KR20150131770A

KR20150131770A - Ｓｌｃ6ａ3 유전자의 다형성 소위성과 이를 이용한 ｄｎａ 타이핑 키트 및 상기 유전자 관련 질병의 진단키트

Info

Publication number: KR20150131770A
Application number: KR1020140058990A
Authority: KR
Inventors: 임선희; 김원태; 이세라; 노윤길
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2015-11-25
Also published as: KR101588119B1

Abstract

본 발명은 SLC6A3(solute carrier family 6[dopamine], member 3) 유전자의 다형성 소위성과 이를 이용한 DNA 타이핑 키트 및 상기 유전자 관련 질병의 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개인 식별 마커로 사용할 수 있는 도파민 수송체(dopamine transporter)인 SLC6A3 유전자 내의 다형성 소위성, 상기 다형성 소위성 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 DNA 타이핑 키트 및 SLC6A3 유전자 관련 질병의 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SLC6A3 유전자 내의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, SLC6A3-MS9 다형성 소위성 영역에서 7번 반복되는 대립형질을 가지는 경우 고혈압에 대하여 그 감수성이 정상인보다 약 2배 이상 높게 나타남에 따라, SLC6A3-MS9 다형성 소위성은 고혈압 같은 질병에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서 예측진단에 중요한 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＳＬＣ6Ａ3 유전자의 다형성 소위성과 이를 이용한 ＤＮＡ 타이핑 키트 및 상기 유전자 관련 질병의 진단키트{DNA Typing Kits and Diagnostic Kits for Detecting Diseases Related to Polymorphic Microsatellites of ＳＬＣ6Ａ3 Gene}

본 발명은 SLC6A3(solute carrier family 6[dopamine], member 3) 유전자의 다형성 소위성과 이를 이용한 DNA 타이핑 키트 및 상기 유전자 관련 질병의 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개인 식별 마커로 사용할 수 있는 도파민 수송체(dopamine transporter)인 SLC6A3 유전자 내의 다형성 소위성, 상기 다형성 소위성 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 DNA 타이핑 키트 및 SLC6A3 유전자 관련 질병의 진단키트에 관한 것이다.

척추동물의 게놈(genome)에 있어서, 막 단백질을 암호화하는 유전자는 가장 큰 그룹 중에 하나를 이룬다. 인간과 쥐의 경우, 막 단백질들은 전체 유전자의 10% 이상을 차지하고, 그 종류로는 G-단백질 수용체, 키나아제 수용체, 이온 채널 및 solute carrier 등이 있다. 상기 막 단백질 중, solute carrier(SLC)는 당, 아미노산, 뉴클레오티드 및 무기 이온이 수동적 또는 능동적으로 세포막을 통과하도록 조절한다. 현재 solute carrier(SLC)는 51개의 다른 군들이 존재하며, 이들 중에, SLC6 군의 단백질은 신경전달물질(neurotransmitter), 아미노산 및 오스모라이트(osmolyte, 침투압 조절 물질)의 특이적인 운반체 역할을 한다. 신경시스템에서 신경전달물질(neurotransmitter)은 생리학적인 여러 현상을 조절한다. 특히, 이들은 뇌와 관련하여 뇌의 여러 병리학적 과정에 포함되며, 파킨슨병, 우울증, 간질 및 약물남용과 같은 질병에 연관되어 있다. 상기 SLC6 군은 GABA(gamma-aminobutyric acid), 모노아민(monoamine), 아미노산(amino acid) 및 올판(orphan) 의 4가지로 소분류된다.

SLC6A3 은 모노아민 그룹에 해당하고, SLC6A19 및 SLC6A20과 함께 5p15.3 부위에 위치하고 있다. SLC6A3은 뇌에서 높은 발현을 보이므로, 여러 신경전달물질과 관련된 질병에 영향을 미칠 것으로 보인다. 최근 연구에 따르면, SLC6 군의 다른 유전자 내의 SNP(단일염기다형성)가 고혈압과도 관련되어 있음이 보고되었다(Koh Ono, et al., Hypertens Res . 26(9):685-689, 2003).

한편, 인간의 게놈에서 약 45% 정도의 많은 부분을 차지하고 있는 반복서열 (repeated sequence)은 새로운 유전자의 발생과 다양성의 변이를 포함한 전체 게놈의 진화를 이해하는데 중요한 역할을 하며, 이 영역에서의 변이는 여러 난치병과 높은 연관성을 지닌다. 다양한 반복서열 중 연쇄반복(tandem repeat, TR) 서열은 인간 유전체의 10% 이상을 차지하고, 다양한 질병의 원인이 되며 유전자 발현의 조절 및 진화에서 매우 중요한 요소이다. 연쇄반복 서열은 그 길이에 따라 모든 사람에서 하나의 대립형질(allele)만을 가진 단형성(monomorphic)과 2개 이상의 대립형질(allele)을 가지고 사람마다 다르게 나타나는 다형성(polymorphic)으로 구분된다. 이러한 연쇄반복 서열에 속하는 다형성 소위성(Polymorphic Microsatellites)은 그 길이가 주로 10 ~ 100 bp의 반복단위를 지니고 반복횟수에 따라 수 백 bp에서 약 20 kb 이상에 이르기까지 다양한 길이를 나타낸다. 이 반복서열은 주로 유전자 조절영역과 인트론 부분에 존재하며 Mucin 유전자와 같이 엑손에 존재하여 그 기능에 중요한 역할을 수행하는 경우도 있다. 이러한 다형성 소위성은 그 길이에 따른 다형성이 매우 높아 두 개 이상의 대립형질을 갖는 마커로 사용이 가능하여 유전체 연구의 유전자 지도 마커(genetic mapping marker)로 널리 사용되고 있으며, 이 외에도 친자확인이나 법의학 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 당업계에는 구조적으로 매우 복잡한 유전자 내의 연쇄반복(tandem repeat, TR) 분석 및 다형성 소위성의 발견 및 질병과의 관련성에 대한 연구가 매우 중요한 연구 분야로 자리 잡았으며, 현재 지속적인 발전이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 친자확인이나 법의학 마커로 유용하게 사용될 수 있는 특정 유전자 내의 다형성 소위성 규명과 더불어 이들의 질병과의 관련성을 연구하기 위하여 예의 노력하였으며, 그 결과 도파민 수송체로 알려진 SLC6A3 유전자의 다형성 소위성의 위치를 분석하였고, 상기 다형성 소위성 중 일부가 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달된다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-0861383호 한국등록특허 제10-0861384호

따라서 본 발명의 주된 목적은 개인 식별 마커로 사용 가능한 다형성 소위성 검출용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 유용한 DNA 타이핑 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 유용한 DNA 타이핑 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 SLC6A3 관련 질병의 진단키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1 검출용 프라이머 세트; (ⅱ) 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS4 검출용 프라이머 세트; (ⅲ) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS8 검출용 프라이머 세트; 및 (ⅳ) 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트로 구성된 군에서 선택되는 개인 식별 마커용 다형성 소위성 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성 검출을 위한 DNA 타이핑 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 개체의 조직으로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 타이핑 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 검체는 혈액, 머리카락, 타액, 표피, 정액, 질 채취물, 분리된 세포, 조직샘플, 비듬 및 유골로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 타이핑 방법은 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트를 포함하는 SLC6A3 관련 질병 진단키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SLC6A3 관련 질병은 고혈압일 수 있다.

본 발명에 따른 SLC6A3 유전자 내의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, SLC6A3-MS9 다형성 소위성 영역에서 7번 반복되는 대립형질을 가지는 경우 고혈압에 대하여 그 감수성이 정상인보다 약 2배 이상 높게 나타남에 따라, SLC6A3-MS9 다형성 소위성은 고혈압 같은 질병에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서 예측진단에 중요한 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 5번 염색체에 위치하는 SLC6A3 유전자의 위치 및 방향을 나타내는 개략도이다. 5p15.3 염색체상의 SLC6A3 유전자를 도식한 그림과 SLC6A3 유전자의 구조 및 유전자 내의 소위성(minisatellite, MS)의 위치를 보여주고 있다. 엑손(exon)은 검은색 선으로 표시하였고, Tandem Repeats Finder Program에 의해 검출된 소위성(minisatellite)의 위치를 별표(*)로 표시하였다.
도 2는 SLC6A3-MS1의 다형성 소위성(polymorphic minisatellites)을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3은 SLC6A3-MS4의 다형성 소위성(polymorphic minisatellites)을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 4는 SLC6A3-MS8의 다형성 소위성(polymorphic minisatellites)을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 SLC6A3-MS9의 다형성 소위성(polymorphic minisatellites)을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 6은 SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9 이 부모와 자손 간에 있어서 유전적으로 전달되는 것을 보여주는 전기영동 사진이다. 첫 번째 및 마지막 레인은 사이즈 마커이다. GF 또는 GM은 할아버지 또는 할머니를 의미하고, F 또는 M은 아버지 또는 어머니를 의미하며, 자손의 DNA 샘플은 C1 및 C2로 나타내었다.

본 발명은 개인 식별 마커의 용도로 사용할 수 있는 SLC6A3 유전자 관련 다형성 소위성(polymorphic minisatellites)을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 용어 ‘소위성(minisatellite)’은 약 10 ~ 100 bp개의 뉴클레오티드로 이루어진 기본 단위가 동일한 방식으로 수차례 반복되어 있는 서열을 의미하며, 이러한 구조를 ‘연쇄반복서열(tandem repeat sequences)’이라고 부른다.

본 발명에서 용어 ‘다형성(polymorphism)’이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미한다.

본 발명에서 용어 ‘다형성 소위성(polymorphic minisatellites)’이란 연쇄반복 서열에 해당하는 소위성이 모든 사람에서 2개 이상의 대립형질(allele)을 가지고 사람마다 다르게 나타나는 다형성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 ‘대립유전자(allele)’는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위(locus) 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다.

상기 SLC6A3(solute carrier family 6[dopamine], member 3) 유전자는 SLC6 군에서 모노아민 그룹에 해당하고, SLC6A19 및 SLC6A20과 함께 Homo sapiens chromosome 5p15.3 부위에 위치하고 있다. SLC6A3은 뇌에서 높은 발현을 보이므로, 여러 신경전달물질과 관련된 질병에 영향을 미칠 것으로 예상되고 있다.

본 발명자들은 개인 식별 마커로 이용할 수 있는 다형성 소위성 규명을 위하여, 먼저 상기와 같은 특징을 갖는 SLC6A3 유전자에 초점을 맞추어 이의 유전자 구조적 특징을 BLAST를 이용하여 분석하였으며, 그 결과 SLC6A3 유전자 내에 10개의 소위성이 존재함을 최초로 규명하면서 이들을 각각 SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS2, SLC6A3-MS3, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS5, SLC6A3-MS6, SLC6A3-MS7, SLC6A3-MS8, SLC6A3-MS9 및 SLC6A3-MS10으로 명명하였으며, 이들의 염기서열을 서열번호 1 내지 10으로 표시하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 총 10개의 소위성 중 개인 식별 마커로 사용할 수 있는 다형성 여부를 자세히 분석하였으며, 그 결과 상기 소위성 중 SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9에서 다형성이 나타나는 것을 확인하였으며, 동시에 이들 모두 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명은 (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1 (SLC6A3-ministallite1); (b) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS4 (SLC6A3-ministallite4); (c) 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS8 (SLC6A3-ministallite8); 및 (d) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 SLC6A3유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 (SLC6A3-ministallite9)로 이루어진 군으로부터 선택되는 개인 식별 마커로의 용도를 가진 다형성 소위성을 제공한다.

이하, 본 발명에서는 간략하게 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성을 ‘SLC6A3-MS1’로, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성을 ‘SLC6A3-MS4’로, 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성을 ‘SLC6A3-MS8’로, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 SLC6A3유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성을 ‘S LC6 A3-MS9’로 각각 약칭한다.

본 발명의 상기 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성)은 개인 식별 마커로서 DNA 타이핑을 통한 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성)을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 상기 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성)을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 (ⅰ) 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1 검출용 프라이머 세트; (ⅱ) 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS4 검출용 프라이머 세트; (ⅲ) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS8 검출용 프라이머 세트; 및 (ⅳ) 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성)을 검출을 위한 DNA 타이핑 키트를 제공한다.

상기 키트에는 본 발명의 프라이머 세트((ⅰ) 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1 검출용 프라이머 세트; (ⅱ) 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS4 검출용 프라이머 세트; (ⅲ) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS8 검출용 프라이머 세트; 및 (ⅳ) 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머 세트)뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 1) 검체로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 DNA 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 간략하게 ‘PCR’라 약칭함)을 수행하는 단계; 및 2) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 타이핑 방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 타이핑 방법에서 단계 1은 검체로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적 서열(서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성 영역)을 증폭하는 단계이다.

상기 검체는 피검자의 검사를 위한 시료로서 세포, 조직(생검 샘플 등), 혈액, 머리카락, 타액, 표피, 혈청, 뇌척수액, 정액, 침, 가래, 소변, 대변, 질 채취물, 분리된 세포, 조직샘플, 비듬, 유골 및 세포 배양액과 같은 표적 핵을 포함할 수 있는 어느 샘플을 제한하지 않고 사용할 수 있다.

본 발명의 DNA 타이핑 방법에서 단계 2는 상기와 같은 과정을 거쳐 수득한 PCR 증폭 산물을 전기영동으로 분리하여 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성을 검출하는 단계이다.

PCR 증폭 산물의 식별을 용이하게 하기 위하여, PCR 증폭 산물의 경우 방사성동위원소 또는 형광으로 표지할 수 있다. 표지는 프라이머의 5' 말단에 형광물질이나 동위원소를 부착하여 얻을 수 있고 혹은 PCR 후 3' 말단에 터미날 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(terminal deoxynucleotidyl transferase)의 반응을 이용하여 첨가할 수도 있다. 표지하지 않는 경우에는 전기영동 후 은염색(silver staining)하여 절편을 확인할 수 있다.

전기영동으로 분리한 PCR 증폭 산물은 본 발명의 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성) 검출을 위해 PCR에 의해 증폭된 DNA 절편의 길이를 측정하는 전기영동 검사나 증폭된 단편의 질량을 측정하는 질량측정기(mass spectrometer)를 이용하는 방법, 보합(hybridization)에 의한 염기서열의 차이를 측정하는 방법 및 염기서열을 직접 결정하는 방법을 이용할 수 있다. 상기 보합을 측정하는 검사의 범주에는 DNA 칩과 같이 특성이 미리 알려진 표준 DNA를 기질의 표면에 부착시킨 후 검체의 DNA와 반응시켜 검체 DNA의 특성을 알아내는 DNA 배열(array) 등이 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 다형성 소위성(SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다형성 소위성) 검출을 위해 검체의 DNA에 부착된 표지를 감지하는 장치나 혹은 DNA 절편을 감지할 수 있도록 처리할 수 있다. 이때 바람직한 탐지 방법으로는 방사성동위원소로 표지된 DNA는 자가방사기록법(autoradiography)과 섬광계수법(scintillation counting methods)이 있으며, 형광으로 표지된 경우에는 어플라이드 바이오시스템즈사의 ABI 자동염기분석기나 히타치사(Hitachi)의 FMBIO와 같은 형광을 감지할 수 있는 장치를 사용하고 아무런 표지가 되지 않은 경우에는 은염색법이 있다.

상기와 같은, DNA 타이핑 방법은 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트를 포함하는 SLC6A3 관련 질병 진단용 조성물 또는/및 진단키트를 제공한다.

본 발명의 SLC6A3-MS9는 고혈압에 높은 연관성을 나타내는 것을 실험을 통해 입증되었다.

즉, 본 발명의 하기 실시예 4에서는 SLC6A3-MS9 영역의 짧은 대립형질 보유와 고혈압과의 연관성 분석을 위하여, 대립형질의 크기가 일반적인 크기의 대립형질보다 7번 반복되는 대립형질과 질병 발생에 대한 감수성을 분석하였다. 대립형질이 나타나는 패턴을 나누어, 일반 대립형질(common allele)로만 이루어진 패턴을 C/C로 하고, 적어도 하나 이상의 7번 반복되는 대립형질을 가지는 패턴을 S/-로 나누어 비교하였다. 그 결과, SLC6A3 - MS9의 경우 고혈압 환자에서 S/- 패턴이 정상인에 비해 약 2배 정도 높게 나타남에 따라, SLC6A3-MS9의 7번 반복되는 대립형질을 가지는 경우 고혈압 발병 위험도와의 상관관계를 고려할 수 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해서, SLC6A3-MS9가 고혈압 같은 질병에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서 유용하게 사용될 수 있으며, 예측진단에 중요한 자료로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이에, 본 발명에서는 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트를 포함하는 고혈압 발병 위험을 예측하거나 진단하기 위한 진단키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 키트는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역에 존재하는 다형성 소위성 SLC6A3-MS9에서 7번 반복되는 대립형질을 가지는 패턴 측정을 통해 고혈압 발병 위험을 예측 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트)뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 검체에서 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 고혈압 발병 위험을 예측하거나 진단하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

SLC6A3 유전자의 구조적 분석 및 소위성(minisatellite, MS)의 다형성 소위성( polymorphic minisatellites ) 분석

SLC6A3(NC_000005.9|NC_000005: 1382905-1455543 Homo sapiens chromosome 5, GRCh37.p2 primary reference assembly) 유전자의 구조적 특징을 BLAST를 이용하여 분석하였다. 하기 표 1에서 보여주는 색인(indices)의 위치번호는 NC_000005 REGION 내에서 분석한 결과를 보여준 것이다. 프로모터 영역과 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF) 내에 존재하는 엑손(exon) 및 인트론(intron) 영역을 조사하고, 각 영역에 존재하는 연쇄반복(tandem repeats, TR)의 위치를 결정한 다음, 반복되는 서열 크기가 10~100bp 정도의 소위성의 위치를 분석하였다.

그 결과, SLC6A3은 약 52Kb 크기의 15개의 엑손으로 이루어져 있었고, 연쇄반복 영역의 위치는 표 1에서 나타낸 바와 같이, 유전자 내에 10개가 존재하였다.

SLC6A3 유전자 내에 존재하는 10개의 소위성의 다형성 소위성을 PCR을 이용하여 분석하였다. PCR 분석에서 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에서 나타내었다.

SLC6A3 유전자 내에 존재하는 연쇄반복(tandem repeat, TR) 색인 및 위치 정보

서열번호	소위성 (minisatellite)	색인 (indices)	위치	반복 크기 (repeat size)	대표 복사수 (copy no.)	대표 크기(bp)
서열번호 1	SLC6A3-MS1	1276671-1276892	인트론3	66	6.8	705
서열번호 2	SLC6A3-MS2	1280072-1280306	인트론3	73	3	500
서열번호 3	SLC6A3-MS3	1282333-1282473	인트론4	58	7.5	844
서열번호 4	SLC6A3-MS4	1282315-1282838	인트론4	75	13.8	1110
서열번호 5	SLC6A3-MS5	1282847-1283295	인트론6	83	6.1	900
서열번호 6	SLC6A3-MS6	1291318-1291587	인트론6	109	2.7	562
서열번호 7	SLC6A3-MS7	1295501-1295715	인트론6	55	9.5	765
서열번호 8	SLC6A3-MS8	1300333-1300530	인트론8	30	6.1	276
서열번호 9	SLC6A3-MS9	1300333-1300530	엑손15	40	10.0	750
서열번호 10	SLC6A3-MS10	1300333-1300530	엑손15	82	2.6	417

SLC6A3 유전자 내에 존재하는 연쇄반복의 서열

서열번호	염기서열
서열번호 1	TGGCCACTACCGTTCAAGGGAGCCATTTCCTCACCCAGGTGCCCAGGGAAGCATCCAGGAGGGGAC
서열번호 2	TCCGGACAGACGGTAATATAGAATTATTTAATATGGACCAGATCCACGTGGGAGAAGGCCTTCCAAAGGCAAT
서열번호 3	GGCCAGGCCTGACCTGCACAGTCCTCCCCAGCCAGGCCAGTTCCTCACTGCCCACCCC
서열번호 4	GTGGGCAGCAGTGGGTACCCAGCAGCGTGGGCAGCACTGTGGGCAGCGGTGGGTACCCAGCACCATGGGCAGCAC
서열번호 5	GGATGGATGGGTGGATGGATGATGGGTGGATTGCTGGATGATGGATGGCTGGGTGGATGGATGAATGATAGGTAGGTAGCTGG
서열번호 6	ATCAGGACACCATCATCATGTAGCATGTGGATGGGTCCATGCCTTTCTGAGGGTTATCAGGGTGCTGCCATCATGCAGCATGTGGATGATCCATGCTGTTCTGAGGGTT
서열번호 7	GTGTGGATAAGTCCATGCTGTTCTGAGGGTTATCAGGGCGCCGCGGTCATGTTGT
서열번호 8	TGTGTCTGTGTGTGTATATTGCATGGTATG
서열번호 9	AGGAGCGTGTCCTATCCCCGGACGCATGCAGGGCCCCCAC
서열번호 10	GCTGCAGTTAGCACAGAGGATGGCTTCCCCATTGCCTTCTGGGGAGGGACACAGAGGACGGCTTCCCCATCGCCTTCTGGCC

다형성 소위성 검출에 사용되는 프라이머 서열

다형성 소위성	프라이머 서열(5'-3')		서열번호
SLC6A3 -MS1	포워드	CTGGGCCTTCGGTGAGCTTG	서열번호 11
SLC6A3 -MS1	리버스	CCACTGGCCACACTGGCTGA	서열번호 12
SLC6A3 -MS2	포워드	TGGGCATCCATTGTCAGTTACCA	서열번호 13
SLC6A3 -MS2	리버스	TGTTCTCATGCTCAGGGCACCTC	서열번호 14
SLC6A3 -MS3	포워드	TGGGTGTCACTGCGCAAGAA	서열번호 15
SLC6A3 -MS3	리버스	CTGGCGAGGGCAGGAAGATG	서열번호 16
SLC6A3 -MS4	포워드	TAGAGTTTGCTCGGCCTCAT	서열번호 17
SLC6A3 -MS4	리버스	GCCACAGAAACCAAAAGGAA	서열번호 18
SLC6A3 -MS5	포워드	GGCTGGCTGGATGTATGG	서열번호 19
SLC6A3 -MS5	리버스	CCATTTCTTTCCTGATTTCTCTTCA	서열번호 20
SLC6A3 -MS6	포워드	CGTGGACCCACCCACCTTTC	서열번호 21
SLC6A3 -MS6	리버스	GCCCTAGCGGGGTCTCCATC	서열번호 22
SLC6A3 -MS7	포워드	GGGGACACACTCAGGGGGTTG	서열번호 23
SLC6A3 -MS7	리버스	GGCAGCAGACGACTGGTGGAA	서열번호 24
SLC6A3 -MS8	포워드	GCACAAATGAGTGTTCGTGCATGT	서열번호 25
SLC6A3 -MS8	리버스	CAGGCTGGTCCTGCCCTTCA	서열번호 26
SLC6A3 -MS9	포워드	CATTGGAGGATGGGGGTCCTG	서열번호 27
SLC6A3 -MS9	리버스	AGCAAGCAGGCTCGCGGATA	서열번호 28
SLC6A3 -MS10	포워드	GTCATGGCTGTCCCCTGCAA	서열번호 29
SLC6A3 -MS10	리버스	GGAGGCTGAGGCAGTTTTTCCA	서열번호 30

100명의 성인 남성과 여성의 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 이용하여 SLC6A3 유전자 내에 존재하는 10개의 TR 중에서 인트론(intron) 3번 영역에 위치한 MS2(minisatellite2) 부위, 인트론(intron) 4번 영역에 위치한 MS3(minisatellite3) 부위, 인트론(intron) 6번 영역에 위치한 MS5(minisatellite5) 부위, 인트론(intron) 6번 영역에 위치한 MS6(minisatellite6) 부위, 인트론(intron) 6번 영역에 위치한 MS7(minisatellite7) 부위, 3‘ UTR 영역에 위치한 MS10(minisatellite10) 부위의 대립형질 양상을 PCR을 사용하여 비교하였다.

게놈 DNA를 표준 PCR 조건(50mM Tris-HCl(pH 9.0), 50mM MgCl2, 0.2mM dTTP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dGTP 및 0.2mM dATP, 최종 부피 50㎕)에서 SLC6A3-MS2는 서열번호 13과 14의 프라이머 쌍, SLC6A3-MS3은 서열번호 15와 16의 프라이머 쌍, SLC6A3-MS5는 서열번호 19와 20의 프라이머 쌍, SLC6A3-MS6은 서열번호 21과 22의 프라이머 쌍, SLC6A3-MS7은 서열번호 23과 24의 프라이머 쌍, SLC6A3-MS10은 서열번호 29와 30의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하였다.

DNA 샘플의 PCR 분석은 게놈 DNA 100ng를 주형으로 타카라 G-Taq DNA 폴리머라제(TAKARA G-Taq DNA polymerase, TAKARA), 제넷바이오 Prime Taq DNA 폴리머라제(GENET BIO Prime Taq DNA polymerase, GENET BIO)를 사용하여 수행하였다. 사이클의 조건은 SLC6A3-MS2, SLC6A3-MS3, SLC6A3-MS6, SLC6A3-MS7 및 SLC6A3-MS10의 경우 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 45초, 68℃에서 2분의 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 7분 연장하였고, SLC6A3-MS5의 경우 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 45초, 62℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 7분 연장하였다.

상기 PCR 산물을 SLC6A3-MS2, SLC6A3-MS3, SLC6A3-MS5, SLC6A3-MS6, SLC6A3-MS7 및 SLC6A3-MS10의 경우, 2% SeaKem LE 아가로스젤에 주입하고, TAE 버퍼에서 전기영동(1볼트/㎝)에 의해 분석하였다. 그 결과, SLC6A3-MS2, SLC6A3-MS3, SLC6A3-MS5, SLC6A3-MS6, SLC6A3-MS7 및 SLC6A3-MS10은 단형성을 나타내었기 때문에 개인 식별 마커로는 사용이 불가능하였다.

100명의 성인 남성과 여성의 혈액으로부터 추출한 게놈 DNA를 이용하여 SLC6A3 유전자 내에 존재하는 10개의 연쇄반복 중에서 인트론 3번 영역에 위치하는 SLC6A3-MS1, 인트론 4번 영역에 위치하는 SLC6A3-MS4, 인트론 8번 영역에 위치하는 SLC6A3-MS8 및 3‘ UTR 영역에 위치하는 SLC6A3-MS9의 대립형질 양상을 PCR을 사용하여 비교하였다.

게놈 DNA를 표준 PCR 조건(50 mM Tris-HCl(pH 9.0), 50 mM MgCl2, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP 및 0.2 mM dATP, 최종 부피 50 ㎕)하에서 SLC6A3-MS1은 서열번호 11과 12의 프라이머, SLC6A3-MS4는 서열번호 17과 18의 프라이머, SLC6A3-MS8는 서열번호 25과 26의 프라이머, SLC6A3-MS9는 서열번호 27와 28의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

DNA 샘플의 PCR 분석은 게놈 DNA 100ng를 주형으로 타카라 G-Taq DNA 폴리머라제(TAKARA G-Taq DNA polymerase, TAKARA), 제넷바이오 Prime Taq DNA 폴리머라제(GENET BIO Prime Taq DNA polymerase, GENET BIO)를 사용하여 수행하였다. 사이클의 조건은 SLC6A3-MS1 및 SLC6A3-MS9의 경우 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 45초, 68℃에서 2분의 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 7분 연장하였다.

SLC6A3-MS4의 경우 94℃에서 3분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 7분 연장하였다. SLC6A3-MS8의 경우 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 45초, 70℃에서 1분의 30 사이클을 수행한 다음, 마지막 신장 단계는 72℃에서 7분 연장하였다.

상기 PCR 산물을 SLC6A3-MS1은 1.5% SeaKem LE 아가로스젤에, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9는 2% SeaKem LE 아가로스젤에 주입한 후, TAE 버퍼에서 전기영동(1볼트/㎝)에 의해 분석하였다. 그 결과, 모두 다형성 소위성을 나타내었기 때문에 개인 식별 마커로 사용이 가능함을 알 수 있었다(도 2 내지 5 참조). 따라서 이하, 개체수를 늘려 추가적인 분석을 실시하였다 (표 3~11). 이때 N은 대립형질의 수로, 사람마다 2개의 대립형질을 가지므로 샘플수의 두 배가 된다.

<1-1> SLC6A3 - MS1 ( minisatellite 1) 추가 분석

정상인 388명을 조사한 결과 약 647bp, 약 713bp 및 약 779bp 크기의 3개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 66bp의 반복단위가 6번, 7번 및 8번 반복된 크기로 나타난 것이다 (하기 표 4 및 도 2 참조). 도 2는 SLC6A3-MS1의 다형성 소위성을 나타낸 것이다.

SLC6A3 -MS1의 다형성 소위성 분석

반복단위×반복수	N값(전체:776)	**횟수(frequency)
66×6	1	0.0013
66×7	369	0.4755
66×8	406	0.5232

** "횟수(frequency)= N값/전체 N값"으로 계산되며, 그 값이 0.01 미만인 경우 희귀 다형성 소위성에 해당함.

<1-2> SLC6A3 - MS4 ( minisatellite 4) 추가 분석

정상인 375명을 조사한 결과, 약 973bp, 약 1123bp, 약 1198bp, 약 1273bp, 약 1348bp, 약 1423bp, 약 1648bp, 약 1948bp, 약 2023bp, 약 2173bp, 약 2248bp, 약 2323bp, 약 2398bp, 약 2473bp, 및 약 2548bp 크기의 15개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 75bp의 반복단위가 11번, 13번 14번, 15번 16번, 17번, 20번 24번, 25번 27번, 28번 29번, 30번, 31번 및 32번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 5 및 도 3 참조). 도 3은 SLC6A3-MS4의 다형성 소위성을 나타낸 것이다.

SLC6A3 -MS4의 다형성 소위성 분석

반복단위×반복수	N=750	**횟수(frequency)
75×11	1	0.0013
75×13	1	0.0013
75×14	320	0.4267
75×15	7	0.0093
75×16	89	0.1187
75×17	2	0.0027
75×20	6	0.0080
75×24	2	0.0027
75×25	1	0.0013
75×27	1	0.0013
75×28	12	0.0160
75×29	131	0.1747
75×30	166	0.2213
75×31	10	0.0133
75×32	1	0.0013

<1-3> SLC6A3 - MS8 ( minisatellite 8) 추가 분석

정상인 388명을 조사한 결과, 약 275bp, 약 305bp, 약 335bp, 약 365bp, 및 약 395bp 크기의 5개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 30bp의 반복단위가 6번, 7번, 8번, 9번 및 10번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 6 및 도 4 참조). 도 4는 SLC6A3-MS8의 다형성 소위성을 나타낸 것이다.

SLC6A3 -MS8의 다형성 소위성 분석

반복단위×반복수	N=776	** 횟수(frequency)
30×6	2	0.0026
30×7	17	0.0219
30×8	26	0.0335
30×9	710	0.9149
30×10	21	0.0271

<1-4> SLC6A3 - MS9 ( minisatellite 9) 추가 분석

정상인 388명을 조사한 결과, 약 586bp, 약 626bp, 약 706bp, 약 746bp, 및 약 786bp 크기의 5개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 40bp의 반복단위가 6번, 7번, 9번, 10번 및 11번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 7 및 도 5 참조). 도 5는 SLC6A3-MS9의 다형성 소위성을 나타낸 것이다.

SLC6A3 -MS9의 다형성 소위성 분석

반복단위×반복수	N=776	** 횟수(frequency)
40×6	2	0.0026
40×7	17	0.0219
40×9	26	0.0335
40×10	710	0.9149
40×11	21	0.0271

< 실시예 2>

감수분열을 통한 다형성 소위성의 유전적 전달 측정

부계와 모계로부터 그 유전 형질이 자손에게 각각 하나씩 전달되는 과정을 멘델의 유전법칙이라고 하며, 이에 의해 부모와 자손 간의 친자확인이 가능하다. 연쇄반복(tandem repeats, TR) 부위의 대립형질은 부모로부터 물려받은 2개의 대립형질로 구성되어 있어, 이것이 감수분열을 통해 자손에게 전달되는지를 확인하였다. 조부모, 부모, 자손의 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 PCR을 이용하여, SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8, 및 SLC6A3-MS9의 대립형질 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, SLC6A3-MS1, SLC6A3-MS4, SLC6A3-MS8 및 SLC6A3-MS9 모두 부모와 자손 간에 감수분열을 통해 유전적으로 정확히 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 멘델의 법칙에 의해 유전되며 개체 확인, 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 효율적인 마커로 사용할 수 있다는 것을 나타내고, 이러한 DNA 타이핑 마커(DNA typing marker)를 이용하여 가족에서의 동일 질환 발생 여부를 조사할 수 있다는 것을 의미한다.

< 실시예 3>

SLC6A3 - MS1 , SLC6A3 - MS4 , SLC6A3 - MS8 및 SLC6A3 - MS9 영역의 고혈압과의 연관성 측정

연쇄반복(tandem repeats, TR)의 구조적 특성이 유전자의 발현에 관여한다는 보고가 h-Ras를 중심으로 보고되었다. 이에 본 발명자들은 SLC6A3유전자의 연쇄반복 영역의 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하기 실험에서는 정상인과 고혈압 환자의 게놈 DNA를 추출하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 PCR을 수행함으로써 정상인과 고혈압 환자간의 일배체형 패턴(haplotype pattern)을 비교 분석하였다.

<3-1> SLC6A3 - MS1 ( minisatellite 1)

SLC6A3 -MS1 부위에 대하여 정상인 388명 및 고혈압 환자 201명을 분석하였다. 고혈압 환자의 분석 결과에서는 약 449bp, 약 713bp 및 약 779bp 크기의 3개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 66bp의 반복단위가 3번, 7번 및 8번 반복된 크기로 나타난 것이다 (하기 표 8 참조).

SLC6A3 -MS1의 고혈압 특이적 다형성 소위성 분석

	정상인		고혈압
반복단위×반복수	N=776	횟수(frequency)	N=402	횟수(frequency)
66×3	0	0.0000	1	0.0025
66×6	1	0.0013	0	0.0000
66×7	369	0.4755	191	0.4751
66×8	406	0.5232	210	0.5224

<3-2> SLC6A3 - MS4 ( minisatellite 4)

SLC6A3 -MS4 부위에 대하여 정상인 375명 및 고혈압 환자 200명을 분석하였다. 고혈압 환자의 분석 결과에서는 약 973bp, 약 1123bp, 약 1198bp, 약 1273bp, 약 1348bp, 약 1423bp, 약 1573bp, 약 1648bp, 약 2248bp, 약 2323bp, 약 2398bp 및 약 2473bp 크기의 12개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 75bp의 반복단위가 11번, 13번 14번, 15번 16번, 17번 19번, 20번, 28번 29번, 30번 및 31번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 9 참조).

SLC6A3 -MS4의 고혈압 특이적 다형성 소위성 분석

	정상인		고혈압
반복단위×반복수	N=750	횟수(frequency)	N=400	횟수(frequency)
75×11	1	0.0013	1	0.0025
75×13	1	0.0013	2	0.0050
75×14	320	0.4267	160	0.4000
75×15	7	0.0093	5	0.0125
75×16	89	0.1187	42	0.1050
75×17	2	0.0027	1	0.0025
75×19	0	0.0000	1	0.0025
75×20	6	0.0080	3	0.0075
75×24	2	0.0027	0	0.0000
75×25	1	0.0013	0	0.0000
75×27	1	0.0013	0	0.0000
75×28	12	0.0160	12	0.0300
75×29	131	0.1747	73	0.1825
75×30	166	0.2213	95	0.2375
75×31	10	0.0133	5	0.0125
75×32	1	0.0013	0	0.0000

<3-3> SLC6A3 - MS8 ( minisatellite 8)

SLC6A3 -MS8 부위에 대하여 정상인 388명 및 고혈압 환자 201명을 분석하였다. 고혈압 환자의 분석 결과에서는 약 275bp, 약 305bp 및 약 335bp 크기의 3개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 30bp의 반복단위가 6번, 7번 및 8번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 10 참조).

SLC6A3 -MS8의 고혈압 특이적 다형성 소위성 분석

	정상인		고혈압
반복단위×반복수	N=776	횟수(frequency)	N=402	횟수(frequency)
30×6	154	0.1985	87	0.2164
30×7	616	0.7938	313	0.7786
30×8	3	0.0039	2	0.0050
30×9	2	0.0026	0	0.0000
30×10	1	0.0013	0	0.0000

<3-4> SLC6A3 - MS9 ( minisatellite 9)

SLC6A3 -MS9 부위에 대하여 정상인 388명 및 고혈압 환자 201명을 분석하였다. 고혈압 환자의 분석 결과에서는 약 586bp, 약 626bp, 약 706bp, 약 746bp, 및 약 786bp 크기의 5개의 대립형질이 확인되었으며, 이는 40bp의 반복단위가 6번, 7번, 9번, 10번 및 11번 반복된 크기로 나타난 것이다(하기 표 11 참조).

SLC6A3 -MS9의 고혈압 특이적 다형성 소위성 분석

	정상인		고혈압
반복단위×반복수	N=776	횟수(frequency)	N=402	횟수(frequency)
40×6	2	0.0026	1	0.0025
40×7	17	0.0219	17	0.0423
40×9	26	0.0335	9	0.0224
40×10	710	0.9149	368	0.9154
40×11	21	0.0271	7	0.0174

< 실시예 4>

SLC6A3 - MS9 영역의 짧은 대립형질 보유와 고혈압과의 연관성 분석

대립형질의 크기가 일반적인 크기의 대립형질보다 7번 반복되는 대립형질과 질병 발생에 대한 감수성을 분석하였다. 대립형질이 나타나는 패턴을 나누어, 일반 대립형질(common allele)로만 이루어진 패턴을 C/C로 하고, 적어도 하나 이상의 7번 반복되는 대립형질을 가지는 패턴을 S/-로 나누어 비교하였다.

그 결과, 하기 표 12에 나타난 바와 같이 SLC6A3-MS9의 경우 고혈압 환자에서 S/- 패턴이 정상인에 비해 약 2배 정도 높게 나타났다. 따라서 SLC6A3-MS9의 7번 반복되는 대립형질을 가지는 경우 고혈압에 대하여 그 감수성이 정상인보다 약 2배 이상 높게 나타남을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해서, SLC6A3-MS9 는 고혈압 같은 질병에 대한 감수성을 조사하는 중요한 마커로서, 예측진단에 중요한 자료로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

정상인과 질병간의 SLC6A3-MS9의 희귀 대립형질 패턴 비교

		정상인		고혈압환자
	패턴	N	%	N	%
SLC6A3-MS9	C/C	371	95.6	184	91.5
SLC6A3-MS9	S/-	17	4.4	17	8.5

C: common allele(일반 대립형질), S: short allele(희귀대립형질), -: common allele(일반 대립형질) 혹은 short allele(희귀대립형질)

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

SLC6A3: solute carrier family 6[dopamine], member 3
SLC: solute carrier
TR: tandem repeat
MS: minisatellite
SLC6A3-MS1: SLC6A3-ministallite1
SLC6A3-MS2: SLC6A3-ministallite2
SLC6A3-MS3: SLC6A3-ministallite3
SLC6A3-MS4: SLC6A3-ministallite4
SLC6A3-MS5: SLC6A3-ministallite5
SLC6A3-MS6: SLC6A3-ministallite6
SLC6A3-MS7: SLC6A3-ministallite7
SLC6A3-MS8: SLC6A3-ministallite8
SLC6A3-MS9: SLC6A3-ministallite9
SLC6A3-MS10: SLC6A3-ministallite10

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> DNA Typing Kits and Diagnostic Kits for Detecting Diseases Related to Polymorphic Microsatellites of SLC6A3 Gene <130> PN1404-130 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> SLC6A3-MS1 polynucleotide sequence <400> 1 tggccactac cgttcaaggg agccatttcc tcacccaggt gcccagggaa gcatccagga 60 ggggac 66 <210> 2 <211> 73 <212> DNA <213> SLC6A3-MS2 polynucleotide sequence <400> 2 tccggacaga cggtaatata gaattattta atatggacca gatccacgtg ggagaaggcc 60 ttccaaaggc aat 73 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> SLC6A3-MS3 polynucleotide sequence <400> 3 ggccaggcct gacctgcaca gtcctcccca gccaggccag ttcctcactg cccacccc 58 <210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> SLC6A3-MS4 polynucleotide sequence <400> 4 gtgggcagca gtgggtaccc agcagcgtgg gcagcactgt gggcagcggt gggtacccag 60 caccatgggc agcac 75 <210> 5 <211> 83 <212> DNA <213> SLC6A3-MS5 polynucleotide sequence <400> 5 ggatggatgg gtggatggat gatgggtgga ttgctggatg atggatggct gggtggatgg 60 atgaatgata ggtaggtagc tgg 83 <210> 6 <211> 109 <212> DNA <213> SLC6A3-MS6 polynucleotide sequence <400> 6 atcaggacac catcatcatg tagcatgtgg atgggtccat gcctttctga gggttatcag 60 ggtgctgcca tcatgcagca tgtggatgat ccatgctgtt ctgagggtt 109 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> SLC6A3-MS7 polynucleotide sequence <400> 7 gtgtggataa gtccatgctg ttctgagggt tatcagggcg ccgcggtcat gttgt 55 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> SLC6A3-MS8 polynucleotide sequence <400> 8 tgtgtctgtg tgtgtatatt gcatggtatg 30 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> SLC6A3-MS9 polynucleotide sequence <400> 9 aggagcgtgt cctatccccg gacgcatgca gggcccccac 40 <210> 10 <211> 82 <212> DNA <213> SLC6A3-MS10 polynucleotide sequence <400> 10 gctgcagtta gcacagagga tggcttcccc attgccttct ggggagggac acagaggacg 60 gcttccccat cgccttctgg cc 82 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS1_forward primer <400> 11 ctgggccttc ggtgagcttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS1_reverse primer <400> 12 ccactggcca cactggctga 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS2_forward primer <400> 13 tgggcatcca ttgtcagtta cca 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS2_reverse primer <400> 14 tgttctcatg ctcagggcac ctc 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS3_forward primer <400> 15 tgggtgtcac tgcgcaagaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS3_reverse primer <400> 16 ctggcgaggg caggaagatg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS4_forward primer <400> 17 tagagtttgc tcggcctcat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS4_reverse primer <400> 18 gccacagaaa ccaaaaggaa 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS5_forward primer <400> 19 ggctggctgg atgtatgg 18 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS5_reverse primer <400> 20 ccatttcttt cctgatttct cttca 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS6_forward primer <400> 21 cgtggaccca cccacctttc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS6_reverse primer <400> 22 gccctagcgg ggtctccatc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS7_forward primer <400> 23 ggggacacac tcagggggtt g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS7_reverse primer <400> 24 ggcagcagac gactggtgga a 21 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS8_forward primer <400> 25 gcacaaatga gtgttcgtgc atgt 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS8_reverse primer <400> 26 caggctggtc ctgcccttca 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS9_forward primer <400> 27 cattggagga tgggggtcct g 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS9_reverse primer <400> 28 agcaagcagg ctcgcggata 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS10_forward primer <400> 29 gtcatggctg tcccctgcaa 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A3-MS10_reverse primer <400> 30 ggaggctgag gcagtttttc ca 22

Claims

다음으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 개인 식별 마커용 다형성 소위성 검출용 프라이머 세트:
(ⅰ) 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 3번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS1 검출용 프라이머 세트;
(ⅱ) 서열번호 16 및 17의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 4번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS4 검출용 프라이머 세트;
(ⅲ) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 인트론(intron) 8번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS8 검출용 프라이머 세트; 및
(ⅳ) 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성 검출을 위한 DNA 타이핑 키트.
검체로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 DNA 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 서열번호 1의 SLC6A3-MS1, 서열번호 4의 SLC6A3-MS4, 서열번호 8의 SLC6A3-MS8 및 서열번호 9의 SLC6A3-MS9로 구성된 군에서 선택되는 다형성 소위성을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 타이핑 방법.
제3항에 있어서,
상기 검체는 혈액, 머리카락, 타액, 표피, 정액, 질 채취물, 분리된 세포, 조직샘플, 비듬, 유골로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 DNA 타이핑 방법은 개체의 친자 확인, 혈연 확인 또는 법의학적 감정에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는, SLC6A3 유전자 내의 엑손(exon) 15번 영역의 다형성 소위성 SLC6A3-MS9 검출용 프라이머 세트를 포함하는 SLC6A3 관련 질병 진단키트.
제6항에 있어서,
상기 SLC6A3 관련 질병은 고혈압인 것을 특징으로 하는 SLC6A3 관련 질병의 진단키트.