RU2816650C1 - Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица - Google Patents
Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816650C1 RU2816650C1 RU2023130664A RU2023130664A RU2816650C1 RU 2816650 C1 RU2816650 C1 RU 2816650C1 RU 2023130664 A RU2023130664 A RU 2023130664A RU 2023130664 A RU2023130664 A RU 2023130664A RU 2816650 C1 RU2816650 C1 RU 2816650C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- name
- value
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 201000007410 Smith-Lemli-Opitz syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 102220002590 rs104894213 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 22
- 101150060473 DHCR7 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 5
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 101000928720 Homo sapiens 7-dehydrocholesterol reductase Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 106
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 106
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 14
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 12
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 11
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102100036512 7-dehydrocholesterol reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010056679 7-dehydrocholesterol reductase Proteins 0.000 description 1
- 206010009269 Cleft palate Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N Dehydrocholesterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 UCTLRSWJYQTBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010042778 Syndactyly Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 206010021093 hypospadias Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000004141 microcephaly Diseases 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 208000003580 polydactyly Diseases 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008132 psychomotor development Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000005287 template synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области генетического тестирования. Описан способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица, предусматривающий выявление наследования патогенных вариантов NC_000011.9:g.711524470Т (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную. Техническим результатом является создание тест-системы для диагностики патогенного варианта NC_000011.9:g.71152447C>T (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. 2 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица. синдром Смита-Лемли-Опица- это наследственное заболевание, характеризующееся аутосомно-рецессивным типом наследования и широко вариабельной экспрессивностью, синдром Смита-Лемли-Опица встречается с частотой 1 на 20000-30000 новорожденных. Это заболевание приводит к нарушению холестеринового обмена, выраженной задержке физического и психомоторного развития, множеству аномалий развития - пороки сердца, аномалии развития головного мозга, микроцефалия, волчья пасть, гипоспадия, полидактилия, синдактилия 2-3 пальцев ног. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.
К заболеванию синдром Смита-Лемли-Опица могут приводить патогенные генетические варианты в гене DHCR7, располагающемся на хромосоме 11. [DeBarber, A. et al. (2011). Smith-Lemli-Opitz syndrome. Expert Reviews in Molecular Medicine, 13, E24.] Этот ген кодирует белок 7-дегидрохолестерин-редуктаза - фермент, который превращает предшественник холестерина - 7-дегидрохолестерин - в холестерин.
ПГТ синдрома Смита-Лемли-Опица проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.
Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ синдрома Смита-Лемли-Опица предложенное Natesan, S. А. и коллегами [Natesan, S. A. et al, Reprod Biomed Online, 2014; 29(5),600-605] для детекции патогенного варианта в гене DHCR7 с помощью ПЦРв 1 раунд на единичных клетках, с помощью прямой детекции мутации и анализа наследования аллелей 3х полиморфных маркеров, сцепленных с геном. Важным преимуществом предлагаемого нами подхода является использование большего количества полиморфных маркеров(14) находящихся на расстоянии менее 3 Мб от гена, что снижает веротяность недостоверного результата из-за выпадения аллеля или рекомбинации, а также использование гнездовой и полугнездовой ПЦР для большей спецефичности и продуктивности реакций.
Представленный нами метод ПГТ синдрома Смита-Лемли-Опица решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000011.9:g.71152447C>T (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Данный вариант был описан в научной литературе как патогенный [Fitzky BU. et al. Mutations in the Delta7-sterol reductase gene in patients with the Smith-Lemli-Opitz syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jul 7;95(14):8181-6] Двойная система детекции необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта NC_000011.9:g.71152447C>T (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) типа однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, англ. Single nucleotide polymorphism SNP) были подобраны эндонуклеазы рестрикции, которые позволяют произвести детекцию патогенного варианта методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестриктных фрагментов), основанным на разнице последовательности в сайте рестрикции у различных аллелей. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена DHCR7 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген DHCR7, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген DHCR7 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 14 STR локусов для гена DHCR7: D11S6816, D11S7047, D11S4139, D11S7053, D11S7064, D11S7067, D11S7079, D11S7175, D11S7200, D11S1314, D11S7267, D11S4184, D11S7304, D11S7315. Праймеры для амплификации фрагментов ДНК, содержащих STR локусы находятся на 11 хромосоме в районе координат 68165431-73154042 (в соответствии с hg19). Их последовательности перечислены в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-46. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п. н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.
Подготовительный этап ПГТ
На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mМ, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mМ каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1xPCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton Х-100, 1 мкг Proteinase К), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.
В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.
Полугнездовая ПЦР
Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п. н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. Последовательности праймеров для амплификации фрагментов ДНК, содержащих STR локусы перечислены в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-46. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1хПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mМ каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.
В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1хПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μМ каждого праймера,1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативные (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона).
Полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) - это способ исследования геномной ДНК, путем специфичного расщипления ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. При использовании данного метода наблюдаются фрагменты различной длины в зависимости от различий в последовательности нуклеотидов в сайте рестрикции, что позволяет детектировать однонуклеотидные варианты, если они располагаются в сайте рестрикции. Более точную детекцию патогенного варианта может обеспечить секвенирование по методу Сэнгера, однако в условиях ПГТ метод ПЦР-ПДРФ оказывается более эффективным из-за сниженной вероятность выпадения аллеля (allele drop out, ADO) и, как следствие, ошибочного результата по оценке статуса эмбриона по патогенному варианту.
Для детекции патогенного варианта NC_000011.9:g.71152447С>Т (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) была разработана тест-система на основе ПЦР-ПДРФ. Стадия амплификации подробно описана в предыдущем разделе. Были использованы следующие праймеры:
Внешние: (прямой), (обратный),
Внутренние для детекции аллеля гена DHCR7 дикого типа: (прямой), (обратный)
Внутренние для детекции мутантного аллеля гена DHCR7: (прямой), (обратный). Далее продукты амплификации с внутренних праймеров для детекции патогенного варианта использовали в реакции рестрикции. Эндонуклеаза BseNI разрезает только аллель дикого типа, эндонуклеаза FspBI разрезает только мутантный аллель варианта NC_000011.9:g.71152447C>T (NM__001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter). Детекция проводилась с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле.
Пример 1
Пациенты А
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в анамнезе которой было прерывание беременности плодом с заболеванием синдром Смита-Лемли-Опица с гомозиготным носительством патогенного варианта NC_000011.9:g.71152447C>T (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания синдром Смита-Лемли-Опица в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.
Гаплотипирование семьи
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 14 STR локусов. Фрагменты ДНК, содержащие STR локусы, амплифицировались с помощью праймеров, представленных в перечне SEQ ID NO 1-46 в формуле изобретения. Из них 11 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры.
Аллели, совпадающие у плода с заболеванием и родителя - носителя патогенного варианта NC_000011.9:g.711524470Т (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7 признавались сцепленными друг с другом и с патогенным вариантом. Несовпадающие у родителя и ребенка с заболеванием аллели признавались сцепленными с друг другом и с нормальным аллелем гена DHCR7. Полученные результаты по информативным маркерам представлены в таблице 1. Аллели, указанные на одной строке, располагаются на одной хромосоме, то есть, представляют группу сцепления. Таким образом для каждого члена семьи представлено по 2 группы сцепления, соответствующие каждой из двух одиннадцатых хромосом человека. Вариант NC_000011.9:g.711524470Т (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7 обозначен в таблице как DHCR7 c.452G>A. N в таблице обозначает аллель дикого типа (нормальный аллель), mut - мутантный аллель. Цифрами записаны длины ампликонов в парах нуклеотидов; их длины, зависят от количества повторов в маркере STR.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у партнера пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D11S6816 - 288, D11S7047 - 235, D11S7064 - 323, D11S7067 - 273, D11S7079- 194, D11S7175 - 265, D11S7200 - 219, D11S1314-274, D11S7267 - 199, D11S4184 - 173, D11S7304 - 223. У пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D11S6816 - 301, D11S7047 - 233, D11S7064 - 323, D11S7067 - 270, D11S7079 - 209, D11S7175 -259, D11S7200 - 221, D11S1314 - 288, D11S7267 - 199, D11S4184 - 175, D11S7304-225.
Преимплантационное генетическое тестирование
В цикле ЭКО было получено 8 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (lxPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты:
По результатам прямой и косвенной диагностики 6 эмбрионов не унаследовали заболевание, у 2 эмбрионов выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. Так как у эмбрионов 2 и 3 произошла рекомбинация в отцовской хромосома между точной мутации и ближайшим к ней STR локусом, вывод о том, что эти эмбрионы не унаследовали патогенный вариант от отца (от партнера пациентки), был сделан на основе данных прямой диагностики. По запросу родителей для эмбрионов 2, 3, 4, 5 и 7 провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов эмбрионы 2, 3, 4 и 5 были рекомендованы к переносу. Эмбрион 7 не был рекомендован в связи с анэуплоидией.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ
преимплантационного генетического тестирования синдрома
Смита-Лемли-Опица.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-11-02">
<ApplicantFileReference>Способ преимплантационного генетического
тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Публичное акционерное общество
«Центр Генетики и Репродуктивной Медицины «ГЕНЕТИКО»</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>GENETICO PJSC</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ преимплантационного
генетического тестирования синдрома
Смита-Лемли-Опица</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>46</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcatttcgcttgtctgtgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acgtgtttaaaggggagagtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acttacagcgggagtgatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaaacaggggagggtagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttataaccccagcttgtcat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccaagagaaaaggaccagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccaatgagctgaacaacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgggctaactcgatttgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caccacctatagacttcagcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgggctaactcgatttgta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttctcataggtctgtaaagagga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtttgaccctcacctcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agttaaagcgattctcctgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaatagttcttgccagtatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaaaacagggcaatgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgagaacacgtagcaaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggattctactaaaagccagatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaagctacgtggagcatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctgatatagggcgtacactcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acaccgccatttttattgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caacccttctcaattaacca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttgtagatgtcagttacttaagcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccttctcaattaaccaactg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctggaagttgatgggttctt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccactccatctttgtagccta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctgcacgttgagctgtagag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcaatcaggaaccagacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcactcttaccccactgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctggttgttagagggaggt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q60">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgtgtgaacccagtcctta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q62">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gggcttcgatcttaaaagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q64">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaaattgcggctcttttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q66">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccacacaaatacatattgcta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="34">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q68">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aattgcctggtttttatgct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="35">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q70">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgacctcaagttcaccaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="36">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q72">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agaccatctaagcctgtgaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="37">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q74">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctcaattattttcttgcttcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="38">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q76">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agatagacatttcaacgcacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="39">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q78">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctgtgcttttaaaaccatcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="40">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q80">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctgatgagcagaggtagaactatac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="41">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q82">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggaaggagggtgcttaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="42">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q84">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaagcccagagattcatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="43">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q86">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgcccactgttaatgttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="44">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q88">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaagtgacagcttgaggaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="45">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q90">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggagggcaagaattatgtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="46">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q92">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctttagttatgtgctcctaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (5)
- Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица, предусматривающий выявление наследования патогенных вариантов NC_000011.9:g.711524470Т (NM_001360.2:c.452G>A, p.Trp151Ter) в гене DHCR7, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную, где прямую детекцию осуществляют с помощью следующих праймеров для амплификации:
- Внешние: 5’-ACCCGCTGCTAAGAACAT-3’ (прямой), 5’-ACGAGATCCAGAACCAAAG-3’ (обратный),
- Внутренние для детекции аллеля гена DHCR7 дикого типа: 5’-CGCTGCTAAGAACATACCAG-3’ (прямой), 5’-CAATGGCCTGCAAGACT-3’ (обратный),
- Внутренние для детекции мутантного аллеля гена DHCR7: 5’-AGGACAGGAGATGAGCGT-3’ (прямой), 5’-CCCAGAAAGTGACCAGG-3’ (обратный),
- а косвенную детекцию осуществляют с помощью праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа STR, сцепленных с патогенными вариантами, выбранных из SEQ ID NO: 1-46, при этом используют праймеры, направленные на те STR, аллели которых разные на хромосомах хотя бы одного родителя-носителя мутации, где внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратный праймер), а внутренние праймеры обозначены как Fin (прямой праймер) и Rin (обратный праймер), при этом диагностику проводят в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводят мультиплексную ПЦР с внешними праймерами, на втором этапе проводят индивидуальную ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами для STR, а также проводят ПЦР-ПДРФ для определения патогенных вариантов в гене DHCR7.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816650C1 true RU2816650C1 (ru) | 2024-04-02 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671156C1 (ru) * | 2017-08-21 | 2018-10-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии типа 1 |
| RU2697398C2 (ru) * | 2018-01-23 | 2019-08-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ преимплантационной генетической диагностики анемии Фанкони |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671156C1 (ru) * | 2017-08-21 | 2018-10-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии типа 1 |
| RU2697398C2 (ru) * | 2018-01-23 | 2019-08-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр Генетики и Репродуктивной Медицины "ГЕНЕТИКО" | Способ преимплантационной генетической диагностики анемии Фанкони |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| /j.rbmo.2014.07.007. Reprod Biomed Online. 2014; 29: 600-605. * |
| DeBarber AE, Eroglu Y, Merkens LS, Pappu AS, Steiner RD. Smith-Lemli-Opitz syndrome. Expert Rev Mol Med. 2011 Jul 22; 13:e24. doi: 10.1017/S146239941100189X. PMID: 21777499; PMCID: PMC3366105. * |
| Natesan S.A., Handyside A.H., Thornhill A.R. et al. Live birth after PGD with confirmation by a comprehensive approach (karyomapping) for simultaneous detection of monogenic and chromosomal disorders. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Anasagasti et al. | Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa | |
| US20150218631A1 (en) | Methods of fetal abnormality detection | |
| US20080311565A1 (en) | Methods and Kits for Detecting Germ Cell Genomic Instability | |
| US20100092959A1 (en) | Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia | |
| US20210102246A1 (en) | Genetic test for detecting congenital adrenal hyperplasia | |
| Jeppesen et al. | Cell‐based non‐invasive prenatal diagnosis in a pregnancy at risk of cystic fibrosis | |
| Capucchio et al. | Degenerative myelopathy in German Shepherd Dog: comparison of two molecular assays for the identification of the SOD1: c. 118G> A mutation | |
| US20220372575A1 (en) | A kit for detection of mutations causing genetic disorders | |
| RU2816650C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Смита-Лемли-Опица | |
| RU2803650C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования спондилоэпифизарной дисплазии | |
| RU2795482C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования ахондроплазии | |
| RU2796834C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Мартина-Белл | |
| RU2795481C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Альпорта | |
| RU2799541C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования наследственной зонулярной катаракты | |
| RU2795483C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования остеопетроза 4 типа | |
| RU2799538C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования Блефарофимоза, птоза и синдрома обратного эпикантуса типа 1,2 | |
| KR20130041767A (ko) | 정상 안압 녹내장 질환 감수성 유전자 및 그 이용 | |
| RU2791878C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования несиндромальной нейросенсорной тугоухости | |
| RU2795796C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования Гемофилии А | |
| RU2808833C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии | |
| RU2772938C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии | |
| RU2671156C1 (ru) | Способ преимплантационной генетической диагностики спинальной мышечной атрофии типа 1 | |
| RU2742956C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования метахроматической лейкодистрофии | |
| RU2792147C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования анемии Фанкони | |
| RU2777091C1 (ru) | Способ преимплатационного генетического тестирования рака молочной железы и яичников |