KR20190071979A - 피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법 - Google Patents

피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부주름, 색소침착, 노화 등과 관련된 MMP1, OCA2, MC1R 및 AGER 유전자의 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 진단 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 피부특성 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1, 및 서열번호 2 또는 3로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 4 또는 5, 및 서열번호 6로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 또는 8, 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 10 또는 11, 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 13, 및 서열번호 14 또는 15로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 16 또는 17, 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머 쌍; 서열번호 19 또는 20, 및 서열번호 21로 표시되는 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 또는 23, 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머 쌍; 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함한다.

Description

피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법{Primer set, composition and kit for diagnosing skin properties, and method of diagnosing skin properties using the same}
본 발명은 피부주름, 색소침착, 노화 등과 관련된 MMP1, OCA2, MC1R 및 AGER 유전자의 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 진단 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법에 관한 것이다.
피부주름, 색소침착, 노화 등과 같은 피부상태 및 민감도는 개개인마다 다르고 유전적 요인과 함께 환경, 음식, 스트레스 등 다양한 요인에 의해 결정된다.
이러한 다양한 요인 중, 각종 오염환경과 심리적 스트레스에 따른 피부변화는 피부상태를 결정하는 하나의 주요인자로 작용할 수 있고, 특히 유전적 요인은 개개인별 피부특성을 결정하는 가장 강력한 인자로 알려져 있다.
그러나, 현재까지 개개인의 피부상태 내지 특성은 주로 단순한 피부문진 내지 간단한 피부테스트를 통하여 이를 진단하고 있으며, 이러한 진단방식에 따른 피부상태 정보는 그 신뢰도가 높지 못하였다.
예컨대, 모사판(replica)을 이용한 Primos와 같은 이미지 분석 시스템(image analyzer system)을 이용하여 주름을 측정하는 방법은 피부표면에 대한 물리적인 상태를 단순하게 수치화하여 나타내는 것으로, 이 경우 측정하는 프로그램에 따라 그 주름 수치가 달라질 수 있기 때문에 피시험자의 작은 개선 정도를 평가하는데 있어서는 오차가 발생할 우려가 있다. 또한, 시험자의 육안평가 및 피시험자의 설문평가의 경우에는 주관적인 측면이 크게 작용하여 피시험자의 피부특성을 객관적이고 정밀하게 평가하기에는 어려운 단점이 있다. 또한 이러한 방법들은 이미 생긴 주름을 측정할 수 있지만 개인의 주름 생성을 예측하는 데에는 한계가 있다.
따라서, 개개인의 피부와 관련하여 특히 유전정보를 알려줄 수 있다면, 자신에게 최선으로 적합한 형태의 피부관리, 식이요법, 치료 및 화장품 선정 등을 할 수 있게 되어 피부를 건강하게 유지시킬 수 있는 바, 이와 같이 개개인마다 다양한 피부특성을 정밀하게 진단할 수 있는 방법 내지 진단키트의 개발 및 필요성이 증대되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 피부특성과 관련된 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자의 단일염기다형성 (SNP) 마커들을 선정하여, 이 단일염기다형성(SNP)들을 간편하게 검출할 수 있는 피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 피부특성 진단용 프라미어 세트는 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1 종 이상의 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 것으로서,서열번호 1의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2 또는 3의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 4 또는 5의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 7 또는 8의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 10 또는 11의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 13의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 14 또는 15의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 16 또는 17의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 18의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 19 또는 20의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 21의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 또는 23의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 24의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;중에서 선택된 적어도 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함한다.
본 발명에 따른 피부특성 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 키트 그리고 이를 이용한 피부특성 진단 방법에 의하면, 한 번의 피부테스트만으로 피부주름, 색소침착, 노화 등과 관련된 유전자 내의 SNP의 다형성 여부를 확인하여 개개인의 유전적 피부정보를 제공할 수 있게 되었다.
따라서, 피진단자는 본인의 피부관련 유전정보를 손쉽고 간편하게 알 수 있어, 자신에게 최선으로 적합한 형태의 피부관리, 식이요법, 치료 및 화장품 선정 등을 할 수 있고, 피부를 보다 건강하게 유지 관리할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하에서는, 본 발명의 바람직한 실시예, 장점 및 특징에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
설명에 앞서, 본 발명의 용어 '다형성(polymorphism)' 이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우로서, 유전자, DNA 서열, 또는 염색체에서의 서열변이, 즉, 유사한 유전적 집단의 게놈에서 동일한 서열위치에 변이가 발생하는 것이다. 다형성 부위 중 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다.
본 발명의 용어 '대립유전자(allele)'는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명의 용어 '피부특성'이란 진단대상의 피부유형 내지 피부상태를 나타내는 피부관련 유전자 정보를 의미한다. 본 발명은 다양한 피부특성 중 특히, 피부주름, 색소침착, 노화 관련 정보을 그 진단대상으로 한다.
본원 발명자는 NCBI에 등재된 SNP database를 이용하여 해당하는 SNP가 포함된 피부특성 관련 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커 (marker)를 선정하였다.
구체적으로, 본 발명의 피부특성 진단용 SNP 마커는 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자 관련 단일염기다형성 마커로서, 표 1과 같이 26번째 염기를 SNP로서 포함하는 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다.
그리고, 본원 발명자는 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1 종 이상의 단일염기다형성 마커를 검출하기 위해, 서열번호 1의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2 또는 3의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 4 또는 5의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 7 또는 8의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 10 또는 11의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 13의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 14 또는 15의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 16 또는 17의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 18의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 19 또는 20의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 21의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 또는 23의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 24의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 새로운 프라이머 세트를 개발하였다.
이와 같은 프라이머 세트를 사용하여 피부 테스트를 시행한 결과, 높은 민감도로 목적 마커를 검출할 수 있음을 확인하였으며, 선정된 피부관련 유전자의 다형성 부위에 특이적으로 결합하여 피부주름, 색소침착, 노화 등과 관련된 유전자의 단일염기다형성 여부를 검출할 수 있음을 확인하였다.
이와 같은 프라이머 세트는 진단 키트 형태로 구현되어, 피부특성 관련 유전자의 SNP 마커를 검출하는 용도로 사용될 수 있다. 그리고 진단 키트는 이와 같은 SNP 마커를 검출 검출할 수 있는 시약, 기구 또는 장치 형태로 구성될 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA를 대상으로, 전술한 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 피부특성 진단 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 중합효소 연쇄반응은 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 피부특성 진단 방법은 증폭된 반응 결과물의 생성 여부를 확인하여 분석 대상 시료의 DNA에 피부의 주름, 색소침착, 노화와 관련된 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커의 변이 여부를 확인함으로써, 피검자의 피부관련 유전정보 중 특히 피부주름, 색소침착, 노화와 관련된 정보를 한번의 Multiplex PCR 반응으로 분석할 수 있다.
실시예 1 : 피부특성 진단용 SNP 마커의 선정
단일염기다형성 마커는 단일염기다형성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이를 통해 개개인의 피부특성을 진단할 수 있다. 이러한 다형성 마커는 선택집단에서 1% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20 % 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 갖는 것으로 선정하는 것이 좋다.
단일염기다형성 마커는 피부상태와 관련된 특성을 정확히 진단할 수 있어야 하며, 이를 위해, 본원 발명자는 사람 피부특성의 주요인자인 피부주름, 색소침착 및 노화와 관련된 유전자로 MMP1, OCA2, MC1R 및 AGER를 선정하였다.
그리고, 선정된 MMP1, OCA2, MC1R 및 AGER 유전자와 관련하여, 단일염기다형성(SNP)의 대립유전자 발생빈도를 분석한 결과에 기초하여, 상위 8개 종의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커(marker)를 선별하였다.
선별한 상위 8개 종의 SNP 마커의 플랭킹 시퀀스(Flanking sequence)를 다음의 표 1에 나타내었다.

Gene
rs Number
Major
Alleles
Minor
Alleles
Flanking sequence

MC1R
rs1805007
C
T
CTACATCTCCATCTTCTACGCACTG[C/T]GCTACCACAGCATCGTGACCCTGCC

OCA2
rs1800414
A
G
TGAGCTGTGGTTTCTCTCTTACAGC[A/G]TAGGATATCTGACGGGATTCTGCTC

OCA2
rs74653330
G
A
GATCTTCACAAACATTGGAGGAGCT[A/G]CCACTGCCATCGGGGACCCTCCAAA

AGER
rs2070600
G
A
CAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAAC[A/G]GCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGG

MMP1
rs1799750
2G
1G
AAATTGTAGTTAAATAATTAGAAAG[1G/2G]ATATGACTTATCTCAAATCAATCCA

MMP1
rs495366
A
G
TTGACCTAAATTTCTGCAAACTATA[A/G]TCTTATGGTTATGACTCTTTTTGTA

MMP1
rs12289128
C
G
AGAAATTGCAAAAATAATCAGACAC[C/G]AATTTAGCTCTTAGAAGTTAATTTG

MMP1
rs11226373
A
G
ATTTATGAAATCTGTGGCATACTAC[A/G]TTACTATTTTCTATGAACCTTTCCT
표 1의 'rs_id'는 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 고유 표지자로서, 본 발명의 경우 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.
결국, 본 발명의 피부특성 진단용 SNP 마커는 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자 관련 단일염기다형성 마커로서, 구체적으로는 표 1 에 나타낸 바와 같이 26번째 염기를 SNP로서 포함하는 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다.
표 1을 참조하면, 본 발명의 피부특성 진단용 SNP 마커는, rs1805007 SNP 마커의 26번째 염기는 C 또는 T이고, rs1800414 SNP 마커의 26번째 염기는 A 또는 G이고, rs74653330 SNP 마커의 26번째 염기는 G 또는 A이고, rs2070600 SNP 마커의 26번째 염기는 G 또는 A이고, rs1799750 SNP 마커의 26번째 염기는 2G 또는 1G이고, rs495366 SNP 마커의 26번째 염기는 A 또는 G이고, rs12289128 SNP 마커의 26번째 염기는 C 또는 G이고, rs11226373 SNP 마커의 26번째 염기는 A 또는 G로 이루어진 SNP 마커일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 피부특성 진단용 SNP 마커는, 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상, 2 종 이상, 3 종 이상, 4 종 이상, 5 종 이상, 6 종 이상, 7 종 이상 또는 8 종의 단일염기다형성 마커를 포함하는 것일 수 있다.
이와 같은 본 발명의 단일염기다형성 마커는 정확한 피부특성을 진단할 수 있는 바, 유효성분과 접촉된 피부의 변화된 피부특성에 대한 정보도 줄 수 있다.
실시예 2 : 피부특성 SNP 마커 검출용 프라이머 설계
본 발명의 피부특성 진단용 프라이머 세트는 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 적어도 어느 하나(즉, 1종 이상)의 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 것으로서, 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 피부주름, 색소침착, 노화 관련 피부특성을 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 피부특성 진단용 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(Primer)를 포함한다.
여기서, "피부특성에 특이적인 단일염기다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머"란 표 1과 같은 유전자 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 유전자 유형이 무엇인지 확인할 수 있는 조성물을 의미하며, 특히 피부특성 진단용 단일염기다형성 마커의 서열만을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.
특히, 본 발명의 프라이머 세트는 복수의 프라이머를 사용하여 단일 샘플내에서 동시에 여러 자리의 DNA 서열들을 증폭시켜 한 번의 테스트로 여러 자리를 동시에 확인할 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 한다.
따라서, PCR에서 사용되는 모든 프라이머 쌍의 프라이머 설계는 모든 프라이머 쌍이 PCR 동안 동일한 풀림 온도에서 작동하도록 최적화되어야 하며, 각 SNP 마커에 대한 프라이머들의 반응 결과물들은 서로 다른 크기를 형성하여 서로 쉽게 구분 할 수 있어야 한다.
본 발명자는 이와 같은 조건을 만족할 수 있는 프라이머 쌍 및 이 프라이머 쌍들 중 적어도 하나 이상을 포함하는 프라이머 세트를 설계하였으며, 이에 따라 제작된 프라이머들을 표 2에 나타내었다.
다음의 표 2는 본 발명의 피부특성 진단용 SNP 마커의 서열별 특이적인 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다.

Gene
rs Number
Name
용도
5’ Primer sequence 3’


OCA2

rs1800414		 OC14F80 Forward CAGGAGTCAGAAGGTTGTGCAGA
(서열번호 1)
OC14RG Reverse CGAGCAGAATCCCGTCAGATATCCTAC
(서열번호 2)
OC14RA Reverse CGAGCAGAATCCCGTCAGATATCCTAT
(서열번호 3)


MC1R

rs1805007		 MCFT Forward gctacatctccatcttctacgcacttt
(서열번호 4)
MCFC Forward gctacatctccatcttctacgcacttc
(서열번호 5)
MCR120 Reverse GCGATGAAGAGCGTGCTGAA
(서열번호 6)


OCA2

rs74653330		 OC30FG Forward gaagtgatcttcacaaacattggaggagctG
(서열번호 7)
OC30FA Forward gaagtgatcttcacaaacattggaggagctA
(서열번호 8)
OC30R160 Reverse GTGGGGTAGAGCTCTAACTAAGTGG
(서열번호 9)


AGER

rs2070600		 RS207FA Forward GGCTCGTGTCCTTCCCAACA
(서열번호 10)
RS207FG Forward GGCTCGTGTCCTTCCCAACG
(서열번호 11)
AGR310 Reverse CTGGCTTCCCAGGAATCTCTGA
(서열번호 12)


MMP1

rs1799750		 MP750F400 Forward gctgctttcctgagttaacctattaactca
(서열번호 13)
MP750RG Reverse ACTTCAGTATATCTTGGATTGATTTGAGATAAGTCATATC
(서열번호 14)
MP750RA Reverse ACTTCAGTATATCTTGGATTGATTTGAGATAAGTCATATT
(서열번호 15)


MMP1

rs12289128		 MP128FG Forward ctacaaggctagaaattgcaaaaataatcagacacg
(서열번호 16)
MP128FC Forward ctacaaggctagaaattgcaaaaataatcagacacC
(서열번호 17)
MP128R500 Reverse TGGCTTAAGAATCATTCACTTTTATCAGCTCC
(서열번호 18)


MMP1

rs11226373		 MP373FG Forward ACTTCCCATTTATGAAATCTGTGGCATACTACg
(서열번호 19)
MP373FC Forward ACTTCCCATTTATGAAATCTGTGGCATACTACc
(서열번호 20)
MP373R646 Reverse GATGGCTCAAGTTACAACGGTTGAC
(서열번호 21)


MMP1

rs495366		 MP366FG Forward agagcaggattttgacctaaatttctgcaaactataG
(서열번호 22)
MP366FA Forward agagcaggattttgacctaaatttctgcaaactataA
(서열번호 23)
MP366R800 Reverse GTGATTAAGAGCAAAAGAGATAGAGCAAAGAAC
(서열번호 24)
따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1, 및 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 4 또는 5, 및 서열번호 6으로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 7 또는 8, 및 서열번호 9로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 10 또는 11, 및 서열번호 12로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 13, 및 서열번호 14 또는 15로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 서열번호 16 또는 17, 및 서열번호 18로 표시되는 제6 프라이머 쌍; 서열번호 19 또는 20, 및 서열번호 21로 표시되는 제7 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 또는 23, 및 서열번호 24로 표시되는 제8 프라이머 쌍; 중에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다.
바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1, 및 서열번호 2 또는 3로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 4 또는 5, 및 서열번호 6로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 7 또는 8, 및 서열번호 9로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 10 또는 11, 및 서열번호 12로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 13, 및 서열번호 14 또는 15로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 서열번호 16 또는 17, 및 서열번호 18로 표시되는 제6 프라이머 쌍; 서열번호 19 또는 20, 및 서열번호 21로 표시되는 제7 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 또는 23, 및 서열번호 24로 표시되는 제8 프라이머 쌍; 중에서 선택된 2개 이상의 프라이머 쌍을 포함하고, 보다 바람직하게는 제1 내지 제8 프라이머 쌍을 모두 포함하는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
상기의 바람직한 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 진단 키트를 제조하면, 하나의 진단 키트로 한번의 Multiplex PCR 반응을 수행하여 다양한 피부특성을 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
전술한 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예컨대, 4개의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 통상 15 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 1 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예컨대, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 PCR 반응을 실시하기 위해, 전술한 프라이머 세트 외에 Taq-polymerase 또는 DNA polymerase의 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드 (dNTP), DNase(deoxyribonuclease), 마그네슘, 반응 완충액(buffer solution), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
실시예 3 : 피부특성 진단을 위한 PCR 법
본 발명 피부특성 진단방법은 바람직하게는 전술한 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 기반으로 Multiplex PCR을 실시하여 진단대상의 피부특성을 판별하도록 구성될 수 있다.
Multiplex PCR은 여러개의 서로 다른 DNA염기 서열을 동시 다발적으로 증폭하는 다중 중합효소 연쇄반응을 의미한다. Multiplex PCR은 다수의 프라이머를 사용하여 단일 샘플내에서 동시에 여러 자리의 DNA 서열들을 증폭시킴으로써 한 번의 테스트로 여러 자리를 동시에 확인할 수 있는 장점이 있다.
본원 발명자는 전술한 프라이머를 포함하는 조성물을 이용하여 다음의 실험예 1과 같이 Multiplex PCR을 수행하였다. 그리고 증폭된 반응 결과물의 생성 여부를 확인하여 분석 대상 시료의 DNA에 피부의 주름, 색소침착, 노화 등과 관련된 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커의 변이 여부를 확인하였다.
< 실험예 1>
서경대학교 화학생명공학과 학생 16명의 타액 샘플을 채취한 후, 이 타액 샘플을 대상으로 PCR 반응을 실시하였다.
구체적으로, Genomic DNA Extraction Kit(Intron, Korea)를 사용하여 채취된 타액으로부터 학생들의 genomic DNA를 추출하였다. 그리고, 상기 추출한 각 genomic DNA를 대상으로 하여 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)을 수행하였다.
이때, PCR 반응을 위한 혼합물의 총 부피를 30㎕로 하였으며, 4 유닛(unit)의 A star taq polymerase(Biofact, Korea)를 사용하였다. Tris-HCl, KCl, MgCl2의 농도가 각각 10.3mM, 51.3mM, 2.9mM이 되도록 첨가하였고, 표 2의 프라이머를 각각 0.5mM이 되도록 첨가하였다.
오염을 방지하기 위하여 UDG(uracil-DNA glycosylase)를 1 유닛 첨가하였고, dNTP 중 dATP, dCTP, dGTP는 200mM 그리고 dUTP는 600mM(Solgent, Korea)의 농도가 되도록 첨가하였다.
PCR 반응을 수행하기 위한 PCR 장치로는 GenePro(Bioer, Japan)를 사용하였으며, 오염방지 단계와 PCR 증폭단계로 나누어 수행하였다.
오염방지 단계의 UDG 반응을 위해 50℃에서 10분간 유지하였으며, 이후 UDG의 불활성화를 위해 95℃에서 10분간 유지하였다.
PCR 증폭 단계는 94℃에서 40초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초로 40회 반복하여 수행하였다.
PCR 증폭 반응 이후 72℃에서 5분간 유지하여 post elongation 반응을 수행하였으며 실시간 핵산 증폭 결과는 전기영동을 통해 분석하였다.
상기의 실험예 1에 따른 결과, 증폭된 다형성 부위의 염기를 확인함으로써 피검자의 피부특성(즉, 피부관련 유전자 정보)을 진단할 수 있음을 확인하였다. 즉, 증폭된 반응 결과물의 생성 여부를 확인하여 분석 대상 시료의 DNA에 피부의 주름, 색소침착, 노화와 관련된 AGER, MC1R, MMP1 및 OCA2 유전자의 단일염기다형성(SNP) 마커의 변이여부를 확인함으로써, 피검자의 피부관련 유전정보 중 특히 피부주름, 색소침착, 노화와 관련된 정보를 한번의 Multiplex PCR 반응으로 검출할 수 있었다.
상기에서 본 발명의 바람직한 실시예가 특정 용어들을 사용하여 설명되었지만 그러한 용어는 오로지 본 발명을 명확히 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 실시예 및 기술된 용어는 다음의 청구범위의 기술적 사상 및 범위로부터 이탈되지 않고서 여러가지 변경 및 변화가 가해질 수 있는 것은 자명한 일이다. 이와 같이 변형된 실시예들은 본 발명의 사상 및 범위로부터 개별적으로 이해되어져서는 안되며, 본 발명의 청구범위 안에 속한다고 해야 할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation of Seokyeong University <120> Primer set, composition and kit for diagnosing skin properties, and method of diagnosing skin properties using the same <130> P17-0237 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC14F80 <400> 1 caggagtcag aaggttgtgc aga 23 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC14RG <400> 2 cgagcagaat cccgtcagat atcctac 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC14RA <400> 3 cgagcagaat cccgtcagat atcctat 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCFT <400> 4 gctacatctc catcttctac gcacttt 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCFC <400> 5 gctacatctc catcttctac gcacttc 27 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCR120 <400> 6 gcgatgaaga gcgtgctgaa 20 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC30FG <400> 7 gaagtgatct tcacaaacat tggaggagct g 31 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC30FA <400> 8 gaagtgatct tcacaaacat tggaggagct a 31 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OC30R160 <400> 9 gtggggtaga gctctaacta agtgg 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS207FA <400> 10 ggctcgtgtc cttcccaaca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS207FG <400> 11 ggctcgtgtc cttcccaacg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGR310 <400> 12 ctggcttccc aggaatctct ga 22 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP750F400 <400> 13 gctgctttcc tgagttaacc tattaactca 30 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP750RG <400> 14 acttcagtat atcttggatt gatttgagat aagtcatatc 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP750RA <400> 15 acttcagtat atcttggatt gatttgagat aagtcatatt 40 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP128FG <400> 16 ctacaaggct agaaattgca aaaataatca gacacg 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP128FC <400> 17 ctacaaggct agaaattgca aaaataatca gacacc 36 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP128R500 <400> 18 tggcttaaga atcattcact tttatcagct cc 32 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP373FG <400> 19 acttcccatt tatgaaatct gtggcatact acg 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP373FC <400> 20 acttcccatt tatgaaatct gtggcatact acc 33 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP373R646 <400> 21 gatggctcaa gttacaacgg ttgac 25 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP366FG <400> 22 agagcaggat tttgacctaa atttctgcaa actatag 37 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP366FA <400> 23 agagcaggat tttgacctaa atttctgcaa actataa 37 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP366R800 <400> 24 gtgattaaga gcaaaagaga tagagcaaag aac 33

Claims (7)

  1. 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1 종 이상의 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 것으로서,
    서열번호 1의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2 또는 3의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 4 또는 5의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 7 또는 8의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 10 또는 11의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 13의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 14 또는 15의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 16 또는 17의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 18의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 19 또는 20의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 21의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 및
    서열번호 22 또는 23의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 24의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    중에서 선택된 적어도 어느 하나의 프라이머 쌍을 포함하는 피부특성 진단용 프라이머 세트.
  2. 표 1 에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1 종 이상의 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 것으로서,
    서열번호 1의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2 또는 3의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 4 또는 5의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 7 또는 8의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 9의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 10 또는 11의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 12의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 13의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 14 또는 15의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 16 또는 17의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 18의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    서열번호 19 또는 20의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 21의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍; 및
    서열번호 22 또는 23의 서열을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열번호 24의 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 쌍;
    중에서 선택된 2개 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 피부특성 진단용 프라이머 세트.
  3. 제1 항 또는 제2 항의 프라이머 세트; DNA 중합효소; dNTP; 및 완충액을 포함하는 피부특성 진단용 조성물.
  4. 제1 항 또는 제2 항의 프라이머 세트; 또는 제3 항의 조성물을 포함하는 피부특성 진단용 키트.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 진단은 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)에 의한 것인 피부특성 진단용 키트.
  6. 피검체로부터 추출한 DNA를 대상으로, 제1 항 또는 제2 항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 것을 포함하는 피부특성 진단 방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 중합효소 연쇄반응은 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)인 것인 피부특성 진단 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021201592A1 (ko) * 2020-03-31 2021-10-07 주식회사 엘지생활건강 색소침착 피부 타입 판단용 유전자 다형성 마커 및 이의 용도

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