KR20160065233A - 말 유전자 타이핑용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말 유전자 타이핑용 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 일부가 형광표지물질로 표지된 34가지의 프라이머를 포함하여 이루어짐으로써 말의 유전체에서 총 17개의 미세위성 좌위를 동시에 증폭할 수 있으며, 이에 따라 말의 유전자 타이핑을 신속 정확하고 용이하게 수행할 수 있도록 하는 다중중합효소연쇄반응 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 말 유전자 타이핑용 조성물, 이 조성물을 포함하는 말 유전자 타이핑용 키트, 그리고 이들을 이용한 말 유전자 타이핑 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 말의 유전자 타이핑을 매우 신속하고 정확하게 수행할 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트는 말 유전체에서 17개의 미세위성 좌위를 신속 정확하게 증폭할 수 있으며, 증폭양상이 기존의 키트를 사용한 경우와 거의 일치하기 때문에 기존 키트를 사용하여 지금까지 축적되어 온 많은 유전자데이터를 활용할 수 있는 것이 가능할 뿐만 아니라 기존 키트에서 몇 개 좌위의 증폭이 불안정한 문제를 해소할 수 있다.
본 발명에 따르면, 말의 유전자 타이핑을 매우 신속하고 정확하게 수행할 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트는 말 유전체에서 17개의 미세위성 좌위를 신속 정확하게 증폭할 수 있으며, 증폭양상이 기존의 키트를 사용한 경우와 거의 일치하기 때문에 기존 키트를 사용하여 지금까지 축적되어 온 많은 유전자데이터를 활용할 수 있는 것이 가능할 뿐만 아니라 기존 키트에서 몇 개 좌위의 증폭이 불안정한 문제를 해소할 수 있다.
Description
본 발명은 말 유전자 타이핑용 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 일부가 형광표지물질로 표지된 34가지의 프라이머를 포함하여 이루어짐으로써 말의 유전체에서 총 17개의 미세위성 좌위를 동시에 증폭할 수 있으며, 이에 따라 말의 유전자 타이핑을 신속 정확하고 용이하게 수행할 수 있도록 하는 다중중합효소연쇄반응 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 말 유전자 타이핑용 조성물, 이 조성물을 포함하는 말 유전자 타이핑용 키트, 그리고 이들을 이용한 말 유전자 타이핑 방법에 관한 것이다.
세계 각국에서는 유전자원으로서의 가축에 대한 보존 및 활용의 가치를 인식하면서(Notter. 1999. J. Anim. Sci. 77:61-69) 가축들의 품종, 유전적 특성, 유전적 다양성, 타 품종간의 유연관계 등의 분석 연구를 수행하여 왔다. 최근 들어 분자생물학적 기법을 이용한 다양한 유전적 분석방법들이 개발되고 활용됨에 따라 DNA 다형성 분석에 기초한 품종 간, 개체 간의 동정이 이루어지고 있다(Peelman et al., 1998. Anim. Genet. 29:161-167).
미세위성(Microsatellite, MS)은 2 ~ 6개 정도의 염기서열이 반복되는 짧은 연쇄반복(STR: Short tandem repeat)으로, 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열(non-coding DNA sequence)이다(Zajc, Sampson, 1999. J Hered 90: 104-107). STR은 특정 좌위에서 반복단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정되는데(Koreth, O'Leary, McGee, 1996. J Pathol 178: 239-248), 반복수에 품종 간 다형성이 있는 경우에 인접영역에 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하면, PCR 산물의 길이에 다형성이 관찰되고 DNA 다형성을 검출하는 것이 가능해진다. 또한, 미세위성은 다른 유전자들과 마찬가지로 멘델의 유전법칙에 따라 자식에게 전달되며 PCR을 이용하여 증폭할 수 있다. 특히, 미세위성은 크기가 작기 때문에 2개에서 최대 8개까지의 프라이머를 동시에 증폭할 수 있으므로(Chamberlain JS et al., (1988) Nucleic Acids Res 16: 11141-11156) 유전자의 다형성을 분석하는데 시간과 비용을 줄일 수 있으며 쉽게 이들의 대립유전자형을 분석할 수 있다.
전 세계적으로 이러한 미세위성 분석은 매우 광범위하게 이루어지고 있으며, 학술적 연구와 더불어, 현재 국내에서 사람의 경우 범죄자 유전자 DB사업, 동물의 경우 쇠고기 이력관리제 등에 활용되고 있다.
말의 경우 1793년 사람의 족보와도 같은 혈통서(Stud book)가 영국에서 처음으로 발간된 이래(Bailey, 1998) 현재는 세계 여러 나라에서 발간되어지고 있으며, 우리나라도 1998년 한국혈통서 제1권이 발간된 바 있다. 혈통서에 등재되기 위해서는 축산법 및 말 혈통등록규정에 근거하여 유전자검사 혹은 혈액형검사와 모색유전의 법칙에 의해서 친자관계가 확인되어야만 한다(Bowling, 1996a). 말의 혈통등록을 위한 친자검사기법은 국제혈통서위원회(International Stud Book Committee: ISBC)의 엄격한 조건을 준수하여야 한다(Miura, 1994). 혈통서 등록기관으로부터 지정받은 각국의 유전자검사기관은 국제동물유전학회(International Society of Animal Genetics: ISAG)에 가입하여 ISBC와 ISAG가 공동으로 결정한 최소표준검사항목을 검사해야 하고 ISBC와 ISAG가 공동 주최하는 말 국제비교동정시험에 참가해야 하는 의무를 준수하여야만 한다. 한국의 말 혈통검사기관인 한국마사회 유전자 검사실도 이러한 국제기준에 준하여 말의 친자검사 및 혈통 검사를 실시하고 있다.
말의 혈통검사기법으로 과거에는 혈액형 검사나 모색 확인으로 대부분의 친자관계를 확인하였으나, 현재는 미세위성 유전자분석으로 정확하고 신속한 검사가 가능하게 되었다. 이러한 미세위성 마커(marker)를 찾기 위하여 1990년 ISAG 위원회의 요청에 의해 유용성 여부를 알아보고자 각국의 친자검사기관이 DNA 마커의 검색을 연구한 결과 1996년 말에 약 130여개가 보고된 바 있고(Natsuno, 1998), 그 후 1997년과 1999년 말 비교동정시험을 통해 2000년 국제동물유전학회(ISAG) 위원회에서 9개(AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20)의 미세위성 DNA 좌위를 국제최소표준 검사항목으로 지정하여 친자검사 및 혈통검사에 활용토록 권장하고 있다(Hasegawa 등, 2001; Kakoi 등, 2000).
미국을 비롯한 선진외국에서는 2001년부터 말의 친자검사에 종전의 혈액형검사 대신 유전자검사를 도입하여 시행하고 있으며, 한국마사회 유전자검사실도 국제기준에 준한 친자검사를 위해서 2003년부터 국내에서 사육 중인 모든 번식마와 혈통등록 대상마(국내 생산 망아지)를 대상으로 유전자검사를 실시하고 있다(도 1 참조).
위와 같은 ISAG 가이드라인에 따라 현재 국내 한국 마사회를 비롯하여 전세계 대부분의 말 유전자검사기관 및 사설 검사소에서는 말의 유전자검사를 위해 혈통 등록을 위한 최소 기준을 만족하는 상업화 키트인 미국 life technologies의 StockMarks® Horse Genotyping Kits를 사용하고 있으며 상업화 키트로는 전세계 독점 제품이다. 그러나 1990년대 개발된 제품에서 업데이트는 거의 이루어지지 않고 있으며 최근 개발사인 미국 life technologies에서 StockMarks® Horse Genotyping Kit를 비롯하여 동물 유전자감식 키트 제품을 더 이상 생산하지 않을 것임을 지속적으로 공지하고 있다. 이는 독점 제품에 의존하던 전 세계 수많은 말 유전자검사기관에게는 대체키트의 필요성을 절감하게 하는 부분이다. 그 동안 많은 말 유전자데이터들이 StockMarks® Horse Genotyping Kit을 통해 축적되어 왔고, 그들을 바탕으로 친자검사 또는 혈통검사가 수행되고 있기 때문에 새로운 유전자좌를 이용한 새로운 키트의 출현은 이제까지 축적된 많은 유전자데이터를 없애고 새롭게 데이터를 축적해야 하는 것이므로 바람직하지 않다. 현재로서의 대체 키트의 최선의 대안은 기존의 StockMarks® Horse Genotyping Kit와 동일한 결과를 얻을 수 있는 호환적인 키트를 개발하는 것이다.
이에 본 발명자들은 기존의 말 유전자 타이핑 키트를 대체하면서도 이전부터 축적되어 온 유전자데이터를 적용할 수 있는 방법을 개발하고자 하였으며, 이와 함께 기존 키트가 갖는 문제점을 보완하여 보다 정확한 유전자 타이핑이 가능하도록 하기 위해 다양한 방법으로 연구하였다. 이의 결과, 34가지의 프라이머가 포함된 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행하면 말 유전체에서 17개의 미세위성 좌위를 신속 정확하게 증폭할 수 있으며 증폭양상이 기존의 키트와 거의 일치하기 때문에 기존의 유전자데이터와 비교하는 것이 가능할 뿐만 아니라 기존 키트에서 몇 개 좌위의 증폭이 불안정한 문제를 해소할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
1. M. Dobosz et al., Probabilistic Expert Systems for Forensic Inference from DNA Markers in Horses: Applications to Confirm Genealogies with Lack of Genetic Data. J. Hered. 101(2), 240-245 (March-April 2010).
2. Caetano A. R., Shiue Y. L., Lyons L. A, O'Brien S. J., Laughlin T. F., Bowling A. T., Murray J. D. 1999. A comparative gene map of the horse (Equus caballus). Genome Res. Dec 9(12):1239-49.
3. Jeffreys, A.J., Wilson, V., Thein, S.L. 1985a. Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature 314, 67-73. Archiva Zootechnica vol. 8, 2005 175.
4. Jeffreys, A.J., Wilson, V. and Thein, S.L. 1985b. Individual-specific "fingerprints" of human DNA. Nature 316, 76-79.
5. Lindgren, G., Sandberg, K., Persson, H., Marklund, S., Breen, M., Sandgren, B., Carlstㅹn, J., Ellegren, H. 1998. A primary male autosomal linkage map of the horse genome. Genome Res. 8: 951-966.
6. Marklund, S., Ellegren, H., Eriksson, S., Sandberg, K. Andersson, L. 1994. Parentage testing and linkage anaylsis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites. Animal Genetics 25:19-23.
7. Shiue, Y.L. 1999. Construction of a horse (Equus caballus) synteny and comparative map based on type I and type II markers. Ph.D. Dissertation University of California, Davis.
8. Shiue, Y.L., Bickel, L. A., Caetano, A. R., Millon, L. V., Clark, R. S., Eggleston, M. L., Michelmore, R., Bailey, E., Guerin, G., Godard, S. 1999. A synteny map of the horse genome comprised of 240 microsatellite and RAPD markers. Anim. Genet. 30: 1-9.
따라서 본 발명의 주된 목적은 기존의 말 유전자 타이핑 키트를 대체하면서도 이전부터 축적되어 온 유전자데이터를 적용할 수 있으며, 기존 키트가 갖는 문제점을 보완하여 보다 정확한 유전자 타이핑이 가능한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 말 유전자 타이핑에 필요한 프라이머 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 말 유전자 타이핑을 용이하게 수행할 수 있도록 하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 말 유전자 타이핑을 용이하게 수행할 수 있도록 하는 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 34의 프라이머를 포함하는 말 유전자 타이핑용 다중중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction) 프라이머 세트를 제공한다.
상기 본 발명의 프라이머들은 각각 말의 유전체에서 17곳의 미세위성 STR 부위를 증폭할 수 있는 프라이머들로, 서열번호 1 및 2는 VHL20, 서열번호 3 및 4는 HTG4, 서열번호 5 및 6은 AHT4, 서열번호 7 및 8은 HMS7, 서열번호 9 및 10은 HTG6, 서열번호 11 및 12는 AHT5, 서열번호 13 및 14는 HMS6, 서열번호 15 및 16은 ASB23, 서열번호 17 및 18은 ASB2, 서열번호 19 및 20은 HTG10, 서열번호 21 및 22는 HTG7, 서열번호 23 및 24는 HMS3, 서열번호 25 및 26은 HMS2, 서열번호 27 및 28은 ASB17, 서열번호 29 및 30은 LEX3, 서열번호 31 및 32는 HMS1, 서열번호 33 및 34는 CA425 STR 부위를 각각 증폭할 수 있다.
본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지를 추가 구성할 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, FAM, VIC, TET, JOE, Alexa, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등이 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 이 중에서도 FAM(화학식 1), JOE(화학식 2), Alexa555(화학식 3) 및 Alexa 594(화학식 4)의 형광표지물질 조합을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1 및 2 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 3 및 4 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 5 및 6 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 7 및 8 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 1의 형광표지물질로 표지되고, 서열번호 9 및 10 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 11 및 12 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 13 및 14 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 15 및 16 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 2의 형광표지물질로 표지되며, 서열번호 19 및 20 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 21 및 22 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 23 및 24 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 25 및 26 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 3의 형광표지물질로 표지되고, 서열번호 27 및 28 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 29 및 30 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 31 및 32 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 33 및 34 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 4의 형광표지물질로 표지되는 것이 바람직하다.
상기 화학식 1 내지 4의 형광표지물질은 각각 FAM, JOE, ALEXA 555, ALEXA 594의 이름으로 알려져 있으며, 뉴클레오티드나 단백질 등에 사용하는 형광표지물질로 잘 알려져 있다. 이들 각 형광표지물질을 프라이머에 표지하는 방법은 공지의 기술이므로 자세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프라이머 세트를 포함하는 말 유전자 타이핑용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 말 유전자 타이핑용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 사용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 말 유전자 타이핑 방법을 제공한다.
이때, 상기 다중중합효소연쇄반응은 반응액 중 34가지의 각 프라이머 농도가 4 내지 6 pmole이 되도록 하고, Hot start taq 계열의 중합효소를 사용하는 것이 보다 효율적이고 명확한 증폭결과 확인을 위해 바람직하다. 또한, 같은 이유로 94 ~ 96℃에서 9 ~ 11분간 반응시키는 단계; 94 ~ 96℃에서 50 ~ 70초, 57 ~ 59℃에서 50 ~ 70초 및 71 ~ 73℃에서 50 ~ 70초 동안의 반응을 순서대로 20 ~ 40회 반복하는 단계; 59 ~ 61℃에서 50 ~ 70분간 반응시키는 단계;를 포함하는 조건으로 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 말의 유전자 타이핑을 매우 신속하고 정확하게 수행할 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트는 말 유전체에서 17개의 미세위성 좌위를 신속 정확하게 증폭할 수 있으며, 증폭양상이 기존의 키트를 사용한 경우와 거의 일치하기 때문에 기존 키트를 사용하여 지금까지 축적되어 온 많은 유전자데이터를 활용할 수 있는 것이 가능할 뿐만 아니라 기존 키트에서 몇 개 좌위의 증폭이 불안정한 문제를 해소할 수 있다.
도 1은 PCR을 이용한 말 유전자 타이핑의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 VHL20, HTG4, AHT4, HMS7 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG6, AHT5, HMS6, ASB23 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG10, HTG7, HMS3, HMS2 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 5는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 ASB17, LEX3, HMS1, CA425 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 VHL20, HTG4, AHT4, HMS7 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: VHL20, B: HTG4, C: AHT4, D: HMS7. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG6, AHT5, HMS6, ASB23 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: HTG6, B: AHT5, C: HMS6, D: ASB23. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 8은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG10, HTG7, HMS3, HMS2 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: HTG10, B: HTG7, C: HMS3, D: HMS2. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 9는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 ASB17, LEX3, HMS1, CA425 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: ASB17, B: LEX3, C: HMS1, D: CA425. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 10은 본 발명 프라이머 세트의 각 프라이머를 표 3과 같이 FAM, JOE, ALEXA 555 또는 ALEXA 594로 표지하여 다중-PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 프라이머의 농도에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: 10 pmole, 중단: 5 pmole, 하단: 3 pmole.
도 12는 중합효소의 종류에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: Hot start taq, 하단: taq polymerase.
도 13은 표 4와 같은 PCR 반응조건에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: 조건 1, 중단: 조건 2, 하단: 조건 3.
도 14는 시제품으로 만든 본 발명의 말 유전자 타이핑용 키트의 사진이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 VHL20, HTG4, AHT4, HMS7 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG6, AHT5, HMS6, ASB23 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG10, HTG7, HMS3, HMS2 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 5는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 ASB17, LEX3, HMS1, CA425 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군을 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: Stock Mark kit를 사용한 결과, B: 표 1의 프라이머 후보군을 사용한 결과.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 VHL20, HTG4, AHT4, HMS7 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: VHL20, B: HTG4, C: AHT4, D: HMS7. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG6, AHT5, HMS6, ASB23 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: HTG6, B: AHT5, C: HMS6, D: ASB23. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 8은 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 HTG10, HTG7, HMS3, HMS2 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: HTG10, B: HTG7, C: HMS3, D: HMS2. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 9는 본 발명의 프라이머 세트를 개발하는 과정 중의 ASB17, LEX3, HMS1, CA425 미세위성 부위에 대한 프라이머 후보군에서 일부 프라이머를 변경하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. A: ASB17, B: LEX3, C: HMS1, D: CA425. 각 A, B, C 및 D에서 상단은 Stock Mark kit를 사용한 결과이고, 하단은 표 1에서 표 2와 같이 수정한 프라이머 후보군을 사용한 결과이다.
도 10은 본 발명 프라이머 세트의 각 프라이머를 표 3과 같이 FAM, JOE, ALEXA 555 또는 ALEXA 594로 표지하여 다중-PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 프라이머의 농도에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: 10 pmole, 중단: 5 pmole, 하단: 3 pmole.
도 12는 중합효소의 종류에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: Hot start taq, 하단: taq polymerase.
도 13은 표 4와 같은 PCR 반응조건에 따른 다중-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상단: 조건 1, 중단: 조건 2, 하단: 조건 3.
도 14는 시제품으로 만든 본 발명의 말 유전자 타이핑용 키트의 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
말의 17개 STR 유전자좌에 대한 프라이머 선정
말의 17개 STR 유전좌위에 대한 Genebank 염기서열을 확인하고 반복부위를 포함하도록 하면서 Life technologies사의 Stock Mark kit(상품명 : Horse STR Kit)의 STR 증폭산물과 동일한 단편길이의 증폭산물이 얻어질 수 있도록 프라이머를 선정하고자 하였다.
마사회의 선행연구에 의해 15개의 프라이머에 대한 정보를 참조하였으며, 실제 증폭단편 길이와 GeneBank 염기서열에 의한 단편길이에서 차이가 발생하는 2개의 유전좌위에 대한 프라이머와 형광표지물질을 채택하기 위한 실험을 수행하였다. 선정된 프라이머 후보군은 표 1과 같다.
| 이름 | 프라이머 서열 및 형광표지 |
| VHL20F | 5'FAM-CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG |
| VHL20R | AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG |
| HTG4F | 5'FAM-CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC |
| HTG4R | CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC |
| AHT4F | 5'FAM-AACCGCCTGAGCAAGGAAGT |
| AHT4R | CCCAGAGAGTTTACCCT |
| HMS7F | 5'FAM-TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT |
| HMS7R | CAGGAAACTCATGTTGATACCATC |
| HTG6F | 5'VIC-GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT |
| HTG6R | CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT |
| AHT5F | 5'VIC-ACGGACACATCCCTGCCTGC |
| AHT5R | GCAGGCTAAGGAGGCTCAGC |
| HMS6F | 5'VIC-GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG |
| HMS6R | CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA |
| ASB23F | 5'VIC-GAGGGCAGCAGGTTGGGAAGG |
| ASB23R | ACATCCTGGTCAAATCACAGTCC |
| ASB2F | 5'VIC-CCACTAAGTGTCGTTTCAGAAGG |
| ASB2R | CACAACTGAGTTCTCTGATAGG |
| HTG10F | 5'NED-TTTTTATTCTGATCTGTCACATTT |
| HTG10R | CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA |
| HTG7F | 5'NED-CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG |
| HTG7R | ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT |
| HMS3F | 5'NED-CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT |
| HMS3R | CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA |
| HMS2F | 5'NED-CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG |
| HMS2R | ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG |
| ASB17F | 5'PET-ACCATTCAGGATCTCCACCG |
| ASB17R | GAGGGCGGTACCTTTGTACC |
| LEX3F | 5'PET-ACATCTAACCAGTGCTGAGACT |
| LEX3R | GAAGGAAAAAAAGGAGGAAGAC |
| HMS1F | 5'PET-CATCACTCTTCATGTCTGCTTGG |
| HMS1R | TTGACATAAATGCTTATCCTATGGC |
| CA425F | 5'PET-AGCTGCCTCGTTAATTCA |
| CA425R | CTCATGTCCGCTTGTCTC |
* 5'FAM : 프라이머의 5' 말단을 FAM(형광표지물질)으로 표지.
* 5'VIC : 프라이머의 5' 말단을 VIC(형광표지물질)로 표지.
* 5'NED : 프라이머의 5' 말단을 NED(형광표지물질)로 표지.
* 5'PET : 프라이머의 5' 말단을 PET(형광표지물질)로 표지.
Single PCR 및 염기서열 확인
17개의 프라이머 쌍으로 각각의 단일 증폭산물을 얻고 염기서열을 분석하였다. Stock Mark kit와의 호환성을 고려하여 증폭산물의 크기가 정확하게 일치하는지 확인고자 하였다(도 2 ~ 5 참조).
마사회의 선행연구에서 얻은 프라이머 정보와 Genebank 데이터를 분석하여 선택한 프라이머 후보군(표 1 참조)을 대상으로 각각 단일 PCR 증폭반응을 실시하고, LT사 제품인 Stock Mark kit로 증폭한 결과와 비교하였다.
프라이머 후보군의 단일 PCR 반응에서 프라이머의 농도는 10 pmole로 하였고, Stock Mark kit의 증폭은 제품 매뉴얼에 따라 진행하였다.
일차 단일 PCR 증폭결과 Stock Mark kit와 일치하지 않는 유전자좌가 다수 발견되었다(도 2 ~ 5 참조). 대부분 5bp 이내의 근소한 차이였으나, 일부 유전자좌는 증폭산물의 차이가 큰 것으로 확인됨에 따라 일부를 변경하여 새롭게 프라이머를 디자인하였다(표 2 참조).
| 이름 | 프라이머 서열 및 형광표지 |
| AHT4R(2) | GCTCCCAGAGAGTTTACCCT |
| HMS7R(2) | CAACCAGGAAACTCATGTTGATACCATC |
| HTG6R(2) | TCCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT |
| AHT5R(2) | TGCAGGCTAAGGAGGCTCAGC |
| HMS6R(2) | GCTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA |
| ASB23R(2) | GAGAAGTCATTTTTAACACCT |
| HTG10R(2) | AATTCCCGCCCCACCCCCGGC |
| HTG7R(2) | AAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT |
| HMS2R(2) | CGGTGGCAACTGCCAAGGAAG |
| ASB17R(2) | GATGGAGGGCGGTACCTTTGTACC |
| LEX3R(2) | AAAAAAGGAGGAAGACTGGC |
| CA425R(2) | CCGCTTGTCTCCGGGCCCCCCTC |
| AHT5F(2) | 5'HEX-CACGGACACATCCCTGCCTGC |
| ASB23F(2) | 5'HEX-GAGGTTTGTAATTGGAATG |
| HTG10F(2) | 5'TAMRA-GATCTGTCACATTTGAATTAACTG |
| HTG7F(2) | 5'TAMRA-GAAGCAGAACATCCCTCCTTGTCG |
| HMS2F(2) | 5'TAMRA-TTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG |
| ASB17F(2) | 5'ROX-GGCACCATTCAGGATCTCCACCG |
| LEX3F(2) | 5'ROX-AACCAGTGCTGAGACTTCTGAG |
* 5'HEX : 프라이머의 5' 말단을 HEX(형광표지물질)로 표지.
* 5'TAMRA : 프라이머의 5' 말단을 TAMRA(형광표지물질)로 표지.
* 5'ROX : 프라이머의 5' 말단을 ROX(형광표지물질)로 표지.
수정된 프라이머를 사용하여 다시 단일 PCR 증폭반응을 실시하고 동일하게 Stock Mark kit와 결과를 비교하였다. 이의 결과, 도 6 ~ 9와 같이 최종적으로 수정된 프라이머를 사용하여 Stock Mark kit와 비교 시 오차범위 1bp 내의 결과물을 확인하였다.
형광물질 선택 및
프라이머
표지
17개 프라이머 쌍에서 한쪽 가닥의 5'-말단(5'-end)에 표지할 형광물질들을 테스트 하였다. 기존 분석장비(예: Life technologies사의 분석장비인 Genetic analyzer)에서 분석 가능하고 파장이 서로 겹치지 않으면서 17개 프라이머 쌍의 증폭산물을 정확하게 구분하여 검출할 수 있는 형광물질이 필요하였다.
키트를 구성하기 위해서는 최소 4개의 형광물질이 필요하다는 판단을 내렸고, 다양한 시도 끝에 FAM, JOE, ALEXA 555, ALEXA 594의 형광물질 조합이 가장 적절한 것으로 나타났다.
이에 다음 표 3과 같이 FAM, JOE, ALEXA 555 또는 ALEXA 594를 프라이머의 5' 말단에 표지하고 다중증폭반응을 수행하였다. 이의 결과, 도 10에서와 같이 각 파장의 형광들이 다른 파장의 결과에 간섭을 미치지 않고 대립유전자를 결정하는데 문제가 없는 것으로 확인되었다.
| Name | Primer sequences |
| VHL20F | 5'FAM-CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG |
| VHL20R | AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG |
| HTG4F | 5'FAM-CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC |
| HTG4R | CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC |
| AHT4F | 5'FAM-AACCGCCTGAGCAAGGAAGT |
| AHT4R | GCTCCCAGAGAGTTTACCCT |
| HMS7F | 5'FAM-TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT |
| HMS7R | CAACCAGGAAACTCATGTTGATACCATC |
| HTG6F | 5'JOE-GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT |
| HTG6R | TGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT |
| AHT5F | 5'JOE-CACGGACACATCCCTGCCTGC |
| AHT5R | TGCAGGCTAAGGAGGCTCAGC |
| HMS6F | 5'JOE-GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG |
| HMS6R | GCTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA |
| ASB23F | 5'JOE-GAGGTTTGTAATTGGAATG |
| ASB23R | GAGAAGTCATTTTTAACACCT |
| ASB2F | 5'JOE-CCACTAAGTGTCGTTTCAGAAGG |
| ASB2R | R: CACAACTGAGTTCTCTGATAGG |
| HTG10F | 5'Alexa555-GATCTGTCACATTTGAATTAACTG |
| HTG10R | CCA CCC CCG GCA CAC |
| HTG7F | 5'Alexa555-GAAGCAGAACATCCCTCCTTGTCG |
| HTG7R | AAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT |
| HMS3F | 5'Alexa555-CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT |
| HMS3R | CCCAACTCTTTGTCACATAACAAG |
| HMS2F | 5'Alexa555-TTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG |
| HMS2R | CGGTGGCAACTGCCAAGGAAG |
| ASB17F | 5'Alexa594-GGCACCATTCAGGATCTCCACCG |
| ASB17R | GATGGAGGGCGGTACCTTTGTACC |
| LEX3F | 5'Alexa594-AACCAGTGCTGAGACTTCTGAG |
| LEX3R | AAAAAAAGGAGGAAGACTGGC |
| HMS1F | 5'Alexa594-CATCACTCTTCATGTCTGCTTGG |
| HMS1R | TTGACATAAATGCTTATCCTATGGC |
| CA425F | 5'Alexa594-AGCTGCCTCGTTAATTCA |
| CA425R | TCCGCTTGTCTCCGGGC |
* 5'FAM : 프라이머의 5' 말단을 FAM(형광표지물질)로 표지.
* 5'JOE : 프라이머의 5' 말단을 JOE(형광표지물질)로 표지.
* 5'Alexa555 : 프라이머의 5' 말단을 Alexa555(형광표지물질)로 표지.
* 5'Alexa594 : 프라이머의 5' 말단을 Alexa594(형광표지물질)로 표지.
Multiplex PCR 조건 확립
17개 조합의 STR 유전자 멀티플렉스 프라이머 세트에 대한 PCR 조건을 확립하고 최적의 버퍼시스템을 찾고자 하였다.
버퍼의 성분, 중합효소의 종류별 증폭 효율, 다중증폭에서의 피크 밸런스, hetero 증폭의 충실도 등에서 최적의 조건을 보이는 반응 조건을 확립하고자 하였다.
도 11에서와 같이 프라이머 혼합물의 농도 비교결과 5 pmole씩 각각의 프라이머를 첨가하였을 때 각 유전자좌의 피크 밸런스가 가장 좋은 것으로 확인되었다.
증폭의 효율 및 피크의 명확성을 높이기 위해 서로 다른 특징의 taq polymerase를 사용한 후 결과를 비교하였다. 도 12의 상단에 보이는 결과는 Hot start taq을 사용한 결과이고, 하단은 PCR 증폭반응의 충실도가 높은 taq polymerase를 사용한 결과이다. 충실도가 높은 taq polymerase를 사용한 것은 반복단위가 단순한 STR의 증폭에서 흔히 나타나는 stutter 피크를 줄여보고자 한 것인데 결론적으로 PCR의 효율은 높은 것으로 보이지만 전체적인 결과는 Hot start taq이 본 발명에는 더 적합한 것으로 확인되었다.
또한 표 4와 같이 PCR 반응 조건을 변경하여 비교한 결과, 조건 2에서 유전자타이핑을 위한 가장 적절한 증폭결과가 나타났다(도 13 참조).
| 조건 1(도 8 상단) | |||
| step | cycles | temp. | time |
| 1 | 1 | 95 | 10분 |
| 2 |
30 |
95 | 30초 |
| 58 | 30초 | ||
| 72 | 1분 | ||
| 3 | 1 | 60 | 60분 |
| 4 | 1 | 4 | hold |
| 조건 2(도 8 중간) | |||
| step | cycles | temp. | time |
| 1 | 1 | 95 | 10분 |
| 2 |
30 |
95 | 1분 |
| 58 | 1분 | ||
| 72 | 1분 | ||
| 3 | 1 | 60 | 60분 |
| 4 | 1 | 4 | hold |
| 조건 3(도 8 하단) | |||
| step | cycles | temp. | time |
| 1 | 1 | 95 | 10분 |
| 2 |
30 |
95 | 1분 |
| 60 | 1분 | ||
| 72 | 1분 | ||
| 3 | 1 | 60 | 60분 |
| 4 | 1 | 4 | hold |
결과의 정확성 검사
Life technologies사의 Stock Mark kit을 사용하여 이미 유전자형을 알고 있는 샘플들을 대상으로 시제품과의 유전자형 판정 결과를 비교하였다.
기존의 Stock Mark kit를 사용하여 이미 각 유전자좌의 대립유전자형을 알고 있는 말 시료 30개를 대상으로 하여 본 발명의 프라이머 세트로 분석한 결과와 비교한 결과, 모든 값이 ±1bp 오차 범위 내에서 서로 일치함을 확인하였다(표 5 참조).
| 유전자좌 | 일치(건) | 불일치(건) | 오차범위( |
| VHL20 | 30 | 0 | 0.21 |
| HTG4 | 30 | 0 | 0.43 |
| AHT4 | 30 | 0 | 0.41 |
| HMS7 | 30 | 0 | 0.35 |
| HTG6 | 30 | 0 | 0.22 |
| AHT5 | 30 | 0 | 0.43 |
| HMS6 | 30 | 0 | 0.33 |
| ASB23 | 30 | 0 | 0.38 |
| ASB2 | 30 | 0 | 0.49 |
| HTG10 | 30 | 0 | 0.45 |
| HTG7 | 30 | 0 | 0.48 |
| HMS3 | 30 | 0 | 0.37 |
| HMS2 | 30 | 0 | 0.32 |
| ASB17 | 30 | 0 | 0.27 |
| LEX3 | 30 | 0 | 0.25 |
| HMS1 | 30 | 0 | 0.44 |
| CA425 | 30 | 0 | 0.32 |
시제품 제작
17개 프라이머 세트들을 포함하여 폴리머라아제 및 반응완충액의 혼합액, 양성대조군으로 구성되는 시제품을 제작하였다(도 14 참조).
<110> Specialty Lab Solution Co., Ltd.
<120> Primer set for genotyping of horse
<130> PA141105-C01
<160> 34
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHL20F primer for VHL20(microsatellite locus) of horse
<400> 1
caagtcctct tacttgaaga ctag 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHL20R primer for VHL20(microsatellite locus) of horse
<400> 2
aactcaggga gaatcttcct cag 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HTG4F primer for HTG4(microsatellite locus) of horse
<400> 3
ctatctcagt cttgattgca ggac 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HTG4R primer for HTG4(microsatellite locus) of horse
<400> 4
ctccctccct ccctctgttc tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHT4F primer for AHT4(microsatellite locus) of horse
<400> 5
aaccgcctga gcaaggaagt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AHT4R primer for AHT4(microsatellite locus) of horse
<400> 6
gctcccagag agtttaccct 20
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HMS7F primer for HMS7(microsatellite locus) of horse
<400> 7
tgttgttgaa acataccttg actgt 25
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HMS7R primer for HMS7(microsatellite locus) of horse
<400> 8
caaccaggaa actcatgttg ataccatc 28
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 9
gttcactgaa tgtcaaattc tgct 24
<210> 10
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<212> DNA
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<223> HTG6R primer for HTG6(microsatellite locus) of horse
<400> 10
tgcttggagg ctgtgataag at 22
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> AHT5F primer for AHT5(microsatellite locus) of horse
<400> 11
cacggacaca tccctgcctg c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> AHT5R primer for AHT5(microsatellite locus) of horse
<400> 12
tgcaggctaa ggaggctcag c 21
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 13
gaagctgcca gtattcaacc attg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 14
gctccatctt gtgaagtgta actca 25
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gaggtttgta attggaatg 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 16
gagaagtcat ttttaacacc t 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASB2F primer for ASB2(microsatellite locus) of horse
<400> 17
ccactaagtg tcgtttcaga agg 23
<210> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cacaactgag ttctctgata gg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatctgtcac atttgaatta actg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ccacccccgg cacac 15
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<212> DNA
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gaagcagaac atccctcctt gtcg 24
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aagtgtctgg gcagagctgc t 21
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ccatcctcac tttttcactt tgtt 24
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ttgcagtcga atgtgtatta aatg 24
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cggtggcaac tgccaaggaa g 21
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<223> ASB17F primer for ASB17(microsatellite locus) of horse
<400> 27
ggcaccattc aggatctcca ccg 23
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ASB17R primer for ASB17(microsatellite locus) of horse
<400> 28
gatggagggc ggtacctttg tacc 24
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LEX3F primer for LEX3(microsatellite locus) of horse
<400> 29
aaccagtgct gagacttctg ag 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LEX3R primer for LEX3(microsatellite locus) of horse
<400> 30
aaaaaaagga ggaagactgg c 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HMS1F primer for HMS1(microsatellite locus) of horse
<400> 31
catcactctt catgtctgct tgg 23
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HMS1R primer for HMS1(microsatellite locus) of horse
<400> 32
ttgacataaa tgcttatcct atggc 25
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA425F primer for CA425(microsatellite locus) of horse
<400> 33
agctgcctcg ttaattca 18
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA425R primer for CA425(microsatellite locus) of horse
<400> 34
tccgcttgtc tccgggc 17
Claims (5)
- 서열번호 1 내지 34의 프라이머를 포함하는 말 유전자 타이핑용 다중중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction) 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서,
서열번호 1 및 2 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 3 및 4 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 5 및 6 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 7 및 8 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 1의 형광표지물질로 표지되고,
서열번호 9 및 10 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 11 및 12 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 13 및 14 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 15 및 16 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 2의 형광표지물질로 표지되며,
서열번호 19 및 20 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 21 및 22 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 23 및 24 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 25 및 26 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 3의 형광표지물질로 표지되고,
서열번호 27 및 28 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 29 및 30 중 어느 하나 또는 둘, 서열번호 31 및 32 중 어느 하나 또는 둘, 및 서열번호 33 및 34 중 어느 하나 또는 둘의 프라이머가 다음 화학식 4의 형광표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 말 유전자 타이핑용 다중중합효소연쇄반응 프라이머 세트.
- 제 1항 또는 제 2항의 프라이머 세트를 포함하는 말 유전자 타이핑용 조성물.
- 제 3항의 조성물을 포함하는 말 유전자 타이핑용 키트.
- 제 1항 또는 제 2항의 프라이머 세트를 사용하여 다중중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 말 유전자 타이핑 방법.
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| KR1020140168019A KR101677127B1 (ko) | 2014-11-28 | 2014-11-28 | 말 유전자 타이핑용 프라이머 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020140168019A KR101677127B1 (ko) | 2014-11-28 | 2014-11-28 | 말 유전자 타이핑용 프라이머 세트 |
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2014
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