ES2321845T3 - Asociacion de polimorfismos de nucleotidos individuales en el ppar gamma, con la osteoporosis. - Google Patents
Asociacion de polimorfismos de nucleotidos individuales en el ppar gamma, con la osteoporosis. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la determinación de la propensión de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual método comprende: detección de la presencia de los alelos homocigotos PPAR Pro12Ala, ó de los alelos homocigotos PPAR VN102G en una muestra del individuo; y registro de un diagnóstico de un mayor riesgo de osteoporosis cuando los alelos homocigotos PPAR Pro12Ala ó los alelos homocigotos PPAR VN102G están presentes.
Description
Asociación de polimorfismos de nucleótidos
individuales en el PPAR\gamma, con la osteoporosis.
El receptor \gamma de peroxisoma activado por
proliferador (PPAR\gamma), es un miembro de la familia de
receptores de hormonas nucleares, de factores de transcripción. El
PPAR\gamma juega un papel en la regulación de la diferenciación
de los adipocitos y el metabolismo de la glucosa y de los ácidos
grasos. Ha sido también postulado que juega un papel en el
crecimiento óseo en modelos de ratón (ver por ejemplo Czernik
et al., Endocrinology ("Endocrinología") 143:
2376-2384, 2002; Akune et al., J. Clin.
Invest 113:846-855, 2004).
Se ha informado de la existencia de un número de
polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs) en el gen
PPAR\gamma2. Estos incluyen el polimorfismo Pro12Ala, una
substitución del nucleótido C por el nucleótido G en el nucleótido
34 de la región de codificación que resulta de la substitución de
una prolina (Pro) por alanina (Ala) en la posición 12 de
PPAR\gamma2 (Yen et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 241:
270-274 (1997). El polimorfismo Ala es
relativamente inhabitual. En los caucasianos, el grupo étnico con la
más alta frecuencia, el predominio del portador es aproximadamente
el 25%. El polimorfismo Pro12Ala, ha sido asociado con la diabetes
(por ejemplo, Alshuler et al., Nat. Gen
26:76-80, 2000; Mori et al., Diabetes 50:
891-894, 2001; Douglas et al., Diabetes 50:
886-890, 2001), así como también con otras
enfermedades, por ejemplo la endometriosis (Dogan et al.,
Fertility and Sterility 81: 1411-1413, 2004).
Inicialmente, se informó de que una reducción del 75% del riesgo
para la diabetes había sido conferida por el alelo Ala (Deeb et
al., Nat. Gen 20:284-287, 1998), pero estudios
subsiguientes no reprodujeron esta asociación. Un estudio más
amplio, identificó un aumento significativo en el riesgo de
diabetes asociado con el alelo prolina más común (85% de
frecuencia). A causa de que el alelo de riesgo, tiene lugar con una
frecuencia tan alta, su modesto efecto se traduce en un riesgo
atribuible a la gran población - influenciando hasta un 25% de la
diabetes tipo 2 en la población total (Alshuler et al.,
supra).
Otro SNP, el polimorfismo VN102, está en un
fuerte desequilibrio de unión con el polimorfismo Pro12Ala. La
frecuencia del alelo polimórfico "A", para este polimorfismo es
similar a la frecuencia del alelo Ala para el polimorfismo
Pro12Ala. Los alelos PPAR\gamma VN102 son ya conocidos per
se (DATABASE SNP, US Nat. Library of Medicine (NLM), ref SNP
ID: rs 1899951,
2001-01-02-XP
002348470, entrada en la base de datos nº ss 2782890).
Aunque se ha informado de que otro polimorfismo
PPAR\gamma2, una transición de C a T, en el exón 6 del
PPAR\gamma2, estaba asociado con la densidad mineral del hueso en
una población japonesa de mujeres post menopáusicas (Ogawa et
al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 260:122-126,
1999), no se había observado anteriormente ninguna asociación entre
los polimorfismos Pro12Ala y VN102 y el riesgo de enfermedades
relacionadas con la densidad ósea, como por ejemplo, la
osteoporosis.
La presente invención se basa por lo tanto en el
descubrimiento de que el polimorfismo de la posición 12 del
PPAR\gamma2 (Pro12Ala) y el VN102 SNP, están asociados con el
riesgo de enfermedades, entre las cuales se incluye la pérdida de
densidad ó sea, por ejemplo, la osteoporosis. Además, los inventores
han descubierto que estos polimorfismos PPAR\gamma,
interaccionan con el polimorfismo COL1A en el sitio de unión Sp1 en
el intrón 1 del tipo colágeno 1 gen alfa. El sitio Sp1 del alelo
"T" dentro del intrón 1 del gen de COL1A1 es conocido por
estar asociado con la osteoporosis (Grant et al., Nature
Genetics ("Genética en la Naturaleza") 14:
203-205, 1996; Mann et al., The Journal of
Clinical Investigation ("Revista de investigación clínica")
107: 899-907, 2001; Mivandola et al.,
Molecular and Cellular Probes ("Sondas moleculares y
celulares") 16: 73-75, 2002).
La invención proporciona por lo tanto un método
de detección de la propensión de un individuo a desarrollar la
osteoporosis, comprendiendo dicho método, la detección de la
presencia de alelos homocigotos PPAR\gammaPro12A1 ó alelos
homocigotos PPAR\gammaVN102 en un individuo, y registrando un
diagnóstico de un mayor riesgo de osteoporosis. El diagnóstico se
registra a menudo en una forma legible en un ordenador. En una
versión, el individuo es una hembra. En otra versión el individuo
es un caucasiano.
Los alelos Pro12A1a se detectan típicamente
mediante la determinación de la presencia de un nucleótido "C"
en la primera posición del codón "CCA" que codifica el radical
12 del PPAR\gamma2 en una muestra de ADN genómico del individuo.
La muestra de ADN genómico se obtiene a menudo a partir de la
sangre, pero puede obtenerse también a partir de otros tejidos. El
método para la detección de un polimorfismo implica generalmente una
reacción de amplificación, por ejemplo una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
En una versión, la reacción de amplificación se
realiza con un juego de cebadores que comprende un cebador
oligonucleótido específico de alelo para el alelo Pro, y un cebador
oligonucleótido específico de alelo para el alelo Ala. Como
ejemplo, los oligonucleótidos específicos de alelo, comprenden las
secuencias de cebador indicadas en SEQ ID Nos: 1 y 2.
En otra versión, la reacción de amplificación
comprende un paso de hibridación de un producto amplificado, con
una sonda marcada que se une específicamente al alelo Pro ó al alelo
Ala.
En otra versión, la invención proporciona un
método para la determinación de la presencia del alelo "Pro"
del polimorfismo Pro12Ala mediante la detección de la presencia de
un polipéptido que comprende el Pro en la posición 12. Puede
detectarse la variante alélica, por ejemplo, empleando anticuerpos
tales como anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al
alelo Pro.
La presencia del alelo VN102 se detecta también
en una muestra de ácido nucleico que comprende el ADN genómico de
un individuo. En una versión típica, el paso de detección comprende
una reacción de amplificación, a menudo una PCR, empleando un juego
de cebadores que comprende un cebador oligonucleótido específico de
alelo, para el alelo "G" y un cebador oligonucleótido
específico de alelo, para el alelo "A". Como ejemplo, los
oligonucleótidos específicos de alelo, comprenden las secuencias de
cebador indicadas en SEQ ID NOs: 4 y 5. En otra versión, la
reacción de amplificación comprende un paso de hibridación de un
producto amplificado, con una sonda marcada que se une
específicamente al alelo G ó al alelo A.
En algunas versiones, el método puede comprender
además un paso de realización de un ensayo de densidad ósea del
individuo.
La invención proporciona también un método para
la determinación de la propensión de un individuo a desarrollar la
osteoporosis, mediante a) detección de la presencia o ausencia de
alelos "G" homocigotos del polimorfismo Pro12A1a y/o la
presencia o ausencia de alelos PPAR\gammaVN102 homocigotos, en un
individuo; y b) detección de la presencia o ausencia de un alelo
"T" para el polimorfismo COL1A1, en donde la presencia
de los alelos "G" homocigotos PPAR del polimorfismo Pro 12
Ala y o la presencia de los alelos VN102 homocigotos juntamente
con la presencia de los alelos "T" de COL1A1, aumenta el
riesgo de osteoporosis. En versiones típicas, la presencia o
ausencia de alelos polimórficos se determina dictaminando el
genotipo empleando muestras de ADN genómico. La invención puede
además comprender un paso de registro de un aumento del riesgo para
la osteoporosis cuando los alelos "G" PPAR homocigotos, del
polimorfismo Pro12 Ala y/o los alelos VN102 homocigotos están
presentes juntamente con el alelo "T" de COL1A1 en un
individuo.
En otro aspecto, la invención proporciona un
medio legible en un ordenador, el cual comprende: a) un código para
la obtención de datos que muestran los resultados de un ensayo para
la determinación de la presencia de alelos Pro homocigóticos del
polimorfismo Pro12Ala ó alelos "G" homocigotos del polimorfismo
VN102 en una muestra biológica; y b) un código para la
determinación de si la muestra biológica está asociada con un mayor
riesgo a la osteoporosis, empleando los datos que muestran los
resultados del ensayo. En algunas versiones, el medio legible en el
ordenador comprende además un código para la obtención de datos que
muestran los resultados de un ensayo para determinar la presencia
de un alelo "T" en el polimorfismo COL1A, y un código
para la determinación de si la muestra tiene un riesgo
adicionalmente mayor a la osteoporosis, empleando los datos que
muestran los resultados del ensayo.
La figura 1 muestra varios PPAR\gamma SNPs,
que fueron seleccionados para una asociación con la
osteoporosis.
La figura 2 proporciona un resumen de los
resultados de genotipos de los análisis del polimorfismo
C-G (Pro12Ala) del exón 1 y su asociación con
condiciones, por ejemplo, la fractura de cadera; el análisis del
polimorfismo G-A (VN102) del intrón 1 y su
asociación con condiciones, por ejemplo, la fractura de cadera; y el
análisis de los polimorfismos PPAR\gamma y COL1A1.
El término alelo se refiere a una variante de la
secuencia de nucleótidos de un gen de interés.
Los términos "polimorfismo Pro12Ala" y
"Pro12Ala SNP", se emplean indistintamente para indicar un
polimorfismo PPAR\gamma2 (CCA/GCA) que tiene lugar en el exón 1
en el codón que codifica el radical 12 de PPAR\gamma2. El nombre
estándar es NT_005718.5_52893. Este nombre está basado en el nombre
de la secuencia contig y la posición del SNP en la secuencia contig
del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI). La
fuente de SNP es el NCBI OMIM 601487.0002; db SNP rs1801282.
Como se emplea en la presente, un "alelo C"
con respecto a la variante alélica Pro12Ala, se refiere a una
variante de la secuencia que tiene una citosina, un "nucleótido
C", en el nucleótido 34 de la región de codificación del
PPAR\gamma2, lo cual da como resultado la presencia de prolina en
la posición 12 de la proteína PPAR\gamma2.
Un "alelo G" con respecto a la variante
alélica Pro12Ala, se refiere a una variante de la secuencia la cual
contiene una guanina, nucleótido "G", en la posición
polimórfica, dando como resultado la presencia de alanina en la
posición 12 del PPAR\gamma2.
El término "polimorfismo VN102" se refiere
a un SNP que tiene lugar en el intrón 1 del PPAR\gamma2. La
posición polimórfica es un radical "G" frente a un radical
"A". La fuente de SNP es el db SNP rs1899951.
Un "alelo G" con respecto al polimorfismo
VN102, se refiere a una variante alélica, la cual tiene una guanina,
un nucleótido "G", en la posición polimórfica en el intrón 1
del PPAR\gamma2.
Un "alelo A" para el polimorfismo VN102, se
refiere a la presencia de una adenina, un "nucleótido A", en la
posición polimórfica en el intrón 1 del PPAR\gamma2.
Un polimorfismo "COL1A1" como se emplea en
la presente, se refiere a un polimorfismo manifestado como un cambio
de un "G" por un "T" en el gen alfa 1 del colágeno tipo 1
(COL1A1). Este polimorfismo está localizado en un sitio de unión
Sp1 en el intrón 1 de COL1A1, y ha sido asociado con una reducida
densidad mineral ósea (Mann et al., J. Clin. Invest.
107:899-907, 2001; Mann&Ralston, Bone
("Huesos") 32: 711-717, 2003). El polimorfismo
altera la unión del Sp1 con su secuencia de reconocimiento. La
presencia del alelo "T" aumenta el riesgo de osteoporosis.
El término "genotipo" se refiere a una
descripción de los alelos de un gen contenido en un individuo o una
muestra. En el contexto de la presente invención no se hace ninguna
distinción entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una
muestra originaria del individuo. Aunque típicamente un genotipo se
determina a partir de muestras de células diploides, un genotipo
puede determinarse a partir de una muestra de células
haploihaploides, tales como por ejemplo una célula de esperma.
Un "polimorfismo" se refiere a la
existencia de dos o más secuencias alternativas genéticamente
determinadas, de un gen en una población. Típicamente, la primera
forma alélica identificada se designa arbitrariamente como la forma
de referencia y las otras formas alélicas se designan como
alternativa o alelos variantes. La forma alélica que se encuentra
con mayor frecuencia en una población seleccionada se atribuye
algunas veces como la forma tipo salvaje.
Un "polimorfismo de nucleótido individual"
ó "SNP" es un sitio de un nucleótido que varía entre alelos.
Los polimorfismos de nucleótido individual pueden tener lugar en
cualquier región del gen. En algunos casos el polimorfismo puede
dar como resultado un cambio en la secuencia de la proteína, por
ejemplo, el polimorfismo Pro12A1a. El cambio en la secuencia de la
proteína puede afectar o no, la función de la proteína.
El término "desequilibrio de la unión" como
se emplea en la presente, se refiere a alelos en diferentes lugares,
que no están asociados al azar, es decir, no están asociados en
proporción a sus frecuencias. Si los alelos están en un
desequilibrio positivo de la unión, entonces los alelos están juntos
más a menudo de lo esperado, asumiendo una independencia
estadística. Por el contrario, si los alelos están en desequilibrio
negativo de la unión, entonces los alelos se encuentran juntos
menos a menudo de lo esperado asumiendo una independencia
estadística. Un "fuerte desequilibrio de unión" como se emplea
en la presente se refiere a un valor D' de aproximadamente 1.
El término "hibridación" se refiere a la
formación de una estructura dúplex mediante dos ácidos nucleicos de
una sola cadena, debido a un emparejamiento de las bases
complementarias. La hibridación puede tener lugar entre cadenas de
ácido nucleico exactamente complementarias o entre cadenas de ácido
nucleico que contienen regiones de emparejamiento poco importantes.
Como se emplea en la presente, el término "substancialmente
complementarias", se refiere a secuencias que son
complementarias excepto en regiones de emparejamiento poco
importantes. Típicamente, el número total de nucleótidos
desaparejados sobre una región de hibridación no es mayor de 3
nucleótidos para secuencias de aproximadamente 15 nucleótidos de
longitud. Las condiciones en las cuales solamente hibridarán las
cadenas de ácido nucleico exactamente complementarias reciben el
nombre de "restrictivas" o condiciones de hibridación
"específicas de la secuencia". Dúplex estables de ácidos
nucleicos substancialmente complementarios, pueden lograrse con
condiciones de hibridación menos restrictivas. Los expertos en la
técnica de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar
empíricamente la estabilidad de un dúplex considerando un número de
variables que incluyen, por ejemplo, la longitud y la concentración
de un par de bases de los oligonucleótidos, la fuerza iónica, e
incidencia de los pares de bases desaparejados. Un programa
informático para el cálculo de la estabilidad de un dúplex puede
adquirirse comercialmente de la firma National Biosciences, Inc.
(Plymouth, Minn.); el manual de referencia, OLIGO versión 5, se
incorpora a la presente como referencia.
Las condiciones restrictivas de hibridación
específica de una secuencia, a las cuales un oligonucleótido
hibridará solamente con la secuencia diana exactamente
complementaria, son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo,
las referencias generales proporcionadas en la sección, sobre
detección de polimorfismos en secuencias de ácido nucleico). Las
condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán
diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente, las
condiciones restrictivas se seleccionan de forma que sean
aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para
la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm
es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos), a la cual
el 50% de los pares de bases se han disociado. La relajación de la
restrictividad de las condiciones de hibridación permitirá que se
toleren los emparejamientos de secuencias; el grado de
emparejamiento tolerado puede ser controlado mediante un ajuste
adecuado de las condiciones de hibridación.
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido que actúa como un punto de iniciación de la síntesis
del ADN bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un
producto de extensión del cebador, complementario a una cadena de
ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro diferentes
nucleósido trifosfatos y de un agente para la polimerización, (es
decir, ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón
apropiado y una temperatura adecuada. Un cebador es de preferencia
un oligodesoxirribonucleotido de una sola cadena. El cebador
incluye una "región de hibridación" exacta o substancialmente
complementaria a la secuencia diana, de preferencia aproximadamente
de 15 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. Un
oligonucleótido cebador, o bien puede constar enteramente de la
región de hibridación, o bien puede contener características
adicionales las cuales permiten la detección, inmovilización, o
manipulación del producto amplificado, pero que no alteran la
capacidad del cebador para servir como reactivo de partida para la
síntesis del ADN. Por ejemplo, puede incluirse una secuencia
"cola" de ácido nucleico en el extremo 5' del cebador que
hibrida, para un oligonucleótido de captura.
Un cebador "específico de alelo", como se
emplea en la presente, es un cebador que hibrida con una secuencia
diana de manera que el extremo 3', habitualmente el nucleótido 3',
del cebador se alinea con el sitio polimórfico de interés, y es
exactamente complementario a uno de los alelos en la posición
polimórfica. Como se emplea en la presente, el cebador es
"específico para" el alelo al cual es exactamente
complementario en el extremo 3'. En general, la extensión del
cebador está inhibida cuando un emparejamiento está presente en el
extremo 3' del cebador. Un cebador específico de alelo, cuando
está hibridado al alelo exactamente complementario puede extenderse
con una gran eficacia.
El mismo cebador, cuando está hibridado a otro
alelo, no es fácilmente extensible, debido al emparejamiento en el
extremo 3' del cebador en el dúplex de hibridación. Así, el empleo
de un cebador específico de un alelo proporciona una descriminación
alélica en base a si se forma un producto de extensión
apreciable.
El término "sonda" se refiere a un
oligonucleótido que hibrida selectivamente con un ácido nucleico
diana en condiciones adecuadas.
Una sonda "específica de un alelo" contiene
una "región de hibridación" exactamente o substancialmente
complementaria a la secuencia diana, y es exactamente
complementaria a la secuencia diana en el sitio polimórfico de
interés. Un ensayo de hibridación efectuado empleando la sonda bajo
condiciones de hibridación suficientemente restrictivas permite la
detección selectiva de una secuencia diana específica. La región de
hibridación de la sonda tiene de preferencia, desde aproximadamente
10 hasta aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, con más
preferencia desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35
nucleótidos de longitud. El empleo de bases modificadas o bases
análogas que afectan la estabilidad de la hibridación, las cuales
son ya bien conocidas en la especialidad, pueden permitir el empleo
de sondas más cortas o más largas con una estabilidad comparable. Un
oligonucleótido sonda, o bien puede constar enteramente de la
región de hibridación, o bien puede contener características
adicionales que permiten la detección o inmovilización de la sonda,
pero que no alteran significativamente las características de
hibridación de la región de hibridación.
El término "secuencia diana" o "región
diana" se refiere a una región de un ácido nucleico que hay que
analizar, y comprende el sitio polimórfico de interés.
Como se emplea en la presente, los términos
"ácido nucleico", "polinucleótido" y
"oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas y fragmentos
de oligómeros. Los términos no están limitados por la longitud, y
son genéricos para los polímeros lineales de
polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2-desoxi-D-ribosa),
polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y
cualquier otro N-glicósido de una base purina o
pirimidina, o bases modificadas de purina o pirimidina. Estos
términos incluyen ADN de doble cadena y de cadena sencilla, así como
también ARN de doble cadena y de cadena sencilla. Los
oligonucleótidos de la invención pueden emplearse como cebadores
y/o como sondas. Por lo tanto, los oligonucleótidos referidos en la
presente como "cebadores" pueden actuar como sondas, y los
oligonucleótidos referidos como "sondas" pueden actuar como
cebadores en algunas versiones.
Un ácido nucleico, polinucleótido u
oligonucleótido, puede contener uniones fosfodiéster o uniones
modificadas, incluyendo pero sin limitarlo al fosfotriéster,
fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato,
carbamato, tioéter, fosforamidato puenteado, metilenfosfonato
puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato,
fosforotioato puenteado o enlaces sulfona, y combinaciones de dichos
enlaces.
Un ácido nucleico, polinucleótido u
oligonucleótido, puede comprender las cinco bases que se encuentran
biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o
bases distintas a las cinco bases que se encuentran biológicamente.
Estas bases pueden servir para un determinado número de finalidades,
por ejemplo, estabilizar o desestabilizar la hibridación; promover
o inhibir la degradación de una sonda; o como puntos de sujeción
para grupos detectables o grupos de extinción. Por ejemplo, un
polinucleótido de la invención puede contener uno o más, grupos base
modificados, no estándares, o derivatizados, incluyendo, pero no
limitados a la,
N^{6}-metil-adenina,
N^{6}-terc-butil-bencil-adenina,
imidazol, imidazoles substituidos, 5-fluoruracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
beta-D-galactosil-queosina,
inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina,
N^{6}-metiladenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetil-uracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
uracilo-5-oxiacético,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,(acp3)w,
2,6-diaminopurina, y 5-propinil
pirimidina. Otros ejemplos de grupos base modificados, no
estándares, o derivados, se pueden encontrar en las patentes U.S.
n^{os} 6.001.611; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343;
5.728.525; y 5.679.785, cada una de las cuales se incorpora a la
presente como referencia en su totalidad.
Además, un ácido nucleico, polinucleótido o
oligonucleótido, puede comprender uno o más grupos de azúcar
modificado, incluyendo pero sin limitar a la, arabinosa,
2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Esta invención está basada sobre el
descubrimiento de polimorfismos nucleótidos individuales en el
PPAR\gamma2, que están asociados con un mayor riesgo a la
enfermedad o condición que implica la pérdida de densidad ósea, por
ejemplo, la osteoporosis. Han sido identificadas un número de
variantes genéticas en el PPAR\gamma2. Una de ellas es una
substitución C por G en el codón 12 del PPAR\gamma, lo cual da
como resultado un cambio de aminoácidos de prolina a Ala (CCG (Pro)
\ding{212} GCG (Ala)). Este polimorfismo ha sido asociado con la
diabetes tipo 2 y la obesidad. La variante menos frecuente Ala12, se
estima que reduce el riesgo de desarrollar la diabetes tipo 2 en un
20 por ciento. En la presente invención, la presencia de alelos
"C" homocigotos (llamados también en la presente como alelos
"Pro"), se asocia a un mayor riesgo para la osteoporosis.
Típicamente, el polimorfismo Pro12Ala se detecta
mediante la determinación de la presencia del alelo "C" ó del
alelo "G" en el ADN genómico obtenido de una muestra biológica
de un individuo. Sin embargo, el polimorfismo puede detectarse
también en otras muestras de ácido nucleico por ejemplo, el ARNm
aislado de un tejido en el cual está expresado el PPAR\gamma2,
por ejemplo, los adipositos. Además, el polimorfismo puede también
ser detectado mediante el análisis del (de los) producto(s)
de los alelos de PPAR\gamma2 presentes en un individuo. Ejemplos
de métodos de determinación de la presencia de una variante
polimórfica están descritos con más detalle, más adelante.
Otro polimorfismo, el VN102, está en un fuerte
desequilibrio de unión con el Pro12Ala. El polimorfismo VN102 es
una substitución de G por A, en el intrón 1. La presencia del alelo
"G" homocigoto en el VN102 se asocia también con un mayor
riesgo a enfermedades o condiciones relacionadas con la pérdida de
densidad ósea, tal como por ejemplo, la osteoporosis. Las variantes
polimórficas del VN102 se detectan mediante la determinación del
genotipo de un individuo en este sitio.
La invención está también basada sobre el
descubrimiento de que los polimorfismos PPAR\gamma descritos en
la presente, interaccionan con el polimorfismo COL1A1 en el
sitio Sp1 en el intrón 1, de forma que los individuos que poseen
ambos: 1) un alelo "T" COL1A1, y 2) los alelos "G"
homocigotos PPAR\gammaPro12 Ala, y los alelos "G"
homocigotos VN102, tienen un mayor riesgo, es decir, tienen un
riesgo estadísticamente significativamente mayor, para la
osteoporosis, respecto a tener solamente el polimorfismo COL1A1 ó el
(los) polimorfismo(s) PPAR\gamma.
Las técnicas de detección para la evaluación de
los ácidos nucleicos para la presencia de un SNP, implican
procedimientos ya bien conocidos en el campo de la genética
molecular. Además, muchos de los métodos implican la amplificación
de los ácidos nucleicos. Una extensa guía para realizarlos está
proporcionada por la técnica. Ejemplos de referencias incluyen
manuales tales como la tecnología de la PCR: Principles and
Applications for DNA Amplification ("Principios y
aplicaciones para la amplificación del ADN") (editores H. A.
Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications ("Protocolos para PCR: Una guía para los
métodos y aplicaciones") (editores Innis, et al., Academic
Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular
Biology ("Protocolos habituales en biología
molecular"),Ausubel, 1994-1999, incluyendo las
actualizaciones suplementarias hasta abril del 2004; Sambrook &
Russell, Molecular Cloning. A Laboratory Manual ("Clonación
molecular. Un manual de Laboratorio") (3ª edición, 2001).
Aunque los métodos emplean típicamente los pasos
de la PCR, pueden emplearse también otros protocolos de
amplificación. Métodos adecuados de amplificación incluyen la
reacción en cadena de la ligasa (ver por ejemplo, Wu & Wallace,
Genomics ("Genómica") 4: 560-569, 1988); ensayo
del desplazamiento de la cadena (ver por ejemplo, Walker et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396,
1992; patente U.S. nº 5.455.166); y varios sistemas de amplificación
basados en la transcripción, incluyendo los métodos descritos en
las patentes U.S. n^{os} 5.437.990; 5.409.818; y 5.399.491; el
sistema de amplificación por transcripción (TAS) (Kwoh et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177,
1989); y replicación de la secuencia autoprolongada (3SR) (Guatelli
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
1874-1878, 1990; WO 92/08800). Alternativamente,
pueden emplearse métodos que amplifican la sonda a niveles
detectables, tales como la amplificación por
Q\beta-replicasa (Kramer & Lizardi, Nature
("Naturaleza") 339: 401-402, 1989; Lomeli et
al., Clin. Chem. 35: 1826-1831, 1989). Se
proporciona una revisión de los métodos de amplificación conocidos,
por ejemplo, por Abramson y Myers, en Current Opinion in
Biotechnology ("Conceptos corrientes en Biotecnología"),
4:41-47, 1993.
Típicamente, la detección del Pro12Ala y/o el
genotipo VN102 de un individuo, se efectúa empleando cebadores
oligonucleótidos y/o sondas. De manera similar, la detección del
polimorfismo COL1A1 se efectúa también mediante el dictamen del
genotipo del individuo en este sitio en el locus COL1A1. Los
oligonucleótidos pueden prepararse por cualquier método adecuado,
habitualmente por síntesis química. Los oligonucleótidos pueden
sintetizarse empleando reactivos e instrumentos comercialmente
disponibles. Alternativamente, pueden comprarse a través de fuentes
comerciales. Los métodos para sintetizar los oligonucleótidos son ya
bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Narang et
al., Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979; Brown et
al., Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucage
et al., Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862,
1981; y el método de un soporte sólido, de la patente U.S. nº 4.
458.066). Además, las modificaciones de los métodos de síntesis
descritos más arriba, pueden emplearse para impactar según se desee
el comportamiento de enzimas con respecto a los oligonucleótidos
sintetizados. Por ejemplo, la incorporación de enlaces fosfodiéster
modificados (por ejemplo, fosforotioato, metilfosfonatos,
fosfoamidato, o borofosfato), o enlaces distintos de derivados del
ácido fosforoso en un oligonucleótido puede emplearse para impedir
la escisión en un sitio seleccionado. Además, el empleo de azúcares
modificados en 2'-amino, tiende a favorecer el
desplazamiento sobre la digestión del oligonucleótido cuando se
hibrida a un ácido nucleico que es también un molde para la
síntesis de una nueva cadena de ácido nucleico.
El genotipo de un individuo para los
polimorfismos Pro12Ala y/o VN102, puede determinarse empleando
muchos métodos de detección que son ya bien conocidos en la
técnica. La mayor parte de ensayos vinculan a uno de los varios
protocolos generales: hibridación empleando oligonucleótidos
específicos de alelo, extensión de un cebador, ligación específica
del alelo, secuenciado, o técnicas de separación electroforética,
por ejemplo polimorfismo conformacional de una sola cadena (SSCP),
y análisis heterodúplex. Ejemplos de ensayos incluyen los ensayos
5' nucleasa, incorporación de un terminador colorante dirigido por
un molde, ensayos de oligonucleótidos específicos de alelo faros
moleculares, ensayos de extensión de base única, y registro de los
SNP mediante secuencias de pirofosfato a tiempo real. El análisis
de las secuencias amplificadas puede ser realizado empleando varias
tecnologías tales como los microchips, ensayos de polarización por
fluorescencia, y desabsorción/ionización mediante láser asistida
por matriz (MALDI)-espectrometría de masas. Dos
métodos que pueden también emplearse son ensayos basados en la
escisión invasiva con nucleasas Flap y metodologías empleando sondas
candado.
La determinación de la presencia o ausencia de
un alelo PPAR\gamma2 particular se efectúa generalmente mediante
el análisis de una muestra de ácido nucleico que se ha obtenido del
individuo que hay que analizar. A menudo, la muestra de ácido
nucleico contiene ADN genómico. El ADN genómico se obtiene
típicamente de muestras de sangre, pero puede también obtenerse de
otras células o tejidos.
También es posible analizar muestras de ARN para
detectar la presencia de alelos polimórficos. Por ejemplo, el ARNm
puede emplearse para determinar el genotipo de un individuo en el
sitio polimórfico Pro12Ala. En este caso, la muestra de ácido
nucleico se obtiene a partir de células en las cuales está expresado
el ácido nucleico diana, por ejemplo, adipocitos. Dicho análisis
puede efectuarse mediante, en primer lugar, una transcripción
inversa del ARN diana, empleando por ejemplo, una transcriptasa
inversa vírica, y a continuación, amplificando el ADNc resultante;
o empleando una reacción en cadena de polimerasa de transcripción
inversa (RT-PCR) a alta temperatura, como se
describe en las patentes U.S. n^{os} 5.310.652; 5.322.770;
5.561.058; 5.641.864 y 5.693.517.
Con frecuencia, las metodologías empleadas para
el análisis de muestras de ácido nucleico para detectar los SNPs,
están brevemente descritos. Sin embargo puede emplearse en la
invención, cualquier método ya conocido en la técnica, para
detectar la presencia de substituciones en nucleótidos
individuales.
Esta técnica, llamada también habitualmente
hibridación de oligonucleótidos específica de alelos (ASO) (por
ejemplo Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:
70-382, 1991; Saiki et al., Nature
("Naturaleza") 324, 163-166, 1986; EP 235.726;
y WO 89/11548), está basada en la diferenciación entre dos moléculas
de ADN que difieren por una base, mediante hibridación con una
sonda de oligonucleótidos, que es específica para una de las
variantes de un producto amplificado obtenido por la amplificación
de la muestra de ácido nucleico. Este método emplea típicamente
oligonucleótidos cortos, por ejemplo de 15-20 bases
de longitud. Las sondas están diseñadas para hibridar
diferencialmente una variante frente a la otra. Los principios y la
guía para diseñar dichas sondas pueden encontrarse en la técnica,
por ejemplo, en las referencias citadas en la presente. Las
condiciones de hibridación deben ser suficientemente restrictivas
para que exista una diferencia significativa en la intensidad de
hibridación entre los alelos, y de preferencia una respuesta
esencialmente binaria, con lo cual una sonda hibrida solamente con
uno de los alelos. Algunas sondas están diseñadas para hibridar con
un segmento de un ADN diana, de forma que el sitio polimórfico se
alinee con una posición central (por ejemplo, en un oligonucleótido
de 15 bases, en la posición 7; en un oligonucleótidos de 16 bases,
bien sea en la posición 8, o bien en la posición 9), de la sonda,
pero este diseño no es necesario.
La cantidad y/o presencia de un alelo se
determina mediante la medición de la cantidad de oligonucleótido
específico del alelo que se hibrida a la muestra. Típicamente, el
oligonucleótido está marcado con una marca como por ejemplo una
marca fluorescente. Por ejemplo, un oligonucleótido específico del
alelo se aplica a oligonucleótidos inmovilizados que representan
las secuencias PPAR\gamma2 SNP. Después de condiciones
restrictivas de hibridación y lavado, se mide la intensidad de la
fluorescencia para cada oligonucleótido SNP.
En una versión, el nucleótido presente en el
sitio polimórfico se identifica por hibridación en condiciones de
hibridación específica de la secuencia con una sonda de
oligonucleótidos exactamente complementaria a uno de los alelos
polimórficos en una región que abarca el sitio polimórfico. La
secuencia de hibridación de la sonda y las condiciones de
hibridación específicas de la secuencia, se seleccionan de tal forma
que un único emparejamiento en el sitio polimórfico
desestabiliza suficientemente el dúplex de hibridación, de manera
que éste no se forma efectivamente. Por lo tanto, en condiciones de
hibridación específica de la secuencia, los dúplex estables se
formarán solamente entre la sonda y la secuencia alélica exactamente
complementaria. Por lo tanto, los oligonucleótidos de
aproximadamente 10 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, de
preferencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos
de longitud, los cuales son exactamente complementarios a una
secuencia del alelo en una región que abarca el sitio polimórfico,
están dentro del ámbito de la invención.
En una versión alternativa, el presente
nucleótido en el sitio polimórfico se identifica mediante
hibridación en condiciones de hibridación suficientemente
restrictivas, con un oligonucleótido substancialmente complementario
a uno de los alelos del SNP en una región que abarca el sitio
polimórfico, exactamente complementario al alelo en el sitio
polimórfico. Debido a que los desemparejamientos que tienen lugar en
sitios no polimórficos son desemparejamientos con ambas secuencias
de alelos, la diferencia en el número de desemparejamientos en un
dúplex formado con la secuencia de alelos diana y en un dúplex
formado con la correspondiente secuencia de alelos no diana, es la
misma que cuando se emplea un oligonucleótido exactamente
complementario a la secuencia de alelos diana. En esta versión, las
condiciones de hibridación están suficientemente relajadas para
permitir la formación de dúplex estables con la secuencia diana,
mientras se mantiene la suficiente restrictividad para excluir la
formación de dúplex estables con secuencias no diana. En
condiciones de hibridación suficientemente restrictivas, los dúplex
estables se formarán solamente entre la sonda y el alelo diana. Por
lo tanto, los oligonucleótidos de aproximadamente 10 a
aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, de preferencia de
aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud,
los cuales son substancialmente complementarios a una secuencia de
alelos en una región que abarca el sitio polimórfico, y son
exactamente complementarios a la secuencia de alelos en el sitio
polimórfico, están dentro del ámbito de la invención.
El empleo de oligonucleótidos substancialmente,
más que exactamente, complementarios, puede ser deseable en
formatos de ensayos en los cuales está limitada la optimización de
las condiciones de hibridación. Por ejemplo en un formato de ensayo
típico multidiana con la sonda inmovilizada, las sondas para cada
diana están inmovilizadas en un único soporte sólido. Las
hibridaciones se efectúan simultáneamente poniendo en contacto el
soporte sólido con una solución que contiene el ADN diana. Como las
hibridaciones se efectúan en condiciones idénticas, las condiciones
de hibridación no pueden estar separadamente optimizadas para cada
sonda. La incorporación de emparejamientos en una sonda puede
emplearse para ajustar la estabilidad del dúplex cuando el formato
del ensayo excluye el ajuste de las condiciones de hibridación. El
efecto de un desemparejamiento particularmente introducido en la
estabilidad del dúplex es ya bien conocido, y la estabilidad del
dúplex puede ser determinada rutinariamente tanto estimada como
empíricamente, como se ha descrito más arriba. Las condiciones
adecuadas de hibridación, las cuales dependen del tamaño exacto y
la secuencia de la sonda, pueden seleccionarse empíricamente
empleando la guía proporcionada en la presente y ya bien conocida en
la técnica. El empleo de sondas de oligonucleótidos para detectar
diferencias en los pares de bases individuales en la secuencia, se
describe por ejemplo, en Conner et al., 1983, Proc.
Natl.Acad. Sci. USA 80:278-282, y las patentes U.S.
n^{os} 5.468.613 y 5.604.099, cada una de las cuales se incorpora
a la presente como referencia.
El cambio proporcional de la estabilidad entre
un dúplex de hibridación perfectamente emparejado y un dúplex de
hibridación desemparejado en bases individuales, depende de la
longitud de los oligonucleótidos hibridados. Los dúplex formados
con secuencias de la sonda más cortas, se desestabilizan
proporcionalmente más por la presencia de un desemparejamiento. En
la práctica, se prefieren los oligonucleótidos entre aproximadamente
15 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud, para la detección
específica de la secuencia. Además, debido a que los extremos de un
oligonucleótido hibridado experimentan una continua disociación al
azar y reasociación, debido a la energía térmica, un
desemparejamiento en cualquier extremo desestabiliza el dúplex de
hibridación menos que un desemparejamiento que tiene lugar en el
interior. De preferencia para la discriminación de un cambio de
pares de bases individuales en la secuencia diana, se selecciona la
secuencia de la sonda que hibrida la secuencia diana de forma que
el sitio polimórfico tenga lugar en la región interior de la
sonda.
Los criterios anteriores para la selección de
una secuencia de la sonda que hibrida con el PPAR\gamma2, son
aplicables a la región de hibridación de la sonda, es decir, aquella
parte de la sonda que está implicada en la hibridación con la
secuencia diana. Una sonda puede estar unida a una secuencia
adicional de ácidos nucleicos, tal como una cola
poli-T empleada para inmovilizar la sonda sin
alterar significativamente las características de hibridación de la
sonda. Una persona experta en la técnica reconocerá que para emplear
en los presentes métodos, la sonda unida a una secuencia de ácidos
nucleicos adicionales la cual no es complementaria a la secuencia
diana y, por lo tanto no está implicada en la hibridación, es
esencialmente equivalente a la sonda no unida.
Los formatos de ensayo adecuados para la
detección de híbridos formados entre las sondas y las secuencias de
ácido nucleico diana en una muestra, son ya conocidos en la técnica,
e incluyen el formato de la diana inmovilizado
(dot-blot) ("transferencia de puntos") y la
sonda inmovilizada (dot blot inverso o blot lineal). Los formatos
de ensayo dot-blot y dot-blot
inverso, están descritos en las patentes U.S. n^{os} 5.310.893;
5.451.512; 5.468.613 y 5.604.099, cada una de ellas incorporada a la
presente como referencia.
En un formato dot-blot, el ADN
diana amplificado se inmoviliza sobre un soporte sólido, como por
ejemplo una membrana de nylon. El complejo
membrana-diana, se incuba con la muestra marcada en
condiciones de hibridación adecuadas, la sonda no hibridada se
elimina por lavado en condiciones adecuadamente restrictivas, y la
membrana se monitoriza para detectar la presencia de sonda unida.
Un ensayo preferido de detección por dot-blot, se
describe en los ejemplos.
En el formato dot-blot inverso
(o blot lineal), las sondas están inmovilizadas sobre un soporte
sólido, como por ejemplo una membrana de nylon o una placa de
microtitulación. El ADN diana se marca, típicamente durante la
amplificación, mediante la incorporación de cebadores marcados. Uno
cualquiera de ambos cebadores puede estar marcado. El complejo
membrana-sonda se incuba con el ADN diana
amplificado marcado, en condiciones adecuadas de hibridación, el
ADN diana sin hibridar se elimina por lavado en condiciones
restrictivas adecuadas, y la membrana se monitorizar para detectar
la presencia de ADN diana unido. Un ensayo de detección por blot
lineal inverso, preferido, está descrito en los ejemplos.
Una sonda específica de un alelo, que es
específica para una de las variantes de polimorfismo, se emplea a
menudo conjuntamente con la sonda específica del alelo para otra
variante de polimorfismo. En ambas versiones, las sondas están
inmovilizadas sobre un soporte sólido y la secuencia diana de un
individuo se analiza empleando ambas sondas simultáneamente.
Ejemplos de conjuntos de ácidos nucleicos están descritos en la
patente WO 95/11995. Puede emplearse el mismo conjunto o un
conjunto diferente para el análisis de polimorfismos caracterizados.
La patente WO 95/11995 describe también subconjuntos que están
optimizados para la detección de formas variantes de un
polimorfismo precaracterizado. Dicho subconjunto puede emplearse
para la detección de la presencia de los polimorfismos Pro12Ala y/o
VN102 descritos en la presente.
Los polimorfismos se detectan también
habitualmente empleando métodos de amplificación específicos para
alelos o métodos de extensión de cebadores. Estas reacciones
implican típicamente el empleo de cebadores que se han diseñado
para localizar específicamente un polimorfismo por medio de un
desemparejamiento en el extremo 3' de un cebador.
La presencia de un desemparejamiento afecta la
capacidad de una polimerasa, de extender un cebador cuando la
polimerasa carece de la actividad correctora de un error. Por
ejemplo, para detectar una secuencia de alelo empleando un método
de amplificación específica del alelo o un método basado en la
extensión, se diseña un cebador complementario al alelo C (o alelo
G) del polimorfismo Pro12A1a, de tal forma que el nucleótido
terminal 3' hibrida en la posición polimórfica. La presencia del
alelo particular puede determinarse por la capacidad del cebador
para iniciar la extensión. Si el término 3' está desemparejado, la
extensión no se realiza. Así, por ejemplo, si un cebador se
empareja con el nucleótido del alelo "C" en el extremo 3', el
cebador se extenderá eficientemente.
Típicamente, el cebador se emplea juntamente con
un segundo cebador en una reacción de amplificación. El segundo
cebador hibrida en un sitio sin relación con la posición
polimórfica. La amplificación tiene lugar a partir de los dos
cebadores, conduciendo a un producto detectable que significa que la
forma alélica particular está presente. Los métodos de
amplificación específica del alelo o los métodos basados en la
extensión, están descritos, por ejemplo, en las patentes WO
93/22456; patentes U.S. n^{os} 5.137.806; 5.595.890; 5.639. 611; y
la patente U.S. nº 4.851.331.
Empleando el genotipado basado en la
amplificación específica del alelo, la identificación de los alelos
requiere solamente la detección de la presencia o ausencia de las
secuencias diana amplificadas. Los métodos para la detección de las
secuencias diana amplificadas ya son bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, la electroforesis sobre gel y los ensayos de
hibridación mediante sondas descritos, se emplean a menudo para
detectar la presencia de ácidos nucleicos.
En un método alternativo, sin sonda, el ácido
nucleico amplificado se detecta mediante la monitorización del
aumento de la cantidad total de ADN de doble cadena en la mezcla de
reacción, y se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº
5.994.056; y las publicaciones de patente europea n^{os} 487. 218
y 512.334. La detección del ADN diana de doble cadena se basa en el
aumento de la fluorescencia de varios colorantes que se unen al
ADN, por ejemplo el verde SYBR, que exhiben cuando están unidos al
ADN de doble cadena.
Como apreciará una persona experta en la
técnica, los métodos de amplificación específicos de alelo pueden
realizarse en una reacción que emplea múltiples cebadores
específicos de alelo, a los alelos diana particulares. Los
cebadores para dichas aplicaciones multiplex están generalmente
marcados con marcas distinguibles, o están seleccionados de forma
que los productos de amplificación producidos a partir de los alelos
son distinguibles por el tamaño. Así por ejemplo, los dos alelos de
una muestra única pueden ser identificados empleando una
amplificación única mediante análisis sobre gel del producto de
amplificación.
Como en el caso de las sondas específicas de
alelo, un cebador oligonucleótido específico de alelo puede ser
exactamente complementario a uno de los alelos polimórficos en la
región de hibridación, o puede tener algunos desemparejamientos en
posiciones distintas al término 3' del oligonucleótido, el cual
desemparejamiento tiene lugar en sitios no polimórficos de ambas
secuencias de alelo.
El genotipado puede también realizarse empleando
un "TaqMan®" ó "ensayo de la 5'-nucleasa"
como está descrito en las patentes U.S. n^{os} 5.210.015;
5.487.972; y 5.804.375; y en Holland et al., 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280. En el ensayo
TaqMan®, las sondas de detección marcadas que hibridan en la región
amplificada, se añaden durante la reacción de amplificación. Las
sondas se modifican de manera que se evite que las sondas actúen
como cebadores para la síntesis del ADN. La amplificación se realiza
empleando una ADN polimerasa, que tiene actividad 5' a 3'
exonucleasa. Durante cada paso de síntesis de la amplificación,
cualquier sonda que hibrida con el ácido nucleico diana, corriente
abajo a partir del cebador que se extiende, se degrada mediante la
actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa. Así, la síntesis
de una nueva cadena diana, da también como resultado la degradación
de una
sonda, y la acumulación del producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de las secuencias diana.
sonda, y la acumulación del producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de las secuencias diana.
La sonda de hibridación puede ser también una
sonda específica del alelo, que discrimina entre los alelos SNP.
Alternativamente, el método puede efectuarse empleando un cebador
específico de alelo, y una sonda marcada que se une al producto
amplificado.
Cualquier método adecuado para la detección del
producto de degradación puede emplearse en un ensayo de la 5'-
nucleasa. A menudo, la sonda de detección está marcada con dos
colorantes fluorescentes, uno de los cuales es capaz de extinguir
la fluorescencia del otro colorante. Los colorantes están sujetos a
la sonda, de preferencia, uno de ellos unido al término 5', y el
otro unido a un sitio interno, de forma que la extinción tiene lugar
cuando la sonda está en un estado no hibridado, y de forma que la
escisión de la sonda mediante la actividad exonucleasa 5' a 3' de
la ADN polimerasa tiene lugar entre los dos colorantes. La
amplificación da como resultado la escisión de la sonda entre los
colorantes con una eliminación concomitante de la extinción y un
aumento en la fluorescencia observable a partir del colorante
inicialmente extinguido. La acumulación del producto de degradación
se monitoriza mediante la medición del aumento de la fluorescencia
de la reacción. Las patentes U.S. n^{os} 5.491.063 y 5.571.673,
ambas incorporadas a la presente como referencia, describen métodos
alternativos para la detección de la degradación de la sonda que
tiene lugar concomitantemente con la amplificación.
Los PPAR\gamma2 SNPs pueden también detectarse
mediante el secuenciado directo. Los métodos incluyen por ejemplo,
los métodos basados en el secuenciado didesoxi, y otros métodos como
por ejemplo la secuencia Maxam y Gilbert (ver por ejemplo, Sambrook
y Russell, más arriba).
Otros métodos de detección incluyen el
"Pyrosequencing^{TM}" (pirosecuenciado) de los productos a lo
largo del oligonucleótido. Dichos métodos emplean a menudo técnicas
de amplificación tales como la PCR. Por ejemplo, en el
pirosecuenciado, un cebador de secuenciado se hibrida a un ADN
molde, amplificado por PCR, de una sola cadena; y se incuba con las
enzimas, ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa, y
los substratos, adenosina 5' fosfosulfato (APS) y luciferina. El
primero de cuatro desoxinucleótido trifosfatos (dNTP), se añade a
la reacción. La ADN polimerasa cataliza la incorporación del
desoxinucleótido trifosfato en la cadena de ADN, si es
complementario a la base en la cadena del molde. Cada caso de
incorporación está acompañado por la liberación de pirofosfato
(PPi) en una cantidad equimolar a la cantidad del nucleótido
incorporado. La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi
en ATP en presencia de adenosin 5' fosfosulfato. Este ATP propulsa
la conversión mediada por la luciferasa de la luciferina en
oxiluciferina, la cual genera luz visible en cantidades que son
proporcionales a la cantidad de ATP. La luz producida en la reacción
catalizada por la luciferasa, se detecta mediante una cámara o
dispositivo acoplado a la carga (CCD), y se ve como un pico en un
pyrogram^{TM} ("pirograma"). Cada señal de luz es
proporcional al número de nucleótidos incorporados. La apirasa, una
enzima que degrada los nucleótidos, degrada continuamente los dNTPs
no incorporados y el exceso de ATP. Cuando la degradación es
completa, se añade otro dNTP.
Otro método similar para la caracterización de
los SNPs, no requiere el empleo de una PCR completa, pero
típicamente emplea solamente la extensión de un cebador mediante
una única molécula de ácido didesoxirribonucleico (ddNTP), marcado
con fluorescencia, el cual es complementario al nucleótido que se
está investigando. El nucleótido en el sitio polimórfico puede
identificarse mediante la detección de un cebador que ha sido
extendido por una base y está marcado fluorescentemente (por
ejemplo, Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes, 9:
175-182, 1995).
Los productos de amplificación generados
empleando la reacción en cadena de la polimerasa, pueden ser
analizados mediante el empleo de la electroforesis en gel con
gradiente desnaturalizante. Pueden identificarse diferentes alelos
en base a las diferentes propiedades de fusión dependientes de la
secuencia, y migración electroforética del ADN en solución (ver por
ejemplo, Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications
for DNA Amplification ("Tecnología de la PCR, Principios y
aplicaciones para la amplificación del ADN"), W. H. Freeman y Co.
Nueva York, 1992, capítulo 7).
Los alelos de secuencias diana pueden
diferenciarse empleando un análisis de polimorfismo conformado con
una sola cadena, el cual identifica las diferencias de bases
mediante la alteración en migración electroforética de los
productos de la PCR de una sola cadena, como se describe por
ejemplo, en Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86,
2766-2770 (1989). Los productos amplificados por la
PCR, pueden ser generados como se ha descrito más arriba, y
calentados o de otra manera desnaturalizados, para formar productos
de amplificación de una sola cadena. Los ácidos nucleicos de una
sola cadena pueden replegarse o formar estructuras secundarias que
son parcialmente dependientes de la secuencia de las bases. Las
diferentes movilidades electroforéticas de los productos de
amplificación de una sola cadena pueden relacionarse con la
diferencia de secuencias de las bases entre alelos de la diana.
Los métodos de detección de SNP emplean a menudo
oligonucleótidos marcados. Los oligonucleótidos puede marcarse
mediante la incorporación de una marca detectable mediante métodos
espectroscopicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o
químicos. Las marcas útiles incluyen colorantes fluorescentes,
marcas radiactivas, por ejemplo, P^{32}, reactivos densos en
electrones, enzimas tales como la peroxidasa o fosfatasa alcalina,
biotina, o haptenos y proteínas para los cuales están disponibles
los antisueros o anticuerpos monoclonales. Las técnicas de marcado
son ya bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo, Current
Protocols in Molecular Biology ("Protocolos habituales en
biología molecular"), ver más arriba; Sambrook & Russell,
ver más arriba).
El polimorfismo Pro12Ala da como resultado el
polipéptido PPAR\gamma2 variante, que tiene un Pro en la posición
12 ó un Ala en las posiciones 12. Estos alelos variantes pueden por
lo tanto ser también detectados mediante métodos que discriminan
entre las dos proteínas variantes. A menudo estos métodos emplean un
anticuerpo específico para la proteína codificada por un alelo
variante.
Una visión general de la tecnología aplicable
puede encontrarse en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual ("Anticuerpos: Un manual de laboratorio") (1988), y
Harlow & Lane, Using Antibodies ("El uso de los
anticuerpos") (1999). Los métodos de producción de anticuerpos
policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con una
variante alélica, son ya conocidos por los expertos en la técnica
(véase por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology
("Protocolos corrientes en innmunología") (1991); Harlow &
Lane, ver más arriba; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice ("Anticuerpos monoclonales: principios y práctica")
(2ª edición 1986); y Kohler & Milstein, Nature
("Naturaleza") 256: 495-497 (1975)). Estas
técnicas incluyen la preparación del anticuerpo, mediante la
selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos
recombinantes en fagos o vectores similares, así como también la
preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante
inmunización de conejos o ratones (véase por ejemplo, Huse et
al., Science ("Ciencia") 246: 1275-1281
(1989); Ward et al., Nature ("Naturaleza") 341:
544-546 (1989)).
Los alelos variantes pueden detectarse mediante
una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de los
procedimientos inmunológicos e inmunoensayos, véase Basic and
Clinical Immunology ("Inmunología básica y clínica") (editores
Stites & Terr, 7ª edición, 1991). Además los inmunoensayos de la
presente invención pueden realizarse en cualquiera de varias
configuraciones, las cuales están revisadas extensivamente en Enzyme
Immunoassay ("Inmunoensayos con enzimas") (editorial Maggio,
1980); y Harlow & Lane, ver más arriba. Para una revisión de
los inmunoensayos generales, véase también Methods in Cell Biology:
Antibodies in Cell Biology ("Métodos en Biología Molecular:
Anticuerpos en Biología Celular"), volumen 37 (editorial Asai
1993); Basic and Clinical Immunology ("Inmunología básica y
clínica") (editores Stites & Teer, 7ª edición 1991).
Los ensayos usados corrientemente incluyen
ensayos no competitivos, por ejemplo, ensayos sandwich, y ensayos
competitivos. Típicamente, puede emplearse un ensayo como por
ejemplo un ensayo ELISA. La cantidad de variante del polipéptido
puede determinarse efectuando análisis cuantitativos.
Otras técnicas de detección, por ejemplo, MALDI,
pueden emplearse para determinar directamente la presencia de un
Pro frente a un Ala en la posición 12 de PPAR\gamma2.
Tanto mujeres como machos pueden ser analizados
para detectar la presencia de polimorfismo. Los análisis pueden
realizarse a cualquier edad. Las frecuencias alélicas pueden variar
en poblaciones particulares. Típicamente las poblaciones
caucasianas tienen el alelo Ala con la más alta frecuencia
(aproximadamente el 12%).
Como será apreciado por los expertos en la
técnica, los métodos de la presente invención pueden emplearse
conjuntamente con otros análisis para detectar una propensión a las
enfermedades de densidad ósea, como por ejemplo la osteoporosis. En
algunas versiones, por ejemplo si un paciente presenta factores de
riesgo adicionales para la osteoporosis, el método puede comprender
un paso adicional de evaluación de la densidad ósea.
Los métodos de la invención implican típicamente
el registro de la presencia de SNPs, asociada a una propensión a
las enfermedades de densidad ósea. Esta información puede
almacenarse en un ordenador en forma legible. Dicho sistema de
ordenador comprende típicamente subsistemas mayores tales como un
procesador central, un sistema de memoria (típicamente RAM), un
controlador de entrada/salida (I/O), un dispositivo externo tal
como por ejemplo una pantalla display por medio de un adaptador
display, portales en serie, un teclado, un drive de disco fijo vía
una interfase de almacenamiento y un drive de disco flexible
operativo para recibir un disco flexible, y un dispositivo
CD-ROM (ó DVD-ROM) operativo para
recibir un CD-ROM. Pueden conectarse muchos otros
dispositivos, como por ejemplo una network interface ("adaptador a
la red") conectada por medio de un portal en serie.
El sistema de ordenador, unido también a una
red, comprende una pluralidad de dispositivos de ordenador unidos
por medio de un enlace de datos, tales como un cable Ethernet
(coaxial ó 10BaseT), línea de teléfono, línea de ISDN, red
inalámbrica, fibra óptica, u otro medio de transmisión por señal
adecuado, en donde por lo menos un dispositivo de red (por ejemplo
un ordenador, un conjunto de discos, etc.) comprende un modelo de
dominios magnéticos (por ejemplo un disco magnético) y/o dominios
de carga (por ejemplo un conjunto de células DRAM), formando un
modelo de bits que codifica los datos obtenidos a partir de un
ensayo de la invención.
El sistema ordenador puede comprender un código
para la interpretación de resultados de un estudio de genotipos
evaluando el PPAR\gamma2 polimórfico, los alelos polimórficos
Pro12Ala y VN102. En algunas versiones el sistema ordenador
comprende también un código para la interpretación de los resultados
de un estudio de genotipos que evalúa el polimorfismo del sitio de
unión COL1A1 intrón 1 Sp1. De esta forma, en una versión de
ejemplo, los resultados del genotipo se proporcionan a un ordenador
en donde un procesador central ejecuta un programa de ordenador
para determinar
la propensión a un aumento o disminución del riesgo de las condiciones que implican la pérdida de densidad ósea.
la propensión a un aumento o disminución del riesgo de las condiciones que implican la pérdida de densidad ósea.
La invención proporciona también el empleo de un
sistema de ordenador, como el que se ha descrito más arriba, el
cual comprende: (1) un ordenador; (2) un modelo de bits almacenado
que codifica los resultados de genotipos obtenidos mediante métodos
de la invención, los cuales pueden almacenarse en el ordenador; (3)
y opcionalmente, (4) un programa para la determinación del riesgo a
una enfermedad relacionada con la pérdida de densidad ósea.
Una versión de la presente invención es la
siguiente:
Un método para la determinación de la propensión
de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual método
comprende:
a) detección de la presencia de los alelos
homocigóticos PPAR\gamma Pro12 ó los alelos homocigóticos
PPAR\gamma VN102 "G", en una muestra del individuo; y
b) registro de un diagnóstico de un mayor riesgo
de osteoporosis en el caso de estar presentes los alelos homogéneos
PPAR\gamma Pro12 ó los alelos homogéneos PPAR\gamma VN102
"G".
\vskip1.000000\baselineskip
Otra versión es un método para la detección de
la propensión de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual
método comprende:
a) detección de la presencia de los alelos
homocigotos PPAR\gamma Pro12 ó los alelos homocigotos PPAR\gamma
VN102 "G" en el individuo; y
b) registro de un diagnóstico de un mayor riesgo
de osteoporosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos anteriores pueden además comprender
un paso para la determinación de si un alelo "T" del sitio Sp1
del intrón 1 COL1A1, está presente en una muestra del individuo.
De preferencia, en los métodos anteriores el
diagnóstico se registra sobre una forma legible de computador.
En los métodos anteriores, los alelos Pro 12
pueden ser detectados mediante la determinación de la presencia de
un nucleótido C, en la posición 1 del codón que codifica Pro12 de
PPAR\gamma2 en una muestra del ADN genómico del individuo, de
preferencia la muestra del ADN genómico está obtenida de la
sangre.
Incluso con más preferencia, el paso de
determinación de la presencia de un nucleótido C comprende una
reacción de amplificación, en donde la reacción de amplificación
más preferida es la reacción en cadena de la polimerasa.
La reacción de amplificación puede realizarse
con un juego de cebadores que comprenden un oligonucleótido
específico de alelo para el alelo Pro y un oligonucleótido
específico del alelo, para el alelo Ala. El oligonucleótido
específico del alelo puede comprender el juego de secuencias de
cebador indicado en SEQ ID NO:1 y 2. Además, la reacción de
amplificación puede comprender un paso de hibridación de un producto
amplificado con una sonda marcada que se une específicamente al
alelo Pro ó al alelo Ala.
De preferencia, en los métodos anteriores, los
alelos VN102 pueden ser detectados en un ADN genómico a partir de
individuos, y de preferencia, la muestra de ADN genómico se obtiene
a partir de la sangre.
Incluso con más preferencia, el paso de
determinación de la presencia del alelo VN102 comprende una reacción
de amplificación, en donde con la mayor preferencia, la reacción de
amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa. La
reacción de amplificación puede realizarse con un juego de cebadores
que comprende un oligonucleótido específico de un alelo para el
alelo "G" y un oligonucleótido específico de un alelo para el
alelo "A". El oligonucleótido específico de un alelo puede
comprender las secuencias de cebador indicadas en SEQ ID NO: 4 y
5.
Además, la reacción de amplificación puede
comprender un paso de hibridación de un producto amplificado con
una sonda marcada que asegure específicamente al alelo G ó al alelo
A.
De preferencia, en todos los métodos anteriores
el individuo es una hembra.
De preferencia también, en todos los métodos
anteriores el individuo es un caucasiano.
Todos estos métodos pueden además comprender un
paso de ejecución de un ensayo de densidad ósea sobre el
individuo.
\newpage
La invención proporciona también unos kits que
comprenden los componentes útiles para la práctica de los métodos.
En algunas versiones, el kit comprende sondas de detección
específicas del alelo, las cuales opcionalmente pueden fijarse a
una membrana de soporte apropiada. Dicho kit puede también contener
cebadores de amplificación para amplificar una región del locus
PPAR\gamma2 que abarca el sitio polimórfico. Además, el kit puede
comprender cebadores para amplificar una región del gen COL1A1 para
detectar el polimorfismo del intrón 1 del SP1 descrito en la
presente. Alternativamente, los kits útiles pueden contener un juego
de cebadores que comprenden un cebador específico del alelo para la
amplificación específica de los alelos polimórficos. Dicho kit puede
también comprender sondas para la detección de los productos de
amplificación.
Otros componentes opcionales de los kits
incluyen reactivos adicionales empleados para los individuos con un
determinado genotipo. Por ejemplo, un kit puede contener una
polimerasa, substrato de nucleósido trifosfatos, medios para el
marcado y/o detección del ácido nucleico (por ejemplo, un conjugado
de avidina-enzima y substrato de enzima y
cromógeno, si la marca es de biotina), tampones apropiados para las
reacciones de amplificación o hibridación, e instrucciones para
efectuar el presente método.
Varios PPAR\gamma SNPs conocidos fueron
seleccionados por asociación con la osteoporosis (figura 1). Se
determinó que dos SNPs tenían una asociación con riesgo de fractura
de cadera. Además, se determinó que los SNPs tenían una interacción
con el polimorfismo COL1A1 Sp1, de forma que el riesgo fue mayor
cuando estaban presentes los genotipos PPAR\gamma y COL1A1
asociados a la osteoporosis. Se observó un efecto interactivo entre
los genotipos PPAR\gamma y COL1A1 en ambas fracturas vertebrales y
una baja densidad de la masa ósea (BMD).
La asociación del polimorfismo de Pro 12Ala con
el riesgo de osteoporosis, se efectuó mediante la evaluación de la
presencia del polimorfismo en una población de mujeres de edad, de
pacientes americanos. Las muestras del ADN genómico de los
pacientes, incluían muestras de control y muestras de mujeres de
edad con fractura de cadera, fracturas vertebrales, y/o baja
densidad mineral ósea (BDM). Se seleccionaron los polimorfismos
individuales de nucleótidos en el PPAR\gamma2, para detectar la
asociación con cualquiera de estos fenotipos.
El análisis de la presencia de los alelos
"C" y "G", se efectuó empleando oligonucleótidos
específicos de alelo, en una PCR. El cebador específico de alelo
para detectar el primer alelo fue el
5'-GAAGGAATCGCTTTCTGG-3' (SEQ ID
NO:1). El cebador específico de alelo para el segundo alelo fue el
5'-GAAGGAATCGCTTTCTGC-3' (SEQ ID
NO:2). La posición dudosa de los cebadores está en el extremo 3'. El
cebador habitual empleado para la amplificación de la región diana
del PPAR\gamma2 fue el
5'-GGTGAAACTCTGGGAGATTCTCCTA-3' (SEQ
ID NO:3). La PCR se efectuó a una temperatura de reasociación de
58ºC. Los cebadores estuvieron en una concentración de 0,2 \muM.
La reacción se efectuó en un volumen de 50 \mul en una mezcla que
comprendía 10 mM de Tris HCl de pH 8,0; 3 mM de MgCl_{2}; 50
\muM de cada uno de los dATP, dCTP, y dGTP; 25 \muM de dTTP; 75
\muM de dUTP, 0,1 U de UNG, 4% de DMSO, 2% de glicerina; 0,2X de
verde de SYBR, 6U de CEA2 oro polimerasa; y 3,5-10
ng de ADN de genoma humano. La reacción se efectuó empleando una
incubación inicial de 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 12
minutos, seguido de 45 ciclos de 95ºC durante 20 segundos y 58ºC
durante 20 segundos.
Una asociación alélica con la fractura de cadera
se encontró en el gen PPAR\gamma para el SNP Pro12A1a (también
llamado en la presente como SNP 2)(OMIM 601487.0002), con un valor p
de 0,06 y un ratio de anormales de 1,45. Después de ajustar por la
edad, peso, y empleo de estrógeno, la asociación con Pro12Ala tuvo
un valor p de 0,02 y un ratio de anormales de 1,76. Un resumen de
los resultados está presentado en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La asociación del polimorfismo VN102, con el
riesgo de osteoporosis, se efectuó mediante la evaluación de la
presencia del polimorfismo en la misma población de mujeres mayores
de pacientes americanos analizados más arriba.
El análisis para detectar la presencia de los
alelos "G" y "A", se efectuó empleando oligonucleótidos
específicos de alelo en una PCR. El cebador específico de alelo
para detectar el primer alelo fue la
5'-GTCTTGGGCCTTTAGGAG-3' (SEQ ID
NO:4). El cebador específico de alelo para el segundo alelo fue la
5'-GTCTTGGGCCTTTAGGAA-3' (SEQ ID
NO:5). La posición dudosa de los cebadores está en el extremo 3'. El
cebador habitual empleado para amplificar la región diana del
PPAR\gamma2 fue la
5'-GGCACTGTTTCTCTGTTAAAAATGTG-3'
(SEQ ID NO:6). La PCR se efectuó a una temperatura de reasociación
de 58ºC. Los cebadores estuvieron en una concentración de 0,2
\muM. La reacción se efectuó en un volumen de 50 \mul en una
mezcla que comprendía 10 mM de Tris HCl de pH 8,0; 0,3 mM de
MgCl_{2}; 50 \muM de cada uno de los dATP, dCTP, y dGTP, y 25
\muM de dTTP; 75 \muM de dUTP; 0,1 U de UNG, 4% de DMSO, 2% de
glicerina; 0,2 X de verde SYBR; 6U de CEA2 oro polimerasa; y
3,5-10 ng de ADN genómico humano. La reacción se
efectuó empleando una incubación inicial de 50ºC durante 2 minutos,
95ºC durante 12 minutos; seguido de 45 ciclos de 95ºC durante 20
segundos y 58ºC durante 20 segundos.
Una asociación alélica con la fractura de cadera
se encontró en el gen PPAR\gamma para el SNP VN102 (rs 1899951)
con un valor p de 0,04 y un ratio de anormales de 1,51. Después del
ajuste por edades, peso, y empleo de estrógeno, la asociación con
VN102 tenía un valor p de 0,01, y un ratio de anormales de 1,85. Un
resumen de los resultados está mostrado en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha informado que, una mutación "G" a
"T" en un sitio de unión Sp1 en el intron 1 del gen COL1A1, va
asociada con una densidad mineral ósea (BMD) reducida, en humanos.
La asociación del polimorfismo Pro12Ala ó del VN102 en combinación
con esta mutación en el COL1A1, con el riesgo de osteoporosis, se
efectuó mediante la evaluación de la presencia de estos
polimorfismos en la misma población de mujeres mayores americanas
pacientes analizadas más arriba.
El análisis de la presencia de los alelos
"G" y/o "T" se efectuó empleando oligonucleótidos
específicos de alelo en una PCR. El cebador específico de alelo
para detectar el primer alelo fue el
5'-CTGCCCAGGGAATGG-3' (SEQ ID
NO:7). El cebador específico de alelo para el segundo alelo fue el
5'- CCTGCCCAGGGAATGT-3' (SEQ ID NO:8). La posición
dudosa de los cebadores está en el extremo 3'. El cebador habitual
empleado para amplificar la región diana de COL1A1 fue el
5'-AAGGGAGGTCCAGCCCTCAT-3' (SEQ ID
NO:9). La PCR se efectuó a una temperatura de reasociación de 58ºC.
Los cebadores estuvieron en una concentración de 0,2 \muM. La
reacción se efectuó en un volumen de 50 \mul en una mezcla que
contenía 10 mM de Tris HCl pH 8,0; 3 mM de MgCl_{2}; 50 \muM de
cada uno de los dATP, dCTP y dGTP; 25 \muM de dTTP; 75 \muM de
dUTP, 1U de UNG, 4% de DMSO, 2% de glicerina, 0,2X de verde SYBR;
6U de CEA2 oro polimerasa; y 3,5-10 ng de ADN
genómico humano. La reacción se efectuó empleando una incubación
inicial de 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 12 minutos, seguido
por 45 ciclos de 95ºC durante 20 segundos y 58ºC durante 20
segundos.
Se observó un efecto interactivo entre los
genotipos PPAR\gamma y COL1A1 tanto en las fracturas vertebrales
como en la baja BMD (p = 0,009 y 0,002 respectivamente, después de
ajustar según la edad, peso, y empleo de estrógeno). Hubo tres
veces más de riesgo (OR = 2,9, p = 0,01) de fractura vertebral para
el genotipo Pro/Pro entre mujeres que tenían el alelo de riesgo
COL1A1 después de ajustar según la edad, peso y empleo de estrógeno.
Un mayor riesgo fue observado también para los otros dos fenotipos
osteoporóticos. El mismo efecto se observó también para
PPARG_VN102. Estos datos indican una nueva interacción interlocus
entre PPAR\gamma y COL1A1 y la susceptibilidad genética a la
osteoporosis en mujeres caucasianas de edad. Un resumen de los
resultados está mostrado en la figura 2.
Aunque la invención ha sido descrita con cierto
detalle mediante ilustraciones y ejemplos con el fin de una mayor
claridad y comprensión, será fácilmente evidente para los expertos
en la técnica, a la luz de las enseñanzas de esta invención, que
pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones en la misma, sin
apartarse por ello del espíritu o ámbito de las reivindicaciones
anexas.
<110> F. Hoffmann - La Roche AG
\hskip1cmGrenzacherstrasse 124
\hskip1cm4070 Basilea
\hskip1cmSuiza
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS DE
NUCLEÓTIDOS INDIVIDUALES EN EL PPARgamma, CON LA OSTEOPOROSIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Case 22482
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/584.116
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-06-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para windows versión
4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggaatcg ctttctgg
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggaatcg ctttctgc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211>
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgaaactc tgggagattc tccta
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcttgggcc tttaggag
\hfill18
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<210> 5
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcttgggcc tttaggaa
\hfill18
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<210> 6
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipggcactgttt ctctgttaaa aatgtg
\hfill26
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 7
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\hfill15
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<210> 8
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 8
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<210> 9
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipaagggaggtc cagccctcat
\hfill20
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<110> F. Hoffmann - La Roche AG
\hskip1cmGrenzacherstrasse 124
\hskip1cm4070 Basilea
\hskip1cmSuiza
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<120> ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS DE
NUCLEÓTIDOS INDIVIDUALES EN EL PPARgamma, CON LA OSTEOPOROSIS
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<130> Case 22482
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<150> US 60/584.116
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<151>
2004-06-29
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<160> 9
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<170> FastSEQ para windows versión
4.0
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<210> 1
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 1
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<210> 2
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador
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\hfill25
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<212> ADN
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\hfill18
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\hskip-.1em\dddseqskipaagggaggtc cagccctcat
\hfill20
Claims (22)
1. Un método para la determinación de la
propensión de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual
método comprende:
detección de la presencia de los alelos
homocigotos PPAR\gamma Pro12Ala, ó de los alelos homocigotos
PPAR\gamma VN102G en una muestra del individuo; y
registro de un diagnóstico de un mayor riesgo de
osteoporosis cuando los alelos homocigotos PPAR\gamma Pro12Ala ó
los alelos homocigotos PPAR\gamma VN102G están presentes.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además un paso para la determinación de si el alelo
"T" del sitio Sp1 del intrón 1 de COL1A1 está presente en la
muestra del individuo.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el
diagnóstico se registra sobre una forma legible de ordenador.
4. El método de la reivindicación 1, en donde
los alelos Pro12Ala se detectan mediante la determinación de la
presencia de un nucleótido C en la posición 1 del codón que codifica
el Pro12 de PPAR\gamma en una muestra de ADN genómico del
individuo.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la
muestra de ADN genómico se obtiene a partir de la sangre.
6. El método de la reivindicación 4, en donde el
paso de determinación de la presencia de un nucleótido C comprende
una reacción de amplificación.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la
reacción de amplificación es una reacción en cadena de la
polimerasa.
8. El método de la reivindicación 6, en donde
la reacción de amplificación se efectúa con un juego de cebadores
que comprende un oligonucleótido específico de alelo para el alelo
Pro, y un oligonucleótido específico de alelo para el alelo
Ala.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el
oligonucleótido específico de alelo comprende las secuencias de
cebadores indicadas en SEQ ID NO:1 y 2.
10. El método de la reivindicación 6, en donde
la reacción de amplificación comprende un paso de hibridación de un
producto amplificado con una sonda marcada que se une
específicamente al alelo Pro ó al alelo Ala.
11. El método de la reivindicación 1, en donde
los alelos VN102 se detectan en un ADN genómico a partir del
individuo.
12. El método de la reivindicación 11, en donde
la muestra de ADN genómico se obtiene a partir de la sangre.
13. El método de la reivindicación 11, en donde
el paso de determinación de la presencia del alelo VN102 comprende
una reacción de amplificación.
14. El método de la reivindicación 13, en donde
la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la
polimerasa.
15. El método de la reivindicación 13, en donde
la reacción de amplificación se efectúa con un juego de cebadores
que comprende un oligonucleótido específico de alelo para el alelo
"G" y un oligonucleótido específico de alelo para el alelo
"A".
16. El método de la reivindicación 15, en donde
el oligonucleótido específico de alelo comprende las secuencias de
cebadores indicadas en la SEQ ID NO:4 y 5.
17. El método de la reivindicación 6, en donde
la reacción de amplificación comprende un paso de hibridación de un
producto amplificado con una sonda marcada que se une
específicamente al alelo G ó al alelo A.
18. El método de la reivindicación 1, en donde
el individuo es una mujer.
19. El método de la reivindicación 1, en donde
el individuo es un caucasiano.
20. El método de la reivindicación 1, que
comprende además un paso de realización de un ensayo de densidad
ósea del individuo.
21. Un método para la determinación de la
propensión de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual
método comprende:
detección de la presencia en una muestra del
individuo, de alelos PPAR\gamma homocigotos, en donde los alelos
PPAR\gamma homocigotos son los alelos PPAR\gamma Pro12Ala ó
PPAR\gammaVN102G; y
detección de la presencia o ausencia de un alelo
"T" COL1A1;
en donde la presencia de alelos PPAR\gamma
homocigotos, y la presencia de un alelo "T" COL1A1, es
indicativa de un riesgo mayor de osteoporosis, en relación a la
detección de los alelos PPAR\gamma homocigotos, o solamente de un
alelo "T" COL1A1.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un kit para la determinación de la
propensión de un individuo a desarrollar osteoporosis, el cual kit
comprende:
- un juego de cebadores de amplificación que
comprende un oligonucleótido específico de alelo para el alelo
"G" PPAR\gammaVN102, y un oligonucleótido específico de alelo
para el alelo "A" PPAR\gammaVN102
- tampones para la amplificación, en donde el
juego de cebadores comprende las secuencias de cebador indicadas
en la SEQ ID No. 4 y 5.
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