JP2016063833A - アレリックラダー遺伝子座 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトのD10S1248およびD12S391遺伝子座における、まれな短縦列反復(STR)対立遺伝子が開示される。各遺伝子座についての代表的なアレリックラダー、これらの対立遺伝子を用いる方法およびアッセイ、および広い範囲の個人の正確な遺伝子型解析および同定のための、これらの対立遺伝子を含むアレリックラダーを含むキットが提供される。一実施形態において、1つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体である、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーが提供される。
【選択図】図1
Description
System(CODIS)DNAデータベースは、選択された個人のDNAプロファイル情報を保存する。CODISプロファイルは、13個のSTRマーカー(STR反復を有する13個の遺伝子座)、2つのさらなる対立遺伝子マーカーおよびAMEL、性別決定対立遺伝子を含む。選択されたDNAプロファイルは、多くの可能性のある供給源、例えば有罪判決を受けた犯罪者、逮捕者、行方不明者または身許不明者、および行方不明者参照DNA(血縁者)由来であり得る。未同定サンプルのDNAプロファイルを、CODIS DNAプロファイルと比較することは、潜在的な身許確認照会(identification match)または、可能性のある加害者の捜査の手掛かりを提供している。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
1つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体である、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーであって、該多型短縦列反復遺伝子座は、対立遺伝子−7を含むD10S1248および対立遺伝子−13を含むD12S391のうちの少なくとも1つである、アレリックラダー。
(項目2)
前記短縦列反復遺伝子座がD10S1248である、項目1に記載のアレリックラダー。
(項目3)
前記短縦列反復遺伝子座がD12S391である、項目1に記載のアレリックラダー。
(項目4)
D10S1248の前記アレリックラダーが、少なくとも12個の対立遺伝子を含む、項目2に記載のアレリックラダー。
(項目5)
D12S391の前記アレリックラダーが、少なくとも14個の対立遺伝子を含む、項目3に記載のアレリックラダー。
(項目6)
以下に示される最小および最大の対立遺伝子の指定とともに、下記の遺伝子座:
(表4)
のうちの1つ以上についてのアレリックラダーを含む、アレリックラダー混合物。
(項目7)
前記混合物が、遺伝子座D10S1248および遺伝子座D12S391についてのアレリックラダーを含む、項目6に記載のアレリックラダー混合物。
(項目8)
D10S1248の前記ラダーは、78塩基対以上および/または122塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含み、かつD12S391の前記ラダーは、203塩基対以上および/または259塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含む、項目6に記載のアレリックラダー混合物。
(項目9)
移動度修飾因子をさらに含む、項目8に記載のアレリックラダー混合物。
(項目10)
前記移動度修飾因子がヘキサエチレンオキシド(HEO)である、項目9に記載のアレリックラダー混合物。
(項目11)
短縦列反復配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法であって、該方法は:
(a)遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって標的核酸サンプルから少なくとも1つの短縦列反復配列を増幅する工程であって、少なくとも1つの該短縦列反復配列は、短縦列反復遺伝子座内に位置する、工程、および
(b)増幅された少なくとも1つの該短縦列反復配列と、該短縦列反復遺伝子座に対応する、項目1に記載のアレリックラダーとを比較する工程、
を包含する、方法。
(項目12)
前記アレリックラダーがPCRによって増幅される、項目11に記載の方法。
(項目13)
工程(a)において、前記遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記アレリックラダーおよび前記標的核酸サンプルの両方を増幅する、項目11に記載の方法。
(項目14)
増幅された前記短縦列反復配列および増幅された前記アレリックラダーを電気泳動し、そして前記サンプルのバンド形成パターンと該アレリックラダーのバンド形成パターンとを比較することによって、増幅された少なくとも1つの該短縦列反復配列と、対応する増幅された該アレリックラダーとを比較する、項目12に記載の方法。
(項目15)
前記標的核酸サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目11に記載の方法。
(項目16)
前記標的核酸サンプルが、犯罪現場から取得されたサンプル、犯罪現場に関連するサンプル、容疑者から採取されたサンプル、参照サンプルまたは検討中のヒトから採取したサンプルのうちの1つ以上である、項目15に記載の方法。
(項目17)
核酸から異なる短縦列反復配列を検出するためのアッセイであって、該アッセイは:
a.遺伝子座特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該核酸内から少なくとも2つの異なる短縦列反復配列を同時増幅する(co−amplifying)工程;ならびに
b.少なくとも2つの同時増幅された該短縦列反復配列と、対立遺伝子−7を含むD10S1248遺伝子座および対立遺伝子−13を含むD12S391遺伝子座から選択される少なくとも1つのアレリックラダーとを比較する工程であって、少なくとも2つの異なる該短縦列反復配列の各々の対立遺伝子が検出される、工程、
を包含する、アッセイ。
(項目18)
前記遺伝子座特異的プライマーが、PCRで使用される、項目17に記載のアッセイ。
(項目19)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、項目18に記載のアッセイ。
(項目20)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、項目19に記載のアッセイ。
(項目21)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目20に記載のアッセイ。
(項目22)
サンプル中のSTRを分析する方法であって、該方法は:
該サンプルが、D10S1248の対立遺伝子−7を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。
(項目23)
前記サンプルと、D10S1248の対立遺伝子−7についての標準とを比較する工程を包含する、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記サンプルを核酸増幅反応に供する、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記サンプルを、D10S1248に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記標準がアレリックラダーを含む、項目23に記載の方法。
(項目30)
前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記アレリックラダーを、D10S1248に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目22に記載の方法。
(項目36)
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、項目35に記載の方法。
(項目37)
サンプル中のSTRを分析する方法であって、該方法は:
該サンプルが、D12S391の対立遺伝子−13を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。
(項目38)
前記サンプルと、D12S391の対立遺伝子−13についての標準とを比較する工程を包含する、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記サンプルを核酸増幅反応に供する、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記サンプルを、D12S391に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記標準がアレリックラダーを含む、項目38に記載の方法。
(項目45)
前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記アレリックラダーを、D12S391に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目37に記載の方法。
(項目51)
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、項目50に記載の方法。
(項目52)
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、項目1に記載の1つ以上のアレリックラダーを含む、少なくとも1つの容器を備える、キット。
(項目53)
少なくとも1つの多型短縦列反復遺伝子座および前記核酸サンプルの対立遺伝子を増幅する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーペアをさらに備える、項目52に記載のキット。
(項目54)
前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座D10S1248のものである、項目52に記載のキット。
(項目55)
前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座D12S391のものである、項目52に記載のキット。
(項目56)
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが標識を含む、項目53に記載のキット。
(項目57)
少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが移動度修飾因子を含む、項目56に記載のキット。
(項目58)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目57に記載のキット。
(項目59)
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、項目52に記載のキット。
(項目60)
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目52に記載のキット。
(項目61)
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、項目60に記載の方法。
(項目62)
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、D10S1248の対立遺伝子−7を検出するためのアレリックラダー、および該D10S1248遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの1つのペアを備える、キット。
(項目63)
少なくとも1つの増幅プライマーが標識を含む、項目62に記載のキット。
(項目64)
少なくとも1つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、項目62に記載のキット。
(項目65)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目64に記載のキット。
(項目66)
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、項目62に記載のキット。
(項目67)
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目62に記載のキット。
(項目68)
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、項目67に記載の方法。
(項目69)
核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、D12S391の対立遺伝子−13を検出するためのアレリックラダー、および該D12S391遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの1つのペアを備える、キット。
(項目70)
少なくとも1つの増幅プライマーが標識を含む、項目69に記載のキット。
(項目71)
少なくとも1つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、項目70に記載のキット。
(項目72)
前記移動度修飾因子がHEOである、項目71に記載のキット。
(項目73)
ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、項目69に記載のキット。
(項目74)
前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、項目69に記載のキット。
(項目75)
前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、項目74に記載の方法。
実施例A.アレリックラダーの構築
特定のSTRマーカーについての変異の代表である対立遺伝子を有すると同定された個人から血液サンプルを採取し、そして当業者に公知の方法によって、DNAをその血液サンプルから単離する。関心のある遺伝子座のためのPCRプライマーによって、関心のある対立遺伝子についてのDNAを増幅する。
DNA鋳型(>1ng) 10.0μl
10×PCR緩衝液 2.5μl
25mM MgCl2 2.0μl
50mM dNTP(0.2mMの各ヌクレオチド3リン酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)) 0.10μlの各dNTP
プライマー(各100〜200ng)各1μM 0.75μl
AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(1ユニット/μl) 1.25μl
水 8.4μl 。
94℃/11分→30サイクル[94℃/15秒、60℃/30秒、72℃/45秒]→72℃/30分→4℃/維持。全てのPCR産物が全長であり、そして3’アデニル化されていることを保証するために、最後のサイクル後に72℃における7から30分の伸長を含める。そのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動によって確認し、そして次いで製造業者の指示に従って、Topo(登録商標)TA Cloning Reaction Kit(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いてプラスミドにクローニングする。
One Shot(登録商標) Mach1TMT1RケミカリーコンピテントE.coli細胞(Invitrtogen)を、ケミカリーコンピテントE.coliのためのクローニング反応を用いて形質転換した。選択プレートは、アンピシリンまたはカナマイシン選択性のいずれかであった。後者は、コロニーを視覚化するために一晩インキュベートすることが必要であった。
AmpliTaqGold(登録商標)DNAポリメラーゼ、12×250ユニット、Gold BufferおよびMgCl2溶液付き(P/N4311820、Appli
ed Biosystems、Foster City、CA)
GeneAmp(登録商標)dNTPブレンド、100mM(N8080261、Applied Biosystems)
グリコーゲン、イガイ由来、Roche Diagnostics Corp.(P/N10901393001)
GenScanTM600LIZTMサイズ標準(P/N4366589、Applied Biosystems)
Hi−DiTMホルムアミド(P/N4311320、Applied Biosystems) 。
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