KR20190054477A - Str 마커를 포함하는 pcr용 프리믹스 조성물 및 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트 - Google Patents

Str 마커를 포함하는 pcr용 프리믹스 조성물 및 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor)에 상보적으로 결합하는 프라이머를 최적비율로 혼합하여 상기 유전자를 모두 동시에 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 PCR용 프리믹스 조성물 포함하는 유전자 감식용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 PCR용 프리믹스 조성물을 포함하는 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 제공할 수 있으며 과학수사 교육에 이용할 수 있다.

Description

STR 마커를 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물 및 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트{PCR Premixes composition containing STR markers and a genetic analysis kit for scientific investigation education using the composition}
본 발명은 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor)에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍을 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 개개인의 유전자 중 특정 유전자의 단기일렬반복(short tandem repeat, STR)의 차이를 이용하고 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR)을 통해 법의학적 개인식별이 가능한 PCR용 프리믹스 조성물, 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트에 관한 것이다.
STR 마커는 각 염색체의 말단부위에 주로 산재되어 있으며 2~7bp의 길이로서 포유동물의 경우 전체 게놈(genome)에 평균 50,000~100,000개 이상의 풍부한 빈도로 존재하고 염기배열의 반복수에 따라 다양한 대립유전자(allele)가 존재하며, 다형성(polymorphism)이 높다는 특징 때문에 인간과 동식물의 가계분석, 혈통비교, 계통분류학, 집단유전학 등 각종 다양성 분석에 광범위하게 이용하는 유전적 마커이다. STR 마커를 이용한 유전자 감식의 분석원리는 다형성이 있는 STR 영역을 포함하도록 프라이머를 설계하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 유전자를 증폭하면 다양한 염기배열의 반복수에 따라 분자량이 다르므로 전기영동 상에서 명확한 개체적 차이를 보이게 된다는 점을 이용하는 것이다.
STR 마커로 유전자 감식을 하기 위해서는 다형성이 있는 다수의 STR 마커가 필요하며, 이러한 STR 마커를 분석하기 위해서는 많은 시간과 경제적 비용을 부담해야 한다. 따라서 여러 STR 마커를 겹침 현상 없이 동시에 증폭할 수 있는 멀티플렉스 유전자증폭방법이 개발되어 현재 널리 이용되고 있다. 멀티플렉스 유전자증폭방법은 여러 STR 마커를 동시에 증폭하기 때문에 반응과정에서 STR 마커간에 상호 영향을 줄 수가 있어 비특이적 유전자형이 함께 증폭되어 유전자형 결정에 오류를 범할 수가 있다는 단점이 있지만, 단일 유전자증폭(single-PCR)법에 비해 시간과 비용적인 면에서 경제적이며, 소량의 DNA만으로도 분석이 가능하다는 장점 때문에 멀티플렉스 유전자증폭방법이 선호되고 있다.
현재 유전자 감식을 통한 개인식별은 법의학 분야에서 사용이 지속적으로 증가하고 있으나, 외국의 상용 검사키트와 장비를 사용하기 때문에 상당히 많은 비용지출이 필요하며, 법의학적 유전자 감식을 수학하는 학생들의 경우 고가의 키트 및 장비를 사용하는 유전자 감식 실무를 경험하지 못하는 바, 분석 비용과 시간을 단축하고, 정확성과 재현성이 우수한 멀티플렉스 PCR용 프리믹스 조성물 및 이를 이용한 과학수사 교육용 유전자 분석 키트의 개발이 필요하다.
대한민국 등록특허 제10-1099-0410000호
본 발명의 하나의 목적은, FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor)를 최적비율로 혼합한 상기 유전자 모두를 동시에 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 유전자 감식용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 이용한 과학수사 교육방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하나의 양태로,
(a) FGA(Human fibrinogen alpha chain)에 상보적으로 결합하는 서열번호 1과 2로 이루어진 프라이머, 아멜로제닌(amelogenin)에 상보적으로 결합하는 서열번호 3과 4로 이루어진 프라이머 및 vWA(von Willebrand factor)의 유전자에 상보적으로 결합하는 서열번호 5와 6으로 이루어진 프라이머; 및
(b) 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하며,
상기 서열번호 1과 2로 이루어진 프라이머는 1.0 ~ 1.5μM의 농도로 포함하며,
상기 서열번호 3과 4로 이루어진 프라이머는 0.25 ~ 1.25μM의 농도로 포함하며,
상기 서열번호 5와 6으로 이루어진 프라이머는 1.0 ~ 2.0μM의 농도로 포함하는 것인, PCR용 프리믹스 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 6의 서열은 다음과 같다.
서열번호 1; FGA forward primer: TGCCCCATAGGTTTTGAACTC
서열번호 2: FGA reverse primer: ATTGAAGTAGCTGCTGAGTGA
서열번호 3: Amelogenin forward primer: TCCCCTGGGCTCTGTAAAGAAT
서열번호 4: Amelogenin Reverse primer: AACTGGGAAGCTGATGGTAGGA
서열번호 5: vWA forward primer: GTGAAAGCCCTAGTGGATGATAAG
서열번호 6: vWA reverse primer: AAATACATAGGATGGATGGATA
본 발명의 용어 “PCR용 프리믹스 조성물”는 PCR 반응전에 미리 제조된 반응 혼합물로서 여기에 분석하고자 하는 DNA 샘플을 넣고 바로 PCR 반응 시킬 수 있는 즉시 사용 가능한 시약(Ready-to-use Reagents)를 의미한다.
또한, 상기 조성물은 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물, 염화마그네슘(MgCl2), DNA 중합효소 또는 완충액(buffer solution)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR용 프리믹스 조성물일 수도 있다.
본 발명의 용어 “프라이머”는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머를 포함하며, 구체적으로는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머를 의미한다. 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머 일 때 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명의 용어 “FGA(Human fibrinogen alpha chain)”는 단기일렬 반복(short tandem repeat, STR)의 일종으로서, 반복서열은 CTTT이고, 구체적인 염기서열 정보는 NCBI에 공지되어있다(Genebank M64982).
상기 단기일렬반복(STR)은 인간 게놈(genome) 내에 존재하는 단기일렬반복 염기서열로 인트론(intron) 내에 분포하며, 이 염기 서열은 처음부터 끝까지 일정하게 반복되는 2 내지 7개의 염기로 구성된 짧은 DNA 서열이며, 개인마다 특정 유전좌위의 다형성 부위가 함유된다. 특정 좌위에서의 짧은 반복 배열 단위의 수가 변함에 따라, 이 좌위에서 DNA 길이가 각 대립형질 (allele) 및 각 개인에 따라 변하게 된다.
본 발명의 용어 “아멜로제닌(amelogenin)”은 STR의 일종으로, 반복서열은 AAAGTG이고, 구체적인 서열정보는 NBCI에 공지되어 있다(Genebank M55418/M55419). X 염색체와 Y 염색체에 존재하며 인트론 서열 내의 6bp의 결손에 의한 부분적인 염기 서열이 달라 DNA의 길이 차이로 성별확인이 가능하다.
본 발명의 용어 “vWA(von Willebrand factor)”는 STR의 일종으로 반복서열은 TCTA이며, 구체적인 정보는 NBCI에 공지되어 있다(Genebank M25858).
본 발명의 실시예에서, FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, FGA의 프라이머 쌍을 0.3 내지 2.2μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하고, PCR을 행하였다.
상기 FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 증폭산물을 전기영동하여 확인한 결과, FGA의 프라이머 쌍의 농도가 0.3 내지 0.9μM이거나 1.6 내지 2.2μM인 경우에는 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나 모두 증폭되지 않았으나, FGA 프라이머 쌍의 농도가 1.0 내지 1.5μM인 경우에는 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
따라서, 상기 PCR용 프리믹스 조성물이 FGA의 프라이머 쌍을 1.0 내지 1.5μM의 농도로 포함할 경우, 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 동시에 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서, 아멜로제닌에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, 아멜로제닌의 프라이머 쌍을 0.1 내지 1.5μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하고 PCR을 행하였다.
상기 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 증폭산물을 전기영동하여 확인한 결과, 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도가 0.2μM이하인 경우 FGA만 증폭됨을 확인하였고, 1.3μM이상에서는 FGA가 증폭되지 않음을 확인하였다. 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도가 0.25 내지 1.25μM 경우에는 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
따라서, 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도가 0.25 내지 1.25μM의 경우, 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다
본 발명의 실시예에서, 상기 vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, vWA의 프라이머 쌍을 0.2 내지 2.2μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하여 PCR을 행하였다.
상기 vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 증폭산물을 전기영동하여 확인한 결과, vWA의 프라이머 쌍의 농도가 0.95μM이하이거나 2.1μM이상인 경우 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭됨을 확인하였으나, 1.0 내지 2.0μM의 농도에서 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
따라서, 상기 PCR용 프리믹스 조성물이 vWA의 프라이머 쌍을 1.0 내지 2.0 μM의 농도로 포함한 경우, 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 염화마그네슘(MgCl2)은 상기 조성물내에 1.0 내지 1.25mM 농도로 포함된 것이 특징인, PCR용 프리믹스 조성물일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 염화마그네슘(MgCl2) 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, 상기 PCR용 프리믹스 조성물의 염화마그네슘(MgCl2) 최종 농도를 0.3 내지 2.0mM로 제조하고 PCR 수행하였다. 상기 염화마그네슘(MgCl2) 농도에 따른 PCR 증폭산물을 전기영동하여 확인한 결과, 염화마그네슘(MgCl2)의 농도가 0.3 내지 0.9mM이거나 1.3 내지 2.0mM인 경우 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나 또는 모두 증폭되지 않음을 확인하였으나, 염화마그네슘(MgCl2)의 농도가 1.0 내지 1.25mM의 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
따라서, 염화마그네슘(MgCl2)은 상기 조성물내에 1.0 내지 1.25mM 농도로 포함된 경우 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 PCR용 프리믹스 조성물을 포함하는, 유전자 감식용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 “유전자 감식(DNA profiling)”은 분자 유전학적 방법을 이용하며 한사람과 다른 사람을 구별하는 유전자 시료의 정확한 유전자형을 결정하는 것을 의미한다.
또한, 상기 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
구체적으로, 아가로스 파우더, 겔 로딩 버퍼, TAE 버퍼, DNA 표준크기 물질, 겔 그린(gel green), 마이크로 센트리퓨즈 튜브, PCR튜브 중 한 종류 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유전자 감식용 키트는 범죄 현장 수사, 재난 및 재해, 친자 확인 검사에 분야에서 활용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 양태로서, PCR용 프리믹스 조성물을 포함하는 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 “과학수사”는 유전자 감식의 지식 및 기술을 이용하여, 범죄현장 증거물에서 얻은 DNA 정보를 이용하여 범인을 수사방법을 의미한다.
상기 PCR용 프리믹스 조성물의 의미 및 상기 용어 키트는 전술한 바와 같다.
또한, 상기 과학수사 교육용 유전자 분석 키트는 가상의 범죄현장에서 얻은 DNA 시료 및 용의자 1명 이상의 DNA 시료를 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 이용하여 과학수사 교육을 실시하는 단계를 포함하는 과학수사 교육방법을 제공한다.
상기의 용어 “과학수사 교육을 실시하는 단계”는 상기 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 이용하여 유전자 감식 실험을 실습하고, 이를 통해 과학수사에서 활용되는 법의학적 개인 식별의 실험 배경 및 원리를 교육하는 단계를 의미한다.
구체적으로, 상기 교육방법은 DNA를 포함하는 시료를 분리하는 단계;
상기 시료와 상기 PCR용 프리믹스 조성물을 혼합하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 증폭산물을 전기영동하는 단계; 및
전기영동 결과, 대조군과 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor) 밴드가 모두 동일하게 형성된 경우 대조군과 동일인으로 식별하는 단계를 포함하는 과학수사 교육방법일수 있다.
본 발명의 용어 “대조군”이란 가상의 범죄현장에서 얻은 DNA를 포함하는 시료를 의미한다.
구체적으로, 상기 PCR 증폭산물인 FGA는 170 내지 210bp, 아멜로제닌은 54 내지 94bp, vWA은 105 내지 149bp 크기로 형성되나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 PCR의 어닐링 온도는 55℃ 내지 60℃로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 상기 PCR용 프리믹스 조성물의 어닐링 온도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, 49℃ 내지 66℃의 어닐링 온도로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 증폭산물을 전기영동하여 확인한 결과 54℃이하거나 60.5℃ 내지 66℃의 어닐링 온도에서는 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나, 또는 모두 증폭되지 않음을 확인하였으나, 어닐링 온도 55℃ 내지 60℃에서 PCR을 행한 증폭산물의 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
따라서, 상기의 PCR의 어닐링 온도를 55℃ 내지 60℃로 행할 경우, 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다
상기의 DNA 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 조골세포, 섬유아세포, 양수로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 시료를 사용할 수도 있다.
본 발명은 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor)를 포함하는 멀티플렉스 PCR용 프리믹스 조성물과 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자를 모두 동시에 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물을 제공하고 이를 이용하여, 분석비용과 시간을 단축하고 정확성과 재현성이 우수한 유전자 감식용 키트 및 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 제공할 수 있으며 과학수사 교육에 이용할 수 있다.
도 1은 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor)의 프라이머의 정보이다.
도 2는 실시예1의 어닐링 온도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다
다음은 실시예 1-1, 1-2, 1-4의 증폭산물의 전기영동 로딩 순서이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell, lane 6: negative control).
도 2 중 실시예 1-3의 증폭산물의 전기영동 로딩 순서는 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: 시료없음 lane 4: HFF-1, lane 5: Human DNA(용의자), lane 6: hFOB1 cell, lane 7: negative control).
도 3은 비교예 1의 어닐링 온도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: negative control).
도 4는 실시예 2의 FGA에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell, lane 6: negative control).
도 5는 비교예 2의 FGA에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다
다음은 비교예 2-5를 제외한 비교예 2의 증폭산물의 전기영동 로딩 순서이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell, lane 6: negative control).
도 5 중 비교예 2-5의 증폭산물의 전기영동 로딩순서는 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: Human DNA, lane 7: negative control).
도 6은 실시예 3의 아멜로제닌에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
다음은 실시예 3-1 내지 3-4의 증폭산물의 전기영동 로딩 순서이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell, lane 6: negative control).
도 6 중 실시예 3-5의 증폭산물의 전기영동 로딩순서는 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: 시료없음 lane 4: HFF-1, lane 5: Human DNA(용의자), lane 6: hFOB1 cell, lane 7: negative control).
도 7은 비교예 3의 아멜로제닌에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
다음은 비교예 3-1 내지 3-3의 증폭산물의 전기영동 로딩순서이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: negative control).
도 7 중 비교예 3-4의 증폭산물의 전기영동 로딩순서는 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: Human DNA, lane 7: negative control).
도 7 중 비교예 3-5의 증폭산물의 전기영동은 로딩순서는 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: Human DNA, lane 7: Human DNA, lane 8: negative control).
도 8은 실시예 4의 vWA에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
다음은 실시예 4-3을 제외한 실시예 4의 증폭산물의 전기영동 로딩순서이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell, lane 6: negative control).
도 8 중 실시예 4-3의 증폭산물의 전기영동은 다음과 같다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: 시료없음, lane 5: Human DNA(용의자), lane 6: hFOB1 cell, lane 7: negative control).
도 9는 비교예 4의 vWA에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: negative control).
도 10은 실시예 5의 염화마그네슘(MgCl2)의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA(범죄현장 증거), lane 2: 293T Cell, lane 3: HFF-1, lane 4: Human DNA(용의자), lane 5: hFOB1 cell).
도 11은 비교예 5의 염화마그네슘(MgCl2)의 농도에 따른 유전자 증폭 산물의 전기영동 결과이다(M: DNA 사이즈 마커, lane 1: Human DNA, lane 2: Human DNA, lane 3: Human DNA, lane 4: Human DNA, lane 5: Human DNA, lane 6: negative control).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> STR(Short Tandem Repeat, STR) 조합 및 프라이머의 설계와 설계한 PCR용 프리믹스 조성물의 어닐링(annealing) 온도에 따른 PCR
CODIS(Combined DNA Index System)에서 권고하는 STR 마커 중 STR 유전좌위가 겹침이 최소화되는 FGA(Human fibrinogen alpha chain), vWA(von Willebrand factor) 마커와 성별 마커인 아멜로제닌(amelogenin)을 사용하였다.
염기서열 정보는 STRbase(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase), Genebank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank)의 내용을 참고하여 수집하였다. 수집된 염기서열 정보를 바탕으로 프라이머 블라스트(primer blast)등의 프라이머 설계 프로그램을 이용하여 새로운 위치의 마커를 증폭할 수 있는 후보 프라이머 세트를 설계하고 프라이머들끼리 간섭 없이 최상의 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR)을 나타내는 프라이머 세트를 선정하였다. 또한 전기 전동에서 STR의 대립 유전자형 결정에 문제가 없도록 유전좌위간 적절한 간격을 두었으며, 증폭산물의 크기는 80bp 내지 400bp가 되도록 설계하였다.
설계된 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin) 및 vWA(von Willebrand factor)의 프라이머 정보는 도 1과 같다.
먼저, 온도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, PCR buffer 1X, 염화마그네슘(MgCl2) 1.25mM, dNTPs 0.2mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U 및 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin) 및 vWA(von Willebrand factor)의 프라이머(primer) 쌍을 각 1μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물과 DNA 샘플시료 2μl를 섞어 최종 반응 부피가 20μl가 되도록 반응혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물을 PCR 튜브에 넣고 내용물을 잘 섞고 뚜껑을 닫은 뒤, 유전자 증폭기(Thermal cycler)에 넣고 표 1과 같은 온도 조건으로 32 사이클의 PCR을 행하고 유전자 증폭산물은 4℃로 보관하였다.
어닐링(annealing) 온도에 따른 PCR (실시예1)
단계 온도 시간
초기변성
(Initial Denaturation)		 95℃ 2분
변성 (Denaturation) 94℃ 1분
어닐링(Anealing) 실시예 1-1 55℃ 1분
실시예 1-2 56℃ 1분
실시예 1-3 58℃ 1분
실시예 1-4 60℃ 1분
연장(Extension) 72℃ 1분
최종 합성 72℃ 10분
유지(hold) 4℃ 지속
상기 유전자 증폭산물을 원심분리기를 이용하여 간단히 원심분리(spin down) 한 뒤 튜브에 로딩다이(loading dye)와 증폭산물을 1:4 비율로 섞어주고, 로딩다이(loading dye)와 표준크기 물질(DNA size ladder marker)을 1:6 비율로 섞어주었다.
250ml 삼각플라스크에 1X TAE buffer 70ml과 아가로스(Agarose) 2.1g을 넣고 충분히 잘 섞은 다음 전자레인지 또는 핫플레이트를 이용하여 용액이 투명해질 때까지 녹이고, 약간 식힌 후에 겔 트레이에 조심스럽게 붓고 콤브(comb)를 꼽고 겔이 굳은 후 조심스럽게 콤브(comb)를 빼서 3% 아가로스겔을 만들었다.
전기 영동 탱크에 3% 아가로스겔(Agarose gel)을 넣고 겔이 잠길 만큼 1X TAE buffer를 부은 뒤 아가로스겔의 각 웰(well)에 샘플과 표준크기 물질을 넣고 120 볼트에서 50분에서 80분동안 전기 영동을 행하고, 자외선 램프를 이용하여 PCR 샘플의 DNA를 확인하였다.
<비교예 1> 어닐링(annealing) 온도에 따른 PCR
어닐링(annealing) 온도에 따른 PCR결과를 확인하기 위해, 어닐링 온도를 제외하고, PCR은 실시예1과 동일한 방법으로 행했으며, 어닐링 온도는 표 2와 같은 조건으로 행하였다.
어닐링 온도에 따른 PCR(비교예 1)
구분 어닐링 온도℃
비교예 1-1 49
비교예 1-2 50
비교예 1-3 51
비교예 1-4 52
비교예 1-5 53
비교예 1-6 53.5
비교예 1-7 54
비교예 1-8 60.5
비교예 1-9 61
비교예 1-10 62
비교예 1-11 62.5
비교예 1-12 63
비교예 1-13 64
비교예 1-14 65
비교예 1-15 66
<실험예 1> 어닐링(annealing) 온도의 최적화
어닐링 온도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, 실시예1과 비교예 1에서 49℃ 내지 66℃의 어닐링 온도로 PCR을 수행하였다. 도 2와 3은 어닐링 온도에 따른 PCR 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 3은 비교예 1의 온도로 PCR한 증폭산물의 전기영동 결과로, 54℃이하이거나, 60.5℃와 66℃사이의 어닐링 온도에서 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나, 또는 모두 증폭되지 않음을 확인하였으나, 도 2에서 실시예 1의 어닐링 온도 55℃ 내지 60℃에서 PCR을 행한 증폭산물의 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
<실시예 2> FGA 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR
FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, PCR buffer 1X, 염화마그네슘(MgCl2) 1.25mM, dNTPs 0.2mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U, 아멜로제닌의 프라이머 0.5μM 및 vWA의 프라이머 1.5μM를 포함하고, 상기 FGA, 프라이머는 1.0 내지 1.5μM로 표 3과 같이 포함하도록 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하였고, DNA 샘플 시료 2μl와 혼합하여 반응혼합물의 최종부피가 20μl가 되도록 반응혼합물을 제조하였다.
상기 반응 혼합물을 PCR 튜브에 넣고 내용물을 잘 섞고 뚜껑을 닫은 뒤 유전자 증폭기(Thermal cycler)에 넣고 초기변성 95℃ 2분 처리한 후, 변성 94℃ 1분, 어닐링(annealing) 57℃ 1분 및 합성 72℃ 1분의 사이클을 32회 행하고, 최종합성을 72℃에서 10분간 행하고 4℃에서 보관하였다.
FGA의 프라이머 쌍의 농도별 PCR(비교예 2)
구분 어닐링 온도(℃) 구성시약 농도
프라이머 쌍(μM)
FGA 아멜로제닌 vWA
실시예 2-1 57 1.0 0.5 1.5
실시예 2-2 57 1.2 0.5 1.5
실시예 2-3 57 1.35 0.5 1.5
실시예 2-4 57 1.5 0.5 1.5
<비교예 2> FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 혼합조성물의 PCR
FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, FGA의 프라이머 쌍의 농도를 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하여 PCR 행하였다. FGA 프라이머 쌍의 농도는 표 4와 같은 조건으로 행하였다.
FGA 프라이머 쌍의 농도별 PCR(비교예 2)
구분 FGA 프라이머 쌍의 농도
(μM)
비교예 2-1 0.3
비교예 2-2 0.45
비교예 2-3 0.5
비교예 2-4 0.6
비교예 2-5 0.7
비교예 2-6 0.8
비교예 2-7 0.9
비교예 2-8 1.6
비교예 2-9 1.7
비교예 2-10 1.8
비교예 2-11 1.9
비교예 2-12 2.0
비교예 2-13 2.1
비교예 2-14 2.15
비교예 2-15 2.2
<실험예 2> FGA의 프라이머 쌍의 농도의 최적화
FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해 실시예 2와 비교예 2에서 FGA의 프라이머 쌍을 0.3 내지 2.2μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하고 PCR을 행하였다. 도 4와 5는 FGA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 5에서 FGA의 프라이머 쌍의 농도가 0.3 내지 0.9μM이거나 1.6 내지 2.2 μM인 경우에는 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나 모두 증폭되지 않았으나, 도 4에서 FGA 프라이머 쌍의 농도가 1.0 내지 1.5μM인 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
<실시예 3> 아멜로제닌 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR
상기 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, PCR buffer 1X, 염화마그네슘(MgCl2) 1.25mM, dNTPs 0.2mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U, FGA의 프라이머 쌍 1.5μM 및 vWA의 프라이머 쌍 1.5μM의 농도로 포함하고, 상기 아멜로제닌의 프라이머 쌍은 0.25 내지 1.25 μM로 표 5와 같이 포함하도록 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하고 PCR을 행하였다.
아멜로제닌 프라이머 쌍의 농도별 PCR(실시예 3)
구분 어닐링 온도(℃) 구성시약 농도
프라이머 쌍(μM)
FGA 아멜로제닌 vWA
실시예 3-1 57 1.5 0.25 1.5
실시예 3-2 57 1.5 0.5 1.5
실시예 3-3 57 1.5 0.7 1.5
실시예 3-4 57 1.5 1.0 1.5
실시예 3-5 57 1.5 1.25 1.5
<비교예 3> 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도에 따른 혼합조성물의 PCR
상기 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도를 달리한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하여 PCR 행하였다. 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도는 표 6과 같은 조건으로 행하였다.
아멜로제닌 프라이머 쌍의 농도별 PCR(비교예 3)
구분 아멜로제닌 프라이머 쌍의 농도 (μM)
비교예 3-1 0.1
비교예 3-2 0.2
비교예 3-3 1.3
비교예 3-4 1.45
비교예 3-5 1.5
<실험예 3> 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도의 최적화
아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해, 실시예 3과 비교예 3에서 아멜로제닌의 프라이머 쌍을 0.1 내지 1.5μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하고 PCR을 행하였다. 도 6과 7은 아멜로제닌에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 7을 통해 상기의 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도가 0.2μM이하인 경우 FGA만 증폭됨을 확인하였고, 1.3μM이상에서는 FGA가 증폭되지 않음을 확인하였다. 도 6에서 아멜로제닌의 프라이머 쌍의 농도가 0.25 내지 1.25μM 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
<실시예 4> vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR
상기 vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, PCR buffer 1X, 염화마그네슘(MgCl2) 1.25mM, dNTPs 0.2mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U, FGA의 프라이머 쌍 1.5μM 및 아멜로제닌의 프라이머 쌍 0.5μM를 포함하고, 상기 vWA의 프라이머 쌍은 1.0μM 내지 2.0μM로 표 7과 같이 포함하도록 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하고 PCR을 행하였다.
vWA의 프라이머 쌍의 농도별 PCR(실시예 4)
구분 어닐링 온도(℃) 구성시약 농도
프라이머 쌍(μM)
FGA 아멜로제닌 vWA
실시예 4-1 57 1.5 0.5 1.0
실시예 4-2 57 1.5 0.5 1.5
실시예 4-3 57 1.5 0.5 1.8
실시예 4-4 57 1.5 0.5 2.0
<비교예 4> vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 혼합조성물의 PCR
상기 vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, vWA의 프라이머 쌍의 농도를 달리한 것을 제외하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하여 PCR 행하였다. vWA의 프라이머 쌍의 농도는 표 8과 같은 조건으로 행하였다.
vWA 농도별 PCR(비교예 4)
구분 vWA 프라이머 쌍의 농도
(μM)
비교예 4-1 0.2
비교예 4-2 0.3
비교예 4-3 0.4
비교예 4-4 0.5
비교예 4-5 0.6
비교예 4-6 0.7
비교예 4-7 0.8
비교예 4-8 0.9
비교예 4-9 0.95
비교예 4-10 2.1
비교예 4-11 2.15
비교예 4-12 2.2
<실험예 4> vWA의 프라이머 쌍의 농도의 최적화
vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해 실시예 4와 비교예 4를 통해 vWA의 프라이머 쌍을 0.2 내지 2.2μM의 농도로 포함하는 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하여 PCR을 행하였다. 도 8과 9는 vWA의 프라이머 쌍의 농도에 따른 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 9를 통해 vWA의 프라이머 쌍의 농도가 0.95μM 이하인 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭됨을 확인하였고, 2.1μM이상인 경우 상기 유전자의 밴드가 모두 증폭되었지만, 전기영동 결과 vWA의 유전자 밴드를 정확하게 식별하기 어려움을 확인하였으나, 도 8에서 1.0 내지 2.0μM의 농도에서 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
<실시예 5> 염화마그네슘(MgCl 2 ) 농도에 따른 PCR
염화마그네슘(MgCl2) 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, PCR buffer 1X, dNTPs 0.2mM, Taq polymerase(Takara, Japan) 1.25U, FGA의 프라이머 쌍 1.5μM, 아멜로제닌의 프라이머 쌍 0.5μM 및 vWA의 프라이머 쌍 1.5μM를 포함하고, 염화마그네슘(MgCl2)은 표 9와 같이 1.0 내지 1.25mM의 농도로 포함하도록 PCR용 프리믹스 조성물을 제조하였으며, 실시예 2와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하고 PCR을 행하였다.
염화마그네슘(MgCl2) 농도별 PCR(실시예 5)
구분 MgCl 2 농도 (mM)
실시예 5-1 1.0
실시예 5-2 1.1
실시예 5-3 1.2
실시예 5-4 1.25
<비교예 5> 염화마그네슘(MgCl 2 ) 농도에 따른 혼합조성물의 PCR
염화마그네슘(MgCl2) 농도에 따른 최적 PCR 조건을 확인하기 위해, 염화마그네슘(MgCl2)의 농도를 달리한 것을 제외하고, 실시예 5와 동일한 방법으로 반응혼합물을 제조하여 PCR 행하였다. 염화마그네슘(MgCl2)의 표 10과 같은 조건으로 행하였다
염화마그네슘(MgCl2) 농도별 PCR(비교예 5)
구분 MgCl 2 농도 (mM)
비교예 5-1 0.3
비교예 5-2 0.5
비교예 5-3 0.6
비교예 5-4 0.65
비교예 5-5 0.8
비교예 5-6 0.9
비교예 5-7 1.3
비교예 5-8 1.4
비교예 5-9 1.5
비교예 5-10 1.6
비교예 5-11 1.8
비교예 5-12 1.9
비교예 5-13 2.0
<실험예 5> 염화마그네슘(MgCl 2 ) 농도의 최적화
염화마그네슘(MgCl2) 농도에 따른 PCR 최적화 조건을 확인하기 위해 PCR용 프리믹스 조성물의 염화마그네슘(MgCl2) 최종 농도를 0.3 내지 2.0mM로 제조하여 PCR을 행하였다. 도 10과 11은 염화마그네슘(MgCl2)의 농도에 따른 유전자 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 11에서 염화마그네슘(MgCl2)의 농도가 0.3 내지 0.9mM이거나 1.3 내지 2.0mM인 경우 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나 또는 모두 증폭되지 않음을 확인하였으나, 도 10에서 염화마그네슘(MgCl2)의 농도가 1.0 내지 1.25mM의 경우에는 상기의 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자 모두 증폭됨을 확인하였다.
앞서 확인한 바와 같이, FGA, 아멜로제닌 및 vWA에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍의 농도의 비율에 따라 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 부분적으로 증폭되거나, 모두 증폭됨을 확인한 바, FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 모두 동시에 검출될 수 있는 프라이머의 최적농도를 확인하였다.
또한, 염화마그네슘(MgCl2)의 농도에 따라 FGA, 아멜로제닌 및 vWF의 유전자가 모두 증폭되지 않거나 부분적으로 증폭됨을 확인한 바, 상기 PCR용 프리믹스 조성물이 1.0mM 내지 1.25mM 농도의 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하는 경우 상기 FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 PCR용 프리믹스 조성물을 이용하여 PCR을 행할 경우 어닐링 온도에 따라 FGA, 아멜로제닌 및 vWA의 유전자가 증폭되거나, 증폭되지 않음을 확인한 바, FGA, 아멜로제닌 및 vWA 유전자 모두 감식할 수 있는 PCR용 프리믹스 조성물을 이용한 PCR의 어닐링 온도의 최적조건을 확인하였다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> PCR Premixes composition containing STR markers and a genetic analysis kit for scientific investigation education using the composition <130> DP20170038 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA forward primer <400> 1 tgccccatag gttttgaact c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA reverse primer <400> 2 attgaagtag ctgctgagtg a 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amelogenin forward primer <400> 3 tcccctgggc tctgtaaaga at 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amelogenin Reverse primer <400> 4 aactgggaag ctgatggtag ga 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWA forward primer <400> 5 gtgaaagccc tagtggatga taag 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vWA reverse primer <400> 6 aaatacatag gatggatgga ta 22

Claims (9)

  1. (a) FGA(Human fibrinogen alpha chain)에 상보적으로 결합하는 서열번호 1과 2로 이루어진 프라이머, 아멜로제닌(amelogenin)에 상보적으로 결합하는 서열번호 3과 4로 이루어진 프라이머 및 vWA(von Willebrand factor)의 유전자에 상보적으로 결합하는 서열번호 5와 6으로 이루어진 프라이머; 및
    (b) 염화마그네슘(MgCl2)을 포함하며,
    상기 서열번호 1과 2로 이루어진 프라이머는 1.0 ~ 1.5μM의 농도로 포함하며,
    상기 서열번호 3과 4로 이루어진 프라이머는 0.25 ~ 1.25μM의 농도로 포함하며,
    상기 서열번호 5와 6으로 이루어진 프라이머는 1.0 ~ 2.0μM의 농도로 포함하는 것인, PCR용 프리믹스 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 염화마그네슘(MgCl2)은 상기 조성물내에 1.0mM 내지 1.25mM 농도로 포함된 것인, PCR용 프리믹스 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물에 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물, DNA 중합효소 또는 완충액(buffer solution)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR용 프리믹스 조성물.
  4. 제 1항의 조성물을 포함하는 유전자 감식용 키트.
  5. 제 1항의 조성물을 이용하는 과학수사 교육용 유전자 분석 키트.
  6. 제 5항의 과학수사 교육용 유전자 분석 키트를 이용하여 과학수사 교육을 실시하는 단계를 포함하는 과학수사 교육방법.
  7. 개체에서 DNA를 포함하는 시료를 분리하는 단계;
    상기 시료와 제1항의 PCR용 프리믹스 조성물을 혼합하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR)을 수행하는 단계;
    상기 PCR에 의해 얻어진 PCR 산물을 전기영동하는 단계; 및
    전기영동 결과, 대조군과 FGA(Human fibrinogen alpha chain), 아멜로제닌(amelogenin), vWA(von Willebrand factor) 밴드가 모두 동일하게 형성된 경우 대조군과 동일인으로 식별하는 단계를 포함하는 과학수사 교육방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 PCR의 수행시 어닐링 온도가 55 내지 60℃ 인 것을 특징으로 하는 과학수사 교육방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 DNA를 포함하는 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 조골세포, 섬유아세포, 양수로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 시료인 것인, 과학수사 교육방법.
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