CN106086230B - 细胞系种属鉴定的引物对及其应用 - Google Patents

细胞系种属鉴定的引物对及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106086230B
CN106086230B CN201610741909.1A CN201610741909A CN106086230B CN 106086230 B CN106086230 B CN 106086230B CN 201610741909 A CN201610741909 A CN 201610741909A CN 106086230 B CN106086230 B CN 106086230B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer pair
primer
seq
sequence
species
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610741909.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106086230A (zh
Inventor
杜红丽
蒙裕欢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Mattel Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Mattel Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Mattel Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangzhou Mattel Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610741909.1A priority Critical patent/CN106086230B/zh
Publication of CN106086230A publication Critical patent/CN106086230A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106086230B publication Critical patent/CN106086230B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了细胞系种属鉴定的引物对及其应用，该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。本发明引物对可用于细胞系种属和物种种属鉴定中，能降低细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，简化操作，促进细胞系质量监测标准化。

Description

细胞系种属鉴定的引物对及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及细胞系种属鉴定技术。
背景技术
很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行，这些细胞可能是从细胞库得来，也可能是受赠于其它研究人员，尤其在中国，目前细胞的传播太复杂、无序，很多都不是通过正规途径获得，如友情赠送等。
据统计，约30％细胞系被交叉污染或错误辨识，因使用了交叉污染或错误辨识的细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果，这浪费大量时间、精力和金钱，还可能造成不可挽回的灾难性后果。
因此，近年NIH、ATCC、Nature和Science等对此多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定，如2011年美国国家标准学会专门颁布了一份细胞STR鉴定国家标准；2014年12月、2015年2月Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识严重性；2015年4月Nature通知：Nature旗下杂志将从5月开始要求作者鉴定论文中所用细胞系；2015年6月有报道称一科学家由于用错细胞系，撤销Nature论文。
STR(Short TandemRepeat，短串联重复序列)基因分型已被ICLAC、ATCC等权威机构作为金标准应用于细胞鉴定，目前越来越多的杂志要求在投稿时提供细胞STR分型数据。与细胞系STR鉴定一样，细胞系是否存在种属间的交叉污染鉴定也同等重要，美国国家标准研究所(American National Standards Institute，ANSI)公布了一个细胞种属鉴定的标准：ANSI/ATCC ASN-0003-2015，而使用此标准ANSI/ATCC ASN-0003-2015需要收取较高费用。
发明内容
本发明的目的是提供适用于细胞系种属鉴定的，鉴定准确性高，操作简单的引物对。
本发明的另一个目的是提供上述引物对在细胞系种属鉴定中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明提供的细胞系种属鉴定的引物对，为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。
本发明人用引物对1分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对1确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对1在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本发明推荐引物对1的PCR反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸42s。
本发明人用引物对2分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对2确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对2在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本发明推荐引物对2的PCR反应条件为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸42s。
本发明人用引物对3分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对3确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对3在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本发明推荐引物对3的PCR反应条件为：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸72s。
本发明的引物对1或引物对2或引物对3可应用于细胞系种属鉴定，从而加速细胞质量监测的标准化；也可以作为辅助手段，用于细胞系种属鉴定。
本发明的引物对1或引物对2或引物对3可应用于物种种属鉴定。
本发明的引物1或引物对2或引物对3可以制备成试剂盒，用于细胞系种属鉴定或物种鉴定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.现有技术中尚未有一对引物可以同时扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列；本发明采用生物信息技术优势开发出能用于多个物种鉴定的3对引物对，这3对引物对每1对引物都可以扩增出人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴这7个物种的目的片段，且同一对引物扩增出的序列各物种间差异性明显；
2.本发明引物对的应用可大大降低了细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，而且大大简化了细胞系种属鉴定或物种鉴定的操作，促进了细胞系质量监测标准化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1引物对的获得
1、基因组来源
人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)这7个物种的基因组数据是从Genebank上下载的该物种最新版本的基因组，具体基因组数据来源如表1所示。
表1基因组数据来源
2、基因组DNA
本发明人委托泰因生物科技有限公司实验室用TAKARA公司的基因组总DNA提取试剂盒提取获得人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组DNA。
3、目标序列筛选
本发明人采用lastz作为比对软件来比对和分析人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组，然后通过linux运行比对程序。
以兔和狗的基因组比对为例，其比对参数如表2所示。
表2 lastz比对参数
基因组比对总共得到6个比对结果文件，分别为兔与人、大鼠、小鼠、狗、猪、恒河猴的比对结果。由于6个物种都是以兔的基因组做为参考序列来进行的比对，所以可以得到每个物种和兔基因组的同源区域。根据这6个物种和兔同源区域的重叠，进而筛选出人、大鼠、小鼠、狗、猪、恒河猴和兔这7个物种同源的区域以及基因组序列，总共筛选出7个物种共有的同源性大于70％且小于100％，同源区域长度大于200bp的序列57620组。
由于设计引物需要连续相同的序列超过18bp，因此，对上述57620组序列进行进一步地过滤，过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数小于2个的序列区域，得到了可以用来设计引物的873组同源序列。
为了保证序列可以区分出物种的差异，选取物种间差异度较大的序列来设计PCR引物。
4、引物设计
目标片段筛选完成后，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。
引物设计的要求是：选取能够完全涵盖目标片段的引物，引物长度在18～24bp之间，退火温度52℃～60℃。
则最终设计得到3对引物，分别是引物对1、引物对2和引物对3；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。
实施例2引物对1鉴定细胞系种属实验
本实施例用设计的引物对1进行细胞系种属鉴定的实验。
引物对1由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
分别以人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的TAKARA Premix Taq试剂盒，PCR反应体系(20μL)如表3。
表3引物对1的PCR反应体系
将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
将上述PCR产物物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明亮；扩增片段大小为682bp；扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
以狗(dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
以小鼠(mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示；
以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
以大鼠(rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示；
以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
将上述SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：13所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比对，通过与原始序列的同源性来确定用引物对1进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，详见表4。
表4引物对PCR得到的序列与原始序列相似度(％)
从表4可以看出，引物对1可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
引物对1扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表5所示。
表5引物对1扩增的目标序列在不同物种中的序列相似度(％)
序列相似度 狗 小鼠 兔 大鼠 猴 猪 人
狗 90.0 92.7 88.4 93.8 94.6 93.7
小鼠 91.2 95.3 91.1 90.6 91.1
兔 90.9 94.3 95.2 94.4
大鼠 90.9 89.9 90.8
猴 94.4 98.8
猪 94.6
人
从表5可以看出，引物对1扩增出的目标序列在不同物种间的相似度均小于98.8％，说明引物对1扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对应多个物种的情况，由此证明引物对1确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
实施例3引物对2鉴定细胞系种属实验
本实施例用设计的引物对2进行细胞系种属鉴定的实验。
引物对2由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
分别以人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的TAKARA Premix Taq试剂盒，PCR反应体系(20μL)如表6。
表6引物对2的PCR反应体系
将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
将上述PCR产物物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明亮；扩增片段大小为693bp；扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
以狗(dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
以小鼠(mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：15所示；
以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
以大鼠(rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；
以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：18所示；
以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；
以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
将SEQ ID NO：14～SEQ ID NO：20所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比对，通过与原始序列的同源性来确定用引物对2进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，详见表4。
从表4可以看出，引物对2可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
引物对2扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表7所示。
表7引物对2扩增的目标序列在不同物种中的序列相似度(％)
从表7可以看出，引物对2扩增出的目标序列在不同物种间的相似度均小于97.3％，说明引物对2扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对应多个物种的情况，由此证明引物对2确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
实施例4引物对3鉴定细胞系种属实验
本实施例用设计的引物对3进行细胞系种属鉴定的实验。
引物对3由上海生物工程有限公司合成，合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
分别以人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的TAKARA Premix Taq PCR试剂盒，PCR反应体系(20μL)如表8。
表8引物对3的PCR反应体系
将上述PCR反应体系混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
将上述PCR产物物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示目标条带单一明亮；扩增片段大小为1189bp；扩增产物送交基因公司进行DNA测序，测序结果为：
以狗(dog)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
以小鼠(mouse)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：22所示；
以兔(rabbit)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；
以大鼠(rat)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
以恒河猴(rhesus)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ IDNO：25所示；
以猪(pig)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；
以人(human)的基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
将SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：27所示核苷酸序列分别与原基因组上序列比对，通过与原始序列的同源性来确定用引物对3进行PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，详见表4。
从表4可以看出，引物对3可以准确地在目标区域扩增出7个物种的基因组序列。
引物对3扩增的7个目标序列在不同物种间的差异性结果如表9所示。
表9引物对3扩增的目标序列在不同物种中的序列相似度(％)
序列相似度 狗 小鼠 兔 大鼠 猴 猪 人
狗 85.9 86.0 86.9 90.0 90.2 90.5
小鼠 83.6 95.0 86.6 86.6 86.5
兔 83.7 87.0 86.5 87.3
大鼠 88.2 86.9 88.2
猴 89.4 96.9
猪 90.0
人
从表9可以看出，引物对3扩增出的目标序列在不同物种间的相似度均小于96.9％，说明引物对3扩增出的目标序列只能对应到单一物种，而不会存在同一目标序列对应多个物种的情况，由此证明引物对1确实能够准确专一地鉴定细胞系种属。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州泰因生物科技有限公司
<120> 细胞系种属鉴定的引物对及其应用
<130>
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actagcagct tgcagtgatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgctctca caagtcacat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctccatgaga aatgagtatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcttgaaga tgcggaagac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caccgaagcc acagccatac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cctaccgtgg ggagttgaat 20
<210> 7
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actagcagct tgcagtgatt tctttcgcac caaacttgta ggccaagcag aggatgagaa 60
caagaatgtg ttggatttgc accatgttac agtgactggc ttcatacccc ttttagagta 120
tgcttacacg gccactctgt caatcaacac agagaatatc attgatgttc tcgctgcagc 180
cagctacatg cagatgttca gtgttgccag cacctgctca gagttcatga agtccagcat 240
tttatggaat acacccaaca gccaaccaga aaagagtcta gatgctggac aagagaataa 300
ctctaactgc aattttactt ctcgagatgg aagtatttcc cctgtgtctt cagagtgcag 360
tgtggtagaa agaacgattc ctgtctgccg agaatcccgg agaaagcgca aaagctacat 420
tgttatgtct cctgaaagtc ccgtaaaatg tagcacgcaa acaagttctc cccaggtatt 480
gaattcttca gcttcctact cagaaaatag aaatcaacca gttgactctt ctttagcttt 540
tccctggaca tttccttttg gaattgatcg aaggattcag cctgataagg ttaagcaggc 600
agaaaatacc cggactttag aactacctgg cccatctgag acaggtagaa gaatggccga 660
ttatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 8
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
actagcagct tgcagtgatt tctttcgaac caaacttgtt ggccaaacag aagatgagaa 60
caaaaatgtg ttggatctgc atcatgttac agtgactggc tttatacctc ttttagaata 120
cgcttacaca gccactctgt caattaacac ggaaaatatt attgatgttc tagcggcagc 180
cagctatatg caaatgttta gtgttgctag tacatgctca gagttcatga agtcaagtat 240
tttgtggaat acacctaata gccaaccaga aaagagtcta gatgctggac aagaaaatag 300
ctccaactgc aattttactt ctcgagatgg aagcatttct ccagtgtctt cagagtgcag 360
tgctgtggag aggaccattc ctgtctgccg agagtcccgg aggaagcgca aaagctacat 420
tgttatgtct cccgagagtc ccgtgaaatg tagcacccaa acaagttccc cccaggtact 480
gaattcttca gcttcctatg cagaaaatag aagtcagcca gttgactctt ctttagcttt 540
tccttggact ttcccttttg gaatagatcg aaggattcag cctgagaaag caaagcaggc 600
agaaaatacc cggactttag aattgcctgg cccatccgag gcaggtagaa gagtggctga 660
ctatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 9
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actagcagct tgcagtgatt tctttcgcac caaacttgta ggccaagcag aggatgagaa 60
caagaatgtg ttggatctgc atcatgtcac ggtgactggc tttatacccc ttttagaata 120
cgcttataca gccactctgt caattaacac agaaaatatt attgatgttt tagctgcagc 180
aagctatatg caaatgttta gtgttgctag tacctgttcg gaattcatga aatcaagcat 240
tttatggaat acacccaata gccaaccaga aaagggccta gatgctggac aagaaaataa 300
ttctaactgc aattttactt ctcgagatgg aagcatttct ccagtgtctt cagagtgcag 360
tgtggtagaa cgaaccattc ctgtctgccg agaatcccgg agaaagcgca aaagctatat 420
tgttatgtct cctgaaagcc ctgtaaagtg tagcacacaa acaagttcac cccaggtgtt 480
gaattctaca gcttcctact cagaaaatag aagtcaacca gttgactctt ctttagcttt 540
tccctggact tttccttttg gaattgatcg aaggattcag cctgagaagg ttaagcaggc 600
agaaaatacc cggactttag aattacctgg cccatctgag gcaggtagaa gaatgactga 660
ttatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 10
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
actagcagct tgcagtgatt tctttcgaac caaacttgtg ggccaaacag aggatgagaa 60
caaaaatgtg ttggatctgc atcatgttac agtgactggc tttatacctc tgctggaata 120
cgcttacaca gccactctgt ccattaacac ggaaaatatt attgatgttc tagcagcagc 180
cagctatatg caaatgttta gtgttgctag tacgtgctca gagttcatga aatcaagtat 240
tttgtggaat acacctaata gccaaccaga aaagggtcta gatgctggac aagaaaatag 300
ttccaactgc aattttactt ctcgagatgg aagcatttct ccagtgtctt ccgagtgcag 360
tgctgtggaa aggaccattc ctgtctgccg agagtcccgg agaaaacgca aaagctacat 420
tgttatgtct cctgagagcc ctgtaaaatg tagcacacaa acaaattccc cccaggtact 480
gaattcttca gcttcctatg cagaaaatag aaatcagcca gttgattctt ctttagcgtt 540
tccatggact ttcccttttg gaattgatag gaggattcag cctgagaaag caaagcaggc 600
agaaaatacc cggactttag agttgcctgg cccgtccgag gcaggtagaa ggatggctga 660
ctatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 11
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
actagcagct tgcagtgatt tctttcgcac caaacttgta ggccaagccg aggatgagaa 60
caagaatgtg ttggatctgc atcatgttac agtgactggc tttatacctc ttttagaata 120
tgcttacaca gccactctat caattaacac agaaaatatt attgatgttc tagcagcagc 180
cagctatatg caaatgttca gtgttgccag cacttgctca gagttcatga aatcaagcat 240
tttatggaat acacctaaca gccaacccga aaagggtcta gatgctggac aagaaaataa 300
ttctaactgc aattttactt ctcgagatgg gagcatttct cccgtgtcct cagagtgcag 360
tgtggtagaa agaacgattc ctgtctgccg agaatcccgg agaaagcgca aaagctacat 420
tgttatgtct cctgaaagtc ctgtaaagtg tagcacacaa acaagttcac cccagatatt 480
gaattcttca gcttcctact cagaaaatag aaaccaacca gttgactctt ccttagcttt 540
tccctggact tttccttttg gaattgatcg aaggattcag cctgagaaag ttaagcaagc 600
agaaaatacc cggactttag aattacctgg cccatctgag accggtagaa gaatggctga 660
ttatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 12
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actagcagct tgcagtgatt tctttcgcac caaacttgta ggccaagcag aggatgagaa 60
caagaatgtg ttggatttgc atcatgttac agtgactggc tttatacccc tcttagaata 120
tgcttataca gccactctgt caattaacac agaaaatatc attgatgttc tagctgcagc 180
cagctatatg caaatgttca gtgttgctag tacctgctcg gaattcatga aatcaagcat 240
tttatggaat acacccaaca gccaaccaga aaagagtcta gatgctggac aagaaaataa 300
ctctaactgc aattttacgt ctcgagatgg aagcatttct ccagtgtctt cagagtgcag 360
tgtggtagaa agaaccattc ctgtctgtcg agaatcccgg agaaagcgca aaagctacat 420
tgttatgtct cctgaaagtc ctgtaaagtg tagcacacaa acaagttctc cccaggtttt 480
gaattcttca gcttcctact cagaaaatag aaatcagcca gttgactctt ctctagcttt 540
tccctggact tttccttttg gaattgatcg aaggattcag cctgataagg ttaagcaagc 600
agaaggtacc cggactttag aattacctgg gccatctgag acaggtagaa gaatgcccga 660
ttatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 13
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
actagcagct tgcagtgatt tctttcgcac caaacttgta ggccaagccg aggatgagaa 60
caagaatgtg ttggatctgc atcatgttac agtgactggc tttatacctc ttttagaata 120
tgcttacaca gccactctat caattaacac agaaaatatt attgatgttc tagcagcagc 180
cagctatatg caaatgttca gtgttgccag cacctgctca gagttcatga aatcaagcat 240
tttatggaat acacccaaca gccaacctga aaagggtcta gatgctggac aagaaaataa 300
ttctaactgc aattttactt ctcgagatgg gagcatttct cccgtgtcct cagagtgcag 360
tgtggtagaa agaaccattc ctgtctgccg agaatcccgg agaaagcgca aaagctacat 420
tgttatgtct cctgaaagtc ctgtaaagtg tggcacacaa acaagctcac cccaggtatt 480
gaattcttca gcttcctact cagaaaatag aaaccaacca gttgactctt ccttagcttt 540
tccttggact tttccttttg gaattgatcg aaggattcag cctgagaaag ttaagcaagc 600
agaaaatacc cggactttag aattacctgg cccatctgag accggtagaa gaatggctga 660
ttatgtgact tgtgagagca ca 682
<210> 14
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctccatgaga aatgagtatt tctttgacag gaaccggccc agttttgatg gaatcctgta 60
ttattaccaa tcaggtggga aaatccggcg ccctgccaat gtccccatcg acgtctttgc 120
tgatgaaatc tccttctatg aactgggtag cgaggccatg gaccagttcc gggaggatga 180
aggcttcatc aaggaccctg aaacaccgct ccccaccaat gacttccacc ggcagttctg 240
gctcctcttc gagtacccgg agagctccag cgctgcccgc ggtgtggctg tggtctctgt 300
gttggttgtg gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggaa acactaccgg agttccggga 360
ggagagggag ctgaaggtga tgagagaccc cagcctcaac atgagtaaga cagtcctctc 420
ccacaccatg ttcactgacc ccttcttcat ggtggagtcc acctgcatca tgtggttcac 480
tttcgaactg gtgctccggt ttgtggtctg ccccagcaag gctgacttct tcaggaacat 540
catgaacatc attgatatca tctccatcat cccctacttt gcaaccctca tcacagagct 600
ggtccaggag acagagccca gcacccagca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
ccggctggtg cgggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 15
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctccatgaga aatgagtatt tctttgatag aaacagacct agttttgatg gaatcttata 60
ttattaccag tctggtggga aaatacggcg gccagccaac gtgcctatcg atgttttcgc 120
tgatgagatc tccttctatg aactgggtag cgaggccatg gaccagttcc gggaggatga 180
aggcttcatt aaggaccctg agacactgct gcccaccaat gactttcacc ggcaattctg 240
gcttctcttt gagtaccccg agagctccag tgcagctcga ggagtggctg tggtctcggt 300
tttggttgta gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acactcccag agttccgaga 360
ggacagggag ctgaaggtgg tcagagaccc cagcatcaat acaaacaaaa caggcctctc 420
ccagaccatg ttcactgatc ctttcttcat ggtggagtcc acctgcatcg tgtggttcac 480
ctttgagctg gtgctccggt ttgtggtctg ccccagcaag actgacttct tcaagaacat 540
catgaatatt attgacatca tctccatcat cccctacttt gcaaccctca taacagagct 600
agtacaggag accgagccaa gtgcccagca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
tcgtctggtg agggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 16
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctccatgaga aatgagtatt tctttgaccg gaaccggccc agctttgatg gaattctata 60
ttactaccaa tctggaggga agatccggcg cccggccaac gttcccatcg acgtcttcgc 120
ggatgagatc tccttctatg agctgggcag tgaggccatg gaccagttcc gggaagacga 180
aggcttcatc aaagaccctg agataccgct gcccactaac gacttccacc ggcagttctg 240
gctcctcttt gagtatcctg agagctccag cgctgcccgt gccgtggccg tggtctctgt 300
gttggtggtg gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acactgccag agttccggga 360
ggacagggag ctgaaggtgg tcagagaccc cagcctcagc acgaacaaga cggccttccc 420
ccagaccatg ttcaccgacc ccttcttcat ggtggagtcc acgtgcatcg tgtggttcac 480
cttcgagctg gtgctccgct tcgtggtctg ccccagcaag acggacttct tcaggaacat 540
catgaacatc atcgacatca tctccatcat cccctacttt gcaaccctca tcacggagct 600
ggtccaggag acggagccca gcgcccagca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
ccgcctggtg agggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 17
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctccatgaga aatgagtatt tctttgatag aaacagacct agttttgatg gaatcttata 60
ttattaccag tctggtggga aaatacggcg gccagccaat gtgcctattg atgttttcgc 120
tgatgagatc tctttctatg aactgggtag cgaggccatg gaccagttcc gggaggatga 180
aggcttcatt aaggaccctg aaacactgct gcccaccaat gactttcacc ggcaattctg 240
gcttctcttc gagtaccctg agagctccag tgcagctcga ggtgtggctg tggtctcggt 300
tttggttgta gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acactcccgg agttccgaga 360
ggacagggag ctgaaggtgg tcagagaccc caccatcaat acaaacaaaa caggcctctc 420
ccagaccatg ttcactgatc ctttcttcat ggtggagtcc acctgcattg tgtggttcac 480
ctttgagctg gtgctccggt ttgtggtctg ccccagcaag cctgacttct tcaagaacat 540
catgaacatc atcgacatca tctccatcat cccctacttt gcgaccctca taacagagct 600
agtacaggag accgagccaa gcgcccagca gaatatgtcc ctcgccatcc tgaggatcat 660
ccgtctggtg agggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 18
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctccatgaga aatgagtatt tctttgatcg gaaccggccc agttttgatg gaatcctata 60
ttattaccaa tctggtggga aaattcggcg cccagccaat gttcctattg atatctttgc 120
tgatgaaatc tctttctatg agctgggtag tgaggccatg gaccagttcc gggaggatga 180
aggcttcatc aaagaccctg aaacactgct acccaccaat gacatccacc gtcagttctg 240
gctcctcttt gaataccctg agagctccag tgctgcccgt agtgtggccg tggtctcagt 300
gttggttgtg gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acactgccag agttccggga 360
ggatagggag ttgaaggtgg tcagagaccc caatctcaac atgagcaaga tagtcctctc 420
ccagaccatg ttcactgacc ctttcttcat ggtggagtct acctgcatca tgtggttcac 480
ctttgagctg gtgctccggt ttgtggtctg ccccagcaag actgacttct tcaggaacat 540
catgaacatc attgacatta tttccattat cccctacttt gcaactgtca tcacagagct 600
tgcccaggag acagagccga gtgcccaaca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
ccgcctggtg agggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 19
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctccatgaga aatgagtatt tctttgacag gaaccggccc agttttgatg gaatcctcta 60
ttattaccaa tctggcggga aaatccggcg cccggccaat gtccctatcg acgtctttgc 120
ggatgagatg tccttctatg aactgggcag tgaggccatg gaccagttcc gggaggacga 180
aggcttcctc aaggatcccg aaacactgct cccctccaat gacatccacc ggcagttctg 240
gctcctcttt gagtaccccg agagctccag cgccgcccgt ggggtggccg tggtctccgt 300
gctggtcgtg gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acgcttcctg agttccgcga 360
ggacagggag ctgaaggtgg tgagagaccc cagccgcaac accagccaga cggtcctctc 420
ccacaccctg ttcacggacc ccttcttcat ggtggagtcc acctgcatca tgtggttcac 480
cttggaactg gtgctccggt tcgtggtctg ccccagcaag cccgacttct tccggaacat 540
catgaacatc atcgatatca tctccatcat cccctacttt gccaccctcg tcaccgagct 600
ggtccaggag acagagccga gcgcccagca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
ccggctggtg cgggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 20
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctccatgaga aatgagtatt tctttgatcg gaaccggccc agttttgatg gaatcctata 60
ttattaccaa tctggtggga aaattcggcg cccagccaat gttcccattg atatctttgc 120
tgatgaaatc tccttctatg agctgggtag tgaggccatg gaccagttcc gggaggatga 180
aggcttcatc aaagaccctg aaacactgct acccaccaat gacatccacc gtcagttctg 240
gctcctcttt gagtaccctg aaagttccag cgctgcccgt gctgtggccg tggtctcggt 300
gttggttgtg gtcatctcca tcaccatctt ctgcctggag acactgccag agttccggga 360
ggatagggag ctaaaggtgg tcagagaccc caatctcaac atgagcaaga cagtcctctc 420
ccagaccatg ttcaccgacc ctttcttcat ggtggagtct acctgcatcg tgtggttcac 480
cttcgagctg gtgctccggt tcgtggtctg ccccagcaag actgacttct tcaggaacat 540
catgaacatc attgacatca tctccattat cccctacttt gcaactctca tcacagagct 600
agtccaggag acagagccga gtgcccaaca gaacatgtcc ctggccatcc tgaggatcat 660
ccgcctggtg agggtcttcc gcatcttcaa gct 693
<210> 21
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
caccgaagcc acagccatac ccaggaccga aggtccagga atgagagatc gagcaaagcc 60
aaggagagat ccagatcaat ggataactca aagggccctc tgggtgcttc ttctctaggg 120
acacctgaag acctggctga aggctgtagc caagatgacc aaacccccag ccaatcctac 180
attgacgaca gtactttaag gcctgcacaa acaattggtc atcaaagggc tcatgtttca 240
tccacaagct ataaagaggt gtgtattcca gaaatcgtca gtggcagcaa ggagccttcc 300
agtgcttgta gccttttgga gccaggcaaa ccacctgaga gtttgccgcc ctacggggaa 360
ctcagctctt gtccaacaaa aacagcgaca gatgactatt tccagtgcaa cacctccagt 420
gagacggtcc tcacggcgcc atcacctctg ggaaaaaaca aagaggatca tgacactctg 480
actctggcgg aaggggtgaa aaagctgcct ctgtctgata ggcaggcccc acattcttcc 540
agagagcctg tagggcacaa ggaggagtca ccaaaagggc caggtggggg cccagctgcc 600
tcgggcgcgg tggcagaagg gattgccaat ggacgcctcg tccagcacca cggcgccgag 660
cccagcagcc tggacaagag gaaagaaata ttcagcaaag acacactgtt caaacctctt 720
cacagcacct tgtctgtaaa cagctaccac aaatcgagcc tgtccctcct caaatctctc 780
ccgaagacac ctgccgacgc actgccaggc cgatgcgaga aactggagcc gcccctgggg 840
acctcggtgg cagcagccat gcctggttcc cagcgtcagc aggagtcagg ggggaaccaa 900
gaagcctctt ttgactatta caatgtctcg gacgacgacg actccgagga aggggcgaac 960
aaaaacacgg acgaggaaaa aaacagagat gacgtaggca ccatgcagtg gctccttgag 1020
agggagaagg aaagagactt acagaggaaa tttgaaaaga acctcaccct ccttgcccca 1080
aaagagaccg acagtggcag caaccagaga gccacccact cggcacgcct cgacagcata 1140
gacagtagca gcatcactgt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 22
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caccgaagcc acagccatac ccaggaccgg agatccagga atgagaggtc caacaaggcc 60
aaggagagat ccaggtctat ggataactcc aaaggtcccc tgggcgcttc ttcactcggg 120
actccggaag acctggctga aggctgcagc caagatgacc aaacaccgag ccaatcatac 180
attgatgaca gtactttaag gcctgcgcaa acgattggtc atcaaagggc tcatattcct 240
tctgccagct acaaagaggt atgcattcca gaaatagttg gtggcagcaa ggaaccttct 300
agtgcttgta gccttctgga gccaggcaaa acccctgaga gtatgccgtc ctatggggaa 360
ctcagccctt gcccggctaa aacagctgtg gatgactatt ttcagtgcaa cacctcgagt 420
gagaccgtac tcacagcacc gtccccttta gggaagaata aggaggacca tgacactttg 480
accttggtgg agggggtaaa aaagctgtct ccatctgaga ggcagacccc ccattcttcc 540
agggaacctg ttgggcacaa ggaggagtca ccgaaagggc caggaggggg ccctgcagcc 600
tctggtggtg tggcagaggg gttagccaat ggccgccttg tccaacatca tagcgcagaa 660
cccagcagcc tggacaaaag gaaagaaata ttcagcaaag acacactgtt caaacctcta 720
cacagcaccc tgtctgtaaa cagctatcac aaatctagct tgtccctcct caagtctcac 780
ccaaagtcac ccgttgacac actgccaggc cgttgtgaga aactggaacc ttcccttggg 840
acatccgcgg cccaagccat gcctccatcc caacgtcagc aggagcctgg agggaaccag 900
gaggcttctt ttgactatta caacgtctct gatgacgacg actccgagga gggggccaac 960
aaaaacgcgg aggaggagaa aaacagagat gatgtgggca ccatgcagtg gctcctggag 1020
agggagaagg aaagagactt gcagaggaag tttgagaaaa acctcaccct cctcacccca 1080
aaagaaactg atagcagcag caaccagaga gccacccact cagcccggct ggacagcatg 1140
gatagcagca gcatcacggt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 23
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caccgaagcc acagccatac ccaggaccga cggtccagga atgagagatc cagcaaggcc 60
aaggagaggt ccaggtcgat ggataactcc aagggccctc tgggtgcatc ttcgctaggg 120
acgcctgaag acttggccga aggctgcagc caggacgacc agacccccag ccagtcctac 180
attgacgaca gtactttaag gcctgtccag gctgtggggc accaaagggt tcacctggcg 240
tccacgagtt acaaggaggt gtgtattcca gaaatagtcg gtggcagcaa ggagcttccc 300
agcgcgtgca gcctgttgga gccaggcaaa ccgcccgaga gtctgccacc ctatggggac 360
ctcagtgctt gtccaagcaa aacagctgct gatgactatt tccagtgcaa cacctccagt 420
gagacggtgc tcacggcccc atcccccctg ggaaagagca aggaggacca cgacactctg 480
actctggcag aaggagtgaa aaagctgtct tcctccgaca ggcaggcccc ccattcctcc 540
cgggagccca tggggcacaa ggaggagtcc cccaaagggc tgggcggggg cccggctgct 600
tccgggggcg tggcggaggc ggtggcaaat ggacgcctcg tgcagcacca cagcacggag 660
ccgggcagcc tagacaagag gaaagagatt ttcagcaaag acacgctctt caagcctctt 720
cacagcaccc tgtctgtaaa cagctatcac aaatcaagcc tgtccctcct caaatcgcac 780
ccgaagaccc cggctgacac gctgccaggc cggtgcgaga aactggagcc cgccctgggg 840
acctcggcgg cacaggccat gcccgcttcc cagcgccagc aggagtctgg agggaaccag 900
gaggcctcct tcgactacta caacgtctct gacgacgacg actcggagga aggggccaac 960
aaaaacgcgg aggaggagaa gaacagagat gacgtcggca ccatgcagtg gctcctggag 1020
cgagagaagg aaagagactt gcagaggaaa tttgagaaga acctcacgct cctcgccccg 1080
aaagagacgg acagcagcag ccatcagaga gccacgcatt cggcccggct ggacagcatg 1140
gacagcagca gcatcaccgt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 24
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
caccgaagcc acagccatac ccaggaccgg aggtccagga atgagaggtc caacaaggcc 60
aaggagagat ccaggtcaat ggataactcc aaaggccccc tgggcgcttc ttctctcggg 120
actccggaag acctggctga aggctgcagc caagatgacc aaacagccag ccaatcatac 180
attgacgaca gtacgttaag gcctgcgcaa acgattggtc atcaaagggc tcatattcct 240
tctgccagct ataaagaggt gtgcattcca gaaatagttg gtggcagcaa ggaaccttct 300
agtgcttgta gccttttgga gccaggcaaa tcccctgaga gtatgccgtc ttatggggaa 360
ctcagccctt gcccggcaaa aacagctgtg gatgactatt ttcagtgcaa cacttctagt 420
gagactgtgc tcacagcacc gtctccttta gggaagaata aggaggacca cgacactttg 480
accttggtgg agggggtaaa aaagctgtct ccatctgaga ggcagacccc ccactcttcc 540
agggatcctg ttgggcacaa ggaggagtca ccaaaagggc caggtggggg ccctgcagct 600
tctggtggtg tggcagaggg gttggccaat ggccgtcttg tccaacatca tagtgcagaa 660
cccagcaact tggacaaaag gaaagaaata ttcagcaaag acacactgtt caaacctcta 720
cacagcacct tgtctgtaaa cagctatcac aaatccagct tgtccctcct caaatctcac 780
ccgaagtcac ctgctgacac actgccaggc cgatgtgaga aaatggaacc ttcccttggg 840
acgtctgcgg cccaagccat gcctccgtcc cagcgtcagc aggagcctgg agggaaccag 900
gaggcctcct ttgactatta caacgtctcc gacgacgacg actctgagga aggggccaac 960
aaaaacacag aggaggagaa aaacagagat gatgtgggca ccatgcagtg gctcctcgag 1020
agggagaagg aaagagactt gcagaggaag tttgagaaga acctcaccct cctcgcccca 1080
aaggaaaccg atagcagcag caaccagaga gccacccact cagcccggct cgacagcatg 1140
gacagtagca gcatcaccgt ggacagcgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 25
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
caccgaagcc acagccatac gcaggaccgg aggtccagga atgagagatc caacaaagcc 60
aaggagagat ccaggtcgat ggataactcc aaaggccctc tgggtgcttc ttctctaggg 120
acgccggaag acctggctga aggctgcagc caagacgacc agacccccag ccaatcctac 180
gttgacgaca gtactttgag gcctgcacag actgtcggtc accaaagggc tcacatggcg 240
tccacaagct ataaagaggt gtgtattcca gagatagtca gtggcagcaa ggaaccctcc 300
agcgcttgta gccttttgga gccaggcaaa ccacctgaga gtttgccgtc ctatggcgaa 360
ctcaactctt gtccaacaaa aacagccaca gatgactatt tccagtgcaa cacctctagt 420
gagacagtgc ttacggcacc atcacctctg ggaaagaaca aggaggacca tgacactctg 480
actttggcag agggggtgaa aaagctctcc ccatctgata ggcaggtccc ccactcctcc 540
agggagcctg taggacacaa ggaggagtca ccaaaagggc cgggtggggg cccagctgct 600
tcgggaggag tggctgaagg gatcgccaac ggacgcctcg tccagcacca tggtgccgag 660
cccagcagct tggacaagag gaaagagata tttagcaaag acaccctgtt caaacctctt 720
cacagcacct tgtctgtaaa cagctatcac aaatccagcc tgtccctcct caaatctcac 780
ccgaagacac ctgctgacac attgccaggc cgatgtgaga aactggaacc gtccttgggg 840
acctcggcgg cacaagccac gcctgcttcc caacgtcagc aggagtcagg agggaaccag 900
gaaacctctt ttgactatta caacgtctct gatgatgatg agtctgagga aggggcaaac 960
aagaacacag aggaggagaa aaatagagag gacgtaggca ccatgcagtg gctcctcgag 1020
agggagaagg aaagagactt gcagaggaaa tttgaaaaga acctcaccct tctcgcccca 1080
aaagaaaccg acagcagcag caaccagaga gccacccatt cagcccggct ggacagcatg 1140
gacagcagca gcatcaccgt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 26
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
caccgaagcc acagccatac ccaggatcgg aggtcccgga acgagagatc caacaaggcc 60
aaggagaggt ccagatccat ggataactcc aaaggccccc tgggggcctc ctcgctgggc 120
acacctgagg acctggctga aggctgtagc caggatgacc aaacccccag ccaatcctac 180
attgacgaca gtactttaag gcctgcacag actgtcagtc atcaaagggc tcacatttcg 240
tccacaagct acaaagaggt gtgcattcca gaaatagtca gtggctgcaa ggaaccttcc 300
agtgcttgta gcctcctgga gccaggcaaa ccacctgaga ccttgccatc ctatggggaa 360
ctcaactcct gtccagcaaa gacggctgct gatgactatt tccagtgcaa cacctccagt 420
gagacggtgc tcacggcgcc atcacctctg ggaaagaata aagaggacca tgacactctg 480
accctggcgg aaggggtgaa aaagctgcct ctgtcagaca ggcaagcccc acattcttcc 540
agggagcctg tggggcacaa ggaggagtca ccaaaggggc caggtggagg cccagccaca 600
tcgggcaccg gagctgaagg gatcgccaat ggacgcctcg tccagcatca cagcaccgag 660
cccagcagcc tggacaaaag gaaagagcta ttcagcaaag acacactgtt caaacctctt 720
cacagcacct tgtctgtaaa cagctatcac aaatcgagcc tgtccctcct caaatctcac 780
ccgaagacac ctgcggacac actgccaggc cgatgcgaga aactggagcc gtccctgggg 840
acctcggccg cacaagccat gccggcttcc cagcgtcagc aggagtctgg ggggaaccag 900
gaggcctctt tcgactatta caacgtctct gatgatgacg agtctgagga aggggcaaac 960
aaaaacacag aggaggagaa aaacagagat gatgtgggca ccatgcagtg gctcctggag 1020
agggagaagg aaagagactt gcagaggaaa tttgagaaga acctcaccct ccttgccccc 1080
aaggaaactg acagcagcag caaccagaga gccacccatt cggcacgtct ggacagcatg 1140
gacagcagca gcatcacggt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189
<210> 27
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
caccgaagcc acagccatac acaggaccgg aggtccagga atgagagatc caacaaagcc 60
aaggagagat ccaggtcgat ggataactcc aaaggccctc tgggtgcttc ttctctaggg 120
acgccggaag accttgctga aggctgcagc caagacgacc agacccccag ccaatcctac 180
attgacgaca gtactttaag gcctgcacag accgttagtc tccaaagggc tcacatttcg 240
tccacaagct ataaagaggt gtgtattcca gagatagtca gtggcagcaa ggaaccgtcc 300
agcgcttgca gccttttgga gccaggaaaa ccacccgaga gtttgccatc ctatggcgaa 360
ctcaactctt gtccaacaaa aacagccaca gatgactatt tccagtgcaa cacctctagt 420
gagacggtgc tcacggcacc atcacctctg ggaaagaata aggaggacca tgacactctg 480
actttggcag aaggggtgaa aaagctctcc ccttctgata ggcaggtccc ccactcctcc 540
agggagcctg tggggcacaa ggaggagtca ccaaaagggc cgggtggggg ccccgctgct 600
tcgggaggag tggctgaagg gatcgccaac ggacgcctcg tccagcacca tggtgccgag 660
cccagcagct tggacaagag gaaagagata tttagcaaag acacactgtt caaacctctt 720
cacagcacct tgtctgtaaa cagctatcac aagtcgagcc tgtccctcct caaatctcac 780
ccgaagacac ctgctgacac attgccaggc cgatgtgaga aactggaacc gtccctgggg 840
acctcggcgg cacaagccat gcctgcttcc cagcgtcagc aggagtcagg agggaaccag 900
gaagcctctt ttgactatta caacgtctct gatgatgacg actctgagga aggggcaaac 960
aagaacacag aggaggagaa aaatagagag gacgtaggca ccatgcagtg gctcctcgag 1020
cgggagaagg aaagagactt gcagaggaaa tttgaaaaga acctcaccct tcttgctcca 1080
aaagaaaccg acagcagcag caaccagaga gccacccatt cagcccggct cgacagcatg 1140
gacagcagca gcatcacagt ggacagtgga ttcaactccc cacggtagg 1189

Claims (7)

1.一种细胞系种属鉴定的引物对，其特征在于该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对1的PCR反应条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸42s。
3.根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对2的PCR反应条件为94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸42s。
4.根据权利要求1所述引物对，其特征在于所述引物对3的PCR反应条件为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸72s。
5.权利要求1所述引物对在细胞系种属鉴定中的应用。
6.权利要求1所述引物对在物种种属鉴定中的应用。
7.权利要求1所述引物对在制备细胞系种属鉴定试剂盒或物种种属鉴定试剂盒中的应用。
CN201610741909.1A 2016-08-28 2016-08-28 细胞系种属鉴定的引物对及其应用 Expired - Fee Related CN106086230B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610741909.1A CN106086230B (zh) 2016-08-28 2016-08-28 细胞系种属鉴定的引物对及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610741909.1A CN106086230B (zh) 2016-08-28 2016-08-28 细胞系种属鉴定的引物对及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106086230A CN106086230A (zh) 2016-11-09
CN106086230B true CN106086230B (zh) 2017-07-21

Family

ID=57226011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610741909.1A Expired - Fee Related CN106086230B (zh) 2016-08-28 2016-08-28 细胞系种属鉴定的引物对及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106086230B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114062685B (zh) * 2021-11-24 2023-12-26 武汉尚恩生物技术有限公司 一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917661A (zh) * 2011-05-12 2014-07-09 网络百奥有限公司 用于快速多重扩增str基因座的方法和组合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917661A (zh) * 2011-05-12 2014-07-09 网络百奥有限公司 用于快速多重扩增str基因座的方法和组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
15个STR基因座的种属特异性研究;梁景青等;《山西医科大学学报》;20070131;第38卷(第1期);第14页第1.2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106086230A (zh) 2016-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107075581B (zh) 由靶向测序进行数字测量
Bergkessel et al. Colony PCR
Rosato et al. Conserved organisation of 45S rDNA sites and rDNA gene copy number among major clades of early land plants
Rivarola et al. Castor bean organelle genome sequencing and worldwide genetic diversity analysis
CN105696088B (zh) 一种双酶切简化基因组二代测序文库构建方法及配套试剂盒
US20220389416A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONSTRUCTING STRAND SPECIFIC cDNA LIBRARIES
CN103710455B (zh) 一种获得寡核苷酸探针的方法
Vasilishina et al. Relative human telomere length quantification by real-time PCR
CN104480202B (zh) 一种丝瓜内参基因及其应用
CN107841566B (zh) 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
EP3378948B1 (en) Method for quantifying target nucleic acid and kit therefor
CN106086230B (zh) 细胞系种属鉴定的引物对及其应用
CN111944917B (zh) 一种基于转录组测序开发山茶属植物ssr引物的方法
WO1999043856A1 (en) Allelic ladders for short tandem repeat loci
CN110218811B (zh) 一种筛选水稻突变体的方法
CN104560982A (zh) 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
Matyášek et al. Unique epigenetic features of ribosomal RNA genes (rDNA) in early diverging plants (Bryophytes)
CN113403417A (zh) 用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的SSR分子标记AerM01及其应用
CN106967833B (zh) 用于二倍体a基因组棉种和/或四倍体棉种鉴定的引物及其pcr鉴定方法
CN113957159B (zh) 一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN112680542B (zh) 一种兰科植物通用型ssr分子标记引物组合物及其应用
CN108277293B (zh) 转基因水稻g6h1品系特异性lamp检测方法
CN108624593B (zh) 一种苎麻的Bn-miR52及其应用
KR101803677B1 (ko) 메틸로박테리움 필로스피아래 cbmb27 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
CN116064507B (zh) 大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段、遗传性别标记引物及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170721