CN105400874A - 线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，公开了一种线粒体12S？rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒。首先由一对PCR扩增引物对分型目的区域即954bp基因组全长序列进行PCR扩增反应，然后通过四条正向和反向测序引物对扩增产物进行双向测序反应。本发明的贡献在于建立精确、稳定、可靠的12S？rRNA基因组全长序列的测序分型方法。所获得的碱基序列峰图中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。该方法可对12S？rRNA基因组全长序列进行测序分型，解决了测序分型中出现的模棱两可结果；该方法适合于12S？rRNA基因分型，以及12S？rRNA基因的群体遗传学、进化学以及疾病相关性等基础和应用研究工作。

Description

线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及一种线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒。

背景技术

自从1993年Prezant等在一个非综合征型母系遗传的阿拉伯-以色列耳聋家系中首次发现线粒体12SrRNA基因的A1555G突变以来，在不同国家、不同种族的家系和散发耳聋患者中均已证实线粒体12SrRNA基因突变与氨基糖苷类药物致聋和非综合征型耳聋有关。截止2015年2月，NCBI数据库公布有36个线粒体12SrRNA基因单核苷核多态性(SNPs)位点，其中有7个位点与氨基糖甙类药物致聋或/和非综合征型耳聋相关，包括：A827G、T961G、T1095C、T1291C、C1494T、A1555G和G1598A。A1555G和C1494T是中国人群药物性耳聋基因突变的主要位点，位于线粒体12SrRNA的高保守A位点，彼此并列但不形成碱基对。G1555或T1494突变形成了新的G-C或A-U的碱基对，使得12SrRNA的二级结构更为紧密，改变氨基糖苷类药物(如巴龙霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素等)与12SrRNAA位点的结合性能，以致A1555G或C1494T突变携带者在使用氨基糖苷类药物时可以诱发或者加重听力损伤。

A1555G突变相关耳聋在全世界均有报道，且在不同人群中其突变携带率不同。在亚洲耳聋人群中携带率为20～30％，英国和意大利南部的语前耳聋患者中携带率为6％。携带A1555G突变的个体对氨基糖苷类药物表现为高敏感性，可导致极严重的永久性耳聋。即使给予安全范围内的氨基糖苷类药物治疗，也可能导致严重的不可逆的耳聋。在同一母系的家庭成员中，携带A1555G突变的个体的临床表型存在异质性，从严重的语前耳聋到较轻的晚发型进行性耳聋，也有一些携带者表现为听力正常。携带该突变的个体即使不使用氨基糖苷类药物也可能导致耳聋的发生。另一个重要突变位点为C1494T，其突变发生率低于A1555G，在1624名中国耳聋人群中只有3位患者携带该突变。在没有使用氨基糖苷类药物情况下，C1494T突变家系的一些母系成员表现为迟发型或渐进性耳聋，听力损伤程度和发病年龄差异性也较大，而氨基糖苷类药物的使用可以促使家系中患者发病年龄提前或耳聋表型加重。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际基因分型的金标准，但至今尚无商品化12SrRNA测序分型试剂盒应市。目前报道的12SrRNA荧光检测试剂盒或限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)，仅能鉴定部分的12SrRNASNPs位点(C1494T和A1555G)，无法达到精细的等位基因水平和甄别全部的变异体，限制了等位基因水平12SrRNA在群体遗传学、耳聋等疾病关联的研究及临床中的应用。其次，国际上迄今尚无公认的12SrRNA测序分型方法，业已报道的方法存在以下问题：(一)是仅对部分基因序列进行了直接测序分型，测序分型没有涵盖12SrRNA基因组全长序列，不利于12SrRNA基因组全长序列的多态性及其功能的研究，易出现模棱两可的测序分型结果。(二)是测序分型时PCR扩增的目的分型片段虽涵盖了基因组全长序列，但是需要扩增多条产物片段，实验费时费力。随着越来越多12SrRNASNPs位点的报道、12SrRNASNPs位点与氨基糖苷类药物致聋和非综合征型耳聋等疾病关联研究的开展和深入，建立精确、操作方便的线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型方法以达到等位基因水平的基因分型并解决模棱两可结果是迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，而提供一种测定中国汉族个体12SrRNA基因组全长序列测序分型的方法，以便为中国人群12SrRNA基因组全长序列多态性、分子进化以及疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础，并且为12SrRNA基因测序分型试剂商品化奠定基础，改变当前国际上尚无12SrRNA测序分型试剂应市的现状。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的方法，包括以下步骤：

S1、首先由一对PCR扩增引物对分型目的区域即954bp基因组全长序列进行PCR扩增反应；

S2、通过四条正向和反向测序引物对扩增产物进行双向测序反应。

进一步地，所述PCR扩增引物包括上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R，所述上游引物12SrRNA-PCR-F的序列为5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’(SEQIDNo.1)，所述下游引物12SrRNA-PCR-R的序列为5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’(SEQIDNo.2)。

上游引物12SrRNA-PCR-F位于线粒体DNAnt585-nt607，下游引物12SrRNA-PCR-R位于线粒体DNAnt1662-nt1682；目的片段长度1098bp。

进一步地，所述测序引物包括：

第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1，其序列为：5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’(SEQIDNo.3)，第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1，其序列为：5’-TAAGCTGTGGCTCGTAGTG-3’(SEQIDNo.4)；

第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2，其序列为：5’-CTGCTCGCCAGAACACTAC-3’(SEQIDNo.5)，第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2，其序列为：5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’(SEQIDNo.6)。

第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1位于线粒体DNAnt585-nt607，第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1位于线粒体DNAnt1141-nt1159，第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2位于线粒体DNAnt1128-nt1146，第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2位于线粒体DNAnt1662-nt1682。

进一步地，所述PCR扩增反应的体系组成为：

进一步地，所述PCR扩增反应的循环参数为：

进一步地，所述测序反应的体系组成为：

进一步地，所述测序反应的循环参数均为：

线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的试剂盒，包括PCR扩增引物和测序引物，所述PCR扩增引物包括上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R；

其中，上游引物12SrRNA-PCR-F的序列为5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，下游引物12SrRNA-PCR-R的序列为5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’；

所述测序引物包括：第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1，其序列为：5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1，其序列为：5’-TAAGCTGTGGCTCGTAGTG-3’；

第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2，其序列为：5’-CTGCTCGCCAGAACACTAC-3’，第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2，其序列为：5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于对NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)数据库中最新释放的全部12SrRNA变异体全长序列多态性进行初步分析，设计一对组特异性PCR引物进行扩增和四条正/反向测序引物进行双向测序，利用中国汉族个体样本系统地开发精确、稳定、可靠的12SrRNA基因组全长序列测序分型方法，既可有效保特异性扩增12SrRNA基因组全长序列，同时也解决了12SrRNA荧光检测试剂盒或PCR-RFLP在非检测SNPs位点的漏检、部分序列测序分型中出现的模棱两可结果以及因扩增多条PCR产物片段导致的费时费力等问题。

本发明的贡献在于建立精确、稳定、可靠的12SrRNA基因组全长序列的测序分型方法。本发明所获得的12SrRNA基因组全长序列为12SrRNA基因组全长序列多态性、分子进化以及疾病相关性等研究提供宝贵数据。由于所有的12SrRNA基因扩增及测序引物设计时，充分考虑了全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)位点，因而可长期有效地应用于检测工作当中。所获得的碱基序列峰图中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。该方法可对12SrRNA基因组全长序列进行测序分型，解决了测序分型中出现的模棱两可结果；该方法适合于12SrRNA基因分型，以及12SrRNA基因的群体遗传学、进化学以及疾病相关性等基础和应用研究工作。

附图说明

图1是实施例1的12例用12SrRNA基因组全长序列扩增反应琼脂糖凝胶电泳效果图；

图2是实施例1的一例样本12SrRNA基因组四条正/反向测序引物的测序结果示意图；

图3是实施例1中一例样本的所有序列导入Assign3.5SBT(ConexioGenomics，WesternAustralia)软件的示意图；

图4是实施例2中线粒体12SrRNA野生型、C1494T突变型和A1555G突变型个体在nt1494和nt1555位点上序列图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明：

本发明基于中国人群12SrRNA基因的分子遗传学基础，提供了一种12SrRNA基因检测的方法，通过设计12SrRNA基因特异性PCR引物和测序引物、探索最佳退火温度及调节Mg²⁺离子和引物浓度等条件，可以对12SrRNA基因进行高分辨水平测序分型。

本发明的DNA引物序列共6条，委托Invitrogen公司合成。扩增酶采用大连宝生物公司生产的TakaraTaqTM高保真酶，保证序列的准确性。

实施例1

本实施例给出对200例中国汉族婴幼儿外周血样进行12SrRNA基因组全长测序分型的实例。

从深圳市汉族婴幼儿中随机选择了200例样本，用本发明中的PCR扩增引物和测序引物对上述样本进行测序分型实验，最后都得到了12SrRNA基因型，来验证本发明的实施效果。

首先通过一对PCR扩增引物(上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R)对受检样本进行PCR扩增反应，所获得的PCR扩增片段涵盖了包含12SrRNA基因组全长序列。扩增于Eppendorf梯度PCR仪进行，扩增反应体系组成为：

PCR扩增反应的循环参数为：

取2μLPCR产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳，对照TakaraDL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带，PCR产物条带清晰、特异，其中12例的琼脂糖凝胶电泳效果图如图1所示。

扩增反应结束后，用4条测序引物，即第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1、第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1、第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2和第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2对纯化后的特异性PCR产物模板进行测序反应，测序反应体系如下：

测序反应的循环参数均为：

测序反应完成后，在ABI3500Dx测序仪中电泳。

图2是其中一例样本12SrRNA基因组四条正/反向测序引物的测序结果示意图；碱基序列信号峰都较高，均无背景信号和杂峰。

将样本测得的12SrRNA所有序列导入Assign3.5SBT(ConexioGenomics，WesternAustralia)软件中，可清晰地判读出受检者的基因型，如图3所示。

实施例2

本实施例给出对1439位中国汉族新生儿进行氨基糖甙类药物性耳聋相关的线粒体12srRNAC1494T和A1555G两个突变位点进行筛查的实例。

1.特异性PCR扩增

PCR引物：上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R

PCR扩增反应体系组成为：

PCR扩增反应的循环参数为：

2.PCR产物纯化

3.测序反应

测序引物：12SrRNA-SBT-R2

测序反应体系组成为：

测序反应的循环参数均为：

4.PCR产物纯化(乙醇醋酸钠EDTA沉淀法)

酒精/EDTA/NaAc法纯化测序PCR产物。测序PCR产物为10μL。

1)每管加入1μL125mMEDTA与1μL3MNaAc的混合液到管底；

2)每管加入25μL100％酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)2800xg离心30min，马上倒置96孔板，离心至185g停止离心(从离心机启动到达到185g停止离心总共1min时间)；

4)每管加入35μL70％酒精，1650g4℃离心15min；马上倒置96孔板，离心至185g停止离心(从离心机启动到达到185g停止离心总共1min时间)；

5)重复第4步1次；

6)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4℃保存；

7)溶解后的样品需要在96℃变性5min，迅速置冰中冷却15min后，上样电泳。

5.上机测序

用美国ABI公司自动基因分析仪(3500Dx)进行测序分析，将测序结果与人基因组基因序列比较，采用BioEdit软件包对结果进行分析。

6.结果分析

本实施例对1439位中国汉族新生儿进行氨基糖甙类药物性耳聋相关的线粒体12srRNAC1494T和A1555G两个突变位点进行筛查，其携带率分别为0.07％和0.28％，总携带率为0.35％，详见图4和表1。

表11439位中国汉族新生儿线粒体12srRNAC1494T和A1555G频率分布

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCELISTING

<110>深圳市宝安妇幼保健院

<120>线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

arcttacctcctcaaagcaatac23

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gctaggtttagctcagagcgg21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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arcttacctcctcaaagcaatac23

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

taagctgtggctcgtagtg19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctgctcgccagaacactac19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gctaggtttagctcagagcgg

Claims (8)

1.线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、首先由一对PCR扩增引物对分型目的区域即954bp基因组全长序列进行PCR扩增反应；

S2、通过四条正向和反向测序引物对扩增产物进行双向测序反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增引物包括上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R，所述上游引物12SrRNA-PCR-F的序列为5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，所述下游引物12SrRNA-PCR-R的序列为5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序引物包括：

第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1，其序列为：5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1，其序列为：5’-TAAGCTGTGGCTCGTAGTG-3’；

第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2，其序列为：5’-CTGCTCGCCAGAACACTAC-3’，第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2，其序列为：5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系组成为：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的循环参数为：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序反应的体系组成为：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序反应的循环参数均为：

8.线粒体12SrRNA基因组全长序列测序分型的试剂盒，包括PCR扩增引物和测序引物，其特征在于，所述PCR扩增引物包括上游引物12SrRNA-PCR-F和下游引物12SrRNA-PCR-R；

其中，上游引物12SrRNA-PCR-F的序列为5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，下游引物12SrRNA-PCR-R的序列为5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3’；

所述测序引物包括：第一条正向测序引物12SrRNA-SBT-F1，其序列为：5’-ARCTTACCTCCTCAAAGCAATAC-3’，第一条反向测序引物12SrRNA-SBT-R1，其序列为：5’-TAAGCTGTGGCTCGTAGTG-3’；

第二条正向测序引物12SrRNA-SBT-F2，其序列为：5’-CTGCTCGCCAGAACACTAC-3’，

第二条反向测序引物12SrRNA-SBT-R2，其序列为：5’-GCTAGGTTTAGCTCAGAGCGG-3。