KR100825367B1 - 표지자로서 미토콘드리아 유전자 과변이부위를 이용하는조혈모세포이식 후 생착능 평가방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표지자(marker)로서, 미토콘드리아 유전자(mtDNA) 과변이부위(HV) 염기위치 303 폴리C 및/또는 16184 폴리C를 이용함으로써 조혈모세포이식 후 생착능을 정성적 및 정량적으로 평가할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 용이하고 간편할 뿐 아니라 조혈모세포이식 후 생착평가를 위해 현재 사용되고 있는 핵 DNA 표지자 보다 민감도가 매우 높고 정확하다.
미토콘드리아 유전자, 과변이부위, 303 폴리C, 16184 폴리C, 골수이식, 조혈모세포이식, 생착능 평가
Description
도 1은 조혈모세포이식 후 미토콘드리아 DNA 과변이부위 HV2의 303 폴리C 표지자를 이용하여 생착능을 평가한 결과를 보여주는 도면이고;
도 2는 조혈모세포이식 후 미토콘드리아 DNA 과변이부위 HV1의 16184 폴리C 표지자를 이용하여 생착능을 평가한 결과를 보여주는 도면이며;
도 3은 미토콘드리아 DNA 16184 폴리C 표지자를 염기서열 분석으로 확인한 결과를 보여주는 도면이고;
도 4는 미토콘드리아 DNA 303 폴리C 표지자의 민감도를 핵 유전자 D18S51 표지자와 비교하여 평가한 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명은 표지자(marker)로서, 미토콘드리아 유전자 과변이부위(hypervariable region, HV)를 이용하는 조혈모세포이식 후 생착능 평가방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 표지자로서 미토콘드리아 유전자 과변이 부위 303 폴리C 또는 16184 폴리C를 이용함으로써 조혈모세포이식 후 생착능을 정성적 및 정량적으로 평가할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것이다.
1960년대 말 인간에서 최초로 동종 골수이식(allogenic bone marrow transplantation)이 성공적으로 시행된 이래 동종 골수이식은 난치성 혈액질환 등 광범위한 질환에서 완치를 위한 결정적인 치료방법으로 정착되고 있으며, 그 대상 질환과 시술방법 또한 다양화되어가고 있다. 이러한 조혈모세포이식의 성공여부는 주로 원발 질환의 재발이나 이식편 생착거부 반응, 및 이식편-대-숙주(graft-versus-host) 질환의 영향을 받는다.
이식의 생착 여부를 관찰하고, 혈액학적 재발(hematologic relapse) 보다 먼저 재발 여부를 판단하기 위하여 키메리즘(chimerism) 상태를 검사하고 있다. 동종 조혈모세포이식에서 조혈세포는 공여자에서 유래하는 세포로 완전히 대체되고, 그 외의 세포는 환자에서 유래하는 세포로 남아 완전 키메리즘(complete chimerism, CC)을 형성하게 된다. 그러나 조혈세포의 경우에도 골수 이식 후 일정기간 동안 환자 세포와 공여자 세포가 혼재하는 혼합 키메리즘(mixed chimerism, MC)을 이루고, 시간이 경과함에 따라 완전 키메리즘으로 대체된다.
이러한 키메리즘 상태를 확인하는 검사법으로 적혈구 표현형 검사, 면역글로불린 이소타입(immunoglobulin isotype) 분석, 세포분열 중기 세포유전학적 분석 등이 일찍부터 사용되어 왔으나, 검사의 민감도나 특이도 면에서 만족스럽지 못하였다. 특히 조혈모세포이식 후 재생되는 세포가 충분한 양이 될 때까지는 검출할 수 없다는 한계 때문에 초기의 이식편 거부나 급성 이식편-대-숙주병의 진단에 활용하기 어려운 문제점이 있었다. 현재 Y-염색체 특이 형광교잡법(fluorescent in situ hybridization, FISH)이 공여자와 환자의 성별이 다른 경우에 상대적으로 높은 민감도와 정량분석이 가능하다는 장점으로 인해 많은 실험실에서 사용되고 있다.
인간 게놈(genome)의 특정 부위에서는 일정한 크기의 염기서열이 반복하는데 그 반복횟수가 사람마다 다양하다. 이중 VNTR(variable number of tandem repeat) 유전자좌의 염기서열은 8~50 염기쌍 길이의 미니새틀라이트 코어(minisatellite core)로 구성되며, STR(short tandem repeat) 유전자좌는 2~8 염기쌍 길이의 마이크로새틀라이트 코어(microsatellite core)로 이루어져 있다. VNTR 또는 STR(VNTR/STR) 유전자좌는 멘델 법칙에 의해 유전되며 개인마다 연쇄반복의 차이가 있고, 이형접합률이 높은 유전자좌는 개인 식별력이 우수하여 동종 조혈모세포이식 후 이식편의 생착 여부를 확인하는데 이용되어 왔다. 1980년대 후반 DNA를 이용한 제한절편길이다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)에 의해 공여자와 환자 간의 개인 식별이 가능하게 되었다. 그러나 이 방법은 많은 시간과 노력이 소요되며 이식 후 초기에 조혈세포가 극히 적은 상태임에도 불구하고 5~10 ㎍ 이상의 다량의 DNA가 필요한 점 등으로 인해 골수이식 환자에서 이식편의 생착 여부를 확인하기에 적절치 않았다. 1980년대 후반부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 유전자 증폭이 일반화되면서 VNTR/STR 유전자좌의 발굴과 유전자형 분석이 가능하게 되었다. 그러나 이들 표지자는 공여 자 및 환자에 따라 그 유용성에 현저한 차이를 보이고 아직까지 표준화가 이루어지지 않았으며, 무엇보다 그 민감도 및 재현성, 특히 공여자 세포수가 적은 경우 또는 이식 후 조기에 키메리즘 유무를 정량적으로 평가하고자 할 때 문제가 있다.
한편, 미토콘드리아 유전자(mitochondrial DNA; mtDNA)는 세포질 내 미토콘드리아에 존재하는 16,659 염기 크기의 유전자로서, 세포 및 조직이 필요로 하는 ATP 생성 및 세포고사를 조절하는 세포 내의 독립된 유전체이다. mtDNA는 에너지 생성과정 중에 발생하는 세포 내의 유리산소에 직접 노출되어 있고, 손상된 DNA의 복구능력이 취약하여 핵 DNA에 비하여 10~20배 정도 유전변이 빈도가 높은 것으로 알려져 있다. 또한, mtDNA는 세포 내에 분산 배치되어 있고 한 개의 세포 내에 수천 개의 복제수가 있어 그 표적분자 수가 많아 민감도 면에서 우수하고, 전통적으로 HV 부위 및 mtDNA 마이크로새틀라이트는 유전적 변이가 심해 세포 및 조직 수준에서 개인 식별에 이용될 수 있다.
본 발명자들은 조혈모세포이식을 받은 환자의 검체를 대상으로 미토콘드리아 유전자 과변이부위(염기위치(np) 16024~16569 및 1~576)의 염기서열 분석을 수행하고, 총 6개의 미토콘드리아 유전자의 과변이부위 및 암호화부위 표지자(np 303 폴리C, np 16184 폴리C, np 514 CA 반복체(repeat), np 3566 폴리C, np 12385 폴리C 및 np 12418 폴리A)의 조혈모세포이식 후 생착능 평가를 위한 유용성을 평가하였다. 그 결과, 미토콘드리아 과변이부위 유전자 303 폴리C 및 16184 폴리C가 조혈모세포이식 후 생착능 평가에 효율적으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 표지자로서 미토콘드리아 유전자 과변이부위 염기위치 303 폴리C 및/또는 16184 폴리C를 이용하여 개인 간 세포를 식별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 표지자로서 미토콘드리아 유전자 과변이부위 염기위치 303 폴리C 및/또는 16184 폴리C를 이용하여 조혈모세포이식 후 생착능을 평가하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표지자로서 미토콘드리아 과변이부위 유전자 303 폴리C 및/또는 16184 폴리C의 시발체(primers)를 포함하는 상기 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은 표지자로서, 미토콘드리아 유전자 과변이부위 염기위치 303 폴리C 및 16184 폴리C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대해 길이다형성 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 개인 간 세포를 식별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은
1) 표지자로서, 미토콘드리아 유전자 과변이부위 염기위치 303 폴리C 및 16184 폴리C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대해 길이다형성 분석을 수행하고;
2) 이식 후 수혜자(recipient)의 상기 표지자의 길이다형성 분석을 수행하 여, 공여자(donor) 표지자가 차지하는 비율을 계산하는:
단계를 포함하는, 조혈모세포 이식 후 생착능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은
표지자로서, 미토콘드리아 과변이부위 유전자 303 폴리C 및 16184 폴리C로부터 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 검출가능한 표지로 표지된 정방향(forward) 시발체, 및 역방향(reverse) 시발체;
를 포함하는, 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 태양에서, 303 폴리C 및/또는 16184 폴리C의 검출가능한 표지로 표지된 정방향 시발체 및 역방향 시발체를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 길이다형성 분석을 수행할 수 있다. 303 폴리C의 정방향 시발체 및 역방향 시발체는 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지며, 16184 폴리C의 정방향 및 역방향 시발체는 각각 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 미토콘드리아 유전자 조절부위 염기서열을 분석하고, 한국인의 미토콘드리아 유전자 과변이부위 길이다형성을 프로파일링하였으며, 미토콘드리아 유전자 과변이부위의 유전적 다양성을 분석하였다. 나아가, 미토콘드리아 유전자를 이용하여 조혈모세포이식을 받은 각종 혈액질환 환자의 생착능을 평가하기 위하여, 미토콘드리아 과변이부위의 6개의 표지자를 선별하고, 핵 유전자 표지자와 비교하여 그 유용성을 민감도 및 정확성 시험을 통해 증명하였다.
좀더 구체적으로, 미토콘드리아 유전자의 비암호화부위인 HV1 및 HV2에 위치하는 16184 폴리C(16184CCCCCTCCCC16193, 5CT4C), 303 폴리C(303CCCCCCCTCCCCC315, 7CT5C) 및 514 (CA) 반복체(514CACACACACA523, (CA)5 반복체), 및 3566 폴리C(3566CCCCCC3571, 6C), 12385 폴리C(12385CCCCCC12390, 5C) 및 12418 폴리A (12418AAAAAAAA12425, 8A)에 대해 길이다형성 분석을 수행하고, 조혈모세포이식 후의 생착률 평가에 있어서의 유용성을 평가하였다. 또한, 핵 유전자의 7개의 표지자(D12S391, D18S51, D1S80, F13A, HUM FABP2, HUM RENA-4 및 아멜로게닌(amelogenin))에 대해서도 미토콘드리아 유전자 표지자와 동일한 방법으로 길이다형성을 분석하고, 미토콘드리아 유전자의 표지자와 비교하여 유용성을 평가하였다. 그 결과, 미토콘드리아 유전자 6개의 표지자 중 비암호화부위인 HV에 해당하는 3개의 표지자(303 폴리C, 16184 폴리C 및 514 (CA) 반복체)가 조혈모세포이식 후의 생착률을 평가하는데 각각 63, 67 및 11%의 유용성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 50% 이상의 유용성을 나타낸 미토콘드리아 유전자 표지자 303 폴리C와 16184 폴리C를 핵 유전자 표지자와 비교하였을 때 조혈모세포이식 후의 생착률을 평가하기 위한 새로운 표지자로 발굴하였다.
아울러, 미토콘드리아 유전자 표지자의 길이다형성 유전변이를 검증하기 위하여, 303 폴리C 및 514 (CA) 반복체를 포함하는 HV2와 16184 폴리C를 포함하는 HV1에 대해 PCR을 수행한 후 정제하고, 각 정제된 PCR 산물로 대장균 세포를 형질 전환시켜 대량 배양 및 재조합 DNA 추출과정을 수행하여 염기서열 분석을 수행하였다. 또한, 미토콘드리아 유전자 표지자의 민감도와 정확성을 시험하기 위하여, 핵 DNA 표지자와 비교하여 세포혼합 실험을 실시하였다. 이때, 각 표지자의 피크 면적(peak area)을 계산하여 공여자 세포가 차지하는 비율(%)을 구하였다. 그 결과, 미토콘드리아 유전자 표지자의 민감도가 핵 유전자 표지자에 비해 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 조혈모세포이식 후 생착률을 평가하기 위한 새로운 표지자의 발굴
각종 혈액질환으로 조혈모세포이식을 받은 27예(급성골수구성백혈병 12예, 급성림프구성백혈병 10예, 재생불량성빈혈 2예 및 만성골수증식성질환 3예)의 공여자, 환자(수혜자) 및 동종조혈모세포이식 후 환자의 검체를 대상으로 미토콘드리아 유전자 과변이부위(염기위치(np) 16024~16569 및 1~576) 염기서열 분석과 총 6개의 미토콘드리아 유전자의 과변이부위 및 암호화부위 표지자(np 303 폴리C, np 16184 폴리C, np 514 CA 반복체, np 3566 폴리C, np 12385 폴리C 및 np 12418 폴리A)의 조혈모세포이식 후 생착능 평가에 대한 유용성을 평가하였다.
먼저 각종 혈액질환 환자 27명의 조혈모세포 공여자와 이식 전 환자의 혈액 10 ㎖를 헤파린 튜브에 채취하였다. 이식 후 검체로는 골수 및 말초혈액을 이식한 후 약 20일과 약 90일째에 환자의 혈액 또는 골수를 채취하여 배양배지에 1:1의 비율로 혼합한 후 밀도구배 원심침전법으로 원심분리하여 백혈구분획(buffy coat)을 분리하였다. 백혈구 분획에서 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다.
미토콘드리아 DNA의 비암호화부위인 HV1 및 HV2에 위치하는 16184 폴리C(16184CCCCCTCCCC16193, 5CT4C), 303 폴리C(303CCCCCCCTCCCCC315, 7CT5C) 및 514 (CA) 반복체(514CACACACACA523, (CA)5 반복체), 및 3566 폴리C(3566CCCCCC3571, 6C), 12385 폴리C(12385CCCCCC12390, 6C) 및 12418 폴리 A(12418AAAAAAAA12425, 8A)의 길이다형성 유전변이를 정확하게 검출하기 위하여, 이들 부위를 포함한 약 100 bp 크기의 PCR 산물을 얻은 후 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 ABI 프리즘 3100 제네틱 애널라이저(ABI prism 3100 genetic analyzer)와 진 스캔 어낼리시스 소프트웨어 버전 3.1(gene scan analysis software version 3.1)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 수행하였다. 각 정방향 시발체의 5'-말단에 Hex(2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인) 형광물질을 표지하였다. PCR 조성은 10× 완충액 5 ㎕, dNTP 400 μM, Taq DNA 폴리머라제 2.5 U, 각 시발체 20 pmoles, 멸균증류슈 33.5 ㎕ 및 게놈 DNA 5 ng으로 총 50 ㎕ 반응을 수행하였다(타카라 LA Taq(TaKaRa LA Taq)™). PCR 온도조건은 96 ℃ 1 분 열 변성 후 94 ℃ 15 초 DNA 변성(heat denaturation), 56 ℃ 30 초 어닐링(annealing), 72 ℃ 20 초 신장반응(extension)의 35 주기로 수행한 후, 72 ℃ 5 분의 신장반응을 수행하였다. PCR 종료 후 50배 희석한 PCR 산물 1 ㎕, 탈이온 포름아미드 13.5 ㎕ 및 길이 유전자형 분석 ROX 내부표준물질(어플라이드 바이오시스템즈) 0.5 ㎕의 조성으로 95 ℃ 5 분 변성 후 4 ℃에서 반응시켰다. 변성된 PCR 산물을 ABI 프리즘 3100 제네틱 애널라이저와 진 스캔 어낼리시스 소프트웨어 버전 3.1(어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 길이 유전자형 분석을 수행하였다. 정확한 결과를 얻기 위해 각 검체에 대해 최소 2회의 다른 PCR 반응을 수행하였고 반복적인 실험을 수행하였다. 각 미토콘드리아 유전자 표지자에 대해 사용된 시발체는 아래 표 1에 나타낸 바와 같았다.
(F264의 염기서열: 서열번호 1, R391의 염기서열: 서열번호 2, F16142의 염기서열: 서열번호 3, R16251의 염기서열: 서열번호 4)
핵 유전자의 7개의 표지자(D12S391, D18S51, D1S80, F13A, HUM FABP2, HUM RENA-4, 및 아멜로게닌) 또한 미토콘드리아 유전자 표지자와 동일한 방법으로 길이다형성을 분석하고, 미토콘드리아 유전자 표지자와 비교하여 유용성을 평가하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 유전자 6개의 표지자 중 비암호화부위인 과변이부위에 해당하는 3개의 표지자(303 폴리C, 16184 폴리C 및 514 (CA) 반복체)가 조혈모세포이식 후의 생착률을 평가하는데 각각 63, 67 및 11%의 유용성을 나타내었다. 따라서 50% 이상의 유용성을 나타내는 미토콘드리아 유전자 표지자 303 폴리C와 16184 폴리C가 핵 유전자 표지자와 비교하였을 때 조혈모세포이식 후의 생착률을 평가하기 위한 새로운 표지자로 발굴되었다. 조혈모세포이식 후 303 폴리C 및 16184 폴리C 표지자를 이용하여 생착능을 평가한 결과를 도 1 및 2에 각각 나타내었다.
실시예 2: 미토콘드리아 유전자 표지자의 길이다형성 유전변이 검증
미토콘드리아 유전자 표지자의 길이다형성 유전변이를 검증하기 위하여, 303 폴리C 및 514 (CA) 반복체를 포함하는 HV2와 16184 폴리C를 포함하는 HV1에 대해 PCR을 수행하였다. 시발체로는 303 폴리C의 경우 F15(5'-CACCCTATTAACCACTCACG-3') 및 R484(5'-TGAGATTAGTAGTATGGGAG-3')를, 514 (CA) 반복체의 경우 F361(5'-ACAAAGAACCCTAACACCAGC-3') 및 R921(5'-ACTTGGGTTAATCGTGTGACC-3')을 사용하여, 각각 470 bp 및 560 bp 크기의 PCR 산물을 얻었다. 16184 폴리C는 시발체로 F15971(5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3') 및 R16451(5'-GCGAGGAGAGTAGCACTCTTG-3')를 사용하여, 480 bp 크기의 PCR 산물을 얻었다.
각 PCR 산물을 에티디움 브로마이드(0.25 ㎍/㎖)로 염색한 1% 한천 겔에 전기영동하여 면도칼로 절제하였다. 절제된 PCR 산물을 솔젠트(SolGent) 한천 겔 추출 키트(솔젠트, 대전, 한국)를 이용하여 정제하고, 추출 완충용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.5)에 녹여 정량하였다. 각각의 정제된 PCR 산물을 pGEM®-T 이지 벡터(pGEM®-T Easy Vector)(프로메가(Promega), 매디슨, CA)에 삽입하였다. 수용성(Competent) E. coli JM 109 세포를 이용하여 형질전환을 수행하고, 8~12개 백색 콜로니(재조합 플라스미드 함유)를 선택하여 대량 배양 및 재조합 DNA 추출과정을 수행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 염기서열 분석을 통하여 길이다형성 유전변이를 확인하였다.
실시예 3: 미토콘드리아 유전자 표지자의 민감도 및 정확성 시험
미토콘드리아 유전자 표지자의 민감도와 정확성을 시험하기 위하여, 핵 DNA 표지자와 비교하여 세포혼합 실험을 실시하였다. 각 공여자와 환자의 혈액 백혈구 세포를 분리하고 세포수를 측정하여 1:99, 5:95, 10:90, 20:80. 30:70 및 40:60 비율로 혼합하여 미토콘드리아 유전자의 표지자 303 폴리C와 핵 DNA 표지자 D18S51의 민감도를 시험하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 각 표지자의 피크 면적을 산출하여 아래 계산식에 의해 세포혼합비별로 민감도를 비교하였다.
1) 미토콘드리아 DNA 303 폴리C 표지자:
공여자 비율(%) = (F+G)×100 / (A+B+C+D+E+F+G)
2) 핵 DNA D18S51 표지자:
공여자 비율(%) = (C+D)×100 / (A+B+C+D)
미토콘드리아 유전자 표지자의 유전자 스캔 분석을 위한 반응혼합물의 조성은 10배 농축된 완충용액 5 ㎕, 합성 뉴클레오티드 혼합물 400 μM, 내열성 중합효소 2.5 U(타카라(TAKARA)), 각 미토콘드리아 유전자 표지자의 형광물질이 부착된 정방향 시발체와 역방향 시발체 혼합물 20 pmoles, 멸균증류수 33.5 ㎕ 및 게놈 DNA 5 ng을 혼합한 총 50 ㎕로 96 ℃ 1 분 열 변성 후 94 ℃ 15 초 DNA 변성, 56 ℃ 30 초의 어닐링, 72 ℃ 20 초 신장반응의 35 주기를 반복하여 수행한 후 72 ℃ 5 분 신장반응을 거쳐 PCR을 실시하였다. 50 ㎕ PCR 산물 중 1 ㎕를 취하여 포름알데히드 13.7 ㎕, ROX 내부표준물질 0.3 ㎕를 혼합하여 95 ℃에서 5 분간 열처리한 후, 염기서열 분석 및 길이다형성 분석기계인 ABI 프리즘 3100 제네틱 애널라이저와 진 스캔 어낼리시스 소프트웨어 버전 3.1(어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 길이다형성 분석을 실시하였다.
그 결과를 표 3에 나타내었다.
미토콘드리아 유전자: 303 폴리C 표지자 | 핵 유전자: D18S51 표지자 | ||
공여자 세포 혼합률(%) | 정량 비율(%) | 공여자 세포 혼합률(%) | 정량 비율(%) |
1 | 0.8 | NA | NA |
5 | 5.4 | NA | NA |
10 | 9.8 | 10 | 6.0 |
20 | 19.5 | 20 | 14.5 |
30 | 29.7 | 30 | 21.8 |
40 | 37.7 | 40 | 35.5 |
50 | 46.2 | 50 | 37.0 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 세포당 약 1,000개의 미토콘드리아를 함유하고 있어 미토콘드리아 유전자 표지자의 민감도가 핵 유전자 표지자보다 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명은 종래의 미토콘드리아 유전자의 길이다형성 분석방법 보다 짧은 길이의 표지자를 이용하므로, 동종 골수이식 후 조혈모세포 생착 유무 판정을 위한 공여자와 이식 전 및 후 환자의 미토콘드리아 유전자 과변이부위의 구분이 확실하여 용이하고 간편한 정성적 분석방법을 제공한다. 또한, 적은 양의 DNA로도 분석 이 가능하여 변이가 심한 미토콘드리아 유전자의 0.1 염기까지 감지할 수 있고 정확한 크기와 피크의 면적 및 높이까지 검출할 수 있어 키메리즘 비율(%)의 정량적 분석방법을 제공한다. 본 발명은, 한 개의 세포 내에 수천 개의 미토콘드리아 DNA 복제수가 존재하므로, 조혈모세포이식 후 생착평가를 위해 현재 사용되고 있는 핵 DNA 표지자 보다 민감도가 매우 높고 정확한 분석방법을 제공하는 바, 공여자와 환자의 세포 식별에 유용할 뿐 아니라, 조혈모세포이식 후 조혈모세포 생착능을 관찰하여 이식편 거부나 재발의 가능성을 예측하는데 도움을 줄 수 있다.
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Claims (6)
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- 1) 표지자(marker)로서, 미토콘드리아 유전자 과변이부위 염기위치 303 폴리C 및 16184 폴리C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대해 길이다형성 분석을 수행하고;2) 이식 후 수혜자의 상기 표지자의 길이다형성 분석을 수행하여, 공여자 표지자가 차지하는 비율을 계산하는:단계를 포함하는, 조혈모세포 이식 후 생착능을 평가하는 방법.
- 제2항에 있어서, 검출가능한 표지로 표지된 서열번호 1의 정방향 시발체 및 서열번호 2의 역방향 시발체를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 303 폴리C의 길이다형성 분석을 수행하는 방법.
- 제2항에 있어서, 검출가능한 표지로 표지된 서열번호 3의 정방향 시발체 및 서열번호 4의 역방향 시발체를 이용하여 PCR을 수행하여 16184 폴리C의 길이다형성 분석을 수행하는 방법.
- 삭제
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