JP2013511989A - アレリックラダー遺伝子座 - Google Patents
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Abstract
Description
実施例A.アレリックラダーの構築
特定のSTRマーカーについての変異の代表である対立遺伝子を有すると同定された個人から血液サンプルを採取し、そして当業者に公知の方法によって、DNAをその血液サンプルから単離する。関心のある遺伝子座のためのPCRプライマーによって、関心のある対立遺伝子についてのDNAを増幅する。
DNA鋳型(>1ng) 10.0μl
10×PCR緩衝液 2.5μl
25mM MgCl2 2.0μl
50mM dNTP(0.2mMの各ヌクレオチド3リン酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)) 0.10μlの各dNTP
プライマー(各100〜200ng)各1μM 0.75μl
AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ(1ユニット/μl) 1.25μl
水 8.4μl 。
94℃/11分→30サイクル[94℃/15秒、60℃/30秒、72℃/45秒]→72℃/30分→4℃/維持。全てのPCR産物が全長であり、そして3’アデニル化されていることを保証するために、最後のサイクル後に72℃における7から30分の伸長を含める。そのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動によって確認し、そして次いで製造業者の指示に従って、Topo(登録商標)TA Cloning Reaction Kit(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いてプラスミドにクローニングする。
One Shot(登録商標) Mach1TMT1RケミカリーコンピテントE.coli細胞(Invitrtogen)を、ケミカリーコンピテントE.coliのためのクローニング反応を用いて形質転換した。選択プレートは、アンピシリンまたはカナマイシン選択性のいずれかであった。後者は、コロニーを視覚化するために一晩インキュベートすることが必要であった。
AmpliTaqGold(登録商標)DNAポリメラーゼ、12×250ユニット、Gold BufferおよびMgCl2溶液付き(P/N4311820、Applied Biosystems、Foster City、CA)
GeneAmp(登録商標)dNTPブレンド、100mM(N8080261、Applied Biosystems)
グリコーゲン、イガイ由来、Roche Diagnostics Corp.(P/N10901393001)
GenScanTM600LIZTMサイズ標準(P/N4366589、Applied Biosystems)
Hi−DiTMホルムアミド(P/N4311320、Applied Biosystems) 。
Claims (75)
- 1つ以上の多型短縦列反復遺伝子座の対立遺伝子変異体である、単離された複数の核酸分子を組み合わせて含むアレリックラダーであって、該多型短縦列反復遺伝子座は、対立遺伝子−7を含むD10S1248および対立遺伝子−13を含むD12S391のうちの少なくとも1つである、アレリックラダー。
- 前記短縦列反復遺伝子座がD10S1248である、請求項1に記載のアレリックラダー。
- 前記短縦列反復遺伝子座がD12S391である、請求項1に記載のアレリックラダー。
- D10S1248の前記アレリックラダーが、少なくとも12個の対立遺伝子を含む、請求項2に記載のアレリックラダー。
- D12S391の前記アレリックラダーが、少なくとも14個の対立遺伝子を含む、請求項3に記載のアレリックラダー。
- 以下に示される最小および最大の対立遺伝子の指定とともに、下記の遺伝子座:
- 前記混合物が、遺伝子座D10S1248および遺伝子座D12S391についてのアレリックラダーを含む、請求項6に記載のアレリックラダー混合物。
- D10S1248の前記ラダーは、78塩基対以上および/または122塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含み、かつD12S391の前記ラダーは、203塩基対以上および/または259塩基対以下の範囲の対立遺伝子を含む、請求項6に記載のアレリックラダー混合物。
- 移動度修飾因子をさらに含む、請求項8に記載のアレリックラダー混合物。
- 前記移動度修飾因子がヘキサエチレンオキシド(HEO)である、請求項9に記載のアレリックラダー混合物。
- 短縦列反復配列の対立遺伝子を検出および同定するための方法であって、該方法は:
(a)遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって標的核酸サンプルから少なくとも1つの短縦列反復配列を増幅する工程であって、少なくとも1つの該短縦列反復配列は、短縦列反復遺伝子座内に位置する、工程、および
(b)増幅された少なくとも1つの該短縦列反復配列と、該短縦列反復遺伝子座に対応する、請求項1に記載のアレリックラダーとを比較する工程、
を包含する、方法。 - 前記アレリックラダーがPCRによって増幅される、請求項11に記載の方法。
- 工程(a)において、前記遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応によって前記アレリックラダーおよび前記標的核酸サンプルの両方を増幅する、請求項11に記載の方法。
- 増幅された前記短縦列反復配列および増幅された前記アレリックラダーを電気泳動し、そして前記サンプルのバンド形成パターンと該アレリックラダーのバンド形成パターンとを比較することによって、増幅された少なくとも1つの該短縦列反復配列と、対応する増幅された該アレリックラダーとを比較する、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項11に記載の方法。
- 前記標的核酸サンプルが、犯罪現場から取得されたサンプル、犯罪現場に関連するサンプル、容疑者から採取されたサンプル、参照サンプルまたは検討中のヒトから採取したサンプルのうちの1つ以上である、請求項15に記載の方法。
- 核酸から異なる短縦列反復配列を検出するためのアッセイであって、該アッセイは:
a.遺伝子座特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該核酸内から少なくとも2つの異なる短縦列反復配列を同時増幅する(co−amplifying)工程;ならびに
b.少なくとも2つの同時増幅された該短縦列反復配列と、対立遺伝子−7を含むD10S1248遺伝子座および対立遺伝子−13を含むD12S391遺伝子座から選択される少なくとも1つのアレリックラダーとを比較する工程であって、少なくとも2つの異なる該短縦列反復配列の各々の対立遺伝子が検出される、工程、
を包含する、アッセイ。 - 前記遺伝子座特異的プライマーが、PCRで使用される、請求項17に記載のアッセイ。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、請求項18に記載のアッセイ。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、請求項19に記載のアッセイ。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項20に記載のアッセイ。
- サンプル中のSTRを分析する方法であって、該方法は:
該サンプルが、D10S1248の対立遺伝子−7を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。 - 前記サンプルと、D10S1248の対立遺伝子−7についての標準とを比較する工程を包含する、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルを核酸増幅反応に供する、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルを、D10S1248に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項24に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項27に記載の方法。
- 前記標準がアレリックラダーを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、請求項29に記載の方法。
- 前記アレリックラダーを、D10S1248に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項30に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項33に記載の方法。
- 前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項35に記載の方法。
- サンプル中のSTRを分析する方法であって、該方法は:
該サンプルが、D12S391の対立遺伝子−13を含むか否かを決定する工程を包含する、方法。 - 前記サンプルと、D12S391の対立遺伝子−13についての標準とを比較する工程を包含する、請求項37に記載の方法。
- 前記サンプルを核酸増幅反応に供する、請求項37に記載の方法。
- 前記サンプルを、D12S391に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項39に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項42に記載の方法。
- 前記標準がアレリックラダーを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記アレリックラダーを核酸増幅反応に供する、請求項44に記載の方法。
- 前記アレリックラダーを、D12S391に対する遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅する、請求項45に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、標識を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記遺伝子座特異的プライマーのうちの少なくとも1つが、移動度修飾因子を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項48に記載の方法。
- 前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項37に記載の方法。
- 前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項50に記載の方法。
- 核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、請求項1に記載の1つ以上のアレリックラダーを含む、少なくとも1つの容器を備える、キット。
- 少なくとも1つの多型短縦列反復遺伝子座および前記核酸サンプルの対立遺伝子を増幅する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーペアをさらに備える、請求項52に記載のキット。
- 前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座D10S1248のものである、請求項52に記載のキット。
- 前記アレリックラダーが、短縦列反復遺伝子座D12S391のものである、請求項52に記載のキット。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが標識を含む、請求項53に記載のキット。
- 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが移動度修飾因子を含む、請求項56に記載のキット。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項57に記載のキット。
- ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、請求項52に記載のキット。
- 前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項52に記載のキット。
- 前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項60に記載の方法。
- 核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、D10S1248の対立遺伝子−7を検出するためのアレリックラダー、および該D10S1248遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの1つのペアを備える、キット。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが標識を含む、請求項62に記載のキット。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、請求項62に記載のキット。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項64に記載のキット。
- ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、請求項62に記載のキット。
- 前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項62に記載のキット。
- 前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項67に記載の方法。
- 核酸サンプルに由来する短縦列反復配列を分析するためのキットであって、該キットは、D12S391の対立遺伝子−13を検出するためのアレリックラダー、および該D12S391遺伝子座から増幅産物を生成するための増幅プライマーの1つのペアを備える、キット。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが標識を含む、請求項69に記載のキット。
- 少なくとも1つの増幅プライマーが移動度修飾因子を含む、請求項70に記載のキット。
- 前記移動度修飾因子がHEOである、請求項71に記載のキット。
- ポリメラーゼ、検出可能なレポーターおよびプロトコールのうちの1つ以上をさらに備える、請求項69に記載のキット。
- 前記サンプルが、毛髪、糞便、血液、組織、尿、唾液、頬細胞、膣細胞、皮膚、骨、歯、頬側サンプル、胎盤細胞を含む羊水、および胎児細胞を含む羊水および精液のうちの1つ以上に由来する、請求項69に記載のキット。
- 前記サンプルが、犯罪現場から取得されるか、犯罪現場に関連するか、容疑者から採取されるか、参照サンプルであるか、または検討中のヒトから採取される、請求項74に記載の方法。
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