ES2339841B1 - Metodo para diagnosticar o determinar la predisposicion genetica a desarrollar miocardiopatia hipertrofica. - Google Patents
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Abstract
Método para diagnosticar o determinar la
predisposición genética a desarrollar miocardiopatía
hipertrófica.
El método para diagnosticar o determinar la
predisposición genética de un sujeto a desarrollar miocardiopatía
hipertrófica (MCH), tanto familiar como esporádica, se basa en la
identificación de mutaciones puntuales en el gen MYH7, que codifica
la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociadas con
el desarrollo de MCH. Dicho método constituye una herramienta de
diagnóstico útil que es particularmente importante cuando se
estudian sujetos asintomáticos con sospecha de tener la enfermedad.
Los sujetos sintomáticos pueden ser diagnosticados por un médico.
Los sujetos asintomáticos procedentes de familias con una historia
de MCH pueden ser estudiados selectivamente usando este método lo
que permite disponer de un diagnóstico antes de la aparición de la
enfermedad. A los individuos que posean la mutación asociada con la
enfermedad se les pueden aconsejar pautas de comportamiento
apropiadas.
Description
Método para diagnosticar o determinar la
predisposición genética a desarrollar miocardiopatía
hipertrófica.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se relaciona con un método para
determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a
desarrollar miocardiopatía hipertrófica o para diagnosticar un
sujeto de dicha enfermedad, basado en un ensayo genético,
extracorpóreo, de una muestra biológica procedente de dicho sujeto,
que comprende detectar la presencia o ausencia de una mutación
puntual de un nucleótido, asociada con dicha enfermedad, en el gen
MYH7 que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca
humana.
La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una
enfermedad autosómica dominante que representa un grupo heterogéneo
de enfermedades del músculo cardíaco cuyos síntomas y
manifestaciones clínicas incluyen grados variables de hipertrofia y
alteración de la función sistólica y diastólica. La MCH puede ser
familiar (MCHF) o esporádica (MCHE). Los individuos afectados por
dicha enfermedad pueden ser sintomáticos o asintomáticos. La
prevalencia es de aproximadamente 1/500 en la población general y la
consecuencia más seria es la muerte súbita de los individuos
portadores y aparentemente sanos.
La MCHF es una enfermedad hereditaria del
músculo cardíaco que se caracteriza por un incremento en la masa
ventricular y una alteración de la función sistólica y diastólica.
La patología de la MCHF es el resultado de las consecuencias
fisiológicas de la alteración de la función sistólica y diastólica,
y sus características patológicas están bien establecidas (Marón BJ
& Epstein SE. 1980. Amer. J. Cardiol.
45:141-154; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a
textbook of cardiovascular medicine. WB Saunders; Philadelphia. p
1404). Además del hallazgo clásico del engrosamiento asimétrico del
septo interventricular también puede observarse la hipertrofia de la
pared anterior del ventrículo izquierdo y del apex cardíaco. La
distribución anatómica y la severidad de la hipertrofia pueden ser
muy variables. Con frecuencia se observa fibrosis en el ventrículo
hipertrofiado y en la región del septo.
La mayoría de las anormalidades histológicas
características de la MCHF tienen que ver con la desorganización de
las miofibrillas en los miocitos. Los miocitos pueden hipertrofiarse
hasta diez o veinte veces el diámetro normal de una célula cardíaca
(Becker AE. 1989. Pathology of Cardiomyopathies, en
Cardiomyopathies: Clinical Presentation, Differential Diagnosis, and
Management, Shaver JA ed., F. A. Davis Co., New York, pp.
9-31; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a textbook
of cardiovascular medicine.WB Saunders; Philadelphia. p 1404).
Actualmente se admite que la MCH es el resultado
de mutaciones en genes que codifican las proteínas del aparato
contráctil. De hecho, entre las posibles causas de dicha enfermedad,
se reconoce la existencia de mutaciones en los siguientes genes:
cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana (MYH7); Proteína de
unión a la miosina (MYBPC3); Troponina T (TNNT2); Troponina I
(TNNI3); Troponina C (TNNC1); Alfa tropomiosina (TPM1), Cadena
reguladora ligera de la miosina (MYL2); Cadena ligera esencial de la
miosina (MYL3), Actina cardíaca alfa (ACTC) (Richard P et al;
2003 Circulation. 107(17):2227-32); Titina
(TTN) (Satoh et al. 1999. Biochem Biophys Res Commun
262, 411); Cadena pesada de la alfa miosina (MYH6) (Tanigawa et
al. 1990.) Cell 62,991); Sub-unidad no
catalítica gamma 2, activada por AMP, de la proteína kinasa (PRKAG2)
(Gollob et al. (2001) N Engl J Med 344, 1823; Blair
et al. 2001 Hum Mol Genet 10, 1215); Quinasa 2 de la
cadena ligera de la miosina (MYLK2) (Davis et al. 2001
Cell 107, 631); Genoma mitocondrial (Arbustini et al.
Heart 1998; 80:548-58).
Diversos análisis genéticos han permitido
identificar mutaciones en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada
de la beta miosina cardíaca humana, asociadas a la aparición de MCHF
(Seidman CE & Seidman JG. 1991. Mol. Biol. Med.
8:159-166; Tanigawa et al. 1990. Cell
62:991-998; Geisterfer-Lowrance
et al. 1990. Cell 61:999-1006), habiéndose
identificado más de 100 mutaciones causantes de MCHF
(http://www.cardiogenomics.org).
Actualmente el diagnóstico de la MCHF se basa en
los datos clínicos, fundamentalmente el ecocardiograma. Sin embargo,
este sistema no permite detectar los casos de muerte súbita que, en
general, están provocados por la presencia de una mutación en alguno
de los genes implicados. Como es conocido, la MCHF es la primera
causa de muerte súbita en personas jóvenes y, dada su prevalencia
(1/500), puede estimarse que el número de portadores de alguna de
las mutaciones responsables de dicha enfermedad en nuestro país se
acerca a las 75.000 personas.
El gran tamaño de los genes relacionados hasta
la fecha con la aparición de MCH, por ejemplo, el gen MYH7 (28.425
pares de bases) dificulta en gran medida la identificación de
mutaciones asociadas con MCH. Esta invención proporciona un método
sencillo y rápido para la identificación de algunas mutaciones en el
gen MYH7 que pueden ser causa de MCH.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de una nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada
con una mayor predisposición de que el sujeto que la porta
desarrolle MCH. La nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada
con el desarrollo o la predisposición a desarrollar MCH identificada
en esta invención es la mutación Lys1459Asn, la cual se definirá
detalladamente más adelante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La identificación de la presencia de dicha
mutación en el gen MYH7 en un sujeto con MCH permite tomar medidas
preventivas en el caso de los portadores, tales como ejercicio,
medicación, consejo genético, etc. En los casos en los que se
identifiquen mutaciones consideradas de alto riesgo podrán tomarse
medidas adicionales tales como la implantación de un desfibrilador
con el fin de evitar la muerte súbita del sujeto portador de tales
mutaciones.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un método para determinar in vitro la
predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH que comprende
analizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica
procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o ausencia de
una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que
dicha mutación es Lys1459Asn.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método de diagnóstico in vitro de MCH que comprende
obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha
muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto
de MCH mediante la detección de la presencia de una mutación puntual
en el gen MYH7, en el que dicha mutación es Lys1459Asn, como
indicador de la enfermedad.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método no invasivo para diagnosticar MCH en un sujeto que
comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de
dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha
muestra de sangre que comprende, al menos, una de las regiones del
gen MYH7 en donde se encuentra la mutación puntual responsable de
dicha mutación Lys1459Asn, y diagnosticar el sujeto de MCH mediante
la detección de la presencia o ausencia de, al menos, dicha
mutación, como indicador de la enfermedad.
La invención proporciona, por tanto, un método
para determinar in vitro la predisposición genética de un
sujeto a desarrollar MCH, o para diagnosticar un sujeto de MCH, bien
sea familiar (MCHF) o esporádica (MCHE), basado en la detección de
una nueva mutación puntual en el gen MYH7 relacionada con la
aparición de dicha enfermedad. La detección de la mutación en una
persona con riesgo o predisposición genética de desarrollar MCH
puede realizarse de forma relativamente sencilla y rápida usando el
método proporcionado por esta invención.
El método proporcionado por esta invención
constituye una herramienta útil de diagnóstico y/o pronóstico que
resulta particularmente importante cuando se aplica sobre sujetos
asintomáticos de los cuales se sospecha que pueden tener la
enfermedad. Los sujetos sintomáticos tienen muchas más
probabilidades de ser diagnosticados adecuadamente por un médico.
Los sujetos asintomáticos de familias que tengan una historia de
MCHF podrían ser diagnosticados usando el método de esta invención
lo que permitiría su diagnóstico antes de la aparición de los
síntomas. A los sujetos en los que se detecte una mutación
responsable de MCHF se les puede aconsejar unas pautas de
comportamiento que probablemente prolonguen su vida; por ejemplo,
evitar el ejercicio intenso, medicación, etc., y, en su caso,
implantarles un desfibrilador.
Para facilitar la comprensión de la invención
objeto de esta solicitud de patente, se expone, a continuación, el
significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan
en el contexto de la presente invención.
El término "MCH" se refiere a la
miocardiopatía hipertrófica e incluye la miocardiopatía hipertrófica
familiar (MCHF) y la miocardiopatía hipertrófica esporádica
(MCHE).
El término "predisposición genética" se
refiere a la probabilidad de que un sujeto desarrolle una patología
determinada (en este caso, MCH); a modo ilustrativo, un sujeto con
una predisposición genética elevada tendrá más probabilidades que la
media para desarrollar dicha patología, mientras que un sujeto con
una predisposición genética reducida tendrá menos probabilidades que
la media para desarrollar dicha patología.
El término "sujeto" se refiere a un ser
humano, de sexo masculino o femenino, de cualquier raza o edad.
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no
covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones
post-traduccionales, por ejemplo glicosilación,
fosforilación o acetilación. Los términos "péptido" y
"polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos
que representan un fragmento proteico. Los términos "proteína",
"péptido" y "polipéptido", se usan indistintamente.
El término "MYH7" se refiere al gen que
codifica la proteína denominada "cadena pesada de la beta miosina
cardíaca humana". La secuencia de nucleótidos del gen MYH7 es
conocida [Jaenicke T et al. 1990. Genomics
8:194-206; NCBI, número de acceso M57965, versión
M57965.2 (GI: 24429600)].
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "DNA" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una
secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de mRNA.
El término "RNA" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "mRNA" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se
traduce a proteínas.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos
(DNA).
El término "mutación puntual" se refiere a
un SNP (single nucleotide polymorphism), es decir, una variante en
una única base de una secuencia de nucleótidos determinada.
Para la nomenclatura de las mutaciones puntuales
se han seguido las recomendaciones contenidas en las siguientes
referencias: (i) den Dunnen JT, Antonarakis SE. 2000. Mutation
nomenclature extensions and suggestions to describe complex
mutations: a discussion. Hum Mutat.
15(1):7-12; y (ii) Antonarakis SE.
Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations.
Nomenclature Working Group. Hum Mutat. 11(1):
1-3.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona, en general, un método
para evaluar in vitro la predisposición genética de un sujeto
a desarrollar MCH. Dicho método permite identificar aquellos sujetos
que, dentro de un grupo o población de sujetos, presentan una mayor
predisposición genética de desarrollar MCH. Dicho método puede
utilizarse tanto con fines de diagnóstico (método de diagnóstico)
como con fines de pronóstico (método de pronóstico). Un método de
diagnóstico se refiere a un ensayo realizado sobre un sujeto al que
previamente se le ha determinado su pertenencia a un grupo de riesgo
de padecer MCH debido a que presente síntomas o a los resultados de
otro análisis diferente. Un método de pronóstico se refiere a un
método que ayuda a predecir, al menos en parte, el posible
desarrollo de la MCH en un sujeto. A modo ilustrativo, se puede
analizar un sujeto al que previamente no se le ha diagnosticado MCH,
o que carece de síntomas, con el fin de obtener información sobre la
probabilidad de que dicho individuo desarrolle MCH.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se
relaciona con un método para determinar in vitro la
predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH que
comprende analizar el ácido nucleico contenido en una muestra
biológica procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o
ausencia de una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH,
en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH, en adelante
mutación puntual de la invención, es la mutación Lys1459Asn.
En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos del gen MYH7 comprende la SEQ. ID. NO: 1. En este caso,
el cambio de nucleótidos relacionado con la mutación puntual de la
invención es el siguiente:
| Mutación | Cambio del nucleótido | |
| Lys1459Asn | 22146G>T |
La presencia de dicha mutación puntual de la
invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica
procedente del sujeto ensayado es indicativa de la existencia de una
mayor predisposición genética de dicho sujeto a desarrollar MCH que
la media, o de que dicho sujeto puede ser diagnosticado de MCH o de
que dicho sujeto ha desarrollado MCH.
La puesta en práctica de dicho método comprende
la obtención previa de una muestra biológica del sujeto a ensayar y
analizar el ácido nucleico contenido en dicha muestra biológica para
detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la
invención mediante cualquier método apropiado para detectar tales
mutaciones.
La muestra biológica procedente del sujeto a
ensayar puede ser cualquier muestra biológica de dicho sujeto que
contenga ácido nucleico. El ácido nucleico presente en dicha muestra
biológica puede ser DNA, por ejemplo, DNA genómico (gDNA) o cDNA, o
RNA, por ejemplo, mRNA. Para analizar gDNA se puede utilizar
prácticamente cualquier muestra biológica que contenga gDNA, por lo
que muestras puras de eritrocitos de mamíferos no pueden ser
utilizadas. Asimismo, para analizar cDNA o mRNA la muestra biológica
debe ser obtenida de células o tejidos que expresen MYH7. A modo
ilustrativo, la muestra biológica que contiene ácido nucleico
procedente del sujeto a ensayar puede ser una muestra de tejido o de
sangre de dicho sujeto. En una realización particular, dicha muestra
biológica se obtiene a partir de células nucleadas de sangre
periférica del sujeto a ensayar.
El ácido nucleico contenido en la muestra
biológica procedente del sujeto a ensayar puede ser aislado por
métodos convencionales mediante el empleo de kits comerciales que
permiten el aislamiento de ácidos nucleicos. Algunos de los sistemas
comerciales para la extracción de ácidos nucleicos están
comercializados por diversas compañías, tales como Qiagen y Amersham
Biosciences, por citar dos ejemplos. Los protocolos de extracción
están bien establecidos en los manuales de instrucciones que se
ofrecen junto con los kits de extracción de ácidos nucleicos
suministrados por las empresas mencionadas.
Muchos de los métodos aquí descritos para
detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual de la
invención requieren la amplificación de la secuencia diana del ácido
nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a
ensayar, por ejemplo, la amplificación previa de un fragmento del
gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la
presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención.
Dicha amplificación puede realizarse por
cualquier técnica conocida, preferentemente, mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o cualquiera de sus variantes, por
ejemplo, PCR anidada o nested-PCR. Información sobre
la realización de PCR y sus variantes puede encontrarse en las
patentes norteamericanas US 4.965.188, US 4.800.159, US 4.683.202 y
US 4.683.195, así como en las publicaciones de Ausubel et al.
eds. Shorts Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, Wiley,
1995; e Innis et al., eds., PCR Protocols, Academic Press,
1990.
Otros métodos de amplificación incluyen la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Wu & Wallace. 1989.
Genomics 4:560-569; Landegren et al. 1988.
Science 241:1077-1080), la amplificación por
desplazamiento de banda (G. Walker et al. 1992. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:392-396; G. Walker et al.
1992. Nucleic Acid Res. 20:1691-1696), la
amplificación basada en la transcripción (D. Kwoh et al.
1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), la
replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) (J.
Guatelli et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874-1878), el sistema de la replicasa Q\beta
(P. Lizardi et al. 1988. BioTechnology
6:1197-1202), la amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico (NASBA) (R. Lewis. 1992. Genetic
Engineering News 12(9): 1) y la amplificación por la
polimerasa del fago phi29 (L. Blanco et al. 1989. J Biol
Chem. 264:8935-8940).
La presencia o ausencia de la mutación puntual
de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra
biológica procedente del sujeto a ensayar se puede detectar por
métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de sondas de
oligonucleótidos marcadas con un grupo marcador detectable o
mediante reacciones enzimáticas específicas.
En una realización particular, la determinación
de la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en
el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del
sujeto a ensayar se realiza mediante el empleo de una sonda de
oligonucleótidos específica marcada con un grupo marcador
detectable. Se han descrito numerosos ensayos que utilizan sondas
marcadas, los cuales pueden ser utilizados en la puesta en práctica
de la presente invención (véanse, por ejemplo, las patentes
norteamericanas US 4.302.204, US 4.358.535, US 4.563.419 o US
4.994.373). A modo ilustrativo, en una realización concreta, dicha
mutación puntual de la invención se detecta mediante el empleo de
una sonda de nucleótidos fijada sobre un soporte sólido, en donde
dicha sonda de nucleótidos se selecciona entre una sonda de
nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia
normal de nucleótidos que codifica la cadena pesada de la beta
miosina cardíaca humana o a un fragmento de la misma que contiene la
región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de mutación
puntual, y una sonda de nucleótidos que es completamente
complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica para una
cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana mutada (portadora
de la mutación a detectar) o a un fragmento de la misma que contiene
la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de
mutación puntual, y detectar la presencia o ausencia de
hibridación.
hibridación.
En otra realización particular, la determinación
de la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en
el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del
sujeto a ensayar se realiza mediante una reacción enzimática
específica para detectar polimorfismos, por ejemplo, mediante
digestión con enzimas de restricción y análisis de los fragmentos de
restricción (RFLP) (véanse, por ejemplo, las patentes
norteamericanas US 5.324.631 y US 5.645.995). A modo ilustrativo, la
mutación puntual de la invención puede ser detectada mediante el uso
de una enzima de restricción que reconoce específicamente el
nucleótido donde reside la mutación puntual asociada a la MCH,
verificándose posteriormente la presencia o ausencia de corte de
dicha enzima de restricción mediante la separación de los fragmentos
de restricción por electroforesis en un gel de agarosa o
poliacrilamida (véanse los Ejemplos que acompañan a esta
descripción).
Otras técnicas apropiadas para detectar la
mutación puntual de la invención incluyen la secuenciación directa
de nucleótidos (Ausubel et al. eds. Shorts Protocols in
Molecular Biology, 3rd edition, Wiley, 1995; Sambrook et al.
1989. Molecular Cloning 2^{nd} ed. Chap. 13, Cold Spring Harbor
Laboratory Press), que puede realizarse por cualquier método
apropiado, por ejemplo, mediante el método de secuenciación de
didesoxinucleótidos (Sanger), secuenciación química (Maxam &
Gilbert) o variantes de los mismos; minisecuenciación directa (US
5.846.710, US 5.888.819, Syvanen et al. 1993, Am. J. Hum.
Genet. 52:46-59, Shumaker et al. 1996. Human
Mut. 7:346-354, Pastinen et al. 1997. Genome
Res. 7:606-614); ensayos de hibridación en array,
por ejemplo, el ensayo múltiple de diagnóstico específico de alelo
(MASDA) (US 5.834.181; Shuber et al. 1997. Hum. Molec. Genet.
6:337-347); ensayos dependientes de discriminación
de alelos basada en hibridación utilizando, por ejemplo, sondas
TaqMan (US 5.962.233; Livak et al. 1995. Nature Genet.
9:341-342) o Molecular Beacons (US 5.925.517, Tyagi
et al., Nature Biotech, 16:49-53);
electroforesis en gel diagonal de fragmentos de restricción
dispuestos en placas de microtitulación (MADGE) (Day &
Humpohries. 1994. Anal. Biochem. 222:389-395),
transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) (US
5.945.283, Chen et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:10756-10761).
La relación de métodos para detectar mutaciones
puntuales previamente mencionada es únicamente ilustrativa y no
pretende ser exhaustiva. Los expertos en la materia entenderán que
cualquier otro método que permita detectar una mutación puntual o un
SNP puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente
invención y cae dentro del espíritu de la misma.
Adicionalmente, si se desea, se puede detectar
si el sujeto es heterozigótico u homozigótico para una mutación
puntual determinada, es decir, detectar la presencia o ausencia de
dichas mutaciones puntuales en ambos cromosomas del sujeto. En
general, la presencia de 2 copias de la misma mutación puntual
asociada a MCH (es decir, individuos homozigóticos para dicha
mutación puntual) puede indicar un mayor riesgo de desarrollar MCH
que en un individuo heterozigótico para dicha mutación puntual.
La mutación puntual de la invención se ha
identificado mediante un ensayo (Ejemplo 1) consistente en la
amplificación previa, mediante PCR, de una secuencia diana del gen
MYH7 contenido en una muestra de ácido nucleico presente en una
muestra de sangre periférica de un sujeto diagnosticado de MCH,
seguido de un análisis de polimorfismo conformacional de una hebra
(SSCP) y secuenciación directa de los productos de amplificación que
mostraron un patrón de movilidad anormal en el gel de SSCP bajo
cualquiera de las condiciones ensayadas. La confirmación de la
mutación puntual se realizó mediante un análisis RFLP o mediante el
diseño de iniciadores degenerados específicos para la mutación
puntual en cuestión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método de diagnóstico in vitro de MCH que comprende
obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha
muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto
de MCH mediante la detección de la presencia de la mutación puntual
de la invención en dicho ácido nucleico, es decir, de la mutación
Lys1459Asn.
Este método comprende, por tanto, la obtención
de una muestra biológica que contiene ácido nucleico del sujeto a
ensayar y analizar el ácido nucleico presente en dicha muestra
biológica para detectar la presencia o ausencia de la mutación
puntual de la invención mediante cualquier método apropiado para
detectar tal mutación. La muestra biológica procedente del sujeto
debe presentar las mismas características que las mencionadas
previamente en relación con el método in vitro para
determinar la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH
previamente descrito. Generalmente, antes de proceder a detectar la
presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención se
procede a amplificar la secuencia diana del ácido nucleico presente
en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar, es decir, a
amplificar un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en
donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la mutación
puntual de la invención. Dicha amplificación puede realizarse por
cualquiera de las técnicas conocidas mencionadas previamente, por
ejemplo, mediante PCR o cualquiera de sus variantes. El análisis del
ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia de la mutación
puntual de la invención asociada con la MCH se puede realizar por
cualquiera de las técnicas previamente mencionadas. La existencia de
la mutación puntual de la invención en el ácido
nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto ensayado permite diagnosticar al sujeto de MCH.
nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto ensayado permite diagnosticar al sujeto de MCH.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método no invasivo para diagnosticar MCH en un sujeto que
comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de
dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha
muestra de sangre que comprende, al menos, la región del gen MYH7 en
donde se encuentra la mutación puntual de la invención asociada a
MCH, es decir, la mutación Lys1459Asn, y diagnosticar el sujeto de
MCH mediante la detección de la presencia o ausencia de dicha
mutación puntual de la invención en dicho fragmento de ácido
nucleico.
En una realización particular, dicho método
comprende la obtención de una muestra de sangre, por ejemplo, de
sangre periférica, del sujeto a ensayar, la amplificación de un
fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que
comprende, al menos, la región del gen MYH7 en donde puede
encontrarse la mutación puntual de la invención, analizar la
presencia o ausencia de dicha mutación puntual de la invención, y,
en su caso, diagnosticar al sujeto de MCH. Tanto la amplificación
del ácido nucleico como su análisis para detectar la presencia o
ausencia de la mutación puntual de la invención se pueden realizar
mediante cualquiera de los métodos previamente descritos.
Adicionalmente, si se desea, dicho método comprende la evaluación de
los síntomas clínicos de la MCH en el sujeto que está siendo
estudiado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit, en particular, un kit útil para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar MCH o para diagnosticar un
sujeto de MCH, que comprende, al menos, un reactivo específico para
detectar la presencia o ausencia de, al menos, la mutación puntual
de la invención, es decir, la mutación Lys1459Asn.
En una realización particular, dicho reactivo
específico para detectar la presencia o ausencia de la mutación
puntual de la invención en el gen MYH7 que codifica para la proteína
cadena pesada de la beta miosina cardiaca humana, es una sonda de
oligonucleótidos que permite distinguir el alelo que contiene una G
en la posición 22146 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una
T en dicha posición.
En otra realización particular, dicho kit
comprende, al menos, una enzima de restricción que permite
distinguir el alelo que contiene una G en la posición 22146 de la
SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una T en dicha posición, tal
como, por ejemplo, la enzima de restricción Tsp509I.
En otra realización particular, el kit
proporcionado por esta invención comprende, al menos, un
oligonucleótido iniciador útil para la amplificación de un fragmento
de ácido nucleico, tal como un fragmento del gen MYH7 que comprende
la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la
mutación puntual de la invención. En una realización particular,
dicho oligonucleótido iniciador se selecciona del grupo formado por
los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 64,
SEQ. ID. NO: 65, y sus mezclas. Dichos oligonucleótidos iniciadores
constituyen un aspecto adicional de la presente invención.
Los oligonucleótidos iniciadores identificados
como SEQ. ID. NO: 64 (directo) y SEQ. ID. NO: 65 (inverso) permiten
amplificar un fragmento correspondiente al exón 32 del gen MYH7 útil
para identificar la mutación Lys1459Asn (22146G>T).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un biochip, en particular, un biochip útil para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar MCH o para diagnosticar un
sujeto de MCH, que comprende, al menos, un reactivo específico para
detectar la presencia o ausencia de, al menos, la mutación puntual
de la invención, es decir, la mutación Lys1459Asn en el gen MYH7,
soportado sobre un soporte sólido.
En una realización particular, el reactivo
específico para detectar la presencia o ausencia de la mutación
puntual de la invención, en particular, en la secuencia de
nucleótidos del gen MYH7 que codifica la cadena pesada de la beta
miosina cardiaca humana, es dicha sonda previamente mencionada en
relación con el kit.
En otra realización particular, dicho biochip
comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la
amplificación de un fragmento de ácido nucleico, tal como un
fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea
estudiar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la
invención. En una realización particular, dicho oligonucleótido
iniciador se selecciona del grupo formado por los oligonucleótidos
iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 64, SEQ. ID. NO: 65, y
sus mezclas.
Dicho biochip puede contener, además de, al
menos uno de dichos oligonucleótidos iniciadores identificados como
SEQ. ID. NO: 64, SEQ. ID. NO: 65, uno o más oligonucleótidos
iniciadores seleccionados entre los identificados como SEQ. ID. NO:
1-SEQ. ID. NO: 63 y SEQ. ID. NO:
66-SEQ. ID. NO: 85. Estos oligonucleótidos
iniciadores amplifican fragmentos incluidos en distintos exones del
gen MYH7 (Tabla 1).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los miembros de las familias fueron evaluados
mediante exploración física, electrocardiograma de 12 derivaciones y
ecocardiografía de dos dimensiones. El diagnóstico de MCH se basó en
la demostración de la existencia de engrosamiento ventricular y del
septo superior al 112% del valor normal en ausencia de hipertensión
arterial. Se confeccionó un árbol genealógico de cada paciente y a
los familiares de primer grado se les ofreció la posibilidad de
acudir a consulta. Se revisaron las historias clínicas de los
familiares fallecidos en los casos en los que fue posible. En los
casos índice y familiares vivos, previo consentimiento informado se
recogieron muestras de sangre periférica para extracción y
conservación de ADN.
Los oligonucleótidos iniciadores utilizados para
amplificar distintos fragmentos del gen MYH7 son los indicados en la
Tabla 1 (mostrada antes).
Se utilizó la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias del gen MYH7 a
partir del DNA obtenido de una muestra de sangre periférica
procedente de sujetos enfermos (pacientes) de MCH. Los iniciadores
usados se relacionan listan en la Tabla 1.
Las reacciones de amplificación se llevaron a
cabo en un volumen final de 50 \muL con 500 ng de DNA en una
mezcla de Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM,
MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada dNTP, 0,2 \muM de cada
desoxinucleótido y 1,5 unidades de Taq DNA polimerasa (QIAGEN). Las
condiciones de la PCR fueron de un ciclo de desnaturalización a 95ºC
durante 10 minutos, seguido de 35 ciclos: desnaturalización a 94ºC
durante 1 minuto, hibridación entre 58ºC y 65ºC durante 1 minuto y
elongación a 74ºC durante 1 minuto; al final de dichos ciclos se
realizó una extensión a 72ºC durante 5 minutos.
Se realizó un análisis SSCP de los productos de
PCR en un sistema GenePhor (Pharmacia) siguiendo las indicaciones
del fabricante. Todas las muestras se corrieron bajo 2 condiciones
de temperatura (12ºC y 20ºC) y 2 condiciones de pH (8,3 y 9). Se
usaron los iniciadores de la Tabla 1.
Se realizó secuenciación directa del producto de
PCR de todas las muestras que mostraron un patrón de movilidad
anormal en el gel de SSCP bajo cualquiera de las condiciones
estudiadas. En todos los casos se realizó la secuencia con el
iniciador directo e inverso mediante secuenciación automática en un
equipo Beckman CQ 2000XL y se siguieron las instrucciones del
fabricante. Se usaron los iniciadores que figuran en la Tabla 1.
La reacción de secuenciación se llevó a cabo en
un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos
del kit CEQ2000 Dye terminator Cycle Sequencing con Quick Start de
Beckman (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, EEUU) y los iniciadores de
la Tabla 1. Los fragmentos generados por la reacción de
secuenciación se analizaron en un secuenciador automático CEQ 2000XL
DNA Analysis System de Beckman. Los cambios observados en la
secuencia se confirmaron mediante secuenciación automática de un
segundo producto de PCR de la misma muestra. La confirmación
posterior en dicho segundo producto de PCR de la misma muestra se
llevó a cabo mediante el corte del producto de PCR con una enzima de
restricción específica (RFLP) o mediante el diseño de un iniciador
degenerado específico para la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la familia VP se encontró la mutación
22146G>T, es decir, un cambio de G (guanina) por T (timina) en el
nucleótido 22146 (según la secuencia del gen MYH7 depositada en la
NCBI con el número de acceso M57965, versión M57965.2 (GI:
24429600)] lo que provoca un cambio de Usina (Lys) a asparragina
(Asn) en el aminoácido 1459 de la cadena pesada de la beta miosina
cardíaca humana (Lys 1459Asn).
Esta mutación "missense" crea una diana de
corte para la enzima de restricción Tsp509I que no está normalmente
presente en el exón 32 lo que proporciona un método independiente
para realizar el diagnóstico genético. Se amplificó la secuencia
correspondiente al exón 32 del gen MYH7 a partir de DNA genómico
obtenido de sangre periférica. Se usaron como iniciadores los
oligonucleótidos identificados mediante la SEQ. ID. NO: 64 y la SEQ.
ID. NO: 65. El producto de PCR se digirió con Tsp509I y
posteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa. La
secuencia normal producía un 1 fragmento de 280 pb. La secuencia
mutada presentaba un sitio de corte para Tsp509I y daba lugar a dos
fragmentos de 192 y 88 pb, respectivamente.
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<110> UNIVERSIDADE DA CORUÑA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR O
DETERMINAR LA PREDISPOSICIÓN GENÉTICA A DESARROLLAR MIOCARDIOPATÍA
HIPERTRÓFICA
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28452
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 3 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagccagc ttctgctcac t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 3 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactctcaca tcagcctgac acc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 4 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactcacca actcctaacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtggacat ggatggagca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 5 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaactggca agtcactgct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 5 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagttccct tcaggaagac ctt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 6 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagcccc acgagagcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 6 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaggctgg gatcagggag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 7 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgatttgag gcttgctggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 7 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaaggagg caggtgagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 8+9 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcacctg cctccttctt gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 8+9 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgagccta gcagattcat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 10 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcccaaac cctaactttt ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 10 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagttggtc tcagtcggtg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 11 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgtgtccc accctaacca tgt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 11 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgcccctc actgccaatc ctc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 12 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctggggt ccgccaatat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 12 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgcccca agaatcctgc ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 13 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttaccaa ctttgctctt gcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 13 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcccacc cattatcatc tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 14 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcccaaca accctgctca atatg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 14 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgattgttc tcccactccc agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 15 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgactg ctcccacccc tcat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 15 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagaattc aggtggtaag gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 16 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaccatag agcagaatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 16 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagaacct tggcagaatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 17 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttactcac accctacctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 17 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggctgggtg gggttgggc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 18 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcctgcat ctctttctgg ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 18 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcagtgggt tggccctagt tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 19 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 33
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagttctca cagactcctc ctac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 19 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgttcta tgagcttctg gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 20 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatctgcag gtgaccctag aat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 20 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacaggaa aagcatcaga gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 21 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccctagtca tggccaacac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 21 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgggaaac ctcctcttga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 22 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaggacctc aggtaggaag gag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 22 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctttgagg cgtgtgaact cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 22 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgaagagt gcagaaagag ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 22 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgggaagt gaaggcagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 23 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaatgagg accttacccc ctg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 23 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctgagca ctcatcttcc aac
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 23 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctaaggtg aaggagatga ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 23 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. 1 ID. NO: 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgagagtc ctgatgagac cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 24 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctaaagga gatgggattc ttg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inveraso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 24 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctaggcccc acaactctca at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 25 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcaggatg ctttgcctca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 25 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtactgtt atgggctggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 26 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 51
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattttcacca ctggtggacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 26 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgctgtga acaggacacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 27 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattccagtgg aggggtcca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 27 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgccgcatct tctggaact
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 27 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttccagaa gatgcggcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 27 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 54
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggaggagg aagttggagg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 28 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacctctta caccccttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 28 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgcgtgta ttggcttgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 29 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtggggat agagaggagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 29 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcaaggc tagtcagtgt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 30 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggagaaag ctgaacccac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 30 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagtcctg cctgcaaag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 31 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtttcctct tgtccccatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 31 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcactga acccctcatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 32 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 65
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagacaga ccctggacat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 32 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaccatatg ggaacactgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 33 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggacctcag cagccctcaa a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 33 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaaagcc tggagctcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 34 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccatgatt agtgagcagg cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 34 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcttctt caccctcagg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 34 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgagggt gaagaagaag a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 34 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaagacact actgcttacg cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 35 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtgaaggg aaccgaggct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 35 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 72
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcccttca ggaatgagca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 36 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaggcttga gagctatgca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 36 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtcaagt cctcacacac t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 37 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcagcaa gtgtgtgag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 37 A del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctgcagc tgcttcttg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 37 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagaagcag ctgcagaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 37 B del
gen MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcagctgg ttgtcactgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 38 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgactgt gccatcttca cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 38 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttctcaga ctcctggctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 39 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 83
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagccaggag tctgagaacc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 39 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtctgggta tgcctgctgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador directo
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 40 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatcagac ccctctcacc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador inverso
utilizado para la amplificación de un fragmento del exón 40 del gen
MYH7 en combinación con la SEQ. ID. NO: 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattctgctt cctcccaagg
\hfill20
Claims (31)
1. Un método para determinar in vitro la
predisposición de un sujeto a desarrollar miocardiopatía
hipertrófica (MCH) que comprende analizar el ácido nucleico
contenido en una muestra biológica procedente de dicho sujeto para
detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual en el gen
MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca
humana, asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual
asociada con la MCH es la mutación Lys1459Asn.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho gen MYH7 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEQ. ID. NO: 1.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho cambio de nucleótidos relacionado con dicha mutación puntual
en el gen MYH7 asociada con la MCH, Lys1459Asn, sones el
siguiente:
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra biológica procedente del sujeto contiene ácido
nucleico.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
dicho ácido nucleico se selecciona entre DNA y RNA.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra biológica procedente del sujeto se selecciona entre
una muestra de tejido y una muestra de sangre de dicho sujeto.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha muestra biológica comprende células nucleadas de sangre
periférica del sujeto a ensayar.
8. Método según la reivindicación 1, que
comprende, además, la amplificación de un fragmento del gen MYH7 en
el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del
sujeto a ensayar, en donde dicho fragmento del gen MYH7 a amplificar
comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o
ausencia de dicha mutación puntual.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dicha amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) o una variante de la misma.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha amplificación se lleva a cabo mediante PCR anidada o
nested-PCR.
11. Método según la reivindicación 8, en el que
dicha amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en cadena
de la ligasa (LCR), la amplificación por desplazamiento de banda, la
amplificación basada en la transcripción, la replicación de
secuencia auto- sostenida (3SR), el sistema de la replicasa
Q\beta, la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico
(NASBA) o la amplificación por la polimerasa del fago phi29.
12. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7
asociada con la MCH, Lys1459Asn, se detecta mediante el empleo de
sondas de oligonucleótidos marcadas con un grupo marcador
detectable.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7
asociada con la MCH se detecta mediante el empleo de una sonda de
nucleótidos fijada sobre un soporte sólido, en donde dicha sonda de
nucleótidos se selecciona entre (i) una sonda de nucleótidos que es
completamente complementaria a la secuencia normal de nucleótidos
que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana o a
un fragmento de la misma que contiene la región donde se desea
estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual, y (ii)
una sonda de nucleótidos que es completamente complementaria a la
secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena pesada de la
beta miosina cardíaca humana mutada o a un fragmento de la misma que
contiene la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia
de mutación puntual, y detectar la presencia o ausencia de
hibridación.
14. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7
asociada con la MCH, Lys1459Asn, se detecta mediante digestión con
enzimas de restricción y análisis de los fragmentos de restricción
(RFLP).
15. Método según la reivindicación 1, en el que
la presencia o ausencia de dicha mutación puntual en el gen MYH7
asociada con la MCH, Lys1459Asn, se detecta mediante secuenciación
directa de nucleótidos, minisecuenciación directa, ensayos de
hibridación en array, ensayos dependientes de discriminación de
alelos basada en hibridación, electroforesis en gel diagonal de
fragmentos de restricción dispuestos en placas de microtitulación
(MADGE) o transferencia de energía de resonancia por fluorescencia
(FRET).
16. Método según la reivindicación 1, en el que
la MCH es miocardiopatía hipertrófica familiar (MCHF).
17. Método según la reivindicación 1, en el que
la MCH es miocardiopatía hipertrófica esporádica (MCHE).
18. Un método de diagnóstico in vitro de
miocardiopatía hipertrófica (MCH) que comprende obtener una muestra
biológica procedente de un sujeto en donde dicha muestra biológica
contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la
detección de la presencia de una mutación puntual en el gen MYH7,
que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana,
asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con
la MCH es la mutación Lys1459Asn.
19. Un método no invasivo para diagnosticar
miocardiopatía hipertrófica (MCH) en un sujeto que comprende aislar,
a partir de una muestra de sangre procedente de dicho sujeto, un
fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que
comprende, al menos, una de las regiones del gen MYH7 en donde se
encuentra una mutación puntual asociada con la MCH, en el que dicha
mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Lys1459Asn, y
diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia
o ausencia de dicha mutación puntual en dicho fragmento de ácido
nucleico.
20. Un kit que comprende, al menos, un reactivo
específico para detectar la presencia o ausencia de, al menos, una
mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha
mutación puntual asociada con la MCH es la mutación Lys1459Asn.
21. Kit según la reivindicación 20, en el que
dicho reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de
dicha mutación puntual, es una sonda de oligonucleótidos que permite
distinguir el alelo que contiene una G en la posición 22146 de la
SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una T en dicha posición.
22. Kit según la reivindicación 20, que
comprende, al menos, una enzima de restricción que permite
distinguir el alelo que contiene una G en la posición 22146 de la
SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una T en dicha posición.
23. Kit según la reivindicación 22, en el que
dicha enzima de restricción es la enzima de restricción Tsp509I.
24. Kit según la reivindicación 20, que
comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la
amplificación de un fragmento del gen MYH7 que comprende la región
en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación
puntual.
25. Kit según la reivindicación 24, que
comprende un oligonucleótido iniciador seleccionado del grupo
formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ.
ID. NO: 64, SEQ. ID. NO: 65 y sus mezclas.
26. Un oligonucleótido iniciador seleccionado
del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados
como SEQ. ID. NO: 64, SEQ. ID. NO: 65 y sus mezclas.
27. Un biochip que comprende, al menos, un
reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de, al
menos, una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en
el que dicha mutación puntual asociada con la MCH es la mutación
Lys1459Asn, soportado sobre un soporte sólido.
28. Biochip según la reivindicación 27, en el
que dicho reactivo específico para detectar la presencia o ausencia
de dicha mutación puntual, es una sonda de oligonucleótidos que
permite distinguir el alelo que contiene una G en la posición 22146
de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una T en dicha
posición.
29. Biochip según la reivindicación 27, que
comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la
amplificación de un fragmento del gen MYH7 que comprende la región
en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de dicha mutación
puntual.
30. Biochip según la reivindicación 29, en el
que dicho oligonucleótido iniciador se selecciona del grupo formado
por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO:
64, SEQ. ID. NO: 65, y sus mezclas.
31. Biochip según la reivindicación 30, que
comprende, además, uno o más oligonucleótidos iniciadores
seleccionados entre los identificados como SEQ. ID. NO:
1-SEQ. ID. NO: 63 y SEQ. ID. NO:
66-SEQ. ID. NO: 85.
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