KR102048700B1 - 미토콘드리아 dna 기반의 프라이머 세트 및 이를 이용한 세포 치료제의 체내 분포 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
개시된 세포치료제 체내 분포 시험용 프라이머 세트는 미토콘드리아 12s rRNA 부위의 DNA를 표적으로 한다. 상기 프라이머 세트는 높은 민감도를 가짐으로써, 세포치료제 체내 분포 시험의 신뢰도를 개선할 수 있다.
Description
본 발명은 프라이머 세트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 정량 중합효소연쇄반응 시험에 사용될 수 있는 미토콘드리아 DNA 기반의 프라이머 세트 및 이를 이용한 세포 치료제의 체내 분포 평가 방법에 관한 것이다.
줄기세포치료제는 살아있는 세포로서 다분화능이라는 세포 자체의 특성과 주변환경에 따라 운명(예; 이동, 생착, 분화, 잔존)에 영향을 받는다고 알려져 있다. 줄기세포치료제의 재생치료에 대한 기대가 높아짐에 따라, 척수강, 피하, 근육내 등 다양한 투여경로로의 적용이 늘어나고, 줄기세포치료제 기원이 자가에서 동종, 이종을 넘어 iPS(유도만능 줄기세포)로 까지 다양화 되어가는 경향이 있어 이에 따른 생체분포를 면밀히 평가해야 하는 경우가 늘어나고 있다.
미국 식품의약품안전국(FDA, Food and Drug Administration)에서는 적절한 동물종을 이용하여 생체내 분포, 이동, 잔존기간에 대한 자료를 안전성 측면에서 확보할 것을 권고하고 있다. 특히 투여 후 세포의 운명을 확인하는 것은, 세포의 생착이 의도한 활성을 나타내는 데에 필수적이고 중요한지를 결정함으로써 세포치료제의 추정되는 작용기전 분석에 도움이 될 수 있다고 권고하고 있다. 유럽 의약품안전청(EMA, European Medicineds Agency)에서는 현재의 기술적 한계 및 윤리적 문제로 인하여 인체 내에 투여한 후 세포의 생체분포 및 거동을 직접 확인할 수 없기 때문에, 비임상 실험동물을 대상으로 하는 연구를 통해 이와 같은 정보를 얻는 것이 중요하다고 강조하고 있다.
줄기세포치료제는 생물학적 특성으로 인해 전통적인 의약품의 일반적 약동학시험(흡수, 분포, 대사 및 배설)과 약동학적 프로파일링은 적용되지 않는다. 대신, 투여후 세포의 체내 분포, 생착 및 증식을 평가하는 것이 합리적이다. 이 때 여러 운명(예, 이동(migration), 미세환경(niche; microenvironment), 생착(engraftment), 분화(differentiation), 잔존(persistence))을 갖는 줄기세포의 특성을 고려하여야 한다.
체내분포에 영향을 미치는 요인으로는 시험동물과 투여 세포와의 유전적 관계(예, 자가, 동종, 이종), 세포의 유래 조직(예, 배아줄기세포, 조혈줄기세포, 중간엽줄기세포), 완제품 제조과정 중에 사용된 세포조작 정도(예, 성장인자 유무에 따른 배양증식, 세포증식 유무와 함께 ex vivo 유도 및 분화), 투여경로 및 방법(예, 정맥투여, 근육투여, 피하투여), 시험동물의 면역상태(예, 면역결핍, 면역저하, 면역억제제 투여), 생체 내 미세환경, 혼합 또는 동시 투여되는 병용약물(예, 피브린글루, 세포전달기구 또는 지지체(예, 매트릭스), 질환/손상 (disease/injury) 발생 시기에 대한 세포 투여 시점(예, 만성, 급성) 등을 예로 들 수 있으며, 이를 고려하여 적절한 접근법이 요구된다.
일반적으로 임상시험용의약품을 임상예정 투여경로로 적용하여 투여부위 및 표적장기에서의 지속시간 및 그 외 주요 장기에서의 분포를 평가한다. 또한, 면역관용, 호밍효과(homing effect) 등 줄기세포의 특성상 일반 면역결핍동물과 질환/손상 동물모델에서의 생체 내 분포가 다를 수 있으므로 세포의 체내분포를 관찰하기에 적합한 동물모델을 선택하는 것이 중요하다.
또한, 만일 세포치료제의 효력 달성을 위해 세포의 생존/생착이 장기간 요구될 경우, 투여 후 충분한 기간 동안 체내 세포 생존과 해부학적 생착 및 생물학적 활성 평가를 고려할 수 있다.
현재의 분석방법 한계로 인하여 임상연구로부터 충분한 정보의 줄기세포치료제 생체 내 분포를 얻는 것이 쉽지 않으므로 비임상 생체 내 분포 연구의 설계가 매우 중요하며, 그 시험방법으로서, 사람유래 세포 또는 시험동물과 다른 핵형(karyotype)(예, 성별)임을 밝힐 수 있는 정량 PCR (예, Realtime-PCR)과 면역화학적 분석법 등의 방법을 수행할 수 있다.
정량 PCR(qPCR)을 수행하는 경우, 예를 들어, 사람 특이적 DNA 서열(sequence) (예, Alu)를 검출할 수 있는 프라이머(primer) 및 형광 부착 프로브(probe)를 이용하는 방법이 알려져 있다. Alu 유전자는 인간 게놈에는 100만개 이상의 카피수가 존재 하고, 이것은 전체 게놈의 10%에 해당한다 (Lander et al., 2001). Alu는 종특이성, 작은 크기, 매우 높은 카피수 때문에 다른 동물종에서 유래한 세포중에 사람 세포를 찾기 위한 이상적인 유전자라고 할 수 있다 (Opel et al.,2008, Preston et al., 2015).
그러나, Alu-qPCR는 다양한 어려운 점이 존재 하는데, 특히 설치류의 DNA와 섞였을 때 백그라운드(background)가 나타나게 된다. 첫 번째 요인은 설치류를 포함한 영장상목에서 Alu연관된 7SL RNA유래 SINE 혹은 B1요소의 존재로 비특이적인 반응이 발생할 수 있다(Kriegs et al., 2007, Kramerov et al., 2011). 두 번째 요인은 Alu는 높은 sequence 유사성과 직접적으로 반복되는 두 단량체로 구성되어 있기 때문에 primer나 probe가 Alu sequence의 multi-site 타겟하게 된다(Batzer et al., 2002). 셋째로 Alu 절편의 매우 높은 카피수와 Alu 염기쌍이 너무 가까이 위치하기 때문이다 (Stenger et al., 2001). 이러한 문제들은 Alu-qPCR의 민감성과 특이성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 일 과제는, 상기의 문제를 해결하기 위한 것으로, 체내 분포 시험을 위한 정량 PCR에서 민감도와 특이도를 개선할 수 있는 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 프라이머 세트를 이용한 세포 치료제의 체내 분포 평가 방법을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급된 과제에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양하게 확장될 수 있을 것이다.
상술한 본 발명의 일 과제를 달성하기 위한 본 발명의 예시적인 실시예들에 따르면, 세포치료제 체내 분포 시험용 프라이머 세트는 미토콘드리아 12s rRNA 부위의 DNA를 표적으로 한다.
일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 22 및 25의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 25의 프라이머 세트 및 서열번호 24 및 26의 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25의 프라이머 세트, 및 서열번호 24 및 27의 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 세포치료제의 체내 분포 평가 방법은, 세포 치료제를 시험 동물에 투여하는 단계, 상기 시험 동물의 조직으로부터 DNA를 분리하는 단계 및 상기 분리된 DNA를 미토콘드리아 12s rRNA 부위의 DNA를 표적으로 하는 프라이머 세트 및 정량 PCR을 이용하여 증폭하는 단계를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 상기 분리된 DNA를 증폭하는 단계는, 서열번호 21의 프로브를 이용하여 수행한다.
일 실시예에 따르면, 상기 시험 동물은 설치류이다.
상술한 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시예들에 따르면, Alu 프라이머 보다 높은(약 50배 이상의) 민감도를 갖는 PCR용 프라이머를 제공할 수 있다. 따라서, 세포 치료제의 체내 분포 시험의 정확성을 크게 개선할 수 있다.
도 1은 미토콘드리아 DNA의 구성을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트 및 서열번호 21의 프로브의 염기서열 및 위치를 도시한 도면이다.
도 3은 Alu 프라이머/프로브 및 12S-4 프라이머/프로브(mtDNA)를 이용하여 얻어진 체내 분포 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 서열번호 22 내지 27의 프라이머의 염기서열 및 위치를 도시한 도면이다.
도 2는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트 및 서열번호 21의 프로브의 염기서열 및 위치를 도시한 도면이다.
도 3은 Alu 프라이머/프로브 및 12S-4 프라이머/프로브(mtDNA)를 이용하여 얻어진 체내 분포 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 서열번호 22 내지 27의 프라이머의 염기서열 및 위치를 도시한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 미토콘드리아 DNA 기반의 프라이머 세트 및 이를 이용한 세포 치료제의 체내 분포 평가 방법에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트는, 미토콘드리아 DNA를 표적으로 한다. 미토콘드리아 DNA는 세포소기관인 미토콘드리아에 존재하는 DNA이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 상기 프라이머 세트는, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 쌍을 포함할 수 있다.
도 1은 미토콘드리아 DNA의 구성을 개략적으로 도시한 도면이다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는, 미토콘드리아 DNA에서 12S rRNA 부위를 표적으로 할 수 있다.
예를 들어, 상기 프라이머 세트는 표 1의 서열번호 1 내지 8 내지 22 내지 27에 의해 예시될 수 있다.
표 1에서, 프라이머의 명칭은 부위(cytb: 사이토크롬 B)-번호-방향(F:정방향 R:역방향)을 나타낸다. bp는 PCR 산물의 길이를 나타낸다.
표 1
일 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 26을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 27을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 23을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 25를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 27을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 23을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 26을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 22를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 25를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 23을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 25를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 26을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에서 선택될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 26을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 7을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 27을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 23을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 8을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 25를 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 서열번호 24를 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 27을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 프라이머 세트는, 정량 PCR에 사용될 수 있다. 예를 들어, 정량 PCR은 반응의 각 사이클에서 PCR 반응에서 생성되는 형광 신호를 측정할 수 있다. 상기 정량 PCR 반응으로 도입되는 테스트 서열의 양은 사이클링 동안 생성되는 신호의 강도를 결정할 것이고, 이러한 신호를 알려진 표준으로부터 수득된 신호와 비교함으로써 DNA의 농도를 정량화할 수 있다.
예를 들어, 반응의 지수기(exponential phase) 동안 존재하는 DNA의 상대적 농도는 로그 등급으로 사이클 수에 대해 형광도를 표시함으로써 측정될 수 있다. 상기 백그라운드(background) 형광의 검출을 위한 임계값이 측정된다. 샘플의 형광이 임계값을 교차하는 사이클은 사이클 임계(cycle threshold) Ct라고 지칭될 수 있다, 알려진 양의 표준 DNA의 다수 희석물들을 사용함으로써, Ct에 대한 log 농도의 표준 곡선이 만들어질 수 있다. 그 후, 알려지지 않은 샘플 내 DNA의 양은 이의 Ct 값으로부터 산출될 수 있다.
당업계의 통상의 기술자라면 증폭하려는 표적 서열의 길이 또는 프라이머의 서열 및 길이를 포함하는 다양한 인자들에 의존하여, 각 정량 PCR 사이클에서 온도, 길이 등과 같은 정량 PCR 반응의 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 예를 들어, 정량 PCR 반응은 약 20 사이클 내지 약 50 사이클, 바람직하게는 약 25 사이클 내지 약 45 사이클, 더 바람직하게는 약 30 사이클 내지 약 45 사이클의 PCR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각 사이클은 변성(denaturing) 단계 및 어닐링(annealing) 단계를 포함할 수 있다. 또한, 정량 PCR 반응은 자동화 시스템에 의해 수행되고 데이터 분석될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 정량 PCR을 통하여, 세포 치료제의 체내 분포 평가를 위한 임상 시험을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포 치료제를 시험 동물에 투여한다. 소정의 시간이 지난 후, 상기 시험 동물의 조직으로부터 DNA를 분리한다. 상기 분리된 DNA를 상기 프라이머 세트 및 정량 PCR을 이용하여 증폭한다.
상기 시험에서는 설치류, 돼지, 개, 원숭이, 양 등이 이용될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 다양한 동물을 이용한 시험에 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 시험 동물은 설치류일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 시약을 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 상기 시약은 샘플의 분리 및/또는 처치를 위한 버퍼, 증폭 반응을 수행하기 위한 DNA 폴리머라아제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 샘플의 제조를 용이하게 하는 반응 용기, 혼합 용기 및 다른 구성을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 종이, 디스크, CD, DVD, 메모리장치 등과 같은 컴퓨트로 판독 가능한 형태로 제공될 수 있는 사용 설명서를 선택적으로 포함할 수 있다
본 발명에 따르면, 세포 치료제의 체내 분포 평가를 위한 정량 PCR의 정확도를 크게 증가시킬 수 있다.
실시예
실험 1 프라이머 탐색
1) 프라이머 제작
Primer3 프로그램을 이용해, 표 1에 나타낸 것과 같은 12S 4개(서열번호 1 내지 8), 16S 4개(서열번호 9 내지 16), Cytochrome B 2개(서열번호 17 내지 20)의 프라이머 세트를 합성을 진행하였다(마크로젠). 특이성 검증을 위한 DNA는 사람의 경우, 인간 지방 파생 줄기 세포(human adipose-derived stem cells)에서 분리하였으며, 마우스(Mouse)와 랫드(Rat)는 폐 조직에서 게노믹(genomic) DNA 추출 키트를 이용하여, DNA 분리 후 사용하였고, 원숭이(Monkey, Zyagen, KG-314), 개(Zyagen, DG-314), 돼지(Pig, Millipore, 69230-3CN), 양(Sheep, Zyagen, SG-314)의 DNA는 구매 후 사용하였다.
2) 실험방법
각 DNA를 100ng, 10pmol 프라이머 1ul, 2X SYVR PCR master mix (abi) 10ul, 총량 20ul를 웰(well)에 넣고, 95℃에서 15분, 이후 40 사이클에선 95℃에서 15초 및 62℃에서 30초의 조건으로 실시간 PCR을 진행하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 2에 나타나있듯이 12S-4 프라이머 세트에서 마우스, 랫드와 같은 설치류에서 CT 값이 나타나지 않은 것을 확인 할 수 있었다.
표 2
실험 2 특이성 비교
1) 재료준비
실험 1의 12S-4 프라이머 세트 및 프로브(서열번호 21, 5'-FAM-AGCCTAGCCACACCCCCACG-MGB-3', Abi에서 합성)를 사용하고, 특이성 검증을 위한 DNA는 실험 1에서 사용한 게노믹 DNA를 사용하였다. 비교예로서, Alu 프라이머 세트를 사용하였다(Abi에서 custom 주문, Cat# 4331348). 12S-4 프라이머 세트 및 프로브의 염기 서열은 도 2에서 표시하였다.
2) 실험방법
각 DNA를 100ng, 10pmol 프라이머 1ul, 5uM 프로브 1ul, 2X Taqman universal PCR master mix (abi) 10ul, 총량 20ul를 웰(well)에 넣고, 95℃에서 15분, 이후 40 사이클에선 95℃에서 15초 및 60℃에서 60초의 조건으로 실시간 PCR을 진행하였다.실험방법은 실험 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 진행하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 3에 나타나있듯이, Alu 프라이머와 프로브로 실험한 경우 주형(template) DNA가 없는 증류수(DW)에서도 CT값이 35.45로 나타났고 실험동물로 많이 사용되는 마우스와 랫드에서 35.39, 34.77로 나타났으며 원숭이에서는 오히려 사람 세포 보다 많이 나타났다. 반면에 12S-4 프라이머 세트(mtDNA)를 이용한 경우 증류수, 마우스, 랫드, 양 등에서 CT값이 나타나지 않은 것을 볼 수 있었다.
표 3
실험 3 프라이머/프로브 밸리데이션
1) 재료준비
실험 2의 12S-4 프라이머와 프로브를 사용하였고, 인간 지방 파생 줄기 세포(human adipose-derived stem cells)에서 분리한 DNA를 사용하였다.
2) 실험방법
직진성을 확인하기 위해서 인간 DNA를 각각 100, 10, 5, 1, 0.5, 0.1ng으로 희석하여, 실험 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 3회 실시하였다. 정확성을 확인하기 위하여 인간 DNA를 각각 80(HQC), 3.2(MQC), 0.3(LQC)ng로 희석한 후, 실험 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 4 내지 표 6에 나타나있듯이 Alu 프라이머와/프로브를 이용한 경우와 12S-4 프라이머/프로브를 이용한 경우 모두에서 R2값이 0.99이상(Alu=0.9973, mtDNA=0.9995)로 나타났으며, 정확성은 모든 항목이 기준(회수율 15%이내, 변동계수 15%이내, 단 LLOQ의 경우 20%이내)안에 들어가는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 미토콘드리아 DNA도 Alu와 마찬가지로 분포시험에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
표 4
표 5
표 6
실험 4 검출 한계 비교
1) 재료준비
면역결핍 마우스 6마리에 인간 지방 파생 줄기 세포(human adipose-derived stem cells) 500,000개씩 넣어주고, 컨트롤은 free media만 동량 넣어 준 후 1시간과 7일 후 부검하여 뇌(Brain), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 콩팥(Kidney), 비장(Spleen), 췌장(Pancreas), 고환(Testes), 골수(Bone marrow)를 채취하였다. 채취된 조직들은 조직분쇄기로 전체 분쇄 하고 그중 25mg을 취해 maxwell kit를 이용하여 DNA를 분리 하였다. 본 실험에 사용하는 것은 배지만 넣은 vehicle control의 조직의 DNA만 이용 하였다. 검출한계측정을 위해 측정용 DNA를 0.05, 0.01, 0.005, 0.001ng으로 희석하여 준비하였다.
2) 실험방법
각각의 조직에서 분리된 DNA를 실험 1 및 2와 동일한 조건으로 실시간 PCR을 진행하여, 검출한계측정용 DNA에서 나타난 CT값과 비교 하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 7에 나타나있듯이 Alu 프라이머/프로브를 이용한 경우 검출 한계가 0.05ng/ug(humanDNA/mouseDNA)로 나타났고 이는 마우스 세포 2만개중에 인간세포 1개가 검출 가능한 것을 의미한다. 12S-4 프라이머/프로브(mtDNA)를 이용한 경우 0.001ng/ug(humanDNA/mouseDNA)으로 이는 마우스 세포 100만개 중에 휴먼 세포 1개 검출 가능한 것을 의미한다. 즉 검출한계는 미토콘드리아 DNA가 50배 낮음을 알 수 있다.
표 7
실험 5 - 분포시험 비교
1) 재료준비
실험 1의 12S-4 프라이머 세트외 추가적으로 앞 뒤 및 프로브(서열번호 21, 5'-FAM-AGCCTAGCCACACCCCCACG-MGB-3', Abi에서 합성)를 사용하고, 특이성 검증을 위한 DNA는 실험 1에서 사용한 게노믹 DNA를 사용하였다. 비교예로서, Alu 프라이머 세트를 사용하였다(Abi에서 custom 주문, Cat# 4331348). 12S-4 프라이머 세트 및 프로브의 염기 서열은 도 2에서 표시하였다.
2) 실험방법
각각의 조직에서 분리된 DNA를 실험 1 및 2와 동일한 조건으로 실시간 PCR을 진행하여, 실험 2에서 만든 표준정량곡선에 대입하여, 결과를 측정하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 8 및 도 3에 나타나있듯이 Alu 프라이머/프로브를 이용한 경우 및 12S-4 프라이머/프로브(mtDNA)를 이용한 경우 모두 폐와 간에서 검출되는 것을 알 수 있다. 또한, 12S-4 프라이머/프로브(mtDNA)를 이용한 경우, 검출 한계가 낮아 투여 후 7일 마우스의 폐에서 미량의 DNA도 검출 할 수 있음을 알 수 있다.
표 8
실험 6 - 분포시험 비교
1) 재료준비
실험 2의 12S-4 프라이머(서열번호 7 및 8)와 염기서열상 비슷한 위치에 있으면서 설치류와 차이를 보이는 위치로 프라이머(서열번호 22 내지 27)를 제작하였다. 염기서열상의 설치류와 차이를 보이는 위치는 도 4에 표시하였다. 프로브를 사용하였고, 인간 지방 파생 줄기 세포(human adipose-derived stem cells)에서 분리한 DNA를 사용하고, 실험 1에서 사용한 인간 지방 파생 줄기 세포(human adipose-derived stem cells)와, 마우스와 랫드는 폐 조직추출한 게노믹(genomic) DNA를 이용하였다.
2) 실험방법
각 DNA를 100ng, 10pmol 프라이머 1ul, 2X SYVR PCR master mix (abi) 10ul, 총량 20ul를 웰(well)에 넣고, 95℃에서 15분, 이후 40 사이클에선 95℃에서 15초 및 62℃에서 30초의 조건으로 실시간 PCR을 진행하였다.
3) 실험결과
상기 실험 결과, 아래 표 9에도 나와 있듯이 서열번호 7-8(12s-4 F 12s-4 R), 서열번호 7-26(12s-4 F 12s-4-6 R), 서열번호 7-27(12s-4 F 12s-4-7 R), 서열번호 23-8(12s-4-6 F 12s-4 R), 서열번호 24-8(12s-4-7 F 12s-4 R), 서열번호 24-25(12s-4-7 F 12s-4-5 R), 서열번호 24-27(12s-4-7 F 12s-4-7 R)에서 DW와 마우스/랫드의 DNA에서 CT값이 검출되지 않았다.
서열번호 23-26(12s-4-6 F 12s-4-6 R), 서열번호 22-25(12s-4-5 F 12s-4-5 R), 서열번호 23-25(12s-4-6 F 12s-4-5 R), 서열번호 24-26(12s-4-7 F 12s-4-6 R)은 마우스/랫드에서 CT값이 36-40정도로 높게 나타났다.
표 9
본 발명의 예시적인 실시예들에 따른 프라이머 세트는 세포 치료제의 체내 분포 시험에 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시예들을 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
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Claims (8)
- 미토콘드리아의 12s rRNA를 코딩하는 DNA를 표적으로 하고,
서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25의 프라이머 세트, 및 서열번호 24 및 27의 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포치료제 체내 분포 시험용 프라이머 세트. - 삭제
- 삭제
- 세포 치료제를 시험 동물에 투여하는 단계;
상기 시험 동물의 조직으로부터 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 DNA를 미토콘드리아의 12s rRNA를 코딩하는 DNA를 표적으로 하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 27의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25의 프라이머 세트, 및 서열번호 24 및 27의 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트 및 정량 PCR을 이용하여 증폭하는 단계를 포함하는 세포치료제의 체내 분포 평가 방법. - 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서, 상기 분리된 DNA를 증폭하는 단계는, 서열번호 21의 프로브를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포치료제의 체내 분포 평가 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 시험 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 체내 분포 평가 방법.
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