RU2772938C1 - Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии - Google Patents
Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2772938C1 RU2772938C1 RU2021111927A RU2021111927A RU2772938C1 RU 2772938 C1 RU2772938 C1 RU 2772938C1 RU 2021111927 A RU2021111927 A RU 2021111927A RU 2021111927 A RU2021111927 A RU 2021111927A RU 2772938 C1 RU2772938 C1 RU 2772938C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- pcr
- detection
- seq
- amplification
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 208000002382 Cardiomyopathy, Hypertrophic, Familial Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 201000006692 familial hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002513 implantation Methods 0.000 title abstract 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 claims abstract description 30
- 102100006255 CSRP3 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 101700007750 CSRP3 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102220401155 c.191G>T Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 11
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 9
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 7
- 201000009752 monogenic disease Diseases 0.000 description 7
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010061205 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 102100005410 LINE-1 retrotransposable element ORF2 protein Human genes 0.000 description 2
- 229920002393 Microsatellite Polymers 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 206010007554 Cardiac failure Diseases 0.000 description 1
- 206010008479 Chest pain Diseases 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormality Diseases 0.000 description 1
- 210000004292 Cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 208000007322 Death, Sudden, Cardiac Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 210000001308 Heart Ventricles Anatomy 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failure Diseases 0.000 description 1
- 206010020871 Hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 210000004165 Myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004413 Myocytes, Cardiac Anatomy 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 206010049418 Sudden cardiac death Diseases 0.000 description 1
- 206010042772 Syncope Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002317 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 108010023942 cysteine and glycine-rich protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000005287 template synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004642 transportation engineering Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии, предусматривающий выявление наследования патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A, NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu в гене CSRP3. Способ включает двойную систему детекции - прямую и косвенную. Прямую детекцию осуществляют с помощью праймеров для амплификации. Косвенную детекцию осуществляют с помощью праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом, выбранных из SEQ ID N 1-24. Изобретение обеспечивает создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов в гене CSRP3 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. 1 пр.
Description
Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии. Семейная гипертрофическая кардиомиопатия - это наследственное заболевание, характеризующееся патологическим асимметричным утолщением сердечной мышцы, способное привести к инвалидизации и ранней смерти носителя. Семейная гипертрофическая кардиомиопатия встречается с частотой 160-290 на 100000. Это заболевание приводит к гипертрофии, приемущественно, левого желудочка и межжелудочковой перегородки сердца, которая может проявляться загрудинными болями, синкопальными состояниями, одышкой и прочими симптомами сердечной недостаточности, а в некоторых случаях становится причиной внезапной сердечной смерти. При аутосомно-доминантном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 50%.
К заболеванию семейная гипертрофическая кардиомиопатия могут приводить патогенные генетические варианты в гене CSRP3, располагающемся на хромосоме 11. [Geier С, et al. Hum Mol Genet. 2008 Sep 15;17(18):2753-65] Этот ген кодирует белок мышечный LIM-белок, стимулирующий дифференциацию миоцитов (в т.ч. кардиомиоцитов), поддерживающий их цитоскелет и играющий роль в сокращении мышц.
ПГТ семейной гипертрофической кардиомиопатии проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.
Описания близкого технического решения не обнаружено в общедоступных источниках.
Представленный нами метод ПГТ семейной гипертрофической кардиомиопатии решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) в гене CSRP3 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Данный вариант не упоминался ранее в литературе как причина семейной гипертрофической кардиомиопатии. Однако, так как вызываемая этим вариантом утрата функции кодируемого белка представляет собой вероятный механизм патогенеза семейной гипертрофической кардиомиопатии, не встречается у здоровых людей, присутствует у пациентки с клиническим диагнозом гипертрофической кардиомиопатии, поставленном в молодом возрасте (пациентка из семьи, представленной ниже) - он был расценен как патогенный. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена CSRP3 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген CSRP3, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген CSRP3 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант.Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации с помощью ПЦР. В тест-систему были включены 12 STR локусов для гена CSRP3: D11S1981, D11S4138, D11S4130, D11S1888, D11S1310, D11S4096, D11S2368, D11S899, D11S928, D11S1755, D11S4190, D11S4114,. Праймеры для амплификации находятся на 11 хромосоме в районе координат 17488442-20630307 (в соответствии с hg19). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта ПЦР не должна превышать 500 п. н. в первом раунде в гнездовой ПЦР и 350 п. н. в простой ПЦР или 2 м раунде гнездовой ПЦР (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), высокая специфичность праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.
Подготовительный этап ПГТ
На подготовительном этапе проводится проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для ПЦР) с концентрацией 10 mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.
В рамках гнездовой ПЦР для патогенного варианта амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится ПЦР со всеми внешними праймерами для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация фрагмента с внутренними праймерами.
ПЦР
Были подобраны высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов 350 п. н, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. В состав ПЦР смеси входили 1×PCR буфер с Мд2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μΜ каждого праймера, 1 U/μΙ ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μΙ ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи). Для детекции патогенного варианта 1 мкл продукта ПЦР был использован в качестве матрицы для 2 го раунда. Состав смеси и условия амплификации во втором раунде были те же.
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).
Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных
фрагментов (ПЦР-ПДРФ) Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.
Для детекции патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:
Внешние праймеры:
5'-TGCTATGGGAACGAAATGAACTG -3' (Fout)
5'-CATGGCATTGGGAGTGCAAAG-3' (Rout)
Внутренние праймеры:
5'-GGCAGTAACTCACTGTTGGAACT-3' (fin)
5'-CTTTTCCTGGCAGTGGCCTG-3' (rin)
Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза HspAI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза BstDEI разрезает только мутантный аллель варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.
Пример 1
Пациенты А
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием семейная гипертрофическая кардиомиопатия с гетерозиготным носительством патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A (NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu), в гене CSRP3. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания семейная гипертрофическая кардиомиопатия в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.
Гаплотипирование семьи
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 12 STR локусов. Из них 8 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам (аллели, указанные с одной стороны от символа «/», для разных маркеров располагаются на одной хромосоме, то есть составляют группу сцепления): партнер пациентки: D11S4138 - 206/202, D11S4130 - 271/267, D11S1888 - 219/215, D11S1310 - 223/221, D11S4096 - 300/317, CSRP3 -N/N, D11S928 - 277/275, D11S4190 - 204/210, D11S4114 - 223/251; пациентка: D11S4138- 198/188, D11S4130 - 277/269, D11S1888 - 217/226, D11S1310 - 223/221, D11S4096 - 289/257, CSRP3 - N/c.191G>T, D11S928 - 275/279, D11S4190 - 206/204, D11S4114 - 246/223; ребенок без заболевания (не унаследовавший патогенный вариант с. 931С>Т): D11S4138 - 206/198, D11S4130 - 271/277, D11S1888 - 219/217, D11S1310 - 223/223, D11S4096 - 300/289, CSRP3 - N/N, D11S928 - 277/275, D11S4190 - 204/206, D11S4114 - 223/246.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у пациентки с патогенным вариантом были связаны следующие аллели STR-маркеров: D11S4138- 188, D11S4130 - 269, D11S1888 - 226, D11S1310 - 221, D11S4096 - 257, D11S928-279, D11S4190 - 204, D11S4114 - 223;
Преимплантационное генетическое тестирование
В цикле ЭКО было получено 2 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты: эмбрион1: D11S4138-206/188, D11S4130 - 271/269D11S1888 - 219/226, D11S1310 - 223/221D11S4096 - 300/257, CSRP3 - N/c.191G>TD11S928 - 277/279, D11S4190 -204D11S4114-223; эмбрион2: D11S4138 - 202/188, D11S4130 - 267/269, D11S1888 - 215/226, D11S1310 - 221, D11S4096 - 317/257, CSRP3 - N/c.191G>T, D11S928 -275/279, D11S4190-210/204, D11S4114 - 251/223.
По результатам прямой и косвенной диагностики у обоих эмбрионов выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию, и они не были рекомендованы к переносу.
Перечень последовательностей праймеров:
D11S1981
SEQ ID NO 1: 5’-AATTCCTTTACTCCAGAAAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO : 2 5’-(HEX)-CAGATTTCTGCTTTCCCAGA-3’ (Rin),
D11S4138
SEQ ID NO 3: 5’-GTGCTGACCGCTCCAAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 4: 5’-(FAM)-CCAAAGGGGTTAATAGGGGTCCA-3’ (Rin),
D11S4130
SEQ ID NO 5 5’-(HEX)-AGCTCTGGAATCTCATCTTC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 6: 5’-AGCTCATGTGTGAGTCTGTG-3’ (Rin),
D11S1888
SEQ ID NO 7: 5’-(HEX)-CCCCAGTACCCTGTATAGGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 8 5’-CACTTGTGTGTTTGTATCGAGTCA-3’ (Rin),
D11S1310
SEQ ID NO 9 5’-GGCCTGGGAAACATCC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 10: 5’-(FAM)-ACTTCCAGTAGGTAGGGG-3’ (Rin),
D11S4096
SEQ ID NO 11: 5’-(FAM)-TTAGGATTCACGGGCA-3’ (Fin);
SEQ ID NO 12: 5’-AGCTAATACATAGTGTAGCAGGG-3’ (Rin),
D11S2368
SEQ ID NO 13: 5’-AAAAAAGACTATGAAGTGGGTAGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 14: 5’-(FAM)-CTGTTTCTACAGTGCATTGTATACG-3’ (Rin),
D11S899
SEQ ID NO 15: 5’-(FAM)-CAGGAGGCAGACACAAGGAC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 16 5’-GAATTGGATTCTCTGGGGAG-3’ (Rin),
D11S928
SEQ ID NO 17: 5’-(HEX)-AAGTGATCCACCTGCCTTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 18 5’-GCCTCTGAGAATTAGTGTCTGTC-3’ (Rin),
D11S1755
SEQ ID NO 19: 5’-AAGAGCCCAGAGTGAAAAT-3’ (Fin);
SEQ ID NO 20: 5’-(FAM)-TCTTTGCATGTACCCCATA-3’ (Rin),
D11S4190
SEQ ID NO 21: 5’-GATAATGGTTTGTGGTTGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO 22: 5’-(HEX)-ACTCTCTATGGAACCCCC-3’ (Rin),
D11S4114
SEQ ID NO 23: 5’-GATCCAGTCAACATGCTCAG-3’ (Fin);
SEQ ID NO 24: 5’-(HEX)-ATGGAACTAGGACACTATTTAACCC-3’ (Rin)
Claims (8)
- Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии, предусматривающий выявление наследования патогенного варианта NC_000011.9:g.19209773C>A, NM_003476.5:c.191G>T, p.Arg64Leu в гене CSRP3, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную, где прямую детекцию осуществляют с помощью праймеров для амплификации:
- внешние праймеры:
- 5'-TGCTATGGGAACGAAATGAACTG-3' (Fout)
- 5'-CATGGCATTGGGAGTGCAAAG-3' (Rout),
- внутренние праймеры:
- 5'-GGCAGTAACTCACTGTTGGAACT-3' (Fin)
- 5'-CTTTTCCTGGCAGTGGCCTG-3' (Rin),
- а косвенную детекцию осуществляют с помощью праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа (STR), сцепленных с патогенным вариантом, выбранных из SEQ ID N 1-24, при этом используют праймеры, направленные на те STR, аллели которых разные на всех хромосомах родителей, где внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратный праймер), а внутренние праймеры как Fin (прямой праймер) и Rin (обратный праймер), при этом диагностику проводят в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводят мультиплексную ПЦР с внешними праймерами, на втором этапе проводят индивидуальную ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами для STR, а также метод ПЦР-ПДРФ для определения патогенного варианта гена CSRP3.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2772938C1 true RU2772938C1 (ru) | 2022-05-27 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009027695A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Scottish Health Innovations Limited | Genetic analysis |
ES2317713B1 (es) * | 2004-06-07 | 2009-12-01 | Universidade Da Coruña | Metodo para diagnosticar o determinar la predisposicion genetica a desarrollar miocardiopatia hipertrofica. |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2317713B1 (es) * | 2004-06-07 | 2009-12-01 | Universidade Da Coruña | Metodo para diagnosticar o determinar la predisposicion genetica a desarrollar miocardiopatia hipertrofica. |
ES2339841B1 (es) * | 2004-06-07 | 2011-02-28 | Universidade Da Coruña | Metodo para diagnosticar o determinar la predisposicion genetica a desarrollar miocardiopatia hipertrofica. |
WO2009027695A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Scottish Health Innovations Limited | Genetic analysis |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ВАТУТИН Н.Т. и др. Гипертрофическая кардиомиопатия: генетические изменения, патогенез и патофизиология. Российский кардиологический журнал. 2014; 5(109): 35-42. GEIER C. et al. Beyond the sarcomere: CSRP3 mutations cause hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 2008 Sep 15; 17(18): 2753-65. VAN TILBORG A.A.G. et al. Selection of Microsatellite Markers for Bladder Cancer Diagnosis without the Need for Corresponding Blood. PLoS ONE. 2012; 7(8): e43345. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2973165A1 (en) | System for amplification of a fetal dna species | |
KR101777161B1 (ko) | 개의 고관절이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 멀티플렉스 단일염기다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법 | |
US20100092959A1 (en) | Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia | |
WO2017112738A1 (en) | Methods for measuring microsatellite instability | |
KR20110094041A (ko) | 정상 안압 녹내장 질환 감수성 유전자 및 그 이용 | |
Capucchio et al. | Degenerative myelopathy in German Shepherd Dog: comparison of two molecular assays for the identification of the SOD1: c. 118G> A mutation | |
KR20130041767A (ko) | 정상 안압 녹내장 질환 감수성 유전자 및 그 이용 | |
RU2772938C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии | |
RU2777084C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования семейной фокальной эпилепсии 1 типа | |
RU2777091C1 (ru) | Способ преимплатационного генетического тестирования рака молочной железы и яичников | |
RU2671156C1 (ru) | Способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии типа 1 | |
RU2795796C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования Гемофилии А | |
RU2777081C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Луи-Бара | |
RU2777086C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования буллезного эпидермолиза | |
RU2791878C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования несиндромальной нейросенсорной тугоухости | |
RU2795824C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования наследственных множественных остеохондром типа 1 | |
RU2799538C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования Блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2 | |
RU2775416C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования миодистрофии Дюшенна-Беккера | |
RU2792147C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони | |
RU2769300C1 (ru) | Тест-система для преимплантационного генетического тестирования спиноцеребеллярной атаксии 1 типа | |
KR102269653B1 (ko) | 고양이의 골연골이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 단일염기 다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법 | |
RU2777078C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования муковисцидоза | |
RU2742956C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования метахроматической лейкодистрофии | |
TW201311908A (zh) | 診斷犬之青光眼的方法及套組 | |
RU2816650C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица |