, 4개의 펜타 유전자좌, 및 성별 감식에 허용된 아멜로게닌을 포함한다. 이러한 접근 방법은 법의학적 형질 결정 방법의 단일화 및 미국과 전 세계의 많은국가과 기관 사이에 보다 유용한 데이타의 공유를 허용한다. 멀티플렉스 DNA를 분석하고, 미국 및 전 세계에 걸쳐의 데이터베이스의 검색을 지원하는, 모든 범죄 현장에서 법 집행, 반테러리즘 및 국가 안보 노력을 지원하는 유럽, 미국 소재 데이터베이스의 검색을 지원하는데 사용될 수 있다.

6-색상 증폭 및 분리 검출 시스템에서 유전자좌 아멜로게닌, D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, D8S1179, FGA, 및 SE33의 동시 다중 증폭의 형광 검출. 본 멀티플렉스 설계 실시예는 실시예 1에 기재된 바와 같이 동일한 유전자좌를 공동 증폭하는 프라이머를 포함한다. 실시예 1과 비교하여 유전자좌 D8S1179, FGA, SE33이 ROX-표지된 프라이머 대신에 이러한 3개의 유전자좌에 대한 6개 염료로 표지된 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍으로 증폭된다는 것이 다르나. 원하는 경우 다른 염료의 하나를 사용할 수 있지만, 6번째 염료는 DyLight 633이다. 본 멀티플렉스의 그외의 6번째 염료로는 FAM, JOE, TMR, CXR 및 CC5가 있다.

도 4는 본 발명의 다중화 시스템의 개발에 포함된 접근법의 이점을 도시한다. 각 행의 특정 유전자좌를 표지하는데 사용된 염료를 왼쪽 칸에 나열하였다 ( A488 이 ATTO488 염료를 나타냄). 각각의 유전자좌에 대한 대략적인 대립 유전자 크기는 도면의 상단부에 표시한 수치로 결정될 수 있다. 한 멀티플렉스 내의 개체의 그룹에 대한 많은 대립 유전자를 각각 나타내는 몇몇의 고다형성 유전자좌의 배치는 매우 바람직하다. 그러나, 분리동안 DNA 단편의 고분자량 범위내의 해상도 손실은 작용가능한 앰플리콘 크기 범위에 상한선을 만들고, 따라서 얼마나 많은 각 형광 염료로 표지된 많은 유전자좌가 명백하게 분리되고 분석될 수 있는가의 한계점을 갖게 된다. 염료의 개수를 늘리는 것이 이러한 한계점을 극복하는 한 방법이다. (변경 방법은 전기 영동법 시스템으로 분리된 효과적인 MW 범위를 증가시키는 것이다). D8S1179, FGA 및 SE33 유전자좌에 대한 특정 프라이머에 결합된 여섯 번째 형광 염료의 포함은 중첩 대립 유전자의 앰플리콘, 즉 동일한 염료로 표지된 프라이머를 갖는 또다른 유전자좌의 대립 유전자의 크기 범위내에서 나타나는 하나의 유전자좌의 대립 유전자를 생성하지 않고 공동 증폭 및 분리 시각화를 허용한다.

다시 말하면, 이러한 25개 유전자좌 분석법은 실질적인 비중첩 STR 분석이다. 실질적인 비중첩 분석법의 가치는 동일한 방식으로 표지된 이웃 유전자좌의 중첩되는 대립 유전자로부터 발생하는 혼동의 가능성을 본질적으로 제한하는 것이다. STR 유전자좌 크기 범위 밖에 있는 희귀 대립 유전자만이 혼란을 일으킬 수 있다. 실시예 5의 본 발명의 27개 멀티플렉스 분석의 설계는 이러한 희귀 중첩 대립 유전자 4개를 가지고 있고, 16개 멀티플렉스 ABI 아이덴티필러 (16plex ABI Identifiler) 분석법은 6개 이상의 중첩 대립 유전자를 가지며, 파워플렉스(Powerplex) 16개 다중체 분석은 이러한 희귀 중첩 대립 유전자 8개를 가지고 있다. 이러한 희소 대립 유전자의 대부분은 하나 또는 소수의 발생에 따라 문헌에 보고되어 왔다. 이와 같이, STR 유전자좌의 많은 개수를 허용하는 멀티플렉스 설계는 그들이 실질적 비중첩 분석이라는 것을 유지하면서 평가되는, 본 발명의 주요 장점이다.

실시예 1의 분석을 제외하고, 실시예들에서 제시한 STR 분석 실험은 모두 실질적 비중첩이다. 따라서, 대립 유전자에 나타내는 단편은 크기 또는 색깔 또는 두 가지 모두에 의해 시각화 및 분석을 위해 확실하게 분리된다. 이것은 많은 집단의 상당한 집단 데이터가 다중체내에 포함되는 유전자용으로 사용가능하기 때문에 가능하다. 이러한 데이터를 사용하지 않고, 각각 또는 색으로 표시되는 보다 적은 고다형성 유전자좌를 허용하거나, 그들이 서로 가까이 위치하면 동일한 색의 이웃하는 유전자좌의 대립 유전자 크기 범위들의 실질적 중첩의 위험이 발생하는 서로로부터 실질적으로 대립 유전자 범위를 구분하는 것이 필요하다.

본 실시에서, DNA 주형 (변형 9947)는 단일 반응 용기에서 FAM으로 표지된 개별 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B 유전자좌; JOE로 표지된 TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 및 펜타 C; TMR로 표지된 유전자좌 D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌 및 펜타 D; CXR로 표지된 유전자좌 D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO 및 펜타 E; 및 6번째 염료로 표지된 유전자좌 D8S1179, FGA 및 SE33에서 동시에 증폭된다. PCR 증폭은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된다. 증폭된 산물은 CC5-표지 크기 마커와 혼합된 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 네트바이오의 젠벤치-FXTM (NetBio's Genebench-FXTM)를 사용하여 분리 검출된다.

실시예 3

35개-STR 유전자좌 멀티플렉스 설계

8-색 증폭 및 분리 검출 시스템에서 STR 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, D8S1179, FGA, SE33, D17S974, D9S1122, D14S1434, D4S2408, D9S2157, D20S1082, D6S1043, D1SGATA113, D10S1435, 및 D11S4463의 동시 다중화 증폭의 형광 검출법

도 5는 유전자좌의 증폭 세트의 산물을 표지하기 위해 8가지 염료를 사용하는 설계를 나타낸다. (본원에 참고로서 포함된 표제 "표적 핵산의 신속한 다중화 증폭 방법(Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids)" 출원번호 12/080,746 참조). 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 및 펜타B는 염료 1로 표지되고, 유전자좌 TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 및 펜타C는 염료 2로 표지되고, 유전자좌 D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 및 펜타 D는 염료 3으로 표지되고, 유전자좌 D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 및 펜타 E는 염료 4로 표지되고, D8S1179, FGA, 및 SE33은 염료 6으로 표지되고, 유전자좌 D17S974, D9S1122, D14S1434, D4S2408, D9S2157, 및 D20S1082는 염료 7로 표지되고, 및 유전자좌 D6S1043, D1SGATA113, D10S1435, 및 D11S4463은 염료 8로 표지된다. 크기 표준은 염료 5로 표지되었다.

D6S1043 유전자좌는 6번 염색체 상의 SE33 유전자좌와 물리적으로 인접하여 6번 염색체과 유전적으로 연결될 수 있다. 본 다중화 시스템에 포함된 D6S1043 유전자좌는 중국에서 사용하고 있다. D17S974, D9S1122, D14S1434, D4S2408, D9S2157, D20S1082, D1SGATA113, D10S1435, 및 D11S4463 유전자좌는 힐 등 (Hill, et al)에 의해 보고되었다 (2009년, 상기). 이러한 유전자좌들은 멀티플렉스 내의 다른 유전자와 유전적 연결을 만들것같지 않은 멀티플렉스 세트에 포함된 다른 유전자 모두로부터 상당한 물리적 (염색체) 거리에 모두 위치한다.

다중화 시스템 내에서 아멜로게닌을 더한 34개 STR 유전자좌의 포함은 이전에 개발된 STR 멀티플렉스 세트에 비해 상당한 복잡성을 추가한다. 70개 이상의 프라이머를 혼합하여 변인물 생성이라는 해로운 결과 없이 동시 공동 증폭하게 한다. 8개의 별도 염료 표지제가, 적은 수의 유전자좌가 이들과 증폭되어 크기가 제한된 고분자량 앰플리콘을 허용하게 되도록 통합된다. 따라서, 이것은 증폭 산물의 보다 신속하고 정확한 분리를 허용한다.

실시예 4

8-색상 증폭 및 분리 검출 시스템에서 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045, 펜타 B, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 펜타 C, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌, 펜타 D, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO, 펜타 E, D8S1179, FGA, SE33, DYS391, D6S1043, DYS439, DYS389II, DYS19, DYS392, DYS393, DYS389I, DYS390, DYS385a, DYS385b, DYS437, 및 DYS438의 동시 다중 증폭의 형광 검출법

본 38개 멀티플렉스 설계는 실시예 1 및 2의 STR 유전자좌 및 아멜로게닌, 실시예 3의 D6S1043 유전자좌, 및 추가 Y 염색체 STR 유전자좌 11개를 포함한다.

Y 염색체 유전자좌는 남성 대 남성 유전을 조사할 때 친족 관계를 결정하는데 효과적이다. 결합된 상염색체 STR 및 Y STR 멀티플렉스는 이러한 다차원 분석에 추가적인 유용성을 제공한다. 이러한 Y STR 유전자좌는 다른 관계들 중 남성 대 남성 가계에 관계된 삼촌 관계, 조부-손자 관계, 남성 사촌 관계 및 동일 아버지로부터의 남성 이복 형제 관계를 정하는데 이용될 수 있다. Y STR은 여러 세대 기간 동안 친족 관계를 정하는데 사용되어 왔다. 이들은 매개하는 남성 친척이 분석에서 누락된 경우 두 사람의 분석에 특히 도움을 준다 (조카의 아버지인 삼촌의 남형제로부터의 시료를 얻지 못한 삼촌과 조카). 또한 이들은 부계의 지리적 조상 결정에 사용될 수 있다는 점에서 추가적 가치를 제공한다. 따라서, 이러한 유전자좌는 수사 분석 및 친족관계 결정에 매우 유용하다.

본 실시예는 유전자좌의 증폭된 세트의 산물에 표지하기 위한 8가지 표지제 사용을 포함한다. 본 발명은 각 염료 표지제로 생성된 증폭 산물을 별개적으로 분리 검출하는 능력을 제공한다.

도 6은 유전자좌의 증폭된 세트 산물을 표지하기 위해 8개 염료를 사용하는 설계를 나타낸다. 유전자좌 D3S1358, D19S433, D2S1338, D22S1045 및 펜타 B는 염료 1로 표지되고, TH01, D18S51, D1S1656, D10S1248, D2S441, 및 펜타 C는 염료 2로 표지되고, D16S539, vWFA31, D21S11, D12S391, 아멜로게닌 및 펜타 D는 염료 3으로 표지되고, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, CSF1PO 및 펜타 E는 염료 4로 표지되고, D8S1179, FGA 및 SE33는 염료 6으로 표지되고, DYS391, D6S1043, DYS439, DYS389II, DYS19 및 DYS392은 염료 7로 표지되고, 그리고 DYS393, DYS389I, DYS390, DYS385, DYS437 및 DYS438는 염료 8로 표지되었다. 크기 표준은 염료 5로 표지하였다.

다중화 시스템 내에서 아멜로게닌을 더한 38개 STR 유전자좌의 포함은 이전에 개발된 STR 멀티플렉스 세트에 비해 상당한 복잡성을 추가한다. 76개 이상의 프라이머를 혼합에 포함하여 변인물 생성이라는 해로운 결과 없이 동시 공동 증폭을 하게한다. 8개의 별도 염료 표지제가, 적은 수의 유전자좌가 이들과 증폭되어 크기가 제한된 고분자량 앰플리콘을 허용하게 되도록 통합된다. 따라서, 차례로, 증폭 산물의 보다 신속하고 정확한 분리를 허용한다.

실시예 5

유전자좌 선별 및 멀티플렉스 설계

STR 유전자좌는 미국과 유럽의 데이터베이스에서 이용이 허가된 것들을 주로 기반으로 하여 27개 유전자좌 멀티플렉스 분석에 포함하기 위해 선별하였다. 이들 유전자좌는 표 5에 나열되었고, 13 CODIS 코어 STR 유전자좌 (Budowle et al. Population Data on the Thirteen CODIS Core Short Tandem Repeat Loci in African-Americans, US Caucasians, Hispanics, Bahamians, Jamaicans, and Trinidadians. J Forensic Sci. 1999;44:1277-86), 유럽 표준 12개 STR 유전자좌 (이들 중 7개는 CODIS 유전자좌와 중복), 아멜로게닌 유전자좌, 오스트리아 데이타베이스에서 사용되는 D2S1138 및 D19S433 유전자좌 및 독일 데이타베이스에 사용되는 SE33 유전자 (Parson et al. Efficient DNA database laboratory strategy for high through-put STR typing of reference samples. Forensic Sci Int. 2001;122(1):1-6; Schneider. Expansion of the European Standard Set of DNA Database Loci-the Current Situation. Profiles in DNA. 2009;12(1):6-7)를 포함한다. 또한, 확장된 CODIS 코어 STR 세트에 최근에 포함이 제안된 펜타 D, 펜타 E 및 DYS391 유전자좌 (Hares. Expanding the CODIS core loci in the United States. Forensic Sci Int Genet. 2012;6(1):e52-4), 중국에서 통상적으로 사용되는 D6S1043 유전자좌 및 큰 길이 반복 길이 용으로 추가적인 펜타누클레오티드 유전자좌도 포함된다.

반복적인 프라이머 설계 및 테스트에 필요한 27개 유전자좌의 공동 증폭을 허용하는 멀티플렉스 설계 생성. 법의학적 샘플 추출물은 때때로 그것의 길이보다 길지않은 큰 DNA 샘플을 포함하기 때문에 증폭된 산물은 500개 미만 염기를 갖는다. 각각의 유전자좌에 대한 최소 및 최대 앰플리콘 길이 필요치는 각 유전자좌에 이용가능한 NIST STRbase 데이터와 NCBI DNA 서열의 검토로 결정되었다. (National Center for Biotechnology Information Homepage: National Institute for Standards and Technology Homepage). 몇 가지 경우에서, 앰플리콘 범위는 시판 키트의 도입에 따라 발견된 새로운 대립 유전자로서 시판 대립 유전자 사다리로 표시되는 범위에 비해 본 멀티플렉스는 실질적으로 확장되었다. 본 실시예에 기재된 멀티플렉스에 11개의 추가 유전자좌를 포함하고 각 유전자좌의 설계된 앰플리콘 범위가 확장됨에도 불구하고, 27개 멀티플렉스 분석은 인접한 유전자좌에 대한 대립 유전자의 가능한 중복 4가지 만을 가지는데, 이것은 매우 희귀한 대립 유전자에서만 나타난다. 이것은 6쌍의 이웃 유전자좌의 중첩 가능성이 있는 아이덴티필러 키트, 및 8개를 갖는 파워플렉스 16 시스템에 비해 유리하며, 이 둘은 27개 유전자좌 분석과 비교하여 유전자좌-대-유전자좌 중복을 많이 갖아 낮은 STR 유전자좌 크기 범위합 및 멀티플렉스 밀도를 갖는다.

선택된 유전자좌에 대해 다수의 유전자좌 및 확대된 앰플리콘 크기 범위를 도모하기 위해, 6개 형광 염료가 PCR 프라이머를 표지하기 위해 사용되었다. 멀티플렉스 설계는 도 7에 회로 형식으로 나타내었다. 도 7은 27개-유전자좌 멀티플렉스 설계를 보여준다. 모든 27개 유전자좌에 대한 대립 유전자로 표현되는 증폭 산물의 대략적인 크기 범위는 크기 마커 위에 표시된다. 각 크기 마커 단편은 그들이 대응하는 염기 사이즈를 보여준다. 각 앰플리콘을 표지하기 위해 사용된 형광 염료는 각각의 유전자좌 이름 옆에 표시한다. 다음의 유전자좌 약자; A=아멜로게닌, D10=D10S1248, D22=D22S1045, Y=DYS391이 사용되었다.

표 5. 선별된 유전자좌

실시예 6

5, 6, 및 8색 광학 검출 및 전기영동 기기

실시예 1의 증폭 산물은 넷바이오의 진벤치 (NetBio's Genebench-FX™)를 사용하여 분리 및 검출되었다. 이 기기는 STR 분석, DNA 시퀀싱 및 SNP 형질 결정을 위해 개발되고 최적화되었으며, 실험실과 현장에서의 선행 활용을 위해 내구성을 높여왔다. 이는 기스 등의 문헌 "전통적 미세유체적인 단기 일렬 반복 분석을 위한 다중화 중합 효소 연쇄 반응 (Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96), 출원의 전체내용을 참조로서 포함하는 미국 출원 번호 11/132,712의 표제 "핵산 및 단백질의 내구성 분석 장치 (Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins)"; 미국 출원 번호 12/080,745의 표제 "플라스틱 미세 유체 분리 및 검출 플랫폼 (PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS)" 미국 출원 번호 12/080,751의 표제 "통합된 핵산 분석 (INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS)"; 및 미국 출원 번호 13/044,485의 표제 "단일 바이오칩 (UNITARY BIOCHIPS)"에 기재되어 있다. 증폭 산물 2.7μL, 포름아미드 9.87μL 및 CC5-ILS 1.02μL (내부 레인 기준, 프로메가 코포레이션 (Promega Corporation), 카달로그)가 첨가되었다. 샘플은 분리 바이오칩에 적재되어 90초간 350V/cm의 전기장을 인가하여 전기영동적으로 분리 채널쪽으로 이동시켰다. 이것은 DNA 단편을 분리하기 위한 분리 채널을 따라 150V/cm의 전기장을 인가함으로써 수반되었다. 모든 분리는 50℃에서 수행되었다. 분리된 산물에 부착하는 염료는 고체레이저 (480nm)로 여기되고, 형광물질은 다이크로익 (dichroic) 및 대역필터 (bandpass filter)로 분리된 파장이고, 5개의 광전자증배관 (photomultiplier tube) 세트로 검출된다. 결과 프로파일은 각각의 염료에 의해 나타나는 단편을 표시하기 위해 데이타 처리 및 색 분리 소프트웨어로 수행된다.

진벤치 (Genebench) FX 기기는 선행 적용 분야에 내구성이 있고, 낮은 전력 소비 및 낮은 저전압 지침 (Loww Voltage Directive) 73/23/EEC에 따라 CE 표기된다. 분리 및 검출을 수행하기 위해, 미세유체 바이오칩을 기기의 챔버에 배치한다. 바이오칩 챔버는 바이오칩에 고전압, 여기 및 검출, 및 열 서브시스템의 결합을 제공한다. 전극 기판 세트를 통해 고전압이 바이오칩에 인가된다. 기기와 바이오칩 사이의 접촉은 칩 챔버의 표면 위를 포고 핀을 연결함으로써 달성된다. 고전압 서브시스템은 분리 채널에 인가되는 10KV까지 허용되고, 선택적으로는 샘플 적재 채널에 인가되는 최대 1.5KV까지 허용된다. 샘플은 공기압을 사용하여 분리 채널에 적재될 수도 있다. 사전 프로그래밍된 스크립트는 스위칭 환경설정, 전압 수준 및 전원 공급의 타이밍을 조절하는 것으로 자동화 공정을 허용한다. 저항성 호일 히터 세트가 바이오칩의 정확하고 지속적인 가열을 제공하기 위해 바이오칩 챔버 내의 히터판에 장착된다.

레이저, 검출기, 및 광학 트레인을 포함하는 광학 시스템은 바이오칩의 여기 및 검출창에 분리 채널을 따라 전기영동적으로 이동한 염료 표지된 DNS 분자의 레이저 여기 및 형광 검출을 제공한다. 광학 여기는 200mW, 488 nm 레이저로 수행된다. (Coherent, Santa Clara, CA). 다색 검출은 다이크로익 거울, 대역필터 (오메가 옵티칼, 브래틀보로, VT), 및 5-광전자배증관 (PMTs) (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) 세트로 수행된다. 렌즈 세트, 검류계 및 10배 대물렌즈가 레이저 및 검출기 용으로 바이오칩을 구성한다. 검출은 첫번째 채널을 여기시키도록 고정하고 이 채널로부터 형광물질을 일정시간 동안 수집하는 단계별 응시 분석법을 이용하여 수행되며, 검류계는 인접한 채널으로부터 형광 물질이 여기되고 수집되도록 장착되고, 이러한 과정은 바이오칩 내의 모든 채널이 통합될 때까지 반복된다. 단일 또는 다색 정량 외에도, 본 광학 구성은 4-색 DNA 서열 분석, 1,5-색 SNP 분석, 및 4 및 5색 다중화된 DNA 단편 크기 분석을 수행할 수 있다.

6- 및 8색 반응의 증폭된 산물은 진벤치 FX 광학 부품의 보완을 기초로 한 기기에서 분리된다. 이러한 접근법은 표제 "통합된 핵산 분석 (Interated Nucleic Acid)"의 미국특허 8,018,593에 기재되었다. 보완된 기기는 진벤치 FX 기기의 다이크로익 거울, 대역 필터 및 별개의 광전자증배관을 재배치 하여 분산격자 및 선형 배열 검출기를 갖는 분광기를 포함하는 검출 시스템의 개발에 기초한다.

다음과 같은 사양을 갖는 분광기 (도 8a)가 선택되었다 :

· 수차 보정된 오목 홀로그램 격자. 이러한 격자 설계는 단일 광학 설비를 갖는 분광기를 허용한다.

· 고정 격자 마운트. 격자는 분광기 내에 견고하게 장착되고 그 자리에 고정된다. 파장 교정을 위한 격자 방향 조절은 격자 마운트에 고정 나사를 풀고 격자를 회전시킴으로써 수행된다. 격자를 견고하게 장착하면 분광기의 내수성이 향상된다.

· 초점거리. 100mm의 초점 길이 분광기는 최소한의 면적을 유지하면서 해상도 요구치 (1 내지 5 nm 정도)를 모두 만족하도록 선택된다.

· 핀홀. 분광기 입구에 1.0mm의 핀홀은 최대한의 빛 수집 및 배경 조명 감소를 허용한다.

· 출력 창. 32mm X 10nm의 출력창은 분리된 파장의 빛이 선형 배열 검출기에 상이 맺히는 것을 허용한다.

· 감지기 장착. 네 개의 나사 구멍은 선형 배열 검출기를 장착하기 위한 분광기의 출력창에 배치한다.

수차 보정 오목 홀로그램 격자는 분광기로 사용하기 위해 선택되었다. 격자 사양은 다음과 같다:

· 평면 상면. 본 격자는 선형 배열 검출기 위로 직접적인 상맺힘을 위해 평면 위에 입구 슬릿으로부터 빛을 시준 및 집중시킨다 (도8b).

· 크기. 42.4 X 42.4nm 격자는 최대 맺힘을 허용한다.

· 홈 밀도. 1200홈/mm 격자는 필요한 파장대 및 해상도를 허용한다.

· 불꽃 파장. 450㎚의 불꽃 각도는 가식 범위에 집중되는 최대 격자 효율을 달성하기 위해 선택된다.

· 분산. 홈 밀도에 의해 정의된 바와 같은 7㎚/mm 분산이 달성된다. 이는 출력에서 32nm의 상면을 통해 상이 맺히는 224nm의 파장대를 허용한다.

· 파장대- 350 내지 850㎚의 파장대는 가시 염료의 방출 스펙트럽 (520 내지 700nm의 범위), 및 파장 보정을 위한 레이저 방출 (488 및 514 nm)의 검출을 허용한다.

진벤치 FX의 광학 바닥판은 통합된 파장 분리 및 검출 모듈을 도모하도록 보완되었다. 장착 브래킷은 바닥판에 통합된 검출 모듈을 장착하기 위해 설계되고 제조되었다. 통합 검출 모듈은 입력 포트의 위치가 진벤치의 검출 통로 길이를 유지하도록 상기 바닥판 위에 위치한다. 맞춤 설계 및 제작된 마운트 위의 거울은 바닥판 위에 설치된다. 거울은 기기가 통합 파장 모듈이나 여기 필터 및 이산 PMT를 갖는 작동에 의해 용이하게 구성될 수 있도록 한다 (도 8c). 이러한 광학 구성의 변경으로 도 8d에 표시한 빔패스(beampath)가 나타난다.

일부 구체예에서, 총 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35, 40개 이상의 형광 염료가 프라이머를 표지하기 위해 사용된다. 분광기, 격자, 검출기 및 레이저의 다양한 구성 및 조합은 이러한 다수의 형광 염료로부터 형광물질을 생성하고 수집하는데 적용할 수 있다. 격자 파라미터의 사양은 파장대를 허용하고, 중심파장은 파장대 및 중심 파장을 나타낸다. 염료의 최대 개수는 격자의 파장대를 확장함으로써 검출될 수 있다. 파장대를 압축하면 높은 파장 해상도를 얻을 수 있다. 파장대를 보다 낮은 파장으로 옮기면 자외선 염료의 검출이 가능하게 되는 반면, 파장대를 보다 긴 파장으로 옮기면 근적외선 및 적외선 염료의 검출을 가능하게된다. 격자를 이용하여 중심 파장 및 파장대를 모두 조정할 수 있으면 UV, 가시, 근적외선 및 적외선 염료의 검출을 할 수 있다. 다중 분광기, 격자 및 검출기 모듈은 많은 수의 염료의 검출을 도모하는 광범위한 파장대 및 높은 파장 분해능을 달성하기 위해 동시에 시행될 수 있다. 본 구성에서 들어오는 형광 물질은 다이크로익 거울로 분산시키고 분산된 빛의 각 부분은 분광기, 격자 및 검출기 모듈 중 하나 위에 입사된다. PMT, 어밸란시 포토다이오드 (avalanche photodiode)를 포함하는 선형 검출기 모듈의 적절한 선택은 형광물질의 효과적인 검출을 허용한다.

일반적으로, 장파장 여기가 근적외선 및 적외선 염료로부터 형광물질을 생성하는데 보다 효과적인 반면, 단파장 여기는 UV 및 가시광선 염료로부터 형광물질을 생성하는데 보다 효과적이다. 많은 수의 염료로부터 동시에 검출할 수 있기 위해, 다수의 레이저 공급원으로부터의 다수의 레이저 여기 파장이 동시에 사용될 수 있다. 가시광선의 광파장대 및 외파장의 범위를 활용하여, Cy7 및 Cy7.5 (각각 773 및 808nm) 및 800 내지 900nm의 최대 파장을 가진 적외선 염료와 같은 염료의 넓은 범위와 매치되는 광학 시스템은 프라이머를 표지하는데 유용하게 쓰이는 형광 염료를 가능케 한다.

실시예 7

염료 선택

6개 염료 멀티플렉스 개발을 위한 형광 염료의 선택에서, 작용하는 5개 염료 세트는 정해졌고, 새로운 염료 후보들은 본 콜렉션의 역량에 대해 평가되었다. 표 6의 상단 부분에는 염료 FAM, JOE, TMR, CXR, 및 CC5의 세트를 각 염료의 여기 및 방출 파장 최대값과 함께 나열하였다.

표 6. 멀티플렉스 세트에 포함되는 형광 염료의 예

* Exc _max : 최대 여기 파장 (나노미터)

** Em _{max :} 최대 방출 파장 (나노미터)

도 9는 디라이트(DyLight) 633를 더하여 5개 코어 염료 각각으로 관찰되는 방출 파장을 도시한다. 이들 6개 염료를 이용하여, 염료의 각 인접 쌍 사이에 4개 이상의 분광기 채널 분리로 뚜렷하게 각 염료를 검출할 수 있었다. 이러한 분리양은 6개 모든 색의 완전한 분리를 가져오는 색 보정 매트릭스를 생성하도록 한다. 아토(ATTO) 488로 표지된 생성물은 동일한 생성물의 FAM으로 표지된 경우보다 더욱 강력한 출력 방출을 나타낸고, 이둘 염료 모두는 동일한 파장에서 방출하고, FAM 염료는 멀티플렉스 세트에서 아토488 염료와 대체되었다.

실시예 8

8색 염료 검출 및 분리

8개 형광 염료로 표지된 STR 산물의 동시 분석을 위해 보완된 광학 시스템의 유용성이 평가되었다. 선택된 8개 염료는 실시예 7에서 논의한 것들에 590nm의 최대 방출 파장을 갖는 리사민-로다민 (lissamine-rhodamine) 염료 및 627nm의 최대 방출 파장을 갖는 아토594 염료를 더한 것이다. 본 형태를 실험하기 위해, 분별된 크기의 증폭 산물이 표지되지 않은 프라이머 하나 및 8개의 상이한 형광 염료 중 하나로부터 각각 선택된 표지제로 표지된 프라이머 하나로 구성되는 각 프라이머 쌍을 갖는 8개의 분리된 프라이머 쌍을 위해 생성되었다. 중첩되는 스펙트럼 신호들을 해결하기 위해 색 보정 매트릭스의 개발 및 적용에 따라, 선명한 신호가 사용된 염료의 각각에 대해 수득되었 (도 10).

실시예 9

모노플렉스(Monoplex) 및 미니플렉스(Miniplex) 실험

멀티플렉스 구성은 많은 단계에서 발생하고, 일반적으로 모노플렉스로부터 유전자좌의 몇몇 코어 세트 구축하고 본 발명의 이전 연구에 기재한 바와 같은 세트를 기본으로 구축하는 것을 따른다(Krenke et al. Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci. 2002;47(4):773-85; Lins et al. Development and population study of an eight-locus short tandem repeat (STR) multiplex system. J Forensic Sci. 1998;43(6):1168-80; Lins et al. Multiplex Sets for the Amplification of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci--Silver Stain and Fluorescence Detection. BioTechniques. 1996;20(5):882-9). 첫째, 각 개별 유전자좌의 모노플렉스 증폭을 위한 프라이머 쌍은 재료 및 방법 (Materials and Methods)에 기재한 바와 같이 설계되었다. 모노플렉스 성능은 FAM, JOE, CXR 및 ROX의 염료 세트로부터 선택된 형광 염료로 표지된 각 프라이머 쌍의 하나를 갖는 순방향 프라이머 0.5㎛ 및 역방향 프라이머 0.5㎛를 사용하여 시험하였다.

상당의 변인물을 생성하지 않고 강력한 증폭 산물을 생성하는 프라이머 쌍 그룹 (STR 유전자좌에 의해 나타나는 전형적인 스터터 및 불완전 비주형 추가 (iNTA)를 제외하고)은 4개 내지 6개 유전자좌를 위한 프라이머 쌍의 작은 세트(즉, 미니플렉스(들)) 동시에 시험하기 위해 결합되었다 (데이타는 표시하지 않음). 대부분의 경우에, 예상치 못한 증폭된 유전자체 서열 (즉, 변인물)이 공동 증폭에 의해 생성되지 않았다. 일부 세트에서 변인물이 나타났고, 이러한 결과는 프라이머 재설계 및 갱신 모노플렉스 실험을 필요로 했다. 프라이머의 개별 쌍 단위 조합물의 증폭 산물의 분석은 변인물 생성에 관여된 프라이머를 보여준다. 모노플렉스 평가를 통해 재설계된 프라이머는 이후 단계에서 전체 멀티플렉스에 이용하기 위한 보다 강한 추천 조합을 식별하기 위해 작은 멀티플렉스 형식으로 재시험된다. 변인물 단편을 생성하는 조합을 포함하는 본 발명 중 임의의 단계에서의 실패한 시도들로 인해 모노플렉스 및 멀티플렉스 단계 둘 모두에서 시험하는 모노플렉스 유전자좌 단계에서 재설계해야 한다.

실시예 10

변인물(artifact) 감소 또는 제거: iNTA

STR 유전자좌 증폭은 종종 스터터 변인물을 발생한다. 이러한 변인물은 일반적으로, 그러나 항상은 아니지만, 하나의 반복 길이 진본 대립 유전자보다 짧은 하나의 반복 길이이다 (Klintschar et al. Polymerase slippage in relation to the uniformity of tetrameric repeat stretches. Forensic Sci Int. 2003;135(2):163-6; Shinde et al. Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi.likelihood analysis:(CA/GT) n and (A/T) n microsatellites. Nucleic Acids Res. 2003;31(3):974-80). 따라서 본 발명을 위해 국내 및 국제 데이터베이스용으로 선별된 유전자좌는 표준 카피수 평가 하에 단일 공급원 샘플의 DNA를 프로파일하는 동안 진짜 대립 유전자와는 구별될 수 있는 많은 양의 스터터를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

주형-의존적 중합반응 후에 불완전한 비주형 누클레어티드 첨가는 STR 증폭 산물에서 일반적으로 발견되는 2차 변인물이다. (Clark . Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1988 Oct 25;16(20):9677-86; H. DNA Polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' of a DNA fragment. DNA and Cell Biology. 1993;12(8):763-70; Magnuson et al. Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning. BioTechniques. 1996 Oct;21(4):700-9)16). 이러한 변인물은 원래의 대립 유전자보다 작은 2차 단편 1개의 염기로 나타난다. 그것의 존재는 일반적으로 원래의 대립 유전자의 최대 높이를 낮추고 하나의 대립 유전자를 나타내는 두개의 단편 모양으로 혼란을 초래할 수 있다. 초기 프라이머 설계에서 전체 주형 첨가를 수행하지 않는 경우, 브라운스테인이 추천한 DNA 서열 5'-GTTTCTT-3'이 보다 완벽한 비주형 첨가를 촉진하기 위해 한 쌍의 프라이머 쌍 중 표지되지 않은 프라이머의 5' 말단에 첨가된다 (Brownstein et al. Modulation of non-templated nucleotide addition by Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. BioTechniques. 1996 Jun;20(6):1004-6, 8-10). 몇몇 경우에서, 5-말단-G 첨가만 동일한 효과를 달성하기 위해 시험되었다. 몇몇 경우중에 다른 방법은 비표지된 프라이머의 대체 5'말단을 생성하기 위해 프라이머 쌍 중 표지 및 비표지된 프라이머를 바꾸는 것이었다. iNTA 감소의 실시예는 도 11에 도시한다.

도 11a는 iNTA를 줄이기 위해 GTTTCTT 꼬리 첨가를 설명한다. 상단 패널은 비표지된 프라이머의 5'-말단에 5'-GTTTCTT-3' 서열 꼬리를 첨가하지 않고 D18S51 프라이머 쌍 증폭 산물을 나타낸다. 하단 패널은 보완된 프라이머 쌍을 사용한 생성물을 보여준다. 이러한 보완은 상단 패널의 약 150 %로부터 하단 패널에 10% 미만의 iNTA를 감소시킨다. 또한, 단편 길이는 증가하였다. 도 11b는 iNTA를 줄이기 위해 비표지된 프라이머의 5-말단에 G-꼬리 첨가를 설명한다. 상단 패널은 비표지된 프라이머의 5'-말단에 5'-G-3' 서열 꼬리를 첨가하지 않고 D2S441 프라이머 쌍 증폭 산물을 나타낸다. 하단 패널은 보완된 프라이머 쌍을 사용한 생성물을 보여준다. 이 변경은 상단 패널의 약 90 %로부터 하단 패널에 10 % 미만의 iNTA를 감소시킨다. 또한, 단편 길이는 증가하였다. 도 11c는 iNTA를 줄이기 위해 프라이머 쌍 내에 역방향의 표지된 프라이머의 생성물을 보여준다. 상단 패널은 원래의 ROX 염료 표지 계획에 따른 D8S1179 프라이머 쌍 증폭 산물을 나타낸다. 하부 패널은 ROX -표지된 프라이머 쌍과 반대 프라이머를 사용한 생성물을 나타낸다. 이러한 변경은 상단 패널의 약 80 %로부터 하단 패널에 10% 미만의 가시가능한 iNTA를 감소시킨다. 이것은 정확한 단편의 길이는 바꾸지 않았으나, 정확한 단편에서 이러한 변경은 증폭된 산물에서 서열의 변화에 따라 발생할 수 있다.

iNTA만 아니라 핵산과 프라이머의 의도치 않은 상호 반응으로 인한 스터터, 및 앰플리콘을 포함하는 STR 변인물은 프라이머 서열 뿐만 아니라 PCR 반응 조건과 관련있다. 효소, 완충용액, 및 순환주기 시간 및 온도 (및 기기 구동 온도 승온 속도)는 변인물 생성과 감소에 큰 영향을 줄 수 있다. 개별 앰플리콘의 상대 신호 강도도 이러한 요인들에 영향을 받을 수 있다. 따라서, STR 다중체를 개발함에 있어 상기의 앰플리콘 조건 세트에 기초하여 프라이머의 최적화를 고려하는 것이 중요하다. 예를 들어, 90분 PCR 반응을 위한 최적의 다중체는 20분 PCR 반응에서 비슷한 성능에 대한 수정이 필요할 수 있다.

실시예 11

멀티플렉스 증폭 산물로부터 변인물 제거

증폭 변인물은 프라이머 설계에서 포함된 프라이머의 1개 이상에 대해 의도한 하이브리드화 표적이 아닌 유전적 서열과, 표지된 1개 이상의 프라이머 2개의 의도치 않은 상호 반응으로부터 발생한다. 이러한 변인물은 변인물 생성에 관여된 프라이머를 우선 식별하므로 제거할 수 있다. 이것은 특정 변인물의 제거로 특이적 프라이머의 제거를 결부시키기 위해 전체 멀티플렉스로부터 한번에 하나의 프라이머 또는 프라이머 쌍을 제거함으로써 달성할 수 있다. 변인물 생성에 대한 후보 프라이머가 식별되면, 두개의 후보 프라이머는 변인물 생성에서 그들의 역할을 확인하기 위해 다른 프라이머의 부재하에 샘플을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 재실험에 따른 하나 또는 두 프라이머의 재설계는 종종 모든 멀티플렉스 유전자좌의 증폭을 유지하는 동안 인공물(들)을 제거한다. 멀티플렉스 내의 다수의 유전자좌의 표현을 재조정하는 노력은 재설계된 프라이머를 멀티플렉스 프라이머 세트에 포함해야 한다.

도 12a, 12b, 및 12c는 5색 진벤치 (GeneBench) FX 검출기로 6-색 증폭 생성물의 검풀을 나타낸다. DL633-표지된 샘플 증폭 단편과 CC5-표지 크기 단편은 동일한 PMT 채널에서 검출된다. 도 12a는 변인물 생성의 두가지 경우를 도시한다. ATTO488으로 표지된 비교적 약한 단편은 107 염기 (B107)에 위치하고, 193개 염기(B193) 위치 주변 ATTO488 표지된 단편을 주시하라. 도 12b의 왼편에 이들 동일한 변인물을 확대하여 설명하였다. 도 12b의 오른편은 보완된 서열의 프라이머로 두개의 개별 프라이머를 교체한 것에 따른 증폭을 표시한다. 도 12c는 프라이머 교체에 따른 샘플 증폭 산물 균형유지 나타낸다.

실시예 12

증폭 산물 강도를 개선하기 위한 염료 선택

여러 다른 방법이 다중체 증폭 맥락에서 개별 유전자좌로부터의 증폭 산물 강도를 증가하기 위한 시도로 이용될 수 있다. 예를 들어, 새로운 유전 서열을 결합하거나 보다 안정한 하이브리드화를 제공하기 위한 프라이머 재설계가 수행될 수 있다. 선택적으로, 유전자좌에 대한 프라이머의 프라이머 농도 증가 또는 감소는 다른 유전자좌에 대한 생성물 강도를 변경할 수 있다. 때로는 다른 유전자좌에 대한 프라이머의 프라이머 농도 또는 전체 혼합 프라이머 농도의 변경은 증폭 산물 강도를 변경할 수 있다. 낮은 어닐링 온도 또는 보다 많은 증폭 순환주기 등을 포함하는 절차의 변경은 또한 상태 증폭 산물의 생성을 변경할 수 있다. 재료 및 절차 상의 이러한 변화는 실시예 1에 기재되고, 도 1에 도시한 26-유전자좌 멀티플렉스 세트 내의 SE33 중폭 산물의 양을 증가시키지 않았다. 실시예 7에서의 염료 조사는 FAM 염료 사용보다 상대적으로 강한 증폭 산물 생성을 제공하는 ATTO488 염료의 사용을 나타내었다. 우리는 FAM 대신에 ATTO488로 표지된 SE33 프라이머를 재표지 하였고, 다중체 세트에서 다른 유전자좌에 비해 소정의 강한 증폭 산물 생성을 관찰하였다.

도 13에서, 각각의 패널에 표시된 증폭 산물을 생성하는 염료는 각 패널의 좌단에 표시된다. 본 도면은 강한 SE33 증폭 산물을 나타내는 26개 유전자좌의 증폭을 표시한다. 본 증폭의 ATTO488-표지된 SE33 증폭 산물과 FAM 표지된 SE33 생성물을 갖는 도 1에서 관찰되는 상대적 강도를 비교하라. 강한 표현은 ATTO488 염료로 검출된 보다 강렬한 방사로부터 파생한다. 우리는 또한 다수의 염료 세트의 내에 일정하게 잔류하는 이러한 4개의 유전자좌의 스펙트럼 검출을 보장하기 위해 FAM 표지에서 ATT0488표지로 D3S1358, D19S433 및 D2S1338의 표지된 프라이머를 변경하였다.

실시예 13

멀티플렉스 개발 전략에 따른 멀티플렉스 구축 및 결합

몇몇 미니플렉스 세트는 19-유전자좌 멀티플렉스를 생성하기 위해 각 개별 유전자좌에 대한 성공적 증폭 산물 및 결핍된 비특이적 산물 또는 변일물에 관계된 다른 프라이머 서열로 결합된다. 3개의 추가 유전자좌가 22-유전자좌 형을 만들기 위해 다른 미니플렉스로부터 첨가된 후, 남아있는 프라이머 쌍을 개별적으로 추가했다. 각각의 중간단계 미니플렉스는 프라이머-관계된 변인물을 식별하고 유전자좌-대-유전자좌 균형을 평가하고, 이웃 유전자좌의 증폭 산물이 중첩되지 않음을 확인하기 위해 시험되었다. 다수의 프라이머-관계된 변인물 각각의 프라이머의 역할은 전체 프라이머 세트로부터 1개의 프라이머 존재 또는 부재와 특정 변인물의 존재 및 부재를 상호 연관시켜 판별된다. 문제가 되는 프라이머는 이러한 후기 개발 단계에서 대부분의 문제점을 해결하기 위해 재설계되고 재실험되었다. 재시험은 동일한 색깔의 이웃 유전자좌의 대립 유전자가 중복되지 않았는지 확인하기 위해 경험적이나 이론적이지 않는 요주의 앰플리콘 범위 크기 분석법을 포함한다. 프라이머 1개 또는 두개의 5'-말단에 서열을 추가하는 크기 조정은 일반적으로 유전자좌 중첩의 경우를 해결하기 위해 사용된다. 유전자좌-대-유전자좌 균형은 세가지 상이한 접근 방법을 이용하여 조정한다: a) 입력 프라이머 농도 조절; b) PCR 증폭 반응의 어닐링 온도 조절, 및 c) 프라이머 재설계. 상기의 조절에 따라, 도 14a는 균형 유전자좌-대-유전자좌 멀티플렉스 세트를 사용하는 2.8ng의 남성 DNA 샘플을 19.5분 증폭시킨것을 표시한다. 도 14b는 여성 DNA 샘플의 6색 27-유전자좌 증폭을 표지한다. 증폭된 산물은 8색 광학 시스템을 사용하여 분리 및 검출된다.

실시예 14

보다 작은 증폭 산물을 허용하는 보다 많은 염료 혼합

5색 검출법 보다 개선된 6색 검출법 또는 8색 검출법은 인간 식별 목적 용으로 다중화 시스템의 향상된 설계를 허용한다. 인간 유골 사용의 어려움 중 하나는, 예를 들어, 일부 샘플이 분해된 DNA를 함유한다는 것이다. 이런 경우, 보다 큰 앰플리콘의 증폭이 좀더 어렵거나 불가능하게 된다. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16개 이상의 염료의 존재는 보다 작은 증폭 산물을 생성하기 위해 다중화 STR 증폭의 재설계를 가능케 한다. 이것은 결과적으로 샘플 증폭에서 높은 성공률을 허용합니다.

도 15a는 다중화 세트에 13 CODIS STR 코어 유전자좌를 포함하는 5색 설계를 표시한다. 이것은 실질적 비중첩 STR 분석을 허용하는 인접 유전자좌 사이에 70개 염기 이내의 증폭 산물이 없다는 제약과 5개 내지 10개 염기의 필요함을 가정한다. CODIS 13 STR 유전자좌는 689개 염기의 STR 유전자좌 크기 범위합으로 구성된다. 선택된 유전자좌의 유전자좌 크기 범위 및 크기 마커에 대한 하나의 색상을 준비하기 위한 요구 사항의 제약을 감안할 때, 평균 3.25 유전자좌/색은 235개 염기의 멀티플렉스 크기 범위 및 2.93 멀티플렉스 밀도를 떠나 각각의 색으로 설계될 수 있다.

도 15b는 도15a에 설계된 5색과 같은 제약 조건과 동일한 유전자좌를 포함하는 6색 설계를 나타낸다. 6번째 염료의 포함으로, 멀티플렉스 세트에 대한 크기 상한은 대략 275개 염기이다. 또한, 평균 유전자좌/색은 2.6이며, 각 색의 유전자좌의 적은 개수는 실질적 비중첩 STR 분석을 허용하는 대립 유전자의 유전자-대-유전자 중첩의 가능성을 쉽게 방지할 수 있다. 멀티플렉스 크기 범위는 205개 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 3.36이다.

도 15c는 15a에서 5색 설계 및 도 15b에서 6색 설계와 같은 제약 조건을 갖는 동일한 유전자좌를 포함하는 8색 설계를 표시한다. 8개 염료의 포함으로, 멀티플렉스 세트에 대한 크기 상한은 대략 230개 염기이다. 또한, FGA 유전자좌의 큰 대립 유전자는 일반적인 대립 유전자가 155개 염기를 초과하지 않기 때문에 매우 드물다. 대립 유전자 크기의 이러한 상당한 감소는 분해된 샘플의 전체 프로파일을 수득할 수 있는 능력을 증가시킨다. 또한, 1.86의 평균 유전자좌/색이며, 각 색 의 유전자좌들의 낮은 개수는 실질적 비중첩 STR 분석을 허용하는 대립 유전자의 유전자좌-대-유전자좌 중첩의 가능성을 보다 용이하게 방지할 수 있다. 사실, 오직 각 색의 2개의 또는 거의 없는 유전자좌 및 멀티플렉스 세트내의 6개의 인접-대-인접 유전자좌 쌍만으로 동일한 색의 유전자좌 쌍 사이의 간격이 증가된 도 15c에 도시한 바와 같이 이러한 위험을 완전히 방지할 수 있게 한다. 매우 드물고 고분자량 FGA 대립 유전자를 포함하는 본 방식의 멀티플렉스 크기 범위는 160개 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 4.31이다.

13개 STR CODIS 코어 다중체 세트의 3가지 유형의 멀티플렉스 구성, STR 유전자좌 크기 범위합, 및 멀티플렉스 밀도는 표 7로 비교한다.

표 7. 멀티플렉스 세트에서 13-STR CODIS 코어 유전자좌의 비교

실시예 15

24개 유전자좌 23-STR 공식 유전자좌 멀티플렉스

증가된 멀티플렉스 밀도를 갖는 멀티플렉스 디자인은 다중 증폭 분석법에서 보다 큰 효율성을 제공한다. 이러한 접근 방식은 작은 크기의 범위에서 다형성 유전자좌의 보다 많은 대체 형태의 평가를 허용한다. 따라서, 이 방법은 많은 정보가 수득되고록 하고, 수득된 정보로부터 보다 강한 추론이 만들어지도록 한다.

도 16은 다음의 23개 유전자좌; D3S1358, SE33, D6S1043, TH01, D18S51, D1S1656, D19S433, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, D2S1138, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179, 및 D10S1248 포함 아멜로게닌 유전자좌의 동시 공동 증폭 방법을 나타낸다. 본 멀티플렉스 설계의 STR 유전자좌 크기 범위합은 1286이고, 멀티플렉스 크기 범위는 340개 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 3.78이다.

실시예 16

23개 유전자좌 22개 STR 유전자좌 멀티플렉스

증가된 멀티플렉스 밀도를 갖는 멀티플렉스 디자인은 다중 증폭 분석법 보다 큰 효율성을 제공한다. 이러한 접근 방식은 작은 크기의 범위에서 다형성 유전자좌의 보다 많은 대체 형태의 평가를 허용한다. 따라서, 이 방법은 많은 정보가 수득되고록 하고, 수득된 정보로부터 보다 강한 추론이 만들어지도록 한다.

도 17은 다음의 23개 유전자좌; D3S1358, D6S1043, TH01, D18S51, D1S1656, D19S433, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, D2S1138, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179, 및 D10S1248 포함 아멜로게닌 유전자좌의 동시 공동 증폭의 방법을 나타낸다. 본 멀티플렉스 설계의 STR 유전자좌 크기 범위합은 1136개이고, 멀티플렉스 크기 범위는 300 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 3.79이다.

실시예 17

22개 유전자좌 21-STR 형식 유전자좌 멀티플렉스

증가된 멀티플렉스 밀도를 갖는 멀티플렉스 디자인은 다중 증폭 분석법 보다 큰 효율성을 제공한다. 이러한 접근 방식은 보다 작은 크기의 범위에서 다형성 유전자좌의 보다 많은 대체 형태의 평가를 허용한다. 따라서, 이 방법은 많은 정보가 수득되고록 하고, 수득된 정보로부터 보다 강한 추론이 만들어지도록 한다.

도 18은 다음의 23개 유전자좌; D3S1358, D6S1043, TH01, D18S51, D1S1656, D19S433, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, D2S1138, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179, 및 D10S1248 포함 아멜로게닌 유전자좌의 동시 공동 증폭의 방법을 나타낸다. 본 멀티플렉스 설계의 STR 유전자좌 크기 범위합은 1072개이고, 멀티플렉스 크기 범위는 292 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 3.67이다.

실시예 18

2개 유전자좌 20-STR 형식 유전자좌 멀티플렉스

증가된 다중체 밀도를 갖는 멀티플렉스 디자인은 다중 증폭 분석법 보다 큰효율성을 제공한다. 이러한 접근 방식은 작은 크기의 범위에서 다형성 유전자좌의 보다 많은 대체 형태의 평가를 허용한다. 따라서, 이 방법은 많은 정보가 수득되고록 하고, 수득된 정보로부터 보다 강한 추론이 만들어지도록 한다.

도 19는 다음의 23개 유전자좌; D3S1358, D6S1043, TH01, D18S51, D1S1656, D19S433, D2S441, D16S539, VWA, D21S11, D12S391, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, TPOX, D2S1138, D22S1045, DYS391, FGA, D8S1179, 및 D10S1248 포함 아멜로게닌 유전자좌의 동시 공동 증폭의 방법을 나타낸다. 본 멀티플렉스 설계의 STR 유전자좌 크기 범위합은 1044이고, 멀티플렉스 크기 범위는 278 염기이고, 멀티플렉스 밀도는 3.76이다.

실시예 19

6개 색 SNP 분석

6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 14개, 16개 또는 24개 이상 색 검출은 다른 사람의 사이에서 인간 및 동물 식별, 임상 수의학 진단, 생물학적 무기 위험진단, 식품안전, 및 산업용 시험 목적을 위해 향상된 설계를 허용함으로써, SNP 시험과 같은 비-STR 평가를 향상시킨다. 특히, 보다 적은 생성물은 STR 멀티플렉스 분석을 위해 상기 언급한 바와 같이 보다 많은 염료와 구별된다. 선택적으로, 보다 많은 염료가 사용될 때, 보다 많은 유전자좌가 동일한 크기 범위 제약 내에서 시험될 수 있다. 일반적으로, 염료의 개수가 증가하면, 단일 샘플 및 단일 검출 레인에서 보다 많은 정보를 더 얻을 수 있다.

본 실시예에서, 우리는 인간의 홍채 색상을 결정하는 6개 SNP를 분석하기 위해 6개 염료 사용 설명한다. 앞서, 월쉬에 의해 발표된 분석법 (Walsh et al. (2011, Iris IrisPlex: A sensitive DNA tool for accurate prediction of blue and brown eye color in the absence of ancestry information. Forensic Science International: Genetics 5: 170-180.)은 각각의 증폭된 PCR 산물 내에 하나의 개별 염기의 존재를 알아내기 위한 단일 염기 신장 분석법 (Chen et al. 3003, Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost, and throughput, The Pharmacogenomics Journal 3: 77-96)에 따라 인간 DNA 샘플의 6 영역의 증폭을 기초로 하였다. 시험은 크기 마커 용으로 지정된 5개 색상 중 하나와 함께 5-염색 분석법으로 실시하였다. 6개의 관심 위치 각각에 대한 2개의 잠재적인 대체 SNP 생성물, 즉 12개 잠재적 생성물,은 모두 24 내지 52 염기의 생성물 크기 범위에서 4색으로 검출되었다. 본 발명의 6색 염료 접근 방법으로 인해, 단일 염기 신장 생성물 범위가 예를 들어 48개 염기로 감소될 수 있었다. 단일 염기 신장 분석법에서 보다 긴 생성물을 검출하기 위해 필요한 보다 긴 올리고누클레오티드의 제조 및 정제가 어렵다는 점에서 본원에서 제안한 짧은 올리코누클레오티드에 의한 분석법은 장점을 가진다는 것을 시사한다.

본 방법을 확장에서, 다수 SNP 분석법은 단일 반응 및 검출 라인에서 정보를 얻도록 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 1000개 이상, 2000개 이상, 3000개 이상, 또는 5000개 이상의 개별 SNPs이 필요하다. 분석에 6색 시스템, 8색 시스템 또는 그 이상의 색 시스템의 포함은 현재 5색 분석에서와 동일한 크기 범위 내에서 수행될 더 많은 SNP 분석법을 허용한다.

SNP 분석에 사용되는 샘플은 PCR로 증폭된 산물을 포함하는 시료 중에 증폭 되거나 증폭되지 않는 핵산을 포함할 수 있다. 분석은 전기 영동 분리 및 검출뿐만 아니라 마이크로 배열 기반 분석법만으로 제한되지 않는다. 6개 이상의 형광 표지제는 노출 전이나 후에 적어도 3개의 SNP 유전자 다형성체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 올리고누클레오티드는 본 방법의 그들의 사용전이나, 핵산과 표지제를 통합하는 프라이머 신장 분석 과정 동안 표지될 수 있다.

SNP 분석의 여러 가지 다른 방법은 본 발명의 적용을 통해 향상될 수 있다. 한가지 방법은 핵산을 증폭시킨 후, 다르게 표지된 디디옥시 dDTPs (dideoxy-dDTPs)의 존재하에서 표지되지 않은 프라이머 (올리고누클레오티드)로 프라이머 신장을 수행하는 것이다 (Syvanen,A-C et al.1990. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotypin of apolipoprotein E, Genomics 8: 684-692.). 프라이머 신장을 수행하기 위해 다른 길이의 비표지된 프라이머를 사용하면 상이한 길이의 생성물을 생성한다. 검출을 위해 다른 염료를 사용하면 증폭된 STR 생성물이 수행하는 것과 같은 방식에서 검출 수지를 추가한다. 방법의 변형에서, 예를 들어, 데옥시-(deoty) 및 디데옥시 뉴클레오티드 (dideoxy-nucleotide) 혼합물이 포함될 수 있다.

또 다른 대체 방법은 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상의, 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 대립 유전자 특이적 하이브리드화를 포함한다(Wallace 1979. Hybriciation of syntheit oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch, Nucleic Acides Research 10:3543-3557.).

본 발명의 또 다른 구현은 1개의 비표지된 프라이머, 및 분석되어지는 각각의 SNP에 대해 동일한 (또는 거의 동일) 서열을 갖는 2개의 상이한 표지된 프라이머의 존재하에서 PCR의 이용을 포함한다 (Choi et al., 2012. Integrated allele-specific polymerase chain reaction-capillary electrophoresis microdevice for single nucleotide polymorphism genotyping. Biosens. Bioelectron. 35: 327-334.). 최대 4개까지 차등 표지된 프라이머는 드문 경우에 각 SNP 위치에 사용될 수 있다. STR 유전자좌 생성물과 동일한 방식으로 이러한 증폭 산물의 분리 및 검출은 크기 분리 또는 색상 판별이다.

SNP 분석에 적용되는 본 발명의 또 다른 구현은 표적 핵산 존재하에서 중합효소, 완충액, 디옥시누클레오티드 트리포스페이트와 디데옥시누클레오티드 트리포스페이트의 혼합물의 조합물을 사용하여 서열 프라이머 신장을 수반한다. 이과정동안, 1개 핵산 표적으로부터의 증폭 산물은 dDTPs 또는 디데옥시NTPsdp 부착된 4개의상이한 형광 염료로 표지된다(Sanger, Niclen, and Coulson, 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467). 별도의 위치에서, 두 번째 핵산 표적은 dNTPs 또는 dideoxyNTPs 중 하나에 아직 부착되지 않은 4가지 형광 염료로 표지된다. 샘플은 별도로 실행될 수 있거나, 본 발명 측면에서는 혼합된 후 분석을 위해 분리 검출된다.

적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50개 또는 그 이상의 형광 염료의 사용은 SNP 검출 방법의 큰 다양성에 적용될 수 있다. (Chen and Sullivan, 2003, Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost, and throughput. The Pharmacogenomics Journal 3: 77-96; Syvanen, 2001, Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms, Nature Reviews 2: 930-942; Kwok, 2000. High-throughput genotyping assay approaches, Pharmacogenetics 1:1-5; Kwok, 2003 Detection of single nucleotide polymorphisms, Current Issues in Molecular Biology 5:43-60; Kim et al. SNP Genotyping: Technologies and Biomedical Applications Annual Review of Biomedical Engineering, Vol. 9: 289-320, 2007; Nassir et al. An ancestry informative marker set for determining continental origin: validation and extension using human genome diversity panels, BMC Genetics 2009, 10:39).

본원에 기재된 전기영동 분리 및 광학 검출 성능의 조합으로, 법의학적 수사, 임상, 수의학, 식품 안전 및 산업용 미생물 샘플은 많은 수의 SNP를 위해 사용될 수 있다. 시퀀싱 및 본 발명의 다중화 및 기타 분석의 조합에서, SNP 분석 (높은 다중 SNP의 분석 포함)은 엄청난 양의 중요한 정보를 제공할 수 있다. 원한다면, 이러한 SNP 분석법은, 단독으로 또는 조합되어 완전히 통합된 미세 유체 시스템을 포함하는 미세유체 바이오칩에 적용할 수 있다.

실시예 20

STR 분석과 결합된 SNP 분석을 위한 6색 분석

실시예 2, 실시예 3, 실시예 5, 실시예 15, 실시예 16, 실시예 17, 및 실시예 18은 상염색체 STR 유전자좌의 개수 증가, 보다 큰 유전자좌 크기 범위 총합, 및 증가된 멀티플렉스 밀도의 동시 증폭 및 분석을 허용하는 6개 이상의 염료 사용을 기재한다. 실시예 4는 Y STR 유전자와 결합된 상염색체 STR 유전자좌 수의 증가의 동시 증폭 및 분석을 허용하는 6개 이상의 염료 사용을 기재한다. 실시예 19는 SNP 유전자좌의 개수 증가 또는 SNP 유전자좌 분석에서 멀티플렉스 크기 범위 요건을 대한 동시 증폭 및 분석을 허용하는 6개 이상의 염료 사용을 기재한다.

6개, 7개, 8개, 10개, 12개, 14개, 24개 이상 염료의 포함, 검출 및 색 분리를 허용하는 증가된 크기 범위 분석법은 상이한 마커의 유형을 동시에 분석하는데에도 사용될 수 있다. 특히, 실시예 19에 기재된 SNP-기반 홍채 검출의 증폭 산물 및 실시예 5 및 몇몇 다른 실시예에 기재된 상염색체 STR-기반 판별 분석법은 분리된 증폭 산물의 동일한 단일 채널 또는 레인에서 검출될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 동시에 신원 및 물리적 특성 분석을 결정하는데 사용될 수 있다.

다른 목적 (예를 들어, 신분감별, 친족 결정, 법의학적 조상, 물리적 특성, 전염성 질병 원인판별, 유전적 특성)을 위해, 상이한 다형성 마커 유형 (예를 들어, STR, SNP, 서열 변형), 및 상이한 염색체 유형 공급원 (예를 들어, 상염색체, X 염색체, Y 염색체, 미토콘드리아, 박테리아, 곰팡이, 식물)을 결합하는 다중 증폭은 다수의 마커 유형, 다수의 DNA 공급원, 및 여러 기능의 목적을 위해 동시에 분석될 수 있다. 이러한 유형의 다중 증폭 세트는 또한 샘플 유기체 또는 다른 핵산 GKAD 샘플 재료의 존재, 부재, 감별 또는 조건애 대한 진단 정보를 제공하는 비다형성 핵산 마커와 결합될 수 있다.

실시예 21

이중 서열 분석

DNA 서열 분석은 인간의 유전체를 구성하는 염색체 내의 4개의 다른 뉴클레오티드의 순서를 결정하기 위해 수행된다. 서열 분석의 여러 방법을 사용할 수 있지만, 기존의 인기있는 방법은 비표지된 디옥시-누클레오티드 트리포스펭트 및 형광으로 표지된 디데옥시-누클레오티드 트리포스페이트의 혼합물의 존재하에 프라이머 신장을 수행하는 생어 등에 의해 개발된 것이다(1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS 74: 5463-5467.). 4개로 차등 형광 표지된 디데옥시-누클레오티드 트리포스페이트는 각각의 염기 및 위치나 각각의 염기를 나타내는 다양한 길이에 사슬 연장을 종료한다.

8색 검출법은 분리된 산물의 단일 레인으로부터 검출 및 분리 해석을 위해 생거 서열화된 생성물의 두가지 상이한 비중첩성 염료 색 세트의 포함을 허용한다. 따라서 우리는 단일 분리 시험에서 두가지 서열화 반응으로부터 서열 산물을 검출하였다. 또한, 우리는 분리 서열의 이후의 분리, 검출 및 분석을 휘한 단일 반응 용기에서 디데옥시-누클레오티드 트리포스페이트의 비중첩 염료 색을 사용하여 두개의 상이한 DNA 영역을 서열화할 수 있다.

색의 수를 4배로 늘리면 단일 검출 레인에서 분석할 수 있는 DNA 서열의 개수가 증가한다 (예를 들어 16개 색은 4개의 서열 세트를 허용함). 염료 개수 및 분석 요구 사항을 적절하게 선택함으로써, 하나의 샘플은 방대한 양의 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 인간 샘플은 개인식별 및 친족관계 정보(예를 들어, 6색 및 STR 분석 이용), 형질형 정보 (예를 들어, 6색 추가 및 SNP 분석 이용), 및 미토콘드리아의 유전 정보 (예를 들어, 4색 및 서열화 분석 이용)을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 본 방법은 인간 개인식별 및 친족관계 분석 (예를 들어, 8색 및 STR 분석이용) 및 병원체 감별 및 치료 요법 결정 (예를 들어, 8색 및 2개의 다중 서열화 분석 이용)를 수행하는데 사용될 수 있고; 이들의 조합은 패혈증의 징후로 응급실에 데려온 감식되지 않는 개체의 혈액 샘플을 분석하는데 유용할 것이다. 세번째 경우에서, 분석은 개인식별 정보 (예를 들어, 6색 및 STR 분석 이용), 조직 유형 또는 암 단계 결정에 관계된 임상 진단 정보(예를 들어, 4개의 추가 색 및 서열화 분석 이용)을 제공할 수 있고; 이들의 조합은 조직 지증자의 신원에 대한 보증을 제공하면서 수술중 조직을 평가하는데 유용할 것이다.

상기의 활용들은 본 발명의 방법으로 가능한 분석의 많은 수의 조합 중 3개에 해당한다. 이러한 방법을 바탕으로 수행될 수 있는 분석은 개별적 분석법 및 조합 분석법을 포함하지만 핵산 증폭 (예를 들어, 단일 및 다중 엔드포인트 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 비대칭 PCR, 중첩 PCR, LATE PCR, 터치다운 PCR, 디지털 PCR, 압연 원형 증폭, 표준 변위 증폭 및 다중 변위 증폭); Y-STR 증폭; 미니-STR 증폭; 단일 누클레오티드 다형성 분석; VNTR 분석; RELP분석; 핵산 씨퀀싱 (예를 들어, 상거 시퀀싱, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing), 및 단분자 시퀀싱); 역전사; 핵산 라이게이션 (ligation); 핵산 하이브리드화; 면역 분석; 결합 분석; 단백질 분석; 효소 분석; 질량 분석; 및 핵산 및 단백질 정량화에 제한되는 것은 아니다.

SEQUENCE LISTING <110> NetBio, Inc. Schumm, James W Selden, Richard F Tan, Eugene <120> Methods and Compositions for Rapid Multiplex Amplification of STR Loci <130> NBS-007 <150> US 61/485,459 <151> 2011-05-12 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 1 ccctgggctc tgtaaagaa 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 2 atcagagctt aaactgggaa gctg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 3 ccggaggtaa aggtgtctta aagt 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 4 atttcctgtg tcagaccctg tt 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 5 gcgcctggtc tttgtttat 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 6 agaaaatccc catataagtt caagc 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 7 caaaaccctg aaaatggcaa tt 22 <210> 8 <211> 20 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Synthetic Primers <400> 34 gtgacctcag gcaagtccct a 21 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 35 ccataggttt tgaactcaca gattaa 26 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 36 gccagcaaaa aagaaaggaa ga 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 37 cttgaagctg ggagacggaa agt 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 38 agctctctta ctttgggtgg gc 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 39 cttgcaggag acagggttta ta 22 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 40 cgccactgct acaagagag 19 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 41 gtgaggctga agtaggatca c 21 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 42 gacacaagtc cttttttaga tatgtg 26 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 43 gggcgactga gcaagactca 20 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 44 gacatttctt attttctcat attggtgg 28 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 45 tctgtaattc cagctcctag g 21 <210> 46 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 46 aggtttatat atatttctac aacatctcc 29 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 47 ggcctgttcc tcccttattt cc 22 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 48 gagtgcaggt cacagggaac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 49 gcacagaaca ggcacttagg 20 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 50 ccccaacgct caaacgtgag gttg 24 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 51 tccaagttga cttggctgag 20 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Primers <400> 52 cagatgataa atacatagga tggatg 26

Claims (29)

1. 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 핵산의 단일 누클레오티드 다형체들 (SNPs) 의 존재를 검출하는 방법으로서,
   (a) 8개 이상의 비표지 올리고누클레오티드와 상기 샘플을 하나의 용액에서 접촉시키는 단계로서, 상기 올리고누클레오티드와 상기 샘플내의 핵산 사이의 하이브리드화를 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것인 단계;
   (b) 프라이머 신장 생성물들을 생성하는 단계로서, 각각의 생성물은 디데옥시누클레오티드들 (dideoxyNTPs)의 존재하에서 프라이머 신장 반응에 의해 8개 이상의 상이한 형광 염료 중 하나로 표지되고, 각각의 디데옥시누클레오티드는 8개 이상의 상이한 형광 염료 중 하나로 표지된 것인 단계; 및
   (c) 8개 이상의 상이한 형광 염료 중 하나로 표지된 상기 프라이머 신장 생성물들을, 단계별 응시 분석모드(step and stare mode)에서 검류계 및 분광기를 사용하여 상기 8개 이상의 상이한 형광 염료 각각으로부터 형광물질(fluorescence)을 검출하도록 레이저-유도 형광법(laser-induced fluorescence)에 의해 검출함으로써 단일 누클레오티드 다형체들 (SNPs)을 검출하는 단계를 포함하는, 검출 방법.
2. 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 핵산의 단일 누클레오티드 다형체들 (SNPs) 의 존재를 검출하는 방법으로서,
   (a) 상이한 형광 염료로 표지된 8개 이상의 올리고누클레오티드와 상기 샘플을 하나의 용액에서 접촉시키는 단계로서, 상기 올리고누클레오티드와 상기 샘플내의 핵산 사이의 하이브리드화를 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것인 단계; 및
   (b) 각각의 생성물이 8개 이상의 상이한 형광 염료 중 하나로 표지된 하이브리드화 생성물들을, 단계별 응시 분석모드(step and stare mode)에서 검류계 및 분광기를 사용하여 상기 8개 이상의 상이한 형광 염료 각각으로부터 형광물질(fluorescence)을 검출하도록 레이저-유도 형광법(laser-induced fluorescence)에 의해 검출함으로써 단일 누클레오티드 다형체들 (SNPs)을 검출하는 단계를 포함하는, 검출 방법.
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