KR101672240B1

KR101672240B1 - 인간 객체 염색체 상의 str 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트

Info

Publication number: KR101672240B1
Application number: KR1020150189847A
Authority: KR
Inventors: 신경진; 이은영; 오유나; 양영근; 이승환; 심정은; 김혜연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-11-07

Abstract

본 발명은 23개의 global STR 유전자형을 동시에 분석할 수 있는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR 분석방법(Kplex-23 system)에 관한 것이다. 본 발명에서 구축한 Kplex-23 system은 CODIS Core Loci Working Group에서 확장을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP 등 23개 마커를 동시에 분석할 수 있다. 본 발명의 분석방법은 기존 Kplex system과의 호환성을 최대한 유지하면서도 희귀 대립유전자가 나타날 경우에도 STR 유전자형을 결정에 문제가 최소화 되도록 설계되었다. 특히, 4개의 형광 dye를 사용하여 모든 마커의 amplicon 크기가 70 bp ~ 420 bp가 되도록 구축되었으며, 100 pg의 DNA를 대상으로도 allele drop-in이나 drop-out 없이 모든 STR의 유전자형을 결정할 수 있는 민감도를 가지고 있다. 본 발명의 분석방법을 적용한 분석키트는 Prototype 개발 단계에서 사용한 기본적인 PCR 효소와 버퍼뿐 아니라 국산 효소와 버퍼를 사용하여도 대등한 PCR performance를 나타내므로, 향후 대립유전자 사다리의 구축을 통하여 확장 STR 분석키트를 국산화 할 수 있을 것이다.

Description

인간 객체 염색체 상의 STR 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트{Method for Analysing Human Subject Chromosomal STR and Kits using Thereof}

본 발명은 인간 객체 염색체 상의 STR 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트에 관한 것이다.

현재 국내의 DNA 데이터베이스는 기본적으로 13개 CODIS (Combined DNA Index System) STR 마커를 분석하여 구축되고 있으나, 분해된 시료의 분석이나 복잡한 가족관계의 확인 등에서 유전자검사 식별력을 높이기 위하여 추가 상염색체 STR 분석이 요구되고 있다. 유럽에서 핵심 STR 마커를 확장한 것에 이어 최근에 미국의 CODIS Core Loci Working Group에서도 20개의 STR 마커로 확장하는 것을 권고하고 있으며(Forensic Science International: Genetics 6 (2012) e52e54), 이러한 확장 상염색체 STR을 분석할 수 있는 검사 키트도 상용화 되어 출시되었다 (도 1; PowerPlex Fusion System (Promega); GlobalFiler System (Life Technologies)).

DNA 데이터베이스 구축에 따라 국가적인 DNA 감식 수요의 지속적 증가가 예상되고 있으나 현재 국내 DNA 감식은 전적으로 외국의 상용 검사 키트와 장비를 사용하여 수행되고 있다. 특히 DNA 감식 키트는 DNA 데이터베이스 예산의 상당한 부분을 차지하고 있는 상황이다. 이에 국내에서도 20개 이상의 상염색체 STR로 구성된 멀티플렉스 PCR 시스템을 구축하여 DNA 감식 비용을 절감하고 차세대 DNA 데이터베이스 구축에 대비하기 위한 관련 기술을 축적할 필요성이 있다.

본 발명의 목표는 CODIS Core Loci Working Group에서 분석을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP(도 2)을 동시에 분석 가능한 멀티플렉스 PCR 시스템의 프로토타입(prototype)을 구축하여 민감도를 조사하고, 프라미어 부착부위의 돌연변이 여부 및 확장 상염색체 분석 상용 키트 결과와의 concordance를 확인하는 것으로 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 유전자검사의 식별력을 높이기 위하여 23개의 법과학 마커를 동시에 증폭 가능한 멀티플렉스 PCR 시스템(Kplex-23 system)을 개발하였다. 본 발명에서 사용하는 마커는 CODIS Core Loci Working Group에서 분석을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP을 추가로 포함하고 있으며, 기존 Kplex system과의 호환성을 최대한 유지하면서도 희귀 대립유전자의 유전자형 결정에 문제가 최소화 되도록 설계하였으며, 최종적으로는 4개의 형광 dye를 사용하면서 모든 마커의 amplicon 크기가 420 bp 이하가 되도록 멀티플렉스 PCR 시스템을 구축하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 객체(human subject)의 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인간 객체(human subject)의 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석방법을 제공한다: (a) 인간 객체 DNA 시료의 아멜로제닌(Amelogenin), D5S818, TH01, D18S51, TPOX (Human thyroid peroxidase gene), D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO (Human c-fms p20, -oncogene for CSF-1 receptor gene), vWA (von Willebrand factor A), D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA (Human fibrinogen alpha chain), Y-M175 및 D12S391 의 유전좌위에 상보적으로 결합하는 각각의 프라이머를 이용하여 증폭을 실시하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하여, 상기 인간 객체를 유전자로 감식하는 단계; 를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법.

본 발명자들은 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 인간 객체의 유전자 감식 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 유전자검사의 식별력을 높이기 위하여 23개의 법과학 마커를 동시에 증폭 가능한 멀티플렉스 PCR 시스템(Kplex-23 system)을 개발하였다. 본 발명에서 사용하는 마커는 CODIS Core Loci Working Group에서 분석을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP을 추가로 포함하고 있으며, 앞서 개발된 Kplex system과의 호환성을 최대한 유지하면서도 희귀 대립유전자의 유전자형 결정에 문제가 최소화 되도록 설계하였으며, 최종적으로는 4개의 형광 dye를 사용하면서 모든 마커의 amplicon 크기가 420 bp 이하가 되도록 멀티플렉스 PCR 시스템을 구축하였다. 본 발명자들은 Kplex-23 키트가 PowerPlex®Fusion System과 비교하여 검사 동일성이 매우 높고 증폭 효율이 뛰어남을 확인하였다.

한편, 본 발명자들은 GeneMapper ID를 이용한 유전자형 결정을 위한 임시 bin set과 panel을 구축하였고, 연속으로 희석된 표준 DNA를 사용하여 100pg의 DNA 시료에서 allele drop-in이나 drop-out 없이 모든 STR의 유전자형을 결정할 수 있는 민감도를 확인하였다. 또한 100개 이상의 한국인 시료를 대상으로 PowerPlex Fusion System과 Kplex-23 System으로 분석한 유전자형을 비교한 결과 모든 시료에 대해 동일한 것을 확인하였다. 본 발명에서 구축된 Kplex-23 sysyem은 국산 PCR 효소와 버퍼를 이용하였을 경우에도 대등한 PCR performance를 나타내고 있으므로, 향후 대립유전자 사다리 구축과 유효화 시험을 통하여 국산화 할 수 있을 것이다.

본 명세서에서, 용어 'STR'은 인간 게놈(genome) 내의 어떤 형질 등의 유전정보를 담고 있지 않은 인트론(intron) 내에 널리 분포한 것으로 알려진 반복염기서열(tandem repeat sequence)들은 유전자 감정의 마커(marker)로서 범세계적으로 유용하게 사용되고 있다. 인간의 게놈에서 많은 유전좌위가 다형성의 STR 부위를 함유하고 있다. STR 좌위는 길이가 2 내지 7개의 염기쌍인 짧은 반복 서열 요소로 구성되어 있는데, 인간의 게놈에는 매 1형성kb마다 한 번씩, 2백 만개의 삼량체 및 사량체 STR이 존재하는 것으로 추정된다. 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 단위의 수가 변함에 따라, 이 좌위에서의 DNA 길이가 각 대립 형질(allele) 및 각 개인에 따라 변하게 된다. STR 좌위는 이 반복 배열의 측부에 동정되어 있는 특정 프라이머 서열을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 분석대상인 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료이며, 이에 한정되지 않는다.

상기 DNA 시료는 DNA를 포함하는 생물학적 시료(biological sample)이다. 한편, 상기 DNA 시료는 단일-소스(single-source) 시료 또는 2 이상 소스의 혼합 시료(mixture)로 구성될 수 있다. 상기 DNA 시료는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 통해 수득할 수 있다. 예컨대, 상기 조직에 DNA 용해 완충액(예컨대, tris-HCl, EDTA, EGTA, SDS, 디옥시콜레이트(deoxycholate), 및 트리톤X (tritonX) 및/또는 NP-40을 포함)을 처리하여 DNA를 분리한다.

본 발명의 방법에는 생물학적 시료에서 분리된 DNA를 적용할 수 있지만. 상기 생물학적 시료를 직접 이용하여 핵산분자가 관여하는 직접 PCR(Direct Polymerase Chain Reaction)을 실시할 수도 있다(대한민국 등록특허 10-0746372 참조).

상기 유전좌위 중 아멜로제닌 유전좌위는 인간의 성별을 식별하기 위하여 사용되는 성염색체 상의 유전좌위이다. 아멜로제닌 좌위는 남성 DNA에 존재하는 Y 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELY로서 여성 DNA에 존재하는 X 염색체 상의 좌위를 확인하는 경우 HUMAMELX로서 확인된다.

이하, 본 발명의 유전자 감식 방법에 대하여 단계별로 상세하게 설명한다:

단계 (a): 멀티플렉스 증폭 단계

우선, 분석대상인 DNA 시료의 아멜로제닌, D5S818, TH01, D18S51, TPOX, D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, vWA, D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA, Y-M175 및 D12S391에 결합하는 각각의 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 증폭을 실시한다.

본 명세서에 기술된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스(multiplex) PCR, 인덱싱(indexing) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), 인버스 PCR (inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 멀티플렉스 증폭은 멀티플렉스 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭, 또는 직접(direct) 멀티플렉스 PCR 증폭이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 증폭산물은 70-420 bp 이다.

상기 단계 (a)의 멀티플렉스 유전자 증폭은 57-61℃의 어닐링(annealing) 온도 조건을 가지며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 59℃의 어닐링 온도 조건을 갖는다. 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 PCR 증폭은 PCR을 실시하는 데 적정한 싸이클 수가 요구된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 27-31 싸이클, 28-30 싸이클 또는 29 싸이클로 실시한다. 한편, 단계 (a)의 멀티플렉스 PCR 증폭에 사용되는 프라이머 최종 농도는 표 3 및 표 4와 같다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 유전자 증폭은 다음 반응조건으로 실시된다: 95°C, 15분; (29싸이클) 94°C, 20초, 59°C, 90초, 72°C, 60초; 60°C, 60분.

본 발명은 상기 DNA 시료의 아멜로제닌, D5S818, TH01, D18S51, TPOX, D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, vWA, D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA, Y-M175 및 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 각각의 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 증폭을 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제1서열 및 제2서열이고; 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제3서열 및 제4서열이며; 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제5서열 및 제6서열이고; 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제7서열 및 제8서열이며; 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제9서열 및 제10서열이고; 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제11서열 및 제12서열이며; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제13서열 및 제14서열이고; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제15서열 및 제16서열이며; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제17서열 및 제18서열이고; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제19서열 및 제20서열이며; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제21서열 및 제22서열이고, 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제23서열 및 제24서열이며; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제25서열 및 제26서열이고; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제27서열 및 제28서열이며; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제29서열 및 제30서열이고; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제31서열 및 제32서열이며; 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제33서열 및 제34서열이며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제35서열 및 제36서열이며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제37서열 및 제38서열이며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제39서열 및 제40서열이며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제41서열 및 제42서열이며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제43서열 및 제44서열이며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제45서열 및 제46서열이다.

본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 피크 균형을 맞추기 위한 최적의 배합비를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.4-0.8 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.25-0.65 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.55-0.95 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.02-0.42 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.08-0.48 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.45-0.85 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.40 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.25-0.65 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.60-1.00 μM의 최종농도를 갖고; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.38 μM의 최종농도를 가지며; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20-0.60 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.40 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.05-0.45 μM의 최종농도를 가지며, 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.53-0.93 μM의 최종농도를 가지며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.50-0.90 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 가지며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.40-0.80 μM의 최종농도를 가지며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가진다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.5-0.7 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.35-0.55 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20-0.40 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.65-0.85 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.12-0.32 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.90-1.10 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.18-0.38 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.55-0.75 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20-0.40 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.30 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.35-0.55 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.70-0.90 μM의 최종농도를 갖고; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.08-0.28 μM의 최종농도를 가지며; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.30-0.50 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.30 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.15-0.35 μM의 최종농도를 가지며, 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.63-0.83 μM의 최종농도를 가지며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.90-1.10 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.60-0.80 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20-0.40 μM의 최종농도를 가지며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.50-0.70 μM의 최종농도를 가지며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.90-1.10 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.90-1.10 μM의 최종농도를 가진다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.6 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.45 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.30 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.75 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.22 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.00 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.28 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.65 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.30 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.45 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80 μM의 최종농도를 갖고; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.18 μM의 최종농도를 가지며; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.40 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.25 μM의 최종농도를 가지며, 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.73 μM의 최종농도를 가지며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.00 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.70 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.30 μM의 최종농도를 가지며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.60 μM의 최종농도를 가지며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.00 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 1.00 μM의 최종농도를 가진다.

본 발명에서 사용되는 프라이머는 형광염료 서열이 부착되어 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자 감식 방법에 이용되는 프라이머는 유전좌위에 상보적으로 결합하는 한 쌍의 프라이머 중 하나의 프라이머의 5’말단에 형광염료가 표지된다. 상기 제1형광염료 내지 제4형광염료는 모세관 전기영동을 통해 검출할 수 있도록 한 레인에 5 내지 6개의 유전좌위를 배치하는 구성하기 위한 표지이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열 내지 제46서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 형광염료(FAM, VIC, NED 및 PET)로 표지된다.

한편, 단계 (a)에서 유전자 증폭 반응에는 다양한 반응 버퍼가 이용될 수 있지만, 본 발명에서는 Kplex-23 시스템에 최적화된 HotST*Rplus 버퍼(50 mM Tris(pH 8.6), 5 mM KCl, 10 mM 암모늄 설페이트, 0.2 mg/mL BSA, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂)를 사용하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 프라이머는 HPLC 정제 및 G-25 정제를 실시하여 제조된다.

상기 단계 (a)에서 프라이머를 이용하여 생성된 PCR 증폭산물을 대상으로 STR 분석을 실시한다.

단계 (b): 유전자 감식 단계

이어, 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하여, 상기 인간 객체를 유전자로 감식한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서는 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교/평가하여 실시한다. 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 유전좌위-특이적 대립유전자 래더이다.

본 발명의 상기 크기 표준물은 다양한 반복 횟수의 STR(Short Tandem Repeat)를 갖는 분획들로 구성되므로, 멀티플렉스 증폭 산물의 정확한 크기 및 서열을 분석하여 정확한 대립유전자를 평가하는데 이용된다. 상기 래더는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 통해 수득할 수 있다. 예컨대, 다양한 대립유전자형의 gDNA(genome DNA)를 유전좌위 별로 증폭한 후 증폭한 결과에 따라 적절한 배합비로 혼합/희석하고 다시 증폭하여 유전좌위-특이적 대립유전자 래더를 제조하는 방법, 상업용 키트의 래더를 주형으로 하여 해당 유전좌위의 래더를 수득하는 방법, 직접 합성 방법 및 2-3개의 분절을 합성하여 전체 길이의 증폭 산물을 제조하는 방법 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

일반적으로 유전좌위의 대립 형질들은 증폭된 부위 내에 함유되어 있는 반복 서열의 복제수(the number of copy)에 따라 구분되며, 전기 영동법으로 분리한 후, 방사성, 형광, 실버 스테인 및 색채 등 적당한 검출 방법을 사용하여 식별한다.

전기영동은 분산된 공간적으로 동일한 전기장의 영향 하에 입자의 움직임의 흐름에 관한 것이다(Lyklema, J. (1995). Fundamentals of Interface and Colloid Science. vol. 2. p. 3.208; Hunter, R.J. (1989). Foundations of Colloid Science. Oxford University Press; Dukhin, S.S.; B.V. Derjaguin (1974). Electrokinetic Phenomena. J. Willey and Sons; Russel, W.B.; D.A. Saville and W.R. Schowalter (1989). Colloidal Dispersions. Cambridge University Press; Kruyt, H.R. (1952). Colloid Science. Volu El1, Irreversible systems. Elsevier 및 Dukhin, A.S.; P.J. Goetz (2002). Ultrasound for characterizing colloids. Elsevier). 전기영동의 종류로는 친화성 전기영동(Affinity electrophoresis), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis) 및 겔 전기영동(Gel electrophoresis) 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리(separate)하기 위한 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis)을 이용한다. 상기 모세관 전기영동은 전하를 띄고 있는 이온들에 전기장을 걸어주어 각 이온들은 반대전하를 띤 전극으로 이동하는 데 이때의 이동속도는 각 이온들의 평균 전하, 크기, 모양, 용매의 성질에 따라 달라진다. 모세관 전기영동은 이온들이 가느다란 관을 통하여 존재하도록 한 상태에서 관의 양끝에 전기장을 걸어 줄 때 이온들이 관내에서 그들의 성질에 따라 각기 다른 속도로 일정한 방향성을 가지면서 이동하는 성질을 이용하여 물질을 분리하는 장치이다.

본 발명의 유전자 감식 방법은 법의학적 타이핑(Forensic typing) 또는 신원확인의 용도를 갖는다.

한편, 상기 단계 (b) 이후에, 본 발명의 방법에 의해 결정된 STR의 대립유전자형의 정확성을 판단하기 위하여 CE 분석법을 이용한 STR의 대립 유전자형과 비교하는 단계를 추가적으로 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아멜로제닌(Amelogenin), D5S818, TH01, D18S51, TPOX (Human thyroid peroxidase gene), D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO (Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene), vWA (von Willebrand factor A), D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA (Human fibrinogen alpha chain), Y-M175 및 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 각각의 프라이머를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR 분석방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 23개의 global STR 유전자형을 동시에 분석할 수 있는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR 분석방법(Kplex-23 system)을 제공한다.

(b) 본 발명에서 구축한 Kplex-23 system은 CODIS Core Loci Working Group에서 확장을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP 등 23개 마커를 동시에 분석할 수 있다.

(c) 본 발명의 분석방법은 기존 Kplex system과의 호환성을 최대한 유지하면서도 희귀 대립유전자가 나타날 경우에도 STR 유전자형을 결정에 문제가 최소화 되도록 설계되었다.

(d) 특히, 4개의 형광 dye를 사용하여 모든 마커의 amplicon 크기가 70 bp -420 bp가 되도록 구축되었으며, 100 pg의 DNA를 대상으로도 allele drop-in이나 drop-out 없이 모든 STR의 유전자형을 결정할 수 있는 민감도를 가지고 있다.

(e) 본 발명의 분석방법을 적용한 분석키트는 Prototype 개발 단계에서 사용한 기본적인 PCR 효소와 버퍼뿐 아니라 국산 효소와 버퍼를 사용하여도 대등한 PCR performance를 나타내므로, 향후 대립유전자 사다리의 구축을 통하여 확장 STR 분석키트를 국산화 할 수 있을 것이다.

도 1은 확장 상염색체 STR 분석에 사용된 타사 키트를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 사용된 STRs 및 타겟 마커를 나타낸다.
도 3는 Kplex-16 system를 사용하는 2800M 표준 DNA의 전기영동도(electropherogram)를 나타낸다.
도 4는 Kplex-16 system의 대립유전자 크기 범위(Allelic size range)를 나타낸다.
도 5는 D1S1656, D2S441, D10S1248, D12S391, D22S1045, DYS391 마커 정보 (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/)이다.
도 6은 한국인을 대상으로 한 Y-M175 SNP에 대한 연구 논문 (Forensic Science International: Genetics,7, Issue 1, 75-81 (January 2013))이다.
도 7은 PowerPlex Fusion system의 allelic ladder 정보이다.
도 8은 Kplex 확장 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 2800M 표준 DNA의 전기영동도를 나타낸다.
도 9는 Kplex-23 확장 멀티플렉스 PCR 시스템을 이용한 2800M 표준 DNA의 전기영동도를 나타낸다.
도 10a 및 도 10b 는 Kplex-23 시스템을 이용한 패널 및 bin set 의 지노타이핑 전기영동도를 나타낸다. A. 2800M; B. 9948
도 11a 내지 도 11d 는 희석된 DNA의 전기영동도이다. 11a. 125 pg of 2800M; 11b. 100 pg of 2800M; 11c. 100 pg of 007DNA; 11d. 62.5 pg of 2800M.
도 12는 PowerPlex Fusion system을 이용한 2800M의 전기영동도이다.
도 13은 100개 이상 샘플 중 하나의 전기영동도이다. 13a PowerPlex Fusion system; 13b. Kplex-23 system
도 14는 Hot Taq. (5U/ul) 및 BQHotST*R plus Buffer (BioQuest)를 이용한 2800M의 전기영동도이다.
도 15는 Kplex-23 system의 23 loci 대립유전자 크기 범위를 나타낸다.
도 16a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 Gold ST*R buffer / GoldTaq 으로 증폭한 결과를 나타낸다. 도 16b는 9948 DNA 100pg을 사용하여 Gold ST*R buffer / GoldTaq 으로 증폭한 결과
도 17a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 Gold ST*R buffer / GoldTaq 으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다. 도 17b는 9948 DNA 250pg을 사용하여 Gold ST*R buffer / GoldTaq 으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다.
도 18a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 HotST*R buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다. 도 18b는 9948 DNA 250pg을 사용하여 HotST*R buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다.
도 19a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다. 도 19b는 9948 DNA 125pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(P-2정제)를 나타낸다.
도 20a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(G-25정제)를 나타낸다. 도 20b는 9948 DNA 125pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(G-25정제)를 나타낸다.
도 21a는 9948 DNA 1000pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(HPLC정제프라이머 & G-25정제)를 나타낸다. 도 21b는 9948 DNA 62.5pg을 사용하여 HotST*Rplus buffer / HotTaq-fx으로 증폭한 결과(HPLC정제프라이머 & G-25정제)를 나타낸다.
도 22는 본 발명에서 제작된 래더를 나타낸다.
도 23은 Kplex-23 키트의 증폭 효율을 알아보기 위한 예비 실험 결과를 나타낸다.
도 24a는 Buccal FTA card로부터의 Kplex-23 다이렉트 PCR 결과를 나타내고, 도 24b는 Buccal Swab으로부터의 Kplex-23 다이렉트 PCR 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

I. 확장 상염색체 STR 분석용 multiplex PCR system의 prototype 구축

연구방법 및 결과

1. Kplex-16 system 구축

대검찰청에서 선행 연구로 구축된 Kplex-15 system에서 확장 상염색체 STR에 포함되지 않는 D6S1043을 제외하고, 프라이머를 새로 설계하여 TPOX 유전좌위의 위치를 FAM lane의 뒤로 배치하고 기존 NED lane의 TPOX 위치에 CSF1PO를 위치시켜 필수 STR 분석에 유리하도록 멀티플렉스 PCR 시스템을 변경하였다. 이때 D5S818 locus의 global allele을 고려하여 TH01과의 간격을 확보하기 위해 D5S818과 TH01 프라이머를 변경하였다. D18S51 locus는 기존 Kplex-15 system의 프라이머 세트가 새로 추가되는 여러 프라이머와 간섭을 일으켜 부득이하게 새로 설계하였고, D7S820 locus는 allele간의 피크 높이 균형의 개선과 보다 안정된 완전 아데닐화(complete adenylation)를 위해 forward 프라이머의 5’ 말단에 G 염기를 추가하였다. 마지막으로 VIC lane의 끝에 D19S433을, NED lane의 끝에 D2S1338이 위치되도록 하여 Identifiler loci와 호환성을 갖는 Kplex-16 system을 구축하였다(도 3 및 도 4).

2. 새로 추가되는 마커의 정보수집 및 프라이머 설계

CODIS Core Loci Working Group에서 Identifiler loci에 더하여 새로 추가하도록 권고하는 새로운 5개 STR과 (D1S1656, D10S1248, D2S441, D12S391, DYS391)과 D22S1045, Y-M175의 염기서열 정보를 STRBase (http://www.cstl.nist.gov/div/strbase), GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 기존 문헌의 내용을 참고하여 수집하였다(도 5a 및 도 5b).

Y-M175 마커는 Stanford University의 Peter Underhill에 의해 175번째 발견된 Y 염색체상의 indel 마커로 동아시아인과 동남 아시아인에게 흔한 Y-SNP O haplogroup에 속하는 시료에서 “TTCTC” 의 소실(deletion)이 나타난다 (도 6). 이 마커를 분석하면 Y 염색체의 존재 여부와 함께 시료가 haplogroup O에 속하는지의 여부도 부가적으로 확인할 수 있어 최근 출시된 상용 kit인 GlobalFiler에도 포함되어 있다.

수집된 염기서열 정보를 바탕으로 Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)등의 primer 설계 프로그램을 이용하여 새로운 마커를 증폭할 수 있는 후보 primer set을 설계하고, 이들 중 최상의 PCR 결과를 나타내는 primer set을 선정하였다. 또한 PowerPlex Fusion system (도 7)과 GlobalFiler system의 대립유전자와 한국인에서 관찰된 희귀 대립유전자 자료를 바탕으로 STR 유전좌위간 겹침이 최소화 되도록 하여 유전자형을 결정할 수 있도록 새로 추가되는 각 STR 유전좌위를 대략적으로 배치하였다.

3. Kplex Expanded PCR system 구축

새로 추가된 7개의 마커가 PCR 증폭에서 프라이머 간 간섭이 없고, 전기영동에서 STR의 대립유전자형 결정에 문제가 없도록 STR 유전좌위 간 적절한 간격과 peak 높이 균형이 유지되는 최적의 primer 조합을 선정하여 multiplex PCR system을 구축하였다 (도 8).

4. Kplex-23 멀티플렉스 PCR 시스템 구축

Kplex-16 시스템과 새로 구축한 Kplex Expanded system의 프라이머를 같이 사용하여 총 23개의 마커를 동시에 분석할 수 있도록 하였고, 두 system의 피크 높이 균형을 유지하기 위해 프라이머 양을 최종적으로 조절하여 최적화 하였다(도 9). 이때 PCR 최종 반응용액양은 10.0 ㎕로 하였으며 10x Gold ST*R 버퍼는 1.0 μl, AmpliTaq. Gold DNA 폴리머라아제는 4.0 U, 2.5x 프라이머 세트 4.0 μl, 그리고 genomic DNA는 1.0 ng을 사용하였다. PCR 증폭은 95℃ 11분 처리 후 94℃ 20초, 59℃ 1분 30초, 72℃ 1분으로 29회의 온도 순환을 거친 후, 60℃에서 45분간 반응하였다(표 1).

반응 혼합물 조성

A. Gold Taq.		B. BioQuest Taq.
조성	반응 당 부피 (ul)	조성	반응 당 부피 (ul)
dH₂O	3.2	dH₂O	3.2
10x Gold ST*R buffer	1.0	10x BQHotST*R plus Buffer	1.0
2.5x Primer mix	4.0	2.5x Primer mix	4.0
AmpliTaq. Gold (5 U/㎕)	0.8	Hot Taq. (5 U/ul)	0.8
주형 DNA (1 ng/㎕)	1.0	주형 DNA (1 ng/㎕)	1.0
전체부피	10.0	전체부피	10.0

PCR 증폭산물은 통상의 방법에 따라 ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystem)에서 전기영동 한 뒤 GeneMapper ID Software를 이용하여 증폭산물의 크기와 peak 높이를 확인하였다. 이때, extra-peak, drop-in, drop-out 등의 문제가 관찰되는지 확인하고 필요한 경우 프라이머를 변경하여 문제 해결을 시도하였다. 또한 증폭산물의 전기영동에서 incomplete adenylation이 나타나는 경우는 프라이머를 변경하거나 5’말단에 G 염기를 추가하고, peak 높이 균형을 맞추기 위하여 사용된 프라이머의 농도를 조정하였다. 이로써 STR 유전좌위 간의 일정한 간격과 증폭산물간의 겹침이 발생하지 않는 전기영동 결과를 얻을 수 있었고, peak 높이가 균형을 이루는 최적의 프라이머 세트와 농도를 결정하였다.

5. GeneMapper ID에서 유전자형 결정을 위한 bin set과 Panel 구축

GeneMapper ID Software를 사용하여 유전자형을 자동 결정하기 위해 Kplex-16 system과 Kplex Expanded system을 합한 Kplex-23 system의 정보를 바탕으로 GeneMapper ID용 bin set과 panel을 구축하였다. 2800M과 9948 표준 DNA를 대상으로 구축된 Kplex-23 system의 bin set과 panel을 적용하여 유전자형을 분석하였을 때 문헌상에 알려진 표준 DNA의 STR 유전자형과 일치함을 확인할 수 있었다 (도 10a 및 도 10b).

6. 연속 희석된 DNA 시료를 대상으로 한 민감도 확인

Kplex-23 시스템을 사용하여 어느 정도 양의 DNA까지 각각의 STR 유전자형 결정이 가능한 지 알아보기 위해 순차적으로 희석한 DNA를 대상으로 민감도 확인 시험을 수행하였다. 500 pg, 250 pg, 125 pg, 100 pg, 62.5 pg, 31.2 pg으로 연속 희석한 2800M standard DNA와 100 pg의 007 DNA를 준비하고, 표 1의 PCR 조건으로 29회의 PCR 온도순환을 적용하여 각각의 농도의 DNA에 대하여 최소한 2번 이상 증폭하여 ABI 3130xl analyzer (Applied Biosystems)에서 전기영동 하였다. 그 결과 100 pg의 DNA 농도까지는 각각의 STR 유전자형을 결정하는 데에는 allele drop-in이나 allele drop-out 없이 안정적인 결과를 나타냈으며, 62.5 pg의 DNA에서는 1 - 2개의 유전좌위에서 allele drop-out이 발생하였다(도 11a-11d).

결론적으로 Kplex-23 system은 100 pg의 DNA 시료를 대상으로 allele drop-in이나 drop-out 없이 모든 STR의 유전자형을 결정할 수 있는 민감도를 가지고 있음을 확인하였다.

7. PowerPlex Fusion system과의 concordance 시험

임시 구축한 Kplex-23 system 용 bin set과 panel을 이용하여 표준 DNA를 대상으로 분석한 유전자형 결과는 확장 STR을 분석할 수 있는 대표적인 상용 kit인 PowerPlex Fusion system으로 분석한 결과와 일치하는 것을 확인하였다 (도 12).

나아가 100개 이상의 임의로 선택된 한국인 DNA 시료를 대상으로 PowerPlex Fusion system을 사용하여 유전자형을 결정하고, 동일한 시료를 대상으로 새로 구축한 Kplex-23 system을 이용하여 유전자형을 분석한 결과 primer 부착부위의 돌연변이에 의한 peak loss는 관찰할 수 없었고, 모든 시료에서 동일하게 유전자형이 결정되는 것을 확인하였다 (도 13a 및 13b).

Concordance 시험 대상 시료 중에서 bin set을 벗어나는 micro-variant가 D2S441 유전좌위에서 다수 관찰되었다(표 2). 관찰된 micro-variant는 PowerPlex Fusion system과 Kplex-23 system에서 모두 동일하게 관찰되었으므로 Kplex-23 system의 primer set의 문제가 아님을 알 수 있다. 향후 Kplex-23 system을 위한 대립유전자 사다리를 구축할 때 이러한 대립유전자를 추가하는 것을 고려하여야 하겠다.

샘플	PCR 시스템	Allele
ST36	PowerPlex Fusion	9.1,11
ST36	Kplex-23	9.1,11
ST40	PowerPlex Fusion	9.3,12
ST40	Kplex-23	9.3,12
ST52	PowerPlex Fusion	9.1,11
ST52	Kplex-23	9.1,11
ST92	PowerPlex Fusion	9.1,10
ST92	Kplex-23	9.1,10
ST114	PowerPlex Fusion	9.1,11
ST114	Kplex-23	9.1,11
ST115	PowerPlex Fusion	9.1,14
ST115	Kplex-23	9.1,14
ST129	PowerPlex Fusion	9.1,11
ST129	Kplex-23	9.1,11
ST142	PowerPlex Fusion	9.1,11
ST142	Kplex-23	9.1,11

8. 기존 Gold Taq. PCR 시스템과 국산 PCR 효소와 버퍼 시스템의 performance 비교

국산 PCR 효소와 버퍼 시스템을 적용하여 구축된 Kplex-23 시스템의 PCR performance를 알아보기 위해 국내 바이오퀘스트에서 생산된 Hot Taq. (5U/ul)와 HotST*Rplus 버퍼를 사용하여 유전자형을 결정해 보았다 (도 14).

즉, 동일한 조건하에서 BioQuest의 Hot Taq.과 HotST*Rplus 버퍼를 사용하고 PCR의 initial activation time을 15분으로 하여 PCR(표 1-B)을 수행하였을 때, 기존의 AmpliTaq. Gold DNA polymerase와 Gold ST*R buffer를 사용한 결과와 거의 대등한 PCR performance로 유전자형을 결정할 수 있음을 확인하였다.

9. Kplex-23 system의 평가

최종 확정된 Kplex-23 system의 프라이머 세트와 농도는 표 3 및 표 4와 같으며, CODIS Core Loci Working Group에서 확장을 권고하는 STR과 유럽 표준 확장 STR을 포함하여 성별을 구분하는 마커 및 Y 염색체 SNP 등 23개 마커를 동시에 분석할 수 있다. PowerPlex Fusion system과 GlobalFiler system의 대립유전자와 한국인에서 관찰된 희귀 대립유전자를 고려하여 STR 유전자의 분석 위치를 배치하면서 기존 Kplex system과 호환성을 최대한 유지하여 설계되었다. 4개의 형광 dye를 사용하여 70 bp - 420 bp의 amplicon 크기를 생성하며(도 15) 현장 시료의 분석에도 적용할 수 있는 정도의 민감도를 가지고 있다. PowerPlex Fusion System과의 concordance 시험에서 결정된 유전자형에서도 차이를 나타내지 않고, 국산 PCR 효소와 버퍼를 사용하였을 경우에도 대등한 PCR performance를 보이고 있다.

프라이머 서열 및 최종 농도(1)

레인 (lane)	locus	프라이머	서열	최종농도 (μM)
FAM	Amelo	F180g	Gccctttgaagtggtaccagag	0.60
	Amelo	R262*	FAM-gcatgcctaatattttcagggaataa	0.60
	D5S818	F156	FAM-agggtgattttcctctttggt	0.60
	D5S818	R270m1	atctttatctgtatccttatttatacMtctatct	0.60
	TH01	F117	FAM-gattcccattggcctgttc	0.18
	TH01	R289	ctcctgtgggctgaaaagc	0.18
	D18S51	F177g	Gggagatgtcttacaataacagttgc	1.00
	D18S51	R429	FAM-cagctacttgcagggctga	1.00
	TPOX	F084*	FAM-cactagcacccagaaccgtc	0.22
	TPOX	R404	aagcactctcgtgtttgcgt	0.22
	D1S1656	F123	FAM-ctgtgttgctcaagggtcaa	1.00
	D1S1656	R518g	Gtcccttaggcatttattcagtg	1.00
VIC	D3S1358	F164	gagcaagaccctgtctcataga	0.25
	D3S1358	R265*	VIC-tcaacagaggcttgcatgtat	0.25
	D7S820	F183g	GtgtcatagtttagaaYgaactaac	0.35
	D7S820	R344*	VIC-ctcattgacagaattgcacca	0.35
	D21S11	F161*	VIC-aattccccaagtgaattgcc	1.00
	D21S11	R365m	gtcaatgttctccagagacagacta	1.00
	D19S433	F083	VIC-cagcctgggcaacagaataa	0.80
	D19S433	R373	cctggggttctaggaatcaa	0.80
	D10S1248	F000	VIC-attagccccaggaccaatct	0.60
	D10S1248	R342g	Gaaagacactggattccaatatga	0.60
	D22S1045	F160	VIC-tgggcaaaccttaaacctga	0.80
	D22S1045	R571	ctgtaggtggcctggtttct	0.80

프라이머 서열 및 최종 농도(2)

레인 (lane)	locus	프라이머	서열	최종농도 (μM)
NED	CSF1PO	F191	actgccttcatagatagaagat	0.22
	CSF1PO	R295	NED-gaccctgttctaagtacttcct	0.22
	vWA	F096*	NED-gaataatcagtatgtgacttggattg	1.00
	vWA	R249m	aggttagatagagataggacagatga	1.00
	D16S539	F037s	gaagaatccagaaaaccacag	0.33
	D16S539	R250*	NED-tttagcgtttgtgtgtgcatc	0.33
	D2S1338	F095	NED-cataatccagctgtgggagg	1.00
	D2S1338	R387	cttccctgtctcaccccttt	1.00
	D2S441	F131	gactagagtcctgccttggg	1.00
	D2S441	R472	NED-cacccagccataaataacat	1.00
	DYS391	F085	atgtatggagacatttttggtca	1.00
	DYS391	R286	NED-tgcaagcaattgccatagag	1.00
PET	D8S1179	F173*	PET-tttttgtatttcatgtgtacattcgt	0.60
	D8S1179	R275	gtagattattttcactgtggggaa	0.60
	D13S317	F169*	PET-tggactctgacccatctaacg	0.60
	D13S317	R328g	Gctcctccttcaacttgggtt	0.60
	FGA	F109*	PET-caaatgccccataggttttg	0.80
	FGA	R336	aatatggttattgaagtagctgctg	0.80
	Y-M175	F028	agtgctctgtgacataccaatca	0.80
	Y-M175	R321	PET-ttgcagcattttcagttagcc	0.80
	D12S391	F172g	Gccagagagaaagaatcaacagga	1.00
	D12S391	R549	PET-acacattcttctgcccttgg	1.00

결론

본 발명에서는 아멜로제닌, D1S1656, D2S441, D2S1338, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D10S1248, D12S391, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, D22S1045, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, DYS391 및 Y-M175 마커를 동시에 분석할 수 있는 multiplex PCR system (Kplex-23)의 prototype을 구축하였다. 또한 새롭게 구축된 Kplex-23 system은 PowerPlex Fusion system과 GlobalFiler system의 대립유전자와 한국인에서 관찰된 희귀 대립유전자를 고려하여 STR 유전자의 분석 위치를 배치하면서 기존 Kplex system과 호환성을 최대한 유지하여 설계되었다. 또한 4개의 형광 dye를 사용하여 70 bp - 420 bp의 amplicon 크기를 생성하며 현장 시료의 분석에도 적용할 수 있는 정도의 민감도를 가지고 있다. 100여 개의 시료를 대상으로 분석한 결과 primer 부착부위의 돌연변이에 의한 peak loss는 관찰되지 않았고 PowerPlex Fusion System과의 concordance 시험에서도 모든 시료에서 동일하게 유전자형이 결정되었다. 국산 PCR 효소와 버퍼를 사용하였을 경우에도 대등한 PCR performance를 보이고 있어 향후 국산화의 근간이 되는 prototype을 구축하였다고 판단된다.

참고문헌

1. Hares DR. Expanding the CODIS core loci in the United States. Forensic Sci Int Genet. 2012;6:e52-4.

2. Ge J1, Eisenberg A, Budowle B. Developing criteria and data to determine best options for expanding the core CODIS loci. Investig Genet. 2012;3:1. doi: 10.1186/2041-2223-3-1.

3. Park MJ, Lee HY, Kim NY, Lee EY, Yang WI, Shin KJ. Y-SNP miniplexes for East Asian Y-chromosomal haplogroup determination in degraded DNA. Forensic Sci Int Genet. 2013:75-81.

4. Guo F1, Shen H, Tian H, Jin P, Jiang X. Development of a 24-locus multiplex system to incorporate the core loci in the Combined DNA Index System (CODIS) and the European Standard Set (ESS). Forensic Sci Int Genet. 2014;8:44-54.

5. Aznar JM1, Celorrio D, Odriozola A, KoS, Bravo ML, Builes JJ, Pfeiffer H, Herrera RJ, de Pancorbo MM.I-DNASE21 system: development and SWGDAM validation of a new STR 21-plex reaction. Forensic Sci Int Genet. 2014;8:10-9.

6. Ensenberger MG, Hill CR, McLaren RS, Sprecher CJ, Storts DR. Developmental validation of the PowerPlex(®21 System. Forensic Sci Int Genet. 2014;9:169-78.

Ⅱ. 확장 상염색체 STR 분석키트의 유효화 및 제품화 기반 구축

연구방법 및 결과

1. 국산 시약으로의 교체와 유효화를 수행하기 위한 최적화

1) 프라이머 및 시약의 최적화

상기 연구 I (프로토타입 구축)을 통하여 프라이머의 서열과 농도 및 실험 전반에 걸친 프로토타입이 제시된 Kplex-23 키트는 Gold ST*R buffer / GoldTaq PCR 시약을 사용하는 것이었다. 제시된 조건으로 프라이머를 합성하였고 동일 조건을 적용하여 프라이머 합성의 이상 유무와 검출 성능 등을 확인하기 위한 민감도 테스트(9948DNA 1000pg/500/250/125/100/62.5/31.25pg)를 수행하였다.

실험 결과, 1000pg ~ 100pg 범위에서 멀티플렉스 밸런스를 유지하면서 full STR profile을 검출할 수 있었다 (도 16a 및 16b). 그러나 낮은 주형농도에서는 비특이 형광 노이즈가 검출 피크 대비 높아져 개선의 여지가 있었다. 이 피크는 형광 합성 시 발생한 불순물이 원인일 것으로 생각되어 Kplex15 개발 당시 비특이 형광 노이즈 제거를 위하여 적용하였던 P-2 레진을 이용하여 형광 불순물 및 불완전 합성 프라이머를 제거하였다. 예비실험을 통해 P-2레진이 피크 밸런스에 주는 영향을 고려하여 프라이머의 사용농도는 보상하여 주었다. 그 외에는 초기의 프로토타입으로 제시된 조건으로 민감도 테스트를 수행하여, 형광모세관 전기영동으로 증폭 결과의 개선 여부를 확인하였다.

도 17a 및 17b 의 결과에서 보듯이, 비특이 형광 노이즈는 P-2 정제로 부분적인 개선이 되었으나 민감도가 떨어져 250 pg 주형까지만 full STR profile을 검출할 수 있었다. 정제 시 프라이머 수율 손상으로 인한 결과로 추정되었다.

다음은 위의 실험에서 사용한 농도가 보상된 P-2정제 프라이머에 대하여 Kplex15 개발 당시 적용하였던 HotST*R buffer / HotTaq-fx(BioQuest,Inc)를 사용하여 실험을 진행하였다. 이때 버퍼와 효소 외에 다른 조건은 동일하게 해 주었고, PCR 싸이클은 초기 변성만 95℃ 11분에서 95℃ 15분으로 변경하여 주었고 나머지 조건(94℃ 20초, 59℃ 90초 72℃ 60초로 28회, 최종 60℃ 60분)은 동일하게 시행하였다.

P-2정제 프라이머에 대하여 HotST*R buffer / HotTaq-fx를 적용해 본 결과, Gold ST*R buffer / GoldTaq 를 사용하였을 때와 동일하게 250 pg 주형까지만 full STR profile을 검출할 수 있었다(도 18a 및 18b). 그러나 큰 사이즈의 증폭산물일수록 증폭효율이 Gold ST*R buffer / GoldTaq보다 상대적으로 떨어지는 현상이 일어났다. 이를 개선하기 위하여 새로운 조성의 HotST*Rplus buffer를 개발하여 Kplex-23 프라이머에 적용하였다. 이때 모든 조건은 버퍼의 변경 이외에는 HotST*R buffer / HotTaq-fx와 동일하였다. HotST*Rplus buffer는 멀티플렉스 PCR에서 다양한 크기의 Tm과 증폭산물의 길이에 대하여 HotST*R buffer 대비 더 균질한 증폭효율을 보일 수 있도록 완충용액의 농도를 높이고 PCR에 사용되는 염의 농도와 pH를 조절하여 만든 PCR 반응액이다.

HotST*Rplus로 버퍼를 변경하였을 때 9948 DNA 1000 pg에서도 큰 사이즈의 유전좌위들도 증폭효율이 향상되어 동일 프라이머 조건에서도 멀티플렉스 밸런스가 향상되었다(도 19a 및 19b). 따라서 이러한 개선 효과로 인해 125pg까지 민감도가 향상되었고 멀티플렉스 밸런스가 향상되었으나 여전히 100 pg에서 full STR profile은 얻지 못하였고 100 pg 이하의 낮은 주형농도에서의 비특이밴드 검출과 유전자 좌위 내의 검출 피크 불균형은 개선이 필요한 수준을 보였다.

따라서, HotST*Rplus buffer[(50 mM Tris(pH 8.6), 5 mM KCl, 10 mM 암모늄 설페이트, 0.2 mg/mL BSA, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂)] / HotTaq-fx (BioQuest,Inc)를 이용하여 증폭하기로 하고 합성 프라이머의 정제를 P-2 (BioRad) 정제에서 G-25 레진(GE Healthcare)을 이용한 정제로 변경하였고 나머지 조건은 동일하게 하여 정제방식 변경으로 인한 차이를 확인하였다.

P-2에서 G-25정제를 변경하였을 때 민감도는 여전히 125 pg까지 full STR profile을 얻었으나 비특이 밴드 개선이 미세한 차이이긴 하지만 일부 이루어졌고 100 pg 이하에서의 100 rfu 검출율도 향상된 것으로 판단되었다 (도 20a 및 20b). 그러나, 유효화 테스트를 위한 시제품을 제조하여 대검찰청에 요청하여 제품의 성능 및 민감도 검사를 시행한 결과, 유효화 테스트를 진행하기 위해서는 민감도 향상 및 100pg 이하에서의 비특이 밴드가 여전히 해결되어야 하는 문제를 가지고 있었다.

따라서, 프라이머의 정제 전략을 합성 후 자체 정제뿐 만 아니라 합성 직후 탈염만을 진행하던 방식에서 HPLC 정제를 추가하는 것으로 변경한 후 G-25를 추가할지 여부를 테스트하기로 하였다. 이때 HPLC 정제는 비특이 밴드 문제 해결이 필요한 Blue 과 Green panel에 해당되는 프라이머에 대하여 합성과정에서 수행하였고 Yellow 와 Red에 해당하는 프라이머에 대해서는 시행하지 않았다.

또한 HPLC 정제 프라이머를 사용하면서 D7S820 좌위의 프라이머를 아래와 같이 변경하여 주었다.

D7S820-F183g & D7S820-R344m2(R)*

↓ 변경

D7S820-F183g* & D7S820-R344m2(I)

이 이노신(I)을 사용한 프라이머는 Kplex15에서도 적용된 것으로 예비 실험을 통하여 Kplex-23에서도 프라이머간 충돌로 인한 효율 및 비특이 밴드 노이즈 등의 문제를 일으키지 않고 정확한 유전자형을 특정하는 것으로 확인되었다.

HLPC 정제 프라이머를 G-25정제 없이 사용한 실험에서는 민감도 및 비특이 밴드 노이즈 등에서 만족할 만할 결과를 얻지 못하였으나, HPLC정제에 G-25정제를 추가한 결과는 9948 DNA 기준 62.5 pg까지 민감도를 보여 주었고 피크 밸런스 등에 영향이 거의 없으며 추가적인 비특이 밴드 감소 효과가 있는 것으로 판단되었다(도 21a 및 21b). 따라서, 유효화를 위한 시제품은 합성시 HPLC 정제와 프라이머 혼합 후 G-25 정제를 모두 진행한 방식을 적용하여 제조하기로 하였다. 이때, 프라이머의 혼합은 멀티플렉스 피크 밸런스 결과를 참조하여 적절히 조절하였다. 최종 사용한 프라이머의 서열과 멀티플렉스 농도 조건은 하기 표 5 및 표 6에 적시하였다.

최종 프라이머 서열 및 농도(1)

레인 (lane)	locus	프라이머	서열	최종농도 (μM)
FAM	Amelo	F180g	Gccctttgaagtggtaccagag	0.60
	Amelo	R262*	FAM-gcatgcctaatattttcagggaataa	0.60
	D5S818	F156	FAM-agggtgattttcctctttggt	0.45
	D5S818	R270m1	atctttatctgtatccttatttatacMtctatct	0.45
	TH01	F117	FAM-gattcccattggcctgttc	0.30
	TH01	R289	ctcctgtgggctgaaaagc	0.30
	D18S51	F177g	Gggagatgtcttacaataacagttgc	0.75
	D18S51	R429	FAM-cagctacttgcagggctga	0.75
	TPOX	F084*	FAM-cactagcacccagaaccgtc	0.22
	TPOX	R404	aagcactctcgtgtttgcgt	0.22
	D1S1656	F123	FAM-ctgtgttgctcaagggtcaa	1.00
	D1S1656	R518g	Gtcccttaggcatttattcagtg	1.00
VIC	D3S1358	F164	gagcaagaccctgtctcataga	0.28
	D3S1358	R265*	VIC-tcaacagaggcttgcatgtat	0.28
	D7S820	F183g*	GtgtcatagtttagaaYgaactaac	0.65
	D7S820	R344m2(I)	VIC-ctcattgacagaattIcacca	0.65
	D21S11	F161*	VIC-aattccccaagtgaattgcc	0.30
	D21S11	R365m	gtcaatgttctccagagacagacta	0.30
	D19S433	F083	VIC-cagcctgggcaacagaataa	0.20
	D19S433	R373	cctggggttctaggaatcaa	0.20
	D10S1248	F000	VIC-attagccccaggaccaatct	0.45
	D10S1248	R342g	Gaaagacactggattccaatatga	0.45
	D22S1045	F160	VIC-tgggcaaaccttaaacctga	0.80
	D22S1045	R571	ctgtaggtggcctggtttct	0.80

최종 프라이머 서열 및 농도(2)

레인 (lane)	locus	프라이머	서열	최종농도 (μM)
NED	CSF1PO	F191	actgccttcatagatagaagat	0.18
	CSF1PO	R295	NED-gaccctgttctaagtacttcct	0.18
	vWA	F096*	NED-gaataatcagtatgtgacttggattg	0.40
	vWA	R249m	aggttagatagagataggacagatga	0.40
	D16S539	F037s	gaagaatccagaaaaccacag	0.20
	D16S539	R250*	NED-tttagcgtttgtgtgtgcatc	0.20
	D2S1338	F095	NED-cataatccagctgtgggagg	0.25
	D2S1338	R387	cttccctgtctcaccccttt	0.25
	D2S441	F131	gactagagtcctgccttggg	0.73
	D2S441	R472	NED-cacccagccataaataacat	0.73
	DYS391	F085	atgtatggagacatttttggtca	1.00
	DYS391	R286	NED-tgcaagcaattgccatagag	1.00
PET	D8S1179	F173*	PET-tttttgtatttcatgtgtacattcgt	0.70
	D8S1179	R275	gtagattattttcactgtggggaa	0.70
	D13S317	F169*	PET-tggactctgacccatctaacg	0.30
	D13S317	R328g	Gctcctccttcaacttgggtt	0.30
	FGA	F109*	PET-caaatgccccataggttttg	0.60
	FGA	R336	aatatggttattgaagtagctgctg	0.60
	Y-M175	F028	agtgctctgtgacataccaatca	1.00
	Y-M175	R321	PET-ttgcagcattttcagttagcc	1.00
	D12S391	F172g	Gccagagagaaagaatcaacagga	1.00
	D12S391	R549	PET-acacattcttctgcccttgg	1.00

2) 래더 구축 및 binset (31xx, 35xx 버전) 작성

래더는 유효화 시제품 제작을 위하여 Kplex-15에서 활용된 방법을 적용하여 신속하게 제작하였다.

먼저, 상업용 래더 (PowerPlex_Fusion, PowerPlex_21, PowerPlex_ESX16 등)를 주형으로 하여 (10^-3-10^-5 희석 사용) Kplex-23 프라이머(D5S818, TH01, D18S51, TPOX, D3S1358, D7S820, D22S1045, CSF1PO, vWA, D16S539, D2S1338, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA)를 이용하여 27-29 싸이클의 PCR을 실시하여 증폭산물을 얻었다, 이때, D2S1338, D16S539, D18S51은 첫 PCR 산물을 10^-4배 희석하여 25 싸이클 증폭을 하여 주었다. 나머지 좌위(Amelogenin, D1S1656, D21S11, D19S433, D10S1248, D2S441, Y-M175, D12S391))는 해당 좌위의 대립유전자형을 가지는 gDNA를 주형으로 하여 PCR 산물을 얻어 균질한 높이를 얻을 수 있는 비율로 섞어 래더를 증폭하는 주형으로 사용하였다. 이 방법으로 얻은 23개의 유전자 좌위를 적절한 밸런스를 갖도록 섞어 주어 래더로 사용하였다(도 22).

또한 래더와 표준시료의 증폭산물들을 다양한 버전의 Genetic Analyzer (31xx, 35xx 버전, POP4 polymer)에 전개하여 적용하여 유전자형이 정확히 할당되도록 binset을 수정 제작하여 유효화에 사용하였다.

2. 다기관 유효성 평가

GlobalFiler와 Kplex-23 키트의 유효화 평가를 위하여 각각의 키트에 대하여 130 test 분량(30test는 셋업용)과 유효화 시료(농도별 2800M DNA, 9947+2800M DNA mixture)를 아래의 “Kplex-23 HID 키트 유효화 계획” 가이드라인에 의거하여 제작하여 대검찰청의 협조로 3 기관(대검찰청, 국립과학수사연구원, 국방부조사본부)에 송부하여 민감도 및 혼합반 검출능 분석을 요청하였다. 이때, Kplex-23 키트 매뉴얼도 (버전 v.1.0) 함께 제공하였다.

Ⅲ. 유효성 평가

유효성 평가의 필요성

유전자 검사의 식별력을 높이기 위해 상염색체 STR 마커를 확장하는 것이 현재의 국내외 추세이며, 이를 반영하기 위해 국내에서도 확장형 상염색체 STR 증폭키트 개발이 필요하다.

국가연구 개발 사업으로 국산 확장형 상염색체 STR증폭키트(Kplex-23)이 최근 개발되었고, 이 결과물을 외국산 확장형 키트와 비교하여 키트의 유효성을 평가할 필요가 있다. 평가에는 국내 유관기관이 공동으로 참여하며, 그 결과에 대한 피드백은 결과물의 성능 향상에 기여할 것으로 예상된다. 평가내용으로는 민감도 테스트, 혼합 DNA(Mixture Study) 테스트 등이 포함 된다. 비교 대상 외국산 확장형 키트는 GlobalFiler 키트(LT) 이다.

1. Kplex-23 HID PCR 국산화 키트(본 발명)

(1) 분석좌위는 다음과 같다.

; 성-결정 마커(amelogenin), Y-InDel(M175, rs2032678), Y-chromosomal STR (DYS391) 및 20 상염색체 STR loci (D5S818, TH01, D18S51, TPOX, D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO, vWA, D16S539, D2S1338, D2S441, D8S1179, D13S317, FGA 및 D12S391).

(2) 프라이머 배치도는 다음과 같다.

(3) 키트의 구성은 다음과 같다.

Cat. #	Products	Components	Volume
QM66400	Quest Kplex-23 HID Kit (100T)	10x HotSTARplus PCR Buffer Hot Taq-fx DNA polymerase(5U/uL) 3.3x Kplex-23 Primer Mix 9948 Control DNA(1000pg/uL) Allelic ladder	0.5 mL 75 μL 0.75 mL 25 μL 25 μL

(4) PCR 반응 조건은 다음과 같다.

PCR 반응조성물	부피/샘플(μL)
10x HotSTARplus buffer	2.5
Hot Taq-fx DNA pol.(5U/μL)	0.75
3.3x Kplex-23 Primer Mix	7.5
정제 genomic DNA	1000 pg
DW	Add to make final 25uL

95°C for 15분, then:

94°C, 20초

59°C, 90초

72°C, 60초 29 cycles, then:

60°C, 60분

4°C soak

(5) 형광 모세관 전기영동 방법은 다음과 같다.

a. Loading cocktail (0.1μL GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard and 10.0μL Hi-Di™ formamide per sample)을 준비하여 10초간 vortex 해 주고 CE용 plate에 10 μL씩 분주해 둔다.

b. 각 PCR 산물 1 μL을 상기 분주한 Loading cocktail 10.0 μL에 넣고 잘 섞어 준다.

c. Allelic ladder 1 μL을 상기 분주한 Loading cocktail 10.0 μL에 넣고 잘 섞어 준다.

d. Plate의 덮개를 덮고 95°C에서 2분간 heating 후 식혀 준다(on ice).

e. Auto-sampler 트레이에 plate를 장착한다.

f. 런 모듈에서 HID_FragmentAnalysis36_POP4과 dye set G5를 선택해 주고, User Guide에 따라 모세관 전기영동을 수행한다.

2. 민감도 테스트

(1) 표준 DNA

- 2800M (Promega, 10ng/ul)

- 시판되는 표준 DNA를 구매하여 Quantifiler 키트를 이용하여 정량하고, 정량값을 기준으로 희석하여 0.2 ng/μl로 만들어서 serial dilution한다.

- 실험진행 시 각 농도마다 5 μl씩 사용한다.

- 정량하여 실제 농도 확인한다.

※ 표준 DNA는 lot가 다른 2-3개의 제품을 구매하여 균질하게 섞어서 원액으로 사용한다.

(2) DNA 농도(25uL PCR) : 1.0 ng, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62.5 pg, 31.25 pg

※ 9947A(1000 pg)와 negative control(DW)는 양성, 음성 대조군으로 포함

(3) 3번 반복실험 후 결과 분석

※ 신뢰도 낮은 데이터가 나올 경우, 각자 1회 추가실험 수행

3. Mixture Study

(1) 혼합 시료

- 혼합시료의 total DNA 양이 PCR 반응(25 μL) 당 1000 pg이 되도록 한다.

- 실험진행 시 각 반응마다 5 μl씩 사용한다.

- 아래와 같이 혼합한다.

(2) 3번 반복실험 후 결과 분석

<표준 DNA (9947A, 2800M)의 디엔에이형 프로필> (알파벳 순서 배열)

* Kplex-23 키트에서 Y-indel(Y-M 175) 마커의 ins는 GlobalFiler 키트의 2를 의미함.

4. 실험 절차

(1) PCR

- GeneAmp®PCR System 9700을 기본으로 한다(기관에서 타 제품 선택 사용 시 협의 후 결과에 명시).

- Kplex-23 키트와 비교할 STR Kit의 증폭 조건은 각각 제조사의 지시에 따른다.

(2) CE

- ABI Genetic Analyzer 3500xl을 사용하며, 전기영동 조건은 STR 키트 제조사의 지시에 따른다.

※ 전기영동은 3500xl을 사용하고 반드시 두 키트 간에는 동일한 장비를 사용한다.

※ 테스트하는 두 키트의 dye set이 다르나, 두 키트의 injection time을 20초로 통일한다. (20초를 추천하나, 장비 상태에 따라 최적의 injection time이 20초와 다를 경우 다르게 하되, 두 키트 간에는 동일하게 함)

※ 최적의 injection time 설정 시 참고사항 : Kplex-23키트의 경우 1000 pg PCR product를 런 결과 Peak 높이 약 10,000 RFU 나타남.

(3) 데이터분석

- GeneMapper ID-X software를 사용하며, 분석 방법은 키트 제조사의 지시에 따른다.

(4) 데이터 해석

- 대부분의 유전자감식 실험실에서 일반적으로 사용 중인 interpretation threshold가 최소 rfu값이 100 이상이므로, 민감도 분석은 rfu값이 100 이상인 피크만 센다.

(5) 결과 입력

- 각 정량적 결과는 키트별 Table 조건에 맞게 입력한다(별첨 참조- Excel 파일, 추후송부).

- 기본평가 외에 추가적인 평가 및 정성적 평가는 양식에 구애 없이 작성한다.

결론 및 고찰

포렌식(forensic) 분야에서 활용되는 분석 키트의 PCR 민감도에 영향을 미치는 요소들을 정리해 보면 다음과 같다. 사용한 프라이머의 농도와 Tm 그리고 사용된 형광의 extinction coefficiency, 효소의 specificity 및 velocity와 사용된 버퍼의 성능(pH, salt 및 dNTPs 등의 순도와 첨가제 등의 적정 사용 비율) 그리고 PCR 싸이클 수 및 온도/시간 조건 및 ramping 속도 등이 있다. 특히, Kplex-23은 GlobalFiler와 거의 비슷한 PCR 싸이클 수 및 온도/시간 조건을 사용하였고, 또한 프라이머의 Tm 차이를 최소로 유지하여 설계하였으며, 농도도 최대 1.0 μM 이하로 조절함으로써 낮은 농도의 주형 및 PCR 효율을 저하시키는 실험 조건에서 발생하는 stochastic 효과를 최소화하였고, 기존에 사용하던 HotSTAR 버퍼를 멀티플렉스에서 긴 길이의 증폭 효율을 개선한 HotSTARplus 버퍼를 사용함으로써 23개의 멀티플렉스 프라이머 조합에서도 높은 민감도를 보인 것으로 판단되었다.

Kplex-23 시제품을 이용한 민감도(2800M DNA 1000 pg/500/250/125/62.5/31.25 pg) 테스트에서 A 기관은 주형 농도와 민감도에서 밀접한 상관 관계를 보이는 가운데 모두 비교 키트 간 125 pg까지 full STR profile을 검출하였고 모든 유전좌위와 형광군별 멀티플렉스 밸런스에서도 대등 또는 우수한 결과를 보여 주였다 <데이터미기재>. 특히 동일 주형농도에 대해서는 Kplex-23이 GlobalFiler보다 상대적으로 높은 peak height를 보여 주었고 각 유전좌위 내의 이형접합 대립형 편차도 큰 차이 없이 우수한 결과를 보여준 것으로 판단된다. Mixture Study (9947A+2800M DNA=1000pg, 19:1/9:1/6:1/3:1/1:1/1:3/1:6/1:9/1:19)에서도 두 키트 모두 6:1~1:9 사이에서 검출 결과를 보여 주었다.

민감도 테스트에서 B 기관은 주형 농도와 민감도에서 상관 관계를 유지하는 가운데 GlobalFiler는 250 pg, Kplex-23은 125 pg까지 full STR profile을 검출하였고 모든 유전좌위와 형광군별 멀티플렉스 밸런스에서도 유사한 수준의 결과를 보여 주였다. 특히 동일 주형농도에 대해서는 Kplex-23이 GlobalFiler보다 상대적으로 높은 peak height를 보여 주었고 각 유전좌위 내의 이형접합 대립형 편차도 큰 차이 없이 우수한 결과를 보여준 것으로 판단된다. Mixture Study에서도 GlobalFiler는 6:1~1:9, Kplex-23은 9:1~1:9사이에서 더 좋은 검출 결과를 보여 주었다.

민감도 테스트에서 C 기관은 데이터 신뢰도 평가에서도 높지 않았고 주형 농도와 민감도에서 상관 관계가 떨어지는 가운데 두 키트 모두 250 pg까지 full STR profile을 검출하였다. 따라서, 민감도 외의 결과는 평가의 정리에는 최종 반영하지 않았고 참고 수준으로만 이해하는 것이 좋을 것으로 사료된다. 주형 농도감소와 민감도 감소가 연관성이 떨어지는 이유로는 다양한 원인을 예상할 수 있다. 키트의 최적 주형 요구량이 유효화 범위와 차이가 나는 경우도 하나의 원인이 될 수 있으나 두 기관의 결과로 보아 배제할 수 있으며, PCR 장비가 매뉴얼이 요구하는 온도조건에 부합되지 못하였거나 PCR 실험 중 주형의 농도가 부합되지 못할 수도 있다. 그 외에도 실험 숙련도나 키트 자체의 보관 문제 등도 하나의 원인일 수 있다.

따라서 기관 A와 B의 유효화 결과로부터 Kplex-23은 민감도면에서 GlobalFiler 대비 동등 이상의 결과를 보였으며, 같은 주형농도에서도 높은 검출 peak height를 보여 검출율도 GlobalFiler보다 높은 것으로 평가할 수 있다. 또한, 멀티플렉스 밸런스도 GlobalFiler와 큰 차이 없이 우수한 것으로 평가되었다. 다만, 낮은 주형농도에서 보이는 D3S1358주위의 비특이 형광 노이즈는 개선이 요구된다.

<유효화 결과표>

Ⅳ. 검사 동일성 평가

시료의 수집

본 과제에서는 Kplex-23 키트의 유효화 및 국제화를 위해서 국내외적으로 많이 사용되고 있는 키트인 Promega 사의 PowerPlex®Fusion System과 비교를 통해 일치율을 분석하고, 검사 동일성을 평가하기 위하여 500명의 한국인 시료에 대한 유전자형 분석을 수행하였다. 본 연구에 사용된 한국인 시료는 공주대학교에서 보관중인 DNA 시료를 IRB 승인하에 사용하였다.

Kplex-23과 PowerPlex®Fusion System을 이용한 한국인 500명 시료의 유전자형 분석

Kplex-23 키트의 유효성를 평가하기 위하여 Kplex-23과 PowerPlex®Fusion System을 이용하여 DNA 시료 500명에 대한 검출율 및 두 키트 간 검사 동일성을 분석하였다.

두 키트 간의 비교를 위해 DNA 시료 500개에 대해 각 1000pg의 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭 후 유전자형을 분석하고 두 키트가 공동으로 포함하고 있는 21개 좌위와 Amelogenin 좌위를 비교하였다.

500개 DNA 시료는 96 well PCR Plate를 이용하여 회당 48~60개로 나누어 10회에 걸쳐 PCR을 수행하였다. 이 때, Kplex-23의 전체 PCR 반응은 25μL로 하였고 주형 DNA 1000pg, 10x HotSTARplus buffer 2.5μL, 3.3x Kplex-23 primer Mix 7.5μL, Hot Taq-fx DNA polymerase를 3.75U 넣고 수행하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems) 증폭기를 이용하였으며, 95℃ 15분으로 예비변성 후 94℃ 20초, 59℃ 90초 72℃ 60초로 28회, 최종 60℃ 60분간 시행하였다 (표 9).

Kplex-23 키트의 PCR 조건

PCR Component	부피/샘플 (μl)
dH₂O	13.25 μl
10X HotSTARplus buffer	2.5 μl
3.3X Kplex-23 Primer Mix	7.5 μl
Hot Taq-fx DNA pol. (5U/μl)	0.75 μl
주형 DNA (1000 pg/μl)	1.0 μl
전체 부피	25.0 μl

PowerPlex®Fusion System은 제조사에서 제공한 매뉴얼에 따라 PCR 증폭을 수행하였고 각각의 증폭산물은 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)로 전기영동을 수행 후 GeneMapperID v.3.2로 분석하여 증폭산물의 크기를 확인하였다.

한국인 DNA 시료 500개의 분석에 앞서 Kplex-23 키트와 PowerPlex®Fusion System의 증폭 효율을 알아보기 위하여 모근으로부터 추출한 실험자의 DNA로 상기의 PCR 조건 및 분석 방법을 이용하여 예비 실험을 수행한 결과 23좌위 모두에서 각 유전좌위 간 피크 밸런스 및 노이즈 레벨 등에서 PowerPlex®Fusion System과 비슷한 수준을 보여주었다(도 23).

한국인 500명 DNA 시료에 대해 PCR 증폭을 수행한 결과 Kplex-23 과 PowerPlex®Fusion System 두 키트에서 모든 시료에 대한 PCR 증폭이 성공하였으며, 증폭된 모든 샘플에 대한 유전자형 분석을 수행하였다. Kplex-23의 경우 일부 시료에서 D7S820 좌위의 peak가 다소 낮게 검출 되었으나 분석에는 지장이 없었고, 시험에 사용된 DNA 시료의 불규칙한 농도 및 모세관의 사용 상태에 따라서 약간의 차이를 나타내는 것으로 판단된다(데이터 미기재).

Kplex-23 키트와 PowerPlex®Fusion System의 일치율 비교

500명 이상의 DNA 시료에 대한 키트 간 검사 동일성 분석을 통해 Kplex-23 키트의 유효성을 평가하였다. Kplex-23 키트와 PowerPlex®Fusion System이 공통으로 가지고 있는 21 좌위에 대한 유전자형을 분석한 결과 500명 모두에서 두 키트 간 차이는 나타나지 않았다. 미세변이 및 triple allele 또한 발견되지 않았으나, 일부 샘플에서 D2S441 좌위에서 PowerPlex®Fusion System의 bin set에는 포함되어 있으나 Kplex-23 키트의 bin set에는 포함되어 있지 않는 [10.1], [11.3], [12.3] allele이 발견되었다(데이터 미기재). 이와 같은 결과를 반영하여 Kplex-23 키트의 bin set 수정 및 ladder 제작에 반영할 수 있을 것으로 사료된다.

미량의 DNA 시료를 대상으로 한 Kplex-23 키트 분석 민감도 확인

Kplex-23 키트를 사용하여 어느 정도 양의 DNA까지 유전자형 결정이 가능한 지 알아보기 위하여 순차적으로 희석한 DNA를 대상으로 민감도 확인 시험을 수행하였다. 1000 pg, 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62.5 pg, 31.2 pg로 연속 희석한 2800M standard DNA와 9947A standard DNA를 준비하고 [표 5]의 PCR 조건으로 28 PCR cycle을 적용하여 동일한 농도의 DNA에 대하여 최소한 3번 이상 증폭하여 모세관 전기영동 하였다. 그 결과 250 pg의 DNA 농도까지는 유전자형을 결정하는 데에는 안정적인 결과를 나타냈고, 125 pg의 DNA에 대해서도 어느 정도 유전자형 분석이 가능하였으나, 62.5 pg 이하의 DNA에서는 allele drop-out이 자주 발생되었다.

Kplex-23 다이렉트 PCR 기술 적용

DNA 데이터베이스 시료로 주로 활용되고 있는 타액건조 FTA와 타액면봉에 적용하여 보았다. 타액건조 FTA는 1.2 mm φ의 punch를 harris punch로 얻어 직접 반응액에 넣어 주었고, 타액 면봉은 PCR에 사용하기 위하여 타액이 묻어 있는 면봉을 1x Direct-N-Lyse F (BioQuest, Inc.) 200 μl에 넣어 94도에서 30분간 반응 후 1 μl/25 μl PCR를 주형으로 사용하였다.

이 때 다이렉트 PCR 조성을 위하여 1x HotSTARplus PCR 대신 1x AnyDirect F PCR를 사용하였고 프라이머는 정제 DNA를 사용하는 농도에서 1/2만을 사용하였다. 반응 조건은 모두 동일하고 싸이클 수만 최적화 과정을 거쳐서 28회로 낮추어 적용해 주었다(도 24a 및 24b).

결론 및 고찰

본 연구에서는 확장 상염색체 STR 분석 키트인 Kplex-23의 유효성을 높이기 위해 PowerPlex®Fusion System과의 분석 일치율을 비교 하였다. Kplex-23의 증폭 효율은 모든 좌위에서 각 유전좌위 간 피크 밸런스 및 노이즈 레벨 등에서 PowerPlex®Fusion System과 비슷한 수준의 상태를 보여주었다. 분석 결과의 동일성 검사에서 500개 시료 모두에서 PowerPlex®Fusion System과 일치를 보였고, 미세변이 대립유전자 및 다중 대립유전자 또한 발견되지 않았다.

PowerPlex®Fusion System과 유전자형 분석 결과는 동일하나 Kplex-23 키트의 bin set에는 포함되지 않은 D2S441 좌위의 일부 대립유전자는 추후 bin set 수정 및 ladder 체계 개선에 반영되어야 할 것으로 생각된다.

본 연구에서 나타난 결과로 Kplex-23 키트는 PowerPlex®Fusion System과 비교해서 검사 동일성이 매우 높고 증폭 효율이 뛰어나며, 국제적인 활용을 위한 키트로서 유용할 것으로 생각된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Republic Of Korea (Supreme Public Prosecutor's Office) <120> Method for Analysing Human Subject Chromosomal STR and Kits using Thereof <130> PN150340 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amelogenin F primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 1 nccctttgaa gtggtaccag ag 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amelogenin R primer <400> 2 gcatgcctaa tattttcagg gaataa 26 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D5S818 F primer <400> 3 agggtgattt tcctctttgg t 21 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D5S818 R primer <220> <221> misc_feature <222> (27) <223> n denotes Methionine <400> 4 atctttatct gtatccttat ttatacntct atct 34 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH01 F primer <400> 5 gattcccatt ggcctgttc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH01 R primer <400> 6 ctcctgtggg ctgaaaagc 19 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51 F primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 7 nggagatgtc ttacaataac agttgc 26 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D18S51 R primer <400> 8 cagctacttg cagggctga 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPOX F primer <400> 9 cactagcacc cagaaccgtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPOX R primer <400> 10 aagcactctc gtgtttgcgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1S1656 F primer <400> 11 ctgtgttgct caagggtcaa 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1S1656 R primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 12 ntcccttagg catttattca gtg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D3S1358 F primer <400> 13 gagcaagacc ctgtctcata ga 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D3S1358 R primer <400> 14 tcaacagagg cttgcatgta t 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D7S820 F primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n denotes Tyrosine <400> 15 ntgtcatagt ttagaangaa ctaac 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D7S820 R primer <220> <221> misc_feature <222> (16) <223> n denotes Isoleucine <400> 16 ctcattgaca gaattncacc a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D21S11 F primer <400> 17 aattccccaa gtgaattgcc 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D21S11 R primer <400> 18 gtcaatgttc tccagagaca gacta 25 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D19S433 F primer <400> 19 cagcctgggc aacagaataa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D19S433 R primer <400> 20 cctggggttc taggaatcaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D10S1248 F primer <400> 21 attagcccca ggaccaatct 20 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D10S1248 R primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 22 naaagacact ggattccaat atga 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D22S1045 F primer <400> 23 tgggcaaacc ttaaacctga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D22S1045 R primer <400> 24 ctgtaggtgg cctggtttct 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO F primer <400> 25 actgccttca tagatagaag at 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF1PO R primer <400> 26 gaccctgttc taagtacttc ct 22 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWA F primer <400> 27 gaataatcag tatgtgactt ggattg 26 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWA R primer <400> 28 aggttagata gagataggac agatga 26 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D16S539 F primer <400> 29 gaagaatcca gaaaaccaca g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D16S539 R primer <400> 30 tttagcgttt gtgtgtgcat c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2S1338 F primer <400> 31 cataatccag ctgtgggagg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2S1338 R primer <400> 32 cttccctgtc tcaccccttt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2S441 F primer <400> 33 gactagagtc ctgccttggg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2S441 R primer <400> 34 cacccagcca taaataacat 20 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DYS391 F primer <400> 35 atgtatggag acatttttgg tca 23 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DYS391 R primer <400> 36 tgcaagcaat tgccatagag 20 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8S1179 F primer <400> 37 tttttgtatt tcatgtgtac attcgt 26 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D8S1179 R primer <400> 38 gtagattatt ttcactgtgg ggaa 24 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D13S317 F primer <400> 39 tggactctga cccatctaac g 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D13S317 R primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 40 nctcctcctt caacttgggt t 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA F primer <400> 41 caaatgcccc ataggttttg 20 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA R primer <400> 42 aatatggtta ttgaagtagc tgctg 25 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y-M175 F primer <400> 43 agtgctctgt gacataccaa tca 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y-M175 R primer <400> 44 ttgcagcatt ttcagttagc c 21 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D12S391 F primer <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> n denotes Glycine <400> 45 nccagagaga aagaatcaac agga 24 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D12S391 R primer <400> 46 acacattctt ctgcccttgg 20

Claims

다음의 단계를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석방법:
(a) 인간 객체 DNA 시료의 아멜로제닌(Amelogenin), D5S818, TH01, D18S51, TPOX (Human thyroid peroxidase gene), D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO (Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene), vWA (von Willebrand factor A), D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA (Human fibrinogen alpha chain), Y-M175 및 D12S391 의 유전좌위에 상보적으로 결합하는 각각의 프라이머를 이용하여 증폭을 실시하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물을 이용하여 상기 유전좌위의 대립유전자형을 결정하여, 상기 인간 객체를 유전자로 감식하는 단계; 를 포함하는 멀티플렉스 유전자 증폭을 이용한 분석대상의 인간 객체의 유전자 감식을 위한 분석방법으로서,
상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제1서열 및 제2서열이고; 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제3서열 및 제4서열이며; 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제5서열 및 제6서열이고; 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제7서열 및 제8서열이며; 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제9서열 및 제10서열이고; 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제11서열 및 제12서열이며; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제13서열 및 제14서열이고; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제15서열 및 제16서열이며; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제17서열 및 제18서열이고; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제19서열 및 제20서열이며; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제21서열 및 제22서열이고, 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제23서열 및 제24서열이며; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제25서열 및 제26서열이고; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제27서열 및 제28서열이며; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제29서열 및 제30서열이고; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제31서열 및 제32서열이며; 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제33서열 및 제34서열이며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제35서열 및 제36서열이며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제37서열 및 제38서열이며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제39서열 및 제40서열이며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제41서열 및 제42서열이며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제43서열 및 제44서열이며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제45서열 및 제46서열이고,
상기 서열목록 제1서열 내지 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제1형광염료로 표지되고, 상기 서열목록 제13서열 내지 제24서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제2형광염료로 표지되며, 상기 서열목록 제25서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제3형광염료로 표지되고, 상기 서열목록 제37서열 내지 제46서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제4형광염료로 표지되며,
상기 단계 (a)의 증폭산물은 70-420 bp 인 분석방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)의 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자를 분리(separate)하기 위한 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 유전자 증폭은 멀티플렉스 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭 또는 직접(direct) 멀티플렉스 PCR 증폭인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 4 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 유전자 증폭은 57-61℃의 어닐링 온도 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 4 항에 있어서, 상기 단계 멀티플렉스 PCR 증폭은 27-31 싸이클을 갖는 것을 특징으로 하는 분석방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.4-0.8 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.25-0.65 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.55-0.95 μM의 최종농도를 가지며, 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.02-0.42 μM의 최종농도를 갖고, 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.08-0.48 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.45-0.85 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.40 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.25-0.65 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.60-1.00 μM의 최종농도를 갖고; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.38 μM의 최종농도를 가지며; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.20-0.60 μM의 최종농도를 갖고; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.01-0.40 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.05-0.45 μM의 최종농도를 가지며, 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.53-0.93 μM의 최종농도를 가지며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.50-0.90 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.10-0.50 μM의 최종농도를 가지며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.40-0.80 μM의 최종농도를 가지며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가지며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 0.80-1.20 μM의 최종농도를 가지는 것을 특징으로 하는 분석방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 HotST*Rplus 버퍼 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 HPLC 정제 및 G-25 정제를 실시하여 제조된 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 멀티플렉스 증폭 산물에서 증폭된 대립유전자의 크기를 크기 표준물(size standard)과 비교/평가하여 실시하며, 상기 크기 표준물은 DNA 마커 또는 유전좌위-특이적 대립유전자 래더인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 상기 분석방법은 법의학적 타이핑(Forensic typing) 또는 신원확인의 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 상기 DNA 시료는 혈액, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포 또는 태아세포를 포함하는 양수 및 이의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 조직으로부터 분리된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
아멜로제닌(Amelogenin), D5S818, TH01, D18S51, TPOX (Human thyroid peroxidase gene), D1S1656, D3S1358, D7S820, D21S11, D19S433, D10S1248, D22S1045, CSF1PO (Human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene), vWA (von Willebrand factor A), D16S539, D2S1338, D2S441, DYS391, D8S1179, D13S317, FGA (Human fibrinogen alpha chain), Y-M175 및 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 각각의 프라이머를 포함하는 인간 객체(human subject) 염색체 상의 STR (short tandem repeat) 분석용 멀티플렉스 유전자 증폭 키트로서,
상기 아멜로제닌 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제1서열 및 제2서열이고; 상기 D5S818 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제3서열 및 제4서열이며; 상기 TH01 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제5서열 및 제6서열이고; 상기 D18S51 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제7서열 및 제8서열이며; 상기 TPOX 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제9서열 및 제10서열이고; 상기 D1S1656 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제11서열 및 제12서열이며; 상기 D3S1358 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제13서열 및 제14서열이고; 상기 D7S820 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제15서열 및 제16서열이며; 상기 D21S11 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제17서열 및 제18서열이고; 상기 D19S433 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제19서열 및 제20서열이며; 상기 D10S1248 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제21서열 및 제22서열이고, 상기 D22S1045 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제23서열 및 제24서열이며; 상기 CSF1PO 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제25서열 및 제26서열이고; 상기 vWA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제27서열 및 제28서열이며; 상기 D16S539 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제29서열 및 제30서열이고; 상기 D2S1338 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제31서열 및 제32서열이며; 상기 D2S441 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제33서열 및 제34서열이며; 상기 DYS391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제35서열 및 제36서열이며; 상기 D8S1179 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제37서열 및 제38서열이며; 상기 D13S317 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제39서열 및 제40서열이며; 상기 FGA 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제41서열 및 제42서열이며; 상기 Y-M175 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제43서열 및 제44서열이며; 상기 D12S391 유전좌위에 상보적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제45서열 및 제46서열이고,
상기 서열목록 제1서열 내지 제12서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제1형광염료로 표지되고, 상기 서열목록 제13서열 내지 제24서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제2형광염료로 표지되며, 상기 서열목록 제25서열 내지 제36서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제3형광염료로 표지되고, 상기 서열목록 제37서열 내지 제46서열로 구성된 군으로부터 선택되는 프라이머는 제4형광염료로 표지되며,
상기 멀티플렉스 유전자 증폭의 증폭산물은 70-420 bp 인 키트.